環戊烯酮衍生物的制作方法

專利名稱：環戊烯酮衍生物的制作方法
技術領域：
本發明是關于可以在醫藥領域中使用的、具有抗癌作用等生理活性的環戊烯酮衍生物以及該化合物的制造方法。
以往，臨床治療方法中使用的藥物涉及烷基化劑、代謝抑制劑、植物生物堿等抗癌藥、抗生素、免疫促進劑和免疫調節劑等多種藥劑，但這些藥物療法還不能說已經十分完善。
研究報告指出，在這些藥物中，由天然物質得來的前列腺素中在5員環上具有α，β-不飽和羰基的前列腺素A和J類能抑制DNA合成，可以作為安全性高的抗癌藥，目前已經合成了它們的各種衍生物(參見特開昭62-96438)。
本發明的目的是，研制具有抗癌作用、細胞凋亡誘發作用、抗菌作用等生理作用的環戊烯酮衍生物，提供該化合物的制造方法以及含有該化合物的藥物。
為了實現上述目的，本發明人進行了深入的研究，結果發現，使由[III]式表示的4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮(以下簡稱環戊烯酮)與羧酸和/或其反應性衍生物反應，可以生成由[II]式表示的環戊烯酮衍生物，該環戊烯酮衍生物具有很強的癌細胞增殖抑制活性等生理活性。
本發明可以概括如下本發明的第1發明是關于由下列通式[I]表示的環戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽。
式中，R1和R2是相同或不同的直鏈或支鏈烷基、直鏈或支鏈鏈烯基、芳基或芳脂族基，但不包括R1＝R2＝-CH3的情況。
本發明的第2發明是關于由通式[II]表示的環戊烯酮衍生物的制造方法，其特征是，使由下列[III]式表示的4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮和/或其旋光物與相當于由下列通式[II]表示的環戊烯酮衍生物的R3、R4的羧酸和/或其反應性衍生物同時或順次反應。
式中，R3和R4是相同或不同的直鏈或支鏈烷基、直鏈或支鏈鏈烯基、芳基或芳脂族基。
本發明的第3發明是關于一種藥物，其特征是，該藥物含有選自本發明的第1發明的環戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽中的化合物作為有效成分。
本發明的第4發明是關于一種藥物，其特征是，該藥物含有選自用本發明的第2發明的方法得到的環戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽的化合物作為有效成分。
在本發明的第3和第4發明中，優選的方案是，上述藥物為抗癌藥、細胞凋亡誘發劑、抗菌劑。
附圖的簡要說明

圖1是表示二乙酰基環戊烯酮的質譜分析的圖。
圖2是表示二乙酰基環戊烯酮的1H-NMR譜的圖。
圖3是表示二苯甲酰基環戊烯酮的質譜分析的圖。
圖4是表示二苯甲酰基環戊烯酮的1H-NMR譜的圖。
圖5是表示二己酰基環戊烯酮的1H-NMR譜的圖。
圖6是表示二肉豆蔻酰基環戊烯酮的1H-NMR譜的圖。
圖7是表示二辛酰基環戊烯酮的1H-NMR譜的圖。
圖8是表示二-3-辛烯酰基環戊烯酮的1H-NMR譜的圖。
圖9是表示二丁酰基環戊烯酮的1H-NMR譜的圖。
圖10是表示二癸酰基環戊烯酮的1H-NMR譜的圖。
圖11是表示二戊酰基環戊烯酮的1H-NMR譜的圖。
圖12是表示二丙酰基環戊烯酮的1H-NMR譜的圖。
圖13是表示二-2-己烯酰基環戊烯酮的1H-NMR譜的圖。
圖14是表示(-)-環戊烯酮的對二甲氨基苯甲酰基衍生物的CD和(-)-環戊烯酮的立體結構的圖。
圖15是表示(+)-環戊烯酮的對二甲氨基苯甲酰基衍生物的CD和(+)-環戊烯酮的立體結構的圖。
發明的實施方式下面具體地說明本發明。
本發明中使用的由[III]式表示的環戊烯酮，其4位和5位的羥基的立體構型包括順式異構體和反式異構體兩種情況。在本發明中，可以使用順式環戊烯酮，反式環戊烯酮，或者順式環戊烯酮與反式環戊烯酮的混合物。另外，也可以使用它們的旋光物。
順式環戊烯酮可以用化學合成法制備[參見(HelveticaChimica Acta)、第55卷、第2838-2844頁(1972)]。反式環戊烯酮也可以用化學合成法制備[參見(Carbohybrate Res.)、第247卷、第217-222頁(1993)]，另外，還可以通過對糖醛酸(例如葡糖醛酸)、糖醛酸衍生物(例如葡糖醛酸內酯)等進行加熱處理而制備(參見PCT/JP97/03052說明書)。在本發明中，也可以使用含有環戊烯酮的上述加熱處理物、其部分精制物以及精制物。
例如，糖醛酸使用D-葡糖醛酸，將其1％溶液在121℃下加熱處理4小時，使加熱處理物中生成環戊烯酮。用溶劑萃取該加熱處理物中的環戊烯酮，濃縮萃取物。然后用硅膠柱色譜分離該濃縮物，濃縮溶出的環戊烯酮級分，用氯仿從濃縮物中提取環戊烯酮，對提取的濃縮物進行正相柱色譜分離，離析加熱處理物中的環戊烯酮。
環戊烯酮的物性列出如下。環戊烯酮的質譜分析是采用DX302質譜儀(日本電子社制造)進行的。另外，使用重氯仿溶劑的NMR譜的測定是采用JNM-A500(日本電子社制造)。旋光率、UV吸收譜和紅外吸收光譜(IR)分別是使用DIP-370型旋光計(日本分光社制造)、UV-2500分光光度計(島津制作所制造)和FTIR-8000紅外分光光度計(島津制作所制造)。MSm/z 115〔M+H〕+1H-NMR(CDCl3)δ4.20(1H，d，J＝2.4Hz，5-H)、4.83(1H，m，4-H)、6.30(1H，dd，J＝1.2，6.1Hz，2-H)、7.48(1H，dd，J＝2.1，6.1Hz，3-H)其中，1H-NMR的化學位移值是以CHCl3的化學位移值為7.26ppm表示的。
