一種新的人蛋白及其編碼序列,及制法和用途的制作方法

專利名稱：一種新的人蛋白及其編碼序列,及制法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發明涉及人Rab18的cDNA序列，該蛋白是鼠Rab18的同系物。本發明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產方法。
在真核細胞內，膜泡運輸是胞內物質運輸的重要方式。細胞的內吞作用，胞吐作用，內質網與高爾基體之間、高爾基體各囊膜之間的物質運輸過程，以及高爾基體形成溶酶體的過程都是由各類運輸小泡介導的。運輸小泡以出芽的方式從供體膜上產生，然后通過與特定受體膜的融合，將小泡中包含的物質轉運到另一細胞器中或者實現細胞內外物質的交流。
一類低分子量的GTP/GDP結合蛋白Ypt/Rab蛋白在調節膜泡運輸過程中起著重要的作用。Ypt/Rab蛋白和Ras蛋白同屬于GTP/GDP結合蛋白超家族。它們在蛋白結構上存在四個與GTP/GDP結合作用相關的保守區域GXXXXGKS/T，DTAGQE，NKXD和SAK/L(Nature 1989，341(6239)209-214)。除此之外，在Ypt/Rab蛋白家族中，保守的位點還有DTAGQE區前的色氨酸，DTAGQE區后相距約10個氨基酸的精氨酸以及SAK/L區后的苯丙氨酸等。
在釀酒酵母(S.cerevisiae)中的Ypt/Rab家族成員共有11個(Ypt1，Sec4，Ypt31，Ypt32，Ypt51，Ypt52，Ypt53，Ypt6，Ypt7，Ypt10，Ypt11)(Trends Biochem Sci1997；22(12)468-472)；在哺乳動物中，已發現的Rab蛋白約有40個，如Rab1，Rab3，Rab8，Rab10，Rab30等。1993年，Yu，H.，Leaf，D.S.和Moore，H.-P.H.首先報導從小鼠神經內分泌細胞cDNA庫中首次分離了Rab18(Gene 1993，132(2)，273-278)。同年，Marja Agterberg等從蝸牛(Lymnaea stagnalis)的白蛋白(albumen)腺體cDNA庫中也分離到了小鼠Rab18的同源基因，兩者的氨基酸序列同一性為74％(Eur.J.Biochem.1993，217，241-246)，上述兩個基因都已被成功克隆，除此之外，還在Arabidopsis thaliana和Caenorhabditis briggsae中了也發現了Rab18的同源基因/蛋白。
Ypt/Rab蛋白家族成員的多樣性提示，不同的蛋白可能在不同的膜泡運輸途徑的不同步驟中發揮作用。已證明，Sec4蛋白參與了高爾基體分泌小泡向質膜的運輸過程(Cell 1987；49(4)527-538)，而Rab8被證明介導了極化的MDCK細胞中由TGN區向基底外側區的膜泡運輸(J Cell Biol 1993；123(1)35-45)。Rab1與從內質網到高爾基體順式面及隨后的從高爾基體順式面到中間高爾基體的囊泡運輸有關(J.Cell.Biol.1991，115，31-43)Rab3A可能在神經遞質的釋放有關(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990，87，1988-1992)。而Rab4和Rab5則參與了核內體的融合過程，并被認為控制了內吞過程的限制性步驟(Cell，1990，62，317-329；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1991，88，6313-6317；Cell，1992，70，729-740；Cell，1991，64，915-925；Cell，1992，70，715-728)。
Rab蛋白在介導膜泡運輸過程中還涉及到其它因子如GDP解離抑制因子(GDP-dissociation inhibitor，GDI)，GTP/GDP交換因子(GTP/GDP-exchangefactor，GEF)，GTP酶活化因子(GTPase-activating protein，GAP)，GDI置換因子(GDI-displacement factor，GDF)的共同作用。
在介導膜泡運輸中Rab蛋白的循環過程如下(a)在細胞質中，GDI與Rab-GDP結合，抑制了Rab蛋白非選擇性地與膜結合。(b)Rab-GDP在牻牛兒基牻牛兒基轉移酶(geranylgeranyltransferase，簡稱為“GGTase”)的作用下，使Rab蛋白C末端兩個半胱氨酸的異戊二烯化。異戊二烯化是Rab與質膜結合所必需的。GGTase包含兩個組分組分A又稱Rab護衛蛋白(Rab escort protein，REP)，此蛋白與未異戊二烯化的Rab蛋白結合并將其呈遞給催化組分B，催化組分B負責催化半胱氨酸的異戊二烯化。異戊二烯化的Rab蛋白在GIP作用下定位于特定的供體膜上(Cell 1993；73(6)1091-1099)。當Rab-GDP結合于供體膜上時，GDI在GDF作用下從Rab上解離下來。(c)在GEF催化作用下，GTP替換下了Rab上的GDP從而活化了Rab。(d)運輸小泡以出芽方式從供體膜上產生。(e)在GTP-Rab的介導下(或者還有受體膜上的效應分子的共同作用下)，運輸小泡與受體膜結合，GTP在GAP催化下發生水解。(f)GDI與受體膜上的Rab結合，將Rab重新釋放到細胞質中。(Peter Novick，1997)1993年Culine S.等報道，在Sezary綜合征病人的外周血單核細胞中Rab2表現為過度表達，這提示Rab2可能在腫瘤發生的免疫反應中發生作用(LeukLymphoma 1998；28(5-6)515-522)。Sezary綜合征是一類皮膚T細胞淋巴瘤疾病，癥狀表現為分化完全的TH記憶細胞在皮膚組織和血液、淋巴結中的積累(Cancer Res 1992；52(11)3083-3088)。
然而，在本發明之前沒有關于人類Rab18基因的報道。
本發明的一個目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼Rab/Ypt家族的一個新成員，本發明的Rab/Ypt家族成員被命名為人Rab18。
本發明的另一個目的是提供一種新的人的Rab/Ypt家族成員，該蛋白被命名為人Rab18蛋白。
本發明的再一個目的是提供一種利用重組技術生產所述的新的人的Rab18多肽的方法。
本發明還提供了這種人的Rab18核酸序列和多肽的應用。
在本發明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人Rab18蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸30-650位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸30-650位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸30-650位的核苷酸序列。