旋光度[α]D200°(c1.3、水)UVλmax 215nm(水)IR(KBr法)在3400、1715、1630、1115、1060、1025cm-1有吸收。
對離析的環戊烯酮進行光學離析，可以得到(-)-4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮和(+)-4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮。當然，用合成方法得到的環戊烯酮也可以光學離析。
例如，將環戊烯酮溶解在乙醇中，向該乙醇溶液中添加己烷/乙醇(94/6)，制備環戊烯酮溶液。例如使用Chiral Pack As(ダイセル化學工業)柱，在柱溫40℃、流動相己烷/乙醇(94/6)條件下對該試樣溶液進行HPLC，可以將環戊烯酮光學離析。
離析的(-)-反式-4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮[以下簡稱(-)-環戊烯酮]的旋光度是[α]D20-105°(c0.30、乙醇)，(+)-反式-4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮[以下簡稱(+)-環戊烯酮]的旋光度是[α]D20-104°(c0.53、乙醇)。另外，旋光度是用上述DIP-370型旋光計(日本分光社制造)測定的。
隨后，按上面所述的方法，采用質譜分析、核磁共振(NMR)對(-)-環戊烯酮和(+)-環戊烯酮分別進行結構分析，測定UV吸收光譜和紅外吸收光譜。結果，這兩種旋光物顯示出與光學離析前的環戊烯酮相同的結果。
設經過光學離析的(-)-環戊烯酮和(+)-環戊烯酮分別為對二甲氨基苯甲酰基衍生物，使用J-720型圓二色性分散計(日本分光社制造)，測定圓二色性光譜(CD)，將所得結果用于二苯甲酸酯手性規則[參見J.Am.Chem.Soc.、第91卷、第3989-3991頁(1969)]，確定其立體構型。
圖14中示出(-)-環戊烯酮的對二甲氨基苯甲酰基衍生物的CD和(-)-環戊烯酮的立體結構。圖中，縱軸表示摩爾圓二色性，橫軸表示波長(nm)。另外，上述立體結構用[IV]式表示如下
圖15中示出(+)-環戊烯酮的對二甲氨基苯甲酰基衍生物的CD和(+)-環戊烯酮的立體結構。圖中，縱軸表示摩爾圓二色性，橫軸表示波長(nm)。另外，上述立體結構用[V]式表示如下
如同圖14、15和[IV]式、[V]式所示，(-)-環戊烯酮是(-)-(4R，5S)-反式-4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮，(+)-環戊烯酮是(+)-(4S，5R)-反式-4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮。
以上使用的環戊烯酮或其旋光物可以用任一方法制造，可以用說明書中所述的方法制造，也可以用化學合成方法合成，在本發明中也可以使用環戊烯酮的反式體、順式體、它們的混合物以及它們的旋光物。
將環戊烯酮和/或其旋光物與具有直鏈或支鏈烷基、直鏈或支鏈鏈烯基、芳基或芳酯族基的羧酸和/或其反應性衍生物同時或順次反應，在反應液中生成本發明的由通式[II]表示的環戊烯酮衍生物或其旋光物。
具有烷基的羧酸可以使用具有直鏈或支鏈的烷基的羧酸，烷基鏈的鏈長可以根據環戊烯酮衍生物的生物活性、溶解性等適當選擇。
具有直鏈烷基的羧酸例如可以使用乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、正辛酸、壬酸、正癸酸、十一烷酸、十二烷酸、十三烷酸、十四烷酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸、十九烷酸、二十烷酸、二十二烷酸、二十四烷酸、二十六烷酸、三十烷酸等。
具有支鏈烷基的羧酸例如可以使用異丁酸、異戊酸、2-甲基丁酸、三甲基乙酸、4-甲基戊酸、1，2-二甲基戊酸等。
具有鏈烯基的羧酸可以使用具有直鏈或支鏈的鏈烯基的羧酸，鏈烯基的鏈長、不飽和度以及不飽和鍵的位置可以根據環戊烯酮衍生物的生物活性、溶解性等適當選擇。
具有直鏈鏈烯基的羧酸例如可以使用丙烯酸、乙烯基乙酸、丁烯酸、異丁烯酸、烯丙基乙酸、2-己烯酸、3-己烯酸、3-辛烯酸、4-癸烯酸、10-十一碳烯酸、9-十六碳烯酸、6-十八碳烯酸、反式9-十八碳烯酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸、γ-亞麻酸、桐酸、二十碳三烯酸、花生油烯酸、二十碳五烯酸、巴西烯酸、芥酸、二十二碳六烯酸、西門木烯酸、21-三十烯酸等。
具有支鏈鏈烯基的羧酸例如可以使用甲基丙烯酸、惕各酸、當歸酸、α-乙基丁烯酸等。
具有芳基的羧酸例如可以使用苯甲酸、甲苯酸、氯苯甲酸、溴苯甲酸、硝基苯甲酸、苯二甲酸、間苯二甲酸、對苯二甲酸、水楊酸、乙酰水楊酸、乙酰水楊基水楊酸、氨基水楊酸、對羥基苯甲酸、氨基苯甲酸、甲氧基苯甲酸、乙酰胺基苯甲酸、香草酸、苔色酸、萘甲酸、吡啶二羧酸、黃尿烯酸、奎尼酸、犬尿烯酸等，可以根據生成的環戊烯酮衍生物的生物活性、溶解性等選擇所使用的具有芳基的羧酸。
具有芳脂族基的羧酸例如可以使用苯基乙酸、苯基丙酸、苯基乳酸、苯丙酮酸、肉桂酸、阿托酸、萘乙酸等，可以根據生成的環戊烯酮衍生物的生物活性、溶解性等選擇所使用的具有芳烷基的羧酸。
本發明中使用的羧酸的反應性衍生物例如可以舉出酰基鹵、酸酐、酸性酯、鹽等，可以根據要達到的目的制備所使用的羧酸的反應性衍生物。
羧酸或其反應性衍生物與環戊烯酮的反應，可以按照環戊烯酮衍生物中的R3和R4相同的方式進行，也可以按照R3與R4不同的方式進行。即，可以使R3與R4不同的羧酸同時與環戊烯酮反應，也可以使R3與R4不同的羧酸順次與環戊烯酮進行反應。此時，通過保護環戊烯酮中的一個羥基，可以高效率地制備R3與R4不同的環戊烯酮衍生物。
環戊烯酮或其旋光物與羧酸反應生成的環戊烯酮衍生物或其旋光物具有很強的癌細胞增殖抑制活性，可以以該活性作為指標從反應液中提純、分離環戊烯酮或其旋光物。提純、分離的方法可以采用化學方法或物理方法等公知的純化方法，可以將凝膠過濾法、利用分子量分級薄膜的分級法、溶劑萃取法、分餾法、使用離子交換樹脂的各種色譜法等以往公知的純化方法組合使用，提純和離析反應生成物中的環戊烯酮衍生物或其旋光物。
例如，將環戊烯酮或其旋光物、4-二甲氨基吡啶和羧酸溶解在二氯甲烷中，在冰冷卻下添加N，N-二環己基碳化二亞胺使之反應，生成本發明的環戊烯酮衍生物。用硅膠柱色譜提純生成物，可以離析出目的物環戊烯酮衍生物。
另外，也可以使環戊烯酮或其旋光物與醋酸酐在無水吡啶中反應，從反應物中提純、分離出二乙酰環戊烯酮。
由本發明得到的環戊烯酮衍生物的旋光物，可以通過消旋混合物的機械分離進行離析，優先選用結晶法離析，作為非對映立體異構物鹽或包合物結晶而離析，采用酶·微生物的動力學離析，以及采用色譜進行離析。
采用色譜進行離析，可以使用氣相色譜、液相色譜或薄層色譜等，可以使用與它們相適應的手性固定相。
采用液相色譜進行光學離析，可以采用使用手性固定相的方法、使用手性洗提液的方法以及作為非對映立體異構物的分離等方法。
手性固定相可以使用酰胺系固定相、尿素系固定相、配位基交換型固定相、多糖·多糖衍生物固定相、蛋白質固定相、聚甲基丙烯酸酯固定相、聚甲基丙烯酰胺固定相等。
洗提液可以使用己烷系、醇系、水(緩沖液)系等，與上述固定相組合適當使用。
本發明所得到的環戊烯酮衍生物或其旋光物的鹽，有些是可以用作藥物的鹽，可以采用公知的方法轉換。
本發明所得到的環戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽，對于下列癌細胞具有細胞增殖抑制作用人前骨髓性白血病細胞HL-60、人的急性淋巴芽球性白血病細胞MOLT-3、肺癌細胞A-549、SV40形質轉換肺細胞WI-38VA13、肝癌細胞Hep G2、結腸癌細胞HCT 116、人的結腸癌細胞SW480、人的結腸癌細胞WiDr、胃癌細胞AGS、骨髓瘤細胞等癌細胞，含有選自本發明的環戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽的化合物作為有效成分的藥品，例如可以以選自本發明的環戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽的化合物作為有效成分，將其與公知的藥用載體組合形成制劑，制成抗癌藥。本發明所得到的環戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽的癌細胞增殖抑制作用對本發明沒有任何限制作用，例如，本發明還包含對于癌細胞的細胞凋亡誘發作用。
抗癌藥一般可以按下述方法制造，即，將選自環戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽的化合物與藥學上允許的液體或固體的載體配合，必要時添加溶劑、分散劑、乳化劑、緩沖劑、穩定劑、賦形劑、粘結劑、崩解劑、潤滑劑等，制成片劑、顆粒劑、散劑、粉末劑、膠囊劑等固形制劑或通常液劑、懸浮劑、乳劑等溶液劑。另外，還可以制成干燥制品，在使用之前添加適當的載體，形成液狀。
藥用載體可以根據上述給藥方式和劑型加以選擇，對于經口給藥的制劑來說，例如可以使用淀粉、乳糖、白糖、甘露醇、羧甲基纖維素、玉米淀粉、無機鹽等。另外，在制備經口給藥的制劑時，還可以配入粘結劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑、流動性促進劑、矯味劑、著色劑、香料等。
另一方面，對于非經口給藥的制劑來說，將本發明的有效成分即選自環戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽的化合物溶解或懸浮于作為稀釋劑的注射用蒸餾水、生理食鹽水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等中，必要時添加殺菌劑、穩定劑、等張化劑、鎮痛劑等，制成制劑。
本發明的抗癌藥可以采用與制劑形態相應的適當給藥途徑給藥。給藥方法沒有特別的限制，可以內用、外用或注射。注射劑例如可以通過靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、皮內注射給藥，外用劑也包括栓劑等。
抗癌藥的給藥量可以根據制劑形式、給藥方法、使用目的以及患者的年齡、體重、癥狀等適當設定，不是一成不變的，一般地說，制劑中所含的、選自環戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽的化合物的量為成人每日0.2μg～200mg/kg。當然，給藥量根據各種條件而有所變化，有的時候比上述給藥量少，也有的時候比上述給藥量多。本發明的藥劑除了直接經口給藥外，還可以添加到日常的任何食品飲料中攝入。