在本發明的另一方面，提供了一種分離的人Rab18蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本發明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發明的另一方面，提供了一種所述載體轉化的宿主細胞。
在本發明的另一方面，提供了一種產生具有人Rab18蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有人Rab18蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，形成人Rab18蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸30-650位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成人Rab18蛋白的重組細胞；(c)在適合表達人Rab18蛋白多肽的條件下，培養步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有人Rab18蛋白活性的多肽。
在本發明的一個具體實施方案中，本發明的分離的多核苷酸全長為818個核苷酸，其詳細序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于30-650位核苷酸。
在本發明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
在本發明中，術語“人Rab18蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人RAB18蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中30-650位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框30-650位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.3中30-650位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.4所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳地在高度嚴緊條件下，與SEQ ID NO.3中從核苷酸30-650位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還術語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸30-650位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與人Rab18相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
在本發明中，“基本純的”蛋白質或多肽是指其至少占樣品總物質的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態下的伴隨其的組分。
在本發明中，術語“人Rab18蛋白或多肽”指具有人Rab18蛋白活性的SEQID NO.4序列的多肽。該術語還包括具有與人高效淋巴細胞趨化因子相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括人Rab18蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與人Rab18 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人Rab18多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含人Rab18多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了人Rab18多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人Rab18多肽序列的至少約10個連續氨基酸，通常至少約30個連續氨基酸，較佳地至少約50個連續氨基酸，更佳地至少約80個連續氨基酸，最佳地至少約100個連續氨基酸。
發明還提供人Rab18蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人Rab18多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，“人Rab18保守性變異多肽”指與SEQ ID No.4的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行氨基酸替換而產生。
表1
本發明還包括人Rab18多肽編碼序列及其片段的反義序列。這種反義序列可用于抑制細胞內人Rab18的表達。
本發明還包括一種可用作探針或引物的核酸分子，該分子通常具有人Rab18多肽編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼人Rab18的核酸分子。
本發明還包括檢測人Rab18核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產物，其中PCR擴增引物對應于人Rab18多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發明多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，可以形成蛋白表達載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發明中，術語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS細胞等。
另一方面，本發明還包括對人Rab18 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于人Rab18基因產物或片段。較佳地，指那些能與人Rab18基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合并抑制人Rab18蛋白的分子，也包括那些并不影響人Rab18蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的人Rab18基因產物結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的人Rab18基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達人Rab18或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發明的抗體包括能阻斷人Rab18功能的抗體以及不影響人Rab18功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用人Rab18基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人Rab18基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