本發明所得到的環戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽具有細胞凋亡誘發活性，可以從這些化合物中選擇至少一種化合物作為有效成分，制成細胞凋亡誘發劑。細胞凋亡誘發劑可以按照上述抗癌藥中所述的方法制成制劑，并按抗癌藥中所述的方法給藥。
細胞凋亡誘發劑的給藥量可以根據制劑形式、給藥方法、使用目的以及患者的年齡、體重、癥狀等適當設定，不是一成不變的，一般地說，制劑中所含的、選自環戊烯酮衍生物和/或其旋光物的量為成人每日0.1μg～100mg/kg。當然，給藥量根據各種條件而有所變化，有的時候比上述給藥量少，也有的時候超過上述給藥量范圍。本發明的藥劑除了直接經口給藥外，還可以添加到日常的任何食品飲料中攝入。
一般認為，細胞凋亡作用與病理學上所說的細胞死亡即壞死不同，是從一開始就編入細胞本身的基因中的死亡。即，任何外部或內部的因素都可能誘發編程細胞凋亡作用的基因活化，基于該基因而生物合成編程性細胞死亡基因蛋白質，由于生成的編程性細胞死亡蛋白質的作用使細胞本身分解，導致死亡。
本發明的細胞凋亡誘發劑可以在所希望的組織和細胞中誘發這種細胞凋亡作用，以自然的形式從生物體中排除不需要的細胞或病源細胞，因而是極其有用的。
本發明的細胞凋亡誘發劑可以在細胞凋亡作用誘發方法中使用。即，使用環戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽作為有效成分，可以誘發細胞凋亡作用，該方法對于弄清細胞凋亡誘發基理以及篩選細胞凋亡誘發劑和細胞凋亡誘發抑制劑等十分有用。
本發明得到的環戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽具有抗菌活性，可以從這些化合物中選擇至少一種化合物作為有效成分制成抗菌劑。抗菌劑可以按上述抗癌藥的方法制成制劑，采用與制劑形式相應的適當給藥途徑給藥。給藥方法沒有特別的限制，可以內用、外用或注射。注射劑例如可以通過靜脈注射、肌肉注射、皮下注射或皮內注射等給藥，外用劑也包括栓劑等。
抗菌劑的給藥量可以根據制劑形式、給藥方法、使用目的以及患者的年齡、體重、癥狀等適當設定，不是一成不變的，一般地說，制劑中所含的、選自環戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽的量為成人每日10μg～20mg/kg。當然，給藥量根據各種條件而有所變化，有的時候比上述給藥量少，也有的時候超過上述給藥量范圍。本發明的藥劑除了直接經口給藥外，還可以添加到日常的任何食品飲料中攝入。
本發明的抗菌劑也可以作為防腐劑，用來提高食品或飲料的保存性。另外，還可以用于將環戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽添加到食品或飲料中，防止食品或飲料腐敗的方法中。
本發明的抗菌劑對于革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌都有效。另外，本發明的抗菌劑對于齲齒病菌和牙周病菌也具有抗菌活性，可以制成含有本發明的抗菌劑的口腔內用藥。口腔內用藥的形態可以是液體狀或膏狀等公知的形態。口腔內用藥的例子可以舉出牙膏。使用本發明的抗菌劑，還可以提供抗菌性化妝品。另外，使用本發明的抗菌劑還可以提供浴用劑。
本發明得到的環戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽，可以由環戊烯酮和任意的羧酸或其反應性衍生物高效率地制備。
含有本發明得到的環戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽作為有效成分的食品或飲料的制造方法沒有特別的限制，可以采用烹飪、加工以及常用的食品或飲料的制造方法制造，只要制得的食品或飲料中含有有效量的選自具有生理作用的環戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽的化合物即可。
本發明得到的環戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽，將其以生理活性的有效量給藥時沒有發現毒性。例如，在經口給藥的場合，以300mg/kg的劑量將二丙酰基環戊烯酮、二己酰基環戊烯酮、二-2-己烯酰基環戊烯酮或其旋光物或者它們的鹽中的任一種給小鼠一次性經口給藥時，沒有發現死亡例。
本發明所得到的環戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽可以簡便地制造，由于具有各種生理作用，在醫藥、食品等領域中具有廣泛的應用前景。
實施例下面通過實施例更具體地說明本發明，但本發明不受這些實施例的限制。另外，實施例中的％表示重量％。
實施例1(1)將10g D-葡糖醛酸(シグマ公司制造G5269)溶解在1升的水中，在121℃下加熱4小時，然后減壓濃縮至10ml左右。向其中添加醋酸丁酯∶醋酸∶水＝3∶2∶2混合液的上層40ml，混合后離心分離，在減壓下將所得上清液濃縮至約10ml。
將上述提取液加到柱色譜用硅膠BW-300SP(2×28cm，富士シリシア化學社制造)上，以醋酸丁酯∶醋酸∶水＝3∶2∶2的上層作為洗提液，用空氣壓縮機加壓至0.2kg/cm2，以每分鐘5ml的流速進行分離。按照每1級分10ml進行分級分離，每1級分取一部分，用薄層色譜分析，從第61至80級分中含有高純度的環戊烯酮。將這些級分匯集到一起，減壓下濃縮，然后用40ml的氯仿萃取，在減壓下濃縮萃取液，得到100mg的環戊烯酮。
采用使用Palpack型S柱的正相HPLC分離該級分，用215nm的紫外線吸收進行檢測，結果純度為98％。
將113.9mg上述環戊烯酮溶解在2.85ml乙醇中，再向該乙醇溶液中添加己烷/乙醇(94/6)3.85ml，制成17mg/ml的環戊烯酮溶液。用0.5μm的過濾器過濾該溶液，將其作為光學離析HPLC試樣溶液。
按以下條件對該試樣溶液進行光學離析HPLC，分別收集前峰的(-)-環戊烯酮和后峰的(+)-環戊烯酮的級分，減壓干固，分別得到(-)-環戊烯酮43.2 mg和(+)-環戊烯酮43.0mg。
光學離析HPLC條件柱Chiral Pack AS(ダイセル化學工業)2.0cm×25.0cm柱溫度40℃移動相己烷/乙醇(94/6)流速14.0ml/分檢測UV210nm試樣注入量150μl(2.55mg)按上述條件再次進行光學離析，以使所得到的(-)-環戊烯酮和(+)-環戊烯酮兩者總共含有約1％的對映體。結果，從前峰的(-)-環戊烯酮30.0mg中得到19.7mg不含對映體的(-)-環戊烯酮，從后峰的(+)-環戊烯酮37.4mg中得到27.7mg的不含對映體的(+)-環戊烯酮。另外，(-)-環戊烯酮和(+)-環戊烯酮的光學離析HPLC的溶出時間分別為33分鐘和40分鐘。
(2)在按實施例1-(1)所述方法得到的29.6mg環戊烯酮中添加1ml無水吡啶(295-26，ナカライテスク公司制造)和0.1ml醋酸酐(002-26，ナカライテスク公司制造)，在室溫下攪拌3小時。用氯仿萃取反應液，得到36mg二乙酰基環戊烯酮。
使用DX302質譜分析儀(日本電子公司制造)對所得到的二乙酰基環戊烯酮進行質譜分析。另外，將其溶解在CDCl3中，用NMR分析其結構。核磁共振裝置使用JNM-A500(日本電子公司制造)。測定結果列在下面，其中，1H-NMR的化學位移值是以氯仿的化學位移值為7.24ppm表示。MSm/z 199(M+H)+1H-NMRδ2.12(3H，S，-OCOCH3)，2.16(3H，S，-OCOCH3)，5.16(1H，d，J＝3.0Hz，H-5)，5.89(1H，m，H-4)，6.40(1H，d-d，J＝1.5，6.5Hz，H-2)，7.43(1H，d-d，J＝2.5，6.5Hz，H-3)圖1中示出二乙酰基環戊烯酮的質譜，圖2中示出其1H-NMR譜。圖1中，橫軸表示m/z值，縱軸表示相對強度(％)。另外，在圖2中，橫軸表示化學位移值(ppm)，縱軸表示信號的強度。
(3)使用按實施例1-(1)中所述的方法得到15.9mg(-)-環戊烯酮，進行與實施例1-(2)同樣的反應，得到15.1mg二乙酰基(-)-環戊烯酮。與上述實施例1-(2)同樣利用質譜分析和核磁共振進行結構分析，得到與上述實施例1-(2)同樣的結果。
(4)使用按實施例1-(1)中所述的方法得到16.7mg(+)-環戊烯酮，進行與實施例1-(2)同樣的反應，得到18.8mg二乙酰基(+)-環戊烯酮。與上述實施例1-(2)同樣利用質譜分析和核磁共振進行結構分析，得到與上述實施例1-(2)同樣的結果。
(5)13.8mg環戊烯酮中添加44.3mg苯甲酸(041-20，ナカラィテスク公司制造)7.5mg二甲氨基吡啶(DMAP東京化成工業公司制造D1450)和51.0mgN，N’-二環己基碳二亞胺(DCCペフチド研究所制造1001)，添加5ml氯仿，在冰冷卻下攪拌4小時。過濾反應液，將所得濾液加到硅膠柱(75ml)上，用氯仿溶出，得到含有二苯甲酰基環戊烯酮的級分。減壓除去該級分中的溶劑，將殘渣溶解在乙醇中，然后采用以氯仿/甲醇＝99∶1的混合液作為展開溶劑的硅膠薄層色譜進行分離。從薄層中除去Rf＝0.45-0.55部分的硅膠，用氯仿萃取，得到二苯甲酰基環戊烯酮3.2mg。
與上述實施例1-(2)同樣，采用質譜分析和核磁共振對所得到的二苯甲酰基環戊烯酮進行結構分析，結果給出如下。
MS m/z 323(M+H)+1H-NMRδ5.56(1H，d，J＝3.0Hz，H-5)，6.30(1H，m，H-4)，6.54(1H，d-d，J＝T.5，6.5Hz，H-2)，7.44(4H，m，芳香環的H)，7.58(2H，m，芳香環的H)，7.64(1H，d-d，J＝2.0，6.5Hz，H-3)，8.06(4H，m，芳香環的圖3中示出二苯甲酰基環戊烯酮的質譜，圖4中示出其1H-NMR譜。圖3中，橫軸表示m/z值，縱軸表示相對強度(％)。另外，在圖4中，橫軸表示化學位移值(ppm)，縱軸表示信號的強度。
(6)使用22.1mg(-)-環戊烯酮、71.9mg苯甲酸、12.1mg DMAP和80.3mg DCC，進行與上述實施例1-(5)同樣的反應，得到19.2mg二苯甲酰基(-)-環戊烯酮。與上述實施例1-(5)同樣采用質譜分析和核磁共振進行結構分析，得到與上述實施例1-(5)同樣的結果。
(7)使用20.4mg(+)-環戊烯酮、65.6mg苯甲酸、11.0mg DMAP和74.3mg DCC，進行與上述實施例1-(5)同樣的反應，得到21.4mg二苯甲酰基(+)-環戊烯酮。與上述實施例1-(5)同樣采用質譜分析和核磁共振進行結構分析，得到與上述實施例1-(5)同樣的結果。