本發明的人Rab18核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按已知方法制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆人載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
在本發明中，人Rab18的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人肝臟λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用兩對寡核苷酸為引物——A15’-AGCTGGGCTCGGAGCGGAACG-3′為正向引物，寡核苷酸A25′-TCGATGGAGTGGGGATT(T/C)CTTGG-3’為反向引物，進行PCR。測序后得到SEQ ID NO.3的全長cDNA序列。
研究表明，Rab/Ypt家族調控了真核細胞內的膜泡運輸。Rab/Ypt家族成員的多樣性提示，不同成員在膜泡運輸的不同途徑不同步驟中發揮作用。本發明的人類Rab18提供了對Rab/Ypt家族不同成員在調節膜泡運輸中作用的研究的新途徑。
在附圖中，

圖1為本發明的人Rab18蛋白(下方)與小鼠Rab18蛋白(上方)氨基酸序列的同源比較圖。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用“|”標出，相似的氨基酸用“·”標出。相似的氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。圖中，用下劃線標出的是GTP-結合域和效應子結構域(effector domain)。用斜體標出的第44位和102位的F和W是在Rab蛋白中極其保守的氨基酸殘基，但是在其他與Rab相關的GTP-結合蛋白中并不很保守。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1人Rab18的cDNA序列的克隆和測定1.引物擴增以人肝臟λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物——A15’-AGCTGGGCTCGGAGCGGAACG-3’(SEQ ID NO1)為正向引物，寡核苷酸A25’-TCGATGGAGTGGGGATT(T/C)CTTGG-3’(SEQ IDNO2)為反向引物(注引物A2中“(T/C)”表示使用的是兩種引物的混合物，它們在該位置上個別為T或C)，進行PCR。A1/A2的PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、68℃1分鐘和72℃1分鐘進行35個循環，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到約800多堿基對的目的片段。
2.PCR產物的測序將上述PCR擴增產物A1/A2與pGEM-T載體(Promega)連接，轉化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進行定向系列缺失，然后用PCR對缺失子進行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進行測序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共818bp，詳細序列見SEQ ID NO3，其中開放讀框位于30-650位核苷酸。
根據得到的全長基因組序列推導出人Rab18的氨基酸序列，共206個氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO4。
實施例2同源比較用本發明的人Rab18的全長cDNA序列及其編碼蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB數據庫及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數據庫中，用BLAST程序進行核酸和蛋白同源檢索。結果發現與Rab/Ypt家族基因及其編碼蛋白具有廣泛的同源性，用PCGENE軟件比較，發現人Rab18與小鼠Rab18基因在蛋白水平上的同一性高達99％(圖1)。另外，與其它物種的Rab10基因/蛋白也具有較高同源性。氨基酸保守區分析表明本發明的人Rab18蛋白與其同系物在蛋白結構上存在四個與GTP/GDP結合作用相關的保守區域GXXXXGKS/T，DTAGQE，NKXD和SAK/L(Nature 1989；341(6239)209-214)(圖1中標出的結構域I-IV)，因此，本發明的人Rab18蛋白可歸入GTP/GDP結合蛋白超家族。此外，與小鼠Rab18蛋白一樣，人Rab也具有相同的效應子結構域(圖1)。除此之外，本發明的人Rab18蛋白還具有Ypt/Rab蛋白家族特異保守位點如DTAGQE區前的色氨酸，DTAGQE區后距離約10個氨基酸距離的精氨酸以及SAK/L區后的苯丙氨酸等(圖1)。
因此本發明的人Rab18基因是小鼠Rab18基因在人體中的同系物，是Rab/Ypt個家族的一個成員，所以可以從本家族成員的基因或蛋白的功能來推測本發明的人類Rab18的功能，而且，與鼠Rab18的高度同源性提示人Rab18具有與鼠Rab18相似或相同的功能。
Ypt/Rab蛋白家族成員的多樣性提示，不同的蛋白可能在不同的膜泡運輸途徑的不同步驟中發揮作用。研究表明，Sec4蛋白參與了高爾基體分泌小泡向質膜的運輸過程(Cell 1987；49(4)527-538)，而Rab8被證明介導了極化的MDCK細胞中由TGN區向基底外側區的膜泡運輸(J Cell Biol 1993；123(1)35-45)。Rabl與從內質網到高爾基體順式面及隨后的從高爾基體順式面到中間高爾基體的囊泡運輸有關(J.Cell.Biol.1991，115，31-43)Rab3A可能在神經遞質的釋放有關(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990，87，1988-1992)。而Rab4和Rab5則參與了核內體的融合過程，并被認為控制了內吞過程的限制性步驟(Cell，1990，62，317-329；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1991，88，6313-6317；Cell，1992，70，729-740；Cell，1991，64，915-925；Cell，1992，70，715-728)。