(8)將30mg環戊烯酮、10mg DMAP和153mg己酸(ナカライテスク公司制造070-26)溶解在5.9ml的二氯甲烷中，在冰冷卻下添加108mg DCC。反應1小時后，用以氯仿作為展開溶劑的硅膠薄層色譜分離、提純反應液。從薄層中除去Rf＝0.3-0.4部分的硅膠，用氯仿萃取，得到二己酰基環戊烯酮11mg。
將所得到的二己酰基環戊烯酮溶解在CDCl3，用核磁共振法(NMR)確認。核磁共振裝置使用JNM-EX270 FT NMR系統(日本電子公司制造)。另外，1H-NMR的化學位移值是以四甲基硅烷的化學位移值為0ppm表示的。
結果給出如下。1H-NMRδ7.44(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝1.98Hz，H-3)，6.42(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝1.32Hz，H-2)，5.91(1H，m，H-4)，5.16(1H，d，J4-5＝2.97Hz，H-5)，2.42(2H，t，J＝7.26Hz)，2.38(2H，t，J＝7.76Hz)，1.65(4H，m)，1.26(8H，m)，0.88(6H，t)圖5中示出二己酰基環戊烯酮的1H-NMR譜。在圖5中，橫軸表示化學位移值(ppm)，縱橫表示信號的強度。
(9)將30mg環戊烯酮、10mg DMAP和301mg肉豆蔻酸(東京化學工業公司制造M0476)溶解在5.9ml的二氯甲烷中，在冰冷卻下添加108mg DCC。反應1小時后，用以氯仿作為展開溶劑的硅膠薄層色譜分離反應液。從薄層中除去Rf＝0.45-0.55部分的硅膠，用氯仿萃取，得到二肉豆蔻酰基環戊烯酮53mg。
與實施例1-(8)同樣，利用核磁共振對秘得到的二肉豆蔻基環戊烯酮進行結構分析，結果給出如下。1H-NMRδ7.45(1H，dd，J2-3＝5.94Hz，J3-4＝2.31Hz，H-3)，6.42(1H，dd，J2-3＝5.31Hz，J3-4＝1.32Hz，H-2)，5.92(1H，m，H-4)，5.16(1H，d，J4-5＝2.64Hz，H-5)，2.42(2H，t，J＝7.26Hz)，2.38(2H，t，J＝7.91Hz)，1.63(4H，m)，1.26(32H，m)，0.88(6H，t)
圖6中示出二肉豆蔻酰基環戊烯酮的1H-NMR譜。在圖6中，橫軸表示化學位移值(ppm)，縱橫表示信號的強度。
(10)將30mg環戊烯酮、10mgDMAP和190mg辛酸(ナカライテスク公司制造071-11)溶解在5.9ml的二氯甲烷中，在冰冷卻下添加108mg DCC。反應1小時后，用以氯仿作為展開溶劑的硅膠薄層色譜分離反應液。從薄層中除去Rf＝0.25-0.35部分的硅膠，用氯仿萃取，得到二辛酰基環戊烯酮27mg。
與實施例1-(8)同樣，利用核磁共振對所得到的二辛酰基環戊烯酮進行結構分析，結果給出如下。1H-NMRδ7.44(1H，dd，J2-3＝6.1Hz，J3-4＝2.16Hz，H-3)，6.41(1H，dd，J2-3＝6.1Hz，J3-4＝1.48Hz，H-2)，5.92(1H，m，H-4)，5.16(1H-，d，J4-5＝2.97Hz，H-5)，2.42(2H，t，J＝7.59Hz)，2.38(2H，t，J＝7.91Hz)，1.65(4H，m)，1.29(16H，m)，0.88(6H，t)圖7中示出二辛酰基環戊烯酮的1H-NMR譜。在圖7中，橫軸表示化學位移值(ppm)，縱橫表示信號的強度。
(11)將30mg環戊烯酮、10mg DMAP和190mg辛烯酸(東京化成工業公司制造00070)溶解在5.9ml的二氯甲烷中，在冰冷卻下添加108mgDCC。反應1小時后，用以氯仿作為展開溶劑的硅膠薄層色譜分離反應液。從薄層中除去Rf＝0.25-0.35部分的硅膠，用氯仿萃取，得到二-3-辛酰基環戊烯酮25mg。
與實施例1-(8)同樣，利用核磁共振對所得到的二-3-辛烯酰基環戊烯酮進行結構分析，結果給出如下。1H-NMRδ7.44(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝2.32Hz，H-3)，6.42(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝1.49Hz.H-2)，5.91(1H，m，H-4)，5.55(4H，m)，5.16(1H，d，J4-5＝2.97Hz，H-5)，3.12(4H，dd，J＝12.85Hz，J＝6.59Hz)，2.04(4H，m)，1.33(8H，m)，0.89(6H，t)圖8中示出二-3-辛烯酰基環戊烯酮的1H-NMR譜。在圖8中，橫軸表示化學位移值(ppm)，縱橫表示信號的強度。
(12)將30mg環戊烯酮、10mgDMAP和115mg正丁酸酸(東京化成工業公司制造B0754)溶解在5.9ml的二氯甲烷中，在冰冷卻下添加108mg DCC。反應1小時后，用以氯仿作為展開溶劑的硅膠薄層色譜分離反應液。從薄層中除去Rf＝0.20-0.30部分的硅膠，用氯仿萃取，得到二丁酰基環戊烯酮16mg。
與實施例1-(8)同樣，利用核磁共振對所得到的二丁烯酰基環戊烯酮進行結構分析，結果給出如下。1H-NMRδ7.45(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝2.13Hz，H-3)，6.42(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝1.65Hz，H-2)，5.91(1H，m，H-4)，5.16(1H，d，J4-5＝2.64Hz，H-5)圖9中示出二丁烯酰基環戊烯酮的1H-NMR譜。在圖9中，橫軸表示化學位移值(ppm)，縱橫表示信號的強度。
(13)將30mg環戊烯酮、10mgDMAP和226mg正癸酸酸(東京化成工業公司制造D0017)溶解在5.9ml的二氯甲烷中，在冰冷卻下添加108mg DCC。反應1小時后，用以氯仿作為展開溶劑的硅膠薄層色譜分離反應液。從薄層中除去Rf＝0.35-0.45部分的硅膠，用氯仿萃取，得到二癸酰基環戊烯酮35mg。
與實施例1-(8)同樣，利用核磁共振對所得到的二癸酰基環戊烯酮進行結構分析，結果給出如下。1H-NMRδ7.44(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝1.97Hz，H-3)，6.42(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝1.3Hz，H-2)，5.91(1H，m，H-4)，5.15(1H，d，J4-5＝2.97Hz，H-5)，2.42(2H，t，J＝7.24Hz)，2.38(2H，t，J＝7.91Hz)，1.65(4H，m)，1.26(24H，m)，0.88(6H，t)圖10中示出二癸酰基環戊烯酮的1H-NMR譜。在圖10中，橫軸表示化學位移值(ppm)，縱橫表示信號的強度。
(14)將30mg環戊烯酮、16mgDMAP、66mg三乙胺(東京化成工業公司制造T0424)和122mg正戊酸酐(東京化成工業公司制造V0006)溶解在5.9ml的二氯甲烷中，在冰冷卻下反應1小時后，使用以氯仿∶甲醇＝200∶1作為展開溶劑的硅膠薄層色譜展開該反應液，從薄層中除去Rf＝0.7-0.8部分的硅膠，用氯仿萃取，得到二戊酰基環戊烯酮39mg。
與實施例1-(8)同樣，利用核磁共振對所得到的二戊酰基環戊烯酮進行結構分析，結果給出如下。1H-NMRδ7.45(1H，dd，J2-3＝6.11Hz，J3-4＝1.66Hz，H-3)、6.42(1H，dd，J2-3＝6.11Hz，J3-4＝1.66Hz，H-2)、5.91(1H，m，H-4)、5.16(1H，d，J4-5＝2.97Hz，H-5)、2.43(2H，dd，J＝7.59，7.59Hz)、2.39(2H，dd，J＝7.59，7.59Hz)、1.65(4H，m)、1.38(4H，m)、0.93(6H，dd，J＝7.26，7.26Hz)圖11中示出二戊酰基環戊烯酮的1H-NMR譜。在圖11中，橫軸表示化學位移值(ppm)，縱橫表示信號的強度。
(15)將30mg環戊烯酮、16m DMAP、66mg三乙胺和86mg丙酸酐(東京化成工業公司制造P0513)溶解在5.9ml的二氯甲烷中，在冰冷卻下反應1小時，使用以氯仿∶甲醇＝200∶1作為展開溶劑的硅膠薄層色譜展開該反應液，從薄層中除去Rf＝0.5-0.6部分的硅膠，用氯仿萃取，得到二丙酰基環戊烯酮31mg。
與實施例1-(8)同樣，利用核磁共振對所得到的二丙酰基環戊烯酮進行結構分析，結果給出如下。1H-NMRδ7.45(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝2.15Hz，H-3)、6.42(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝1.49Hz，H-2)、5.91(1H，m，H-4)、5.16(1H，d，J4-5＝2.97Hz，H-5)、2.46(2H，dd，J＝15.01，7.59Hz)、2.42(2H，dd，J＝15.01，7.59Hz)、1.18(6H-，dd，J＝7.59，7.59Hz)圖12中示出二丙酰基環戊烯酮的1H-NMR譜。在圖12中，橫軸表示化學位移值(ppm)，縱橫表示信號的強度。
(16)將2g環戊烯酮、733mg DMAP、4.1ml反式-2-己烯酸(東京化成工業公司制造H0383)和5.57g DCC溶解在200ml的二氯甲烷中，室溫下反應2小時。使用以己烷∶乙酸乙酯＝8∶1作為溶劑的硅膠柱色譜分離該反應液，得到在硅膠薄色譜上顯示單一斑點的級分。減壓濃縮該級分，得到油狀的二-2-己烯酰基環戊烯酮約900mg。
與實施例1-(8)同樣，利用核磁共振對所得到的二-2-己烯酰基環戊烯酮進行結構分析，結果給出如下。1H-NMRδ0.92(6H，m，11-H+11’-H)、1.48(4H，m，10-H+10’-H)、2.18(4H，m，9-H，9’-H)、5.22(1H，d，J＝3.0Hz，5-H)、5.85(2H，m，7-H+7’-H)、5.98(1H，m，4-H)、6.41(1H，dd，J＝1.0，6.0Hz，2-H)、7.04(2H，m，8-H+8’-H)、7.47(1Hdd，J＝2.0，6.0Hz，3-H)另外，將在環戊烯酮的5位上鍵合的2-己烯酰基的碳原子規定為從羰基起順序為6位～11位，將在環戊烯酮的4位上鍵合的2-己烯酰基的碳原子規定為從羰基起順序為6’位～11’位。
圖13中示出二-2-己烯酰基環戊烯酮的1H-NMR譜。在圖13中，橫軸表示化學位移值(ppm)，縱橫表示信號的強度。
實施例2將二乙酰基環戊烯酮、二乙酰基(-)-環戊烯酮、二乙酰基(+)-環戊烯酮、二苯甲酰基環戊烯酮、二苯甲酰基(-)-環戊烯酮、二苯甲酰基(+)-環戊烯酮、二己酰基環戊烯酮、二肉豆蔻酰基環戊烯酮、二辛酰基環戊烯酮、二-3-辛烯酰基環戊烯酮、二辛酰基環戊烯酮、辛烯酰基環戊烯酮、二丁酰基環戊烯酮、二癸酰基環戊烯酮、二戊酰基環戊烯酮、二丙酰基環戊烯酮和二-2-己烯酰基環戊烯酮各自和1mM乙醇溶液用70％乙醇水溶液稀釋。