對于有極性的表皮細胞來說，在其頂部和底側產生和維持不同的蛋白和脂類的組成對于這一類細胞的功能是至關重要的(J.Cell.Biol.1990，111，987-1000)。與非極性細胞相比，表皮細胞具有獨特的頂端和底側傳送通路(apical andbasolateral transport pathway)，因而探究在這類細胞中是否存在特殊的Rab家族成員就成了一個令人感興趣問題。對小鼠的研究發現，在表皮細胞中存在了兩個表皮細胞特異表達的Rab蛋白D DRab17和Rab18。其中，Rab18在腎小球表皮細胞中較富集，并可進一步被定位于頂端密集小管處；然而，值得注意的是，Rab18在胰腺表皮細胞的頂端和底側都有表達(J.Cell.Sci.1994，107，3437-3448)。綜上所述，Rab18很可能在產生和維持細胞極性方面發揮作用。
小鼠的Rab18基因被定位于18號染色體，在測量誤差允許的范圍內，Rab18的座位與Tw(twirler)和ax(ataxia)這兩個突變的座位是一致的。Tw雜合子小鼠顯示出搖頭、轉圈、內耳失調、前庭核和小腦星狀細胞凋亡(astrocytosis)；ax純合子小鼠則腦發育不良，并表現出進行性的協調能力喪失和震顫。并且，一些Rab蛋白在器官發育中穩定表達，而另一些則在發育后期被誘導，所以該家族基因，特別是Rab18的突變有可能在上述疾病的過程中起作用(Genomics，1997，45，623-625)。
本發明的人Rab18除了可作為該家族一員用于進一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產生融合蛋白。此外，本發明人Rab18還可以與該家族的其他成員進行融合或交換片段，以產生新的蛋白。例如將本發明人Rab18的C端與小鼠或其他物種的Rab18的C端進行交換，以產生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發明的人Rab18的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關蛋白(如該家族的其他成員)。
例如，本發明的人Rab18核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細胞，以提高人Rab18的表達水平或者抑制人Rab18的過度表達。本發明的人Rab18蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人Rab18缺失、無功能或異常而導致的有關病癥。此外，還可以用基于本發明的核酸序列或抗體進行有關的診斷或預后判斷。
實施例3人Rab18在大腸桿菌中的表達在該實施例中，以實施例1中的PCR產物為模版，將編碼人Rab18的cDNA序列用對應于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得人Rab18 cDNA作為插入片段。
PCR反應中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TCAGGTCGACATGGACGAGGACGTGCTAAC-3′(SEQ ID NO.5)，該引物含有SalI限制性內切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是由起始密碼子開始的人Rab18編碼序列的19個核苷酸；3′端引物序列為5’-AAGGAAGCTTTTATAACACAGAGCAATAAC-3’(SEQ ID NO.6)，該引物含有HindIII限制性內切酶的酶切位點、翻譯終止子和人Rab18的部分編碼序列。
引物上的限制性內切酶的酶切位點對應于細菌表達載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內切酶酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細菌復制起點(ori)、一個IPTG-可調啟動子/操縱子(P/O)、一個核糖體結合位點(RBS)、一個6-組氨酸標記物(6-His)以及限制性內切酶克隆位點。
用SalI和HindIII消化pQE-9載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細菌RBS起始。隨后用連接混合物轉化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質粒pREP4，其表達lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養皿上篩選轉化子，抽提質粒，測序驗證人Rab18的cDNA片段已正確插入了載體。
在補加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養基中過夜培養(O/N)含所需構建物的陽性轉化子克隆。過夜(O/N)培養物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養基中，培養細胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導啟動P/O導致基因表達水平提高。繼續培養細胞3-4小時，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細胞并將細胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標記物蛋白緊密結合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的人Rab18。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫人Rab18。可用幾種方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白。或者，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白。純化后的蛋白質被結合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結合到該柱時蛋白質變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質用PBS進行透析，然后將蛋白質保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達蛋白的分子量大小為約23KDa。