將各稀釋液5μl裝入96孔微量滴定板的加樣孔中，風干后，在各加樣孔中添加含有5000各HL-60細胞(ATCC CCL-240)的含10％胎牛血清的RPMI1640培養基100μl，在5％二氧化碳存在下37℃培養48小時。用光學顯微鏡觀察細胞的形態，添加5mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)磷酸緩沖食鹽水溶液10μl，繼續培養4小時，然后用顯微鏡觀察細胞的發育狀況。另外，添加含有0.04N HCl的2-丙醇100μl，充分攪拌，測定590nm的吸光度，用以作為細胞增殖度。以觀察不到活細胞的、加樣孔的培養基中所含有的最小的環戊烯酮衍生物濃度作為細胞增殖抑制濃度。
結果示于表1中。
表1
在各細胞增殖抑制濃度下，細胞中形成細胞凋亡小體。另外，這些化合物的旋光物也顯示出同樣的癌細胞增殖抑制活性和細胞凋亡誘發作用。
實施例3將Staphylococcus aureus 3A(NCTC 8319、被檢驗菌①)、Bacillus subtilis IFO3021(被檢驗菌②)和Pseu DOMO NAS aeruginosa IFO3081(被檢驗菌③)用敏感性肉湯培養基(ニッスイ公司制造)培養1夜(種培養)。測定600nm的吸光度，根據預先對各菌株制成的、表示活菌數與600nm的吸光度關系的校正曲線計算出活菌數。用新鮮的敏感性肉湯培養基將培養液稀釋成1×106個/ml，在96孔微量滴定板的各孔中分別注入180μl。在各孔中分別加入20μl實施例1-(8)得到的二己酰基環戊烯酮的2000μg/ml、1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml水溶液或水，在37℃下靜置培養一夜(正式培養)。另外，將種培養液的一部分用滅菌水稀釋，涂布在敏感性肉湯瓊脂平板培養基上，在37℃下培養一夜后，計算菌落數，測定實際的活菌數。
將正式培養后各加樣孔中的培養液用滅菌水稀釋，涂布在敏感性內湯瓊脂平板培養基上，在37℃下培養一夜后，計算菌落數，測定實際的活菌數。
與添加水的加樣孔進行比較，以活菌數達到最少的最小濃度作為增殖抑制濃度，以活菌數比正式培養開始時減少的最小濃度作為殺菌濃度。結果示于表2中。
表2中的數值是二己酰基環戊烯酮對于被檢驗菌①-③顯示出增殖抑制作用和殺菌作用的培養液濃度，單位是μg/ml。
表2
由以上所述可以看出，二己酰基環戊烯酮具有很強的抗菌活性，另外，實施例1中制備的其它化合物以及它們的旋光物也顯示出與二己酰基環戊烯酮同樣的抗菌活性。
實施例4注射劑
(1)在生理食鹽水(與上述相同)中添加1％濃度的二乙酰基環戊烯酮或二己酰基環戊烯酮，制成注射劑。
(2)在生理食鹽水(與上述相同)中分別以0.5％和0.1％的濃度添加二苯甲酰基環戊烯酮或者二丁酰基環戊烯酮和甘草酸，制成注射劑。
實施例5片劑(1)制備含有100mg二苯甲酰基環戊烯酮和適量微結晶性纖維素的片劑，包上糖衣，制成片劑。
(2)制備含有0.1mg二乙酰基(-)-環戊烯酮、10mg甘草酸二鉀和適量微結晶性纖維素的片劑，包上糖衣，制成片劑。
發明的效果本發明提供了具有抗癌作用、癌細胞增殖抑制活性、細胞凋亡誘發作用和抗菌作用等生理活性的環戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽以及它們的制造方法。使用本發明得到的化合物作為有效成分的藥物可以維持生物體的正常狀態，是非常有用的藥品。
權利要求
1.由下列通式[I]表示的環戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽，
式中，R1和R2是相同或不同的直鏈或支鏈烷基、直鏈或支鏈鏈烯基、芳基或芳脂族基，但不包括R1＝R2＝-CH3的情況。
2.藥物，其特征是，含有選自權利要求1所述的環戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽中的至少一種化合物作為有效成分。
3.權利要求2所述的藥物，其中，所述的藥物是抗癌藥。
4.權利要求2所述的藥物，其中，所述的藥物是細胞凋亡誘發劑。
5.權利要求2所述的藥物，其中，所述的藥物是抗菌劑。
6.由通式[II]表示的環戊烯酮衍生物的制造方法，其特征是，使由下列[III]式表示的4，5-二羥基-2-環戊烯-1-酮和/或其旋光物與相當于由下列通式[II]表示的環戊烯酮衍生物的R3和R4的羧酸和/或其反應性衍生物同時或順次反應，
式中，R3和R4是相同或不同的直鏈或支鏈烷基、直鏈或支鏈鏈烯基、芳基或芳脂族基。
7.藥物，其特征是，含有選自用權利要求6所述方法得到的環戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽中的至少一種化合物作為有效成分。
8.權利要求7所述的藥物，其中，所述的藥物是抗癌藥。
9.權利要求7所述的藥物，其中，所述的藥物是細胞凋亡誘發劑。
10.權利要求7所述的藥物，其中，所述的藥物是抗菌劑。
全文摘要
5－(R
文檔編號C07C69/013GK1247528SQ98802459
公開日2000年3月15日 申請日期1998年2月26日 優先權日1997年3月11日
發明者小山信人, 豬飼勝重, 小林英二, 加藤郁之進 申請人:寶酒造株式會社