此外，用常規方法對達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發現與SEQ ID NO.4的序列一致。
實施例4人Rab18在真核細胞(CHO細胞株)中的表達在該實施例中，以實施例1中的PCR產物為模版，將編碼人Rab18的cDNA序列用對應于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得人Rab18 cDNA作為插入片段。
PCR反應中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TCAGAAGCTTATGGACGAGGACGTGCTAAC-3′(SEQ ID NO.7)該引物含有HindIII限制性內切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是由起始密碼子開始的人Rab18編碼序列的20個核苷酸；3′端引物序列為5’-AAGGGAGCTCTTATAACACAGAGCAATAAC-3’(SEQ ID NO.8)
該引物含有SacI限制性內切酶的酶切位點、一個翻譯終止子和人Rab18的部分編碼序列。
引物上的限制性內切酶的酶切位點對應于CHO細胞表達載體pcDNA3上的限制性內切酶酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個噬菌體復制起點(fl ori)、一個病毒復制起點(SV40 ori)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)、一個Sp6啟動子、一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應的polyA順序。
用BamHI和XbaI消化pcDNA3載體，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養皿上篩選轉化子，在補加Amp(100μg/ml)的LB液體培養基中過夜培養(O/N)含所需構建物的克隆。抽提質粒，用ApaI酶切鑒定插入片段大小及方向，并測序驗證人Rab18的cDNA片段已正確插入了載體。
質粒轉染CHO細胞是采用脂轉染法，用Lipofectin(GiBco Life)進行的。轉染48小時后，經2-3周的持續G418加壓篩選，收集細胞及細胞上清測定表達蛋白酶活力。去G418，連續傳代培養；對混合克隆細胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細胞亞克隆。按常規方法大量培養上述陽性亞克隆。48小時后，開始收集細胞及上清，用超聲裂解方法破碎細胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經預平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對表達蛋白溶液進行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達蛋白的分子量大小為23KDa。
此外，用常規方法對達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發現與SEQ ID NO.4的序列一致。
實施例5制備抗體將實施例3和4中獲得的重組蛋白用來免疫動物以產生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進行腹膜內注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應活性用它在體外沉淀人Rab18基因翻譯產物的能力加以評估。結果發現，抗體可特異性地與本發明蛋白特異性地發生沉淀。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形序列表(1)一般信息(i)申請人復旦大學(ii)發明名稱一種新的人蛋白及其編碼序列，及制法和用途(iii)序列數目8(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度21堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1AGCTGGGCTC GGAGCGGAAC G 21(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2TCGATGGAGT GGGGATT(T/C)CT TGG 23(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征
(A)長度818bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)序列描述SEQ ID NO.3AGCTGGGCTC GGAGCGGAAC GGGGTCAGGA TGGACGAGGA CGTGCTAACC ACCCTGAAGA 60TCCTCATCAT CGGCGAGAGT GGGGTGGGCA AGTCCAGCCT GCTCTTGAGG TTCACAGATG 120ATACGTTTGA TCCAGAACTT GCAGCAACAA TAGGTGTTGA CTTTAAGGTG AAAACAATTT 180CAGTGGATGG AAATAAGGCT AAACTTGCAA TATGGGATAC TGCTGGTCAA GAGAGGTTTA 240GAACATTAAC TCCCAGCTAT TATAGAGGTG CACAGGGTGT TATATTAGTT TATGATGTCA 300CAAGAAGAGA TACATTTGTT AAACTGGATA ATTGGTTAAA TGAATTGGAA ACATACTGTA 360CAAGAAATGA CATAGTAAAC ATGCTAGTTG GAAATAAAAT CGATAAGGAA AATCGTGAAG 420TCGATAGAAA TGAAGGCCTG AAATTTGCAC GAAAGCATTC CATGTTATTT ATAGAGGCAA 480GTGCAAAAAC CTGTGATGGT GTACAATGTG CCTTTGAAGA ACTTGTTGAA AAGATCATTC 540AGACCCCTGG ACTGTGGGAA AGTGAGAACC AGAATAAAGG AGTCAAACTG TCACACAGGG 600AAGAAGGCCA AGGAGGAGGA GCCTGTGGTG GTTATTGCTC TGTGTTATAA ACTCTGGGAA 660ATTCCATCTC TTGCATATTT GGATCCAGAT AGTTGACATC TTTCTGTATA TTAAACTCTT 720TTAACTGCTA ATTTTAGGGG ACCTTGGCAG TTTGCACATA ATTGGTTTTA TATCCATAGC 780CAGTTAAATA TTTTGCCAAG AAATCCCCAC TCCATCGA 818(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長度206個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.4Met Asp Glu Asp Val Leu Thr Thr Leu Lys Ile Leu Ile Ile Gly 15Glu Ser Gly Val Gly Lys Ser Ser Leu Leu Leu Arg Phe Thr Asp 30Asp Thr Phe Asp Pro Glu Leu Ala Ala Thr Ile Gly Val Asp Phe 45Lys Val Lys Thr Ile Ser Val Asp Gly Asn Lys Ala Lys Leu Ala 60Ile Trp Asp Thr Ala Gly Gln Glu Arg Phe Arg Thr Leu Thr Pro 75Ser Tyr Tyr Arg Gly Ala Gln Gly Val Ile Leu Val Tyr Asp Val 90Thr Arg Arg Asp Thr Phe Val Lys Leu Asp Asn Trp Leu Asn Glu 105Leu Glu Thr Tyr Cys Thr Arg Asn Asp Ile Val Asn Met Leu Val 120Gly Asn Lys Ile Asp Lys Glu Asn Arg Glu Val Asp Arg Asn Glu 135Gly Leu Lys Phe Ala Arg Lys His Ser Met Leu Phe Ile Glu Ala 150Ser Ala Lys Thr Cys Asp Gly Val Gln Cys Ala Phe Glu Glu Leu 165Val Glu Lys Ile Ile Gln Thr Pro Gly Leu Trp Glu Ser Glu Asn 180Gln Asn Lys Gly Val Lys Leu Ser His Arg Glu Glu Gly Gln Gly 195Gly Gly Ala Cys Gly Gly Tyr Cys Ser Val Leu 206(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)長度30堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.5TCAGGTCGAC ATGGACGAGG ACGTGCTAAC 30(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)長度30堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6AAGGAAGCTT TTATAACACA GAGCAATAAC 30(2)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)長度30堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.7TCAGAAGCTT ATGGACGAGG ACGTGCTAAC30(2)SEQ ID NO.8的信息(i)序列特征(A)長度30堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.8AAGGGAGCTC TTATAACACA GAGCAATAAC30
權利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人Rab18蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸30-650位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸30-650位的核苷酸序列雜交。
2.如權利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如權利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸30-650位的核苷酸序列。
4.一種分離的人Rab18蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權利要求1所述的DNA。
7.一種用權利要求6所述載體轉化的宿主細胞。
8.如權利要求7所述的宿主細胞，其特征在于，該細胞是大腸桿菌。
9.如權利要求7所述的宿主細胞，其特征在于，該細胞是真核細胞。
10.一種產生具有人Rab18蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有人Rab18蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，形成人Rab18蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸30-650位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成人Rab18蛋白的重組細胞；(c)在適合表達人Rab18蛋白多肽的條件下，培養步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有人Rab18蛋白活性的多肽。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，該序列為SEQ ID NO.3中從核苷酸30-650位。
12.一種能與權利要求4所述的人Rab18蛋白多肽特異性結合的抗體。
13.一種核苷酸分子，其特征在于，它是權利要求1所述DNA分子的反義序列。
14.一種探針分子，其特征在于，它含有權利要求1所述的DNA分子中8-100個連續核苷酸。
全文摘要
本發明提供了一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說,本發明提供了人Rab18的cDNA序列,該蛋白是鼠Rab18的同系物。本發明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽,這些多核苷酸和多肽的應用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生產方法。
文檔編號C07K14/47GK1255549SQ9812205
公開日2000年6月7日 申請日期1998年11月30日 優先權日1998年11月30日
發明者余龍, 張宏來, 屠強, 趙勇, 趙壽元 申請人:復旦大學