專利名稱：從蓮子心中提取純化異蓮心堿和蓮心堿的制備方法
技術領域：
本發明涉及醫藥制備方法，特別是植物藥的提取純化方法。
我國心腦血管疾病發生率及死亡率居各病之首，呈逐年上升趨勢，高血壓卒中、心律失常、心肌梗死、心衰的死亡率尤高。常用中藥蓮子心“清心火、固精血”，其中具有心血管活性的主要物質為異蓮心堿(Isoliensinine)、[王嘉陵等.中國藥學雜志1992；27(6)359]、蓮心堿(Liensinine)[陳維洲等.藥學學報1962；9(5)277-279][熊一力，王嘉陵等.中國心血管雜志1998，(1)，6-9]和甲基蓮心堿(Neferine)[胡文淑等.中國藥理與毒理學雜志1992；(2)107-109][史宵燕，王嘉陵等.中國藥師1998；1(2)51]，它們屬雙芐基異喹啉類；具有抗Ca++、抗心律失常、擴張血管、抗羥自由基、抑制血小板聚集和血栓形成等作用；可用于治療高血壓、心律失常、缺血性心肌病、腦血管病等。[3H]-硫氮卓酮受體結合實驗證明，異蓮心堿和蓮心堿抗Ca++作用強度高于粉防己堿10多倍，與硫氮卓酮相當。
蓮子心中異蓮心堿含量相對較低，文獻中均前期采用溶劑萃取法獲得脂溶性總堿，再用層析法分離其單體(制備性高效液相法、制備性薄層或柱層析法)，費時耗功，成本昂貴，收得率較低，不適合于工業化生產應用；異蓮心堿為蓮心堿(Liensinine)的同分異構體，兩者化學性質十分相似，難于用溶劑萃取法結合成鹽法分離；文獻中除僅見蓮心堿可制成高氯酸鹽外[Chao Tse-Yuan et al.Scientia Sinica 1962；11(2)215][Pan Pei-Chuan et al.Sinica1962；11(3)321]，未見其它報導。蓮子心中生物堿具有藥用價值已為公認，但其單體生物堿提取的困難則是困擾其開發應用的主要障礙。
本發明的目的是提供一種低成本、高收得率、優質、適合于工業化生產的從蓮子心中提取、純化異蓮心堿(Isoliensinine)和蓮心堿(Liensinine)的制備方法。
本發明提供的從蓮子心中提取純化異蓮心堿和蓮心堿的制備方法的具體方案是(1)從蓮子心中提取以甲基蓮心堿、異蓮心堿、蓮心堿為主要堿的非水溶性總堿；其特征在于(2)從所得的非水溶性總堿中分離出含有異蓮心堿和蓮心堿的強酚性總堿；(3)以結晶法分離強酚性總堿得異蓮心堿和蓮心堿。
下面通過具體實施例對本發明方法作進一步說明。
說明書附圖
為本發明實施例的工藝流程圖。
實施例1以湖北產蓮子心為原料(從湖北省洪湖市蓮心加工廠購得)，首先擇凈、干燥蓮子心8kg，預先用適量3％Na2cO3(約100ml/kg生藥)浸潤濕，再加入適量(約4000ml/kg)甲醇(或乙醇)于室溫下浸泡一周，連續浸泡三次。合并甲醇浸泡液，回收甲醇，殘留液用3％鹽酸調pH至2_3，過濾，濾液用乙醚脫脂，并繼續以下步驟1.非水溶性總生物堿的分離將上述脫脂后酸性溶液，用濃氨水調pH至9左右，用氯仿提取各5000ml×3次，回收氯仿，蒸餾水洗至近中性，回收氯仿，得非水溶性總堿54.4g。
2.強酚性總堿的分離將總堿54.4g溶于1％氫氧化鈉中，用氯仿提取1500ml×1次，得氫氧化鈉層，用氯化銨調節pH至9，有大量沉淀析出，用乙醚萃取2500ml×5次，乙醚層用蒸餾水洗至中性，回收乙醚，殘留物經真空干燥后，得強酚性總堿29.4g。
3.結晶法分離異蓮心堿和蓮心堿將酚性總堿溶于無水甲醇中，冰水浴上降溫至4℃，用高氯酸調節pH至2_3，靜置于冰箱中(4℃)結晶，濾取結晶，甲醇(或乙醇)中反復結晶，得蓮心堿高氯酸鹽，白色結晶。游離成堿，得蓮心堿。
將過濾除去結晶(蓮心堿高氯酸鹽)之母液，用氨水調pH至大量沉淀析出，乙醚萃取500ml×3次(或氯仿萃取500ml×2次)，乙醚層經蒸餾水洗至中性，回收乙醚，殘留物經真空干燥后得無定型粉末。溶于苯和乙酸乙酯混合溶劑中(95∶5)，加入濃鹽酸，調節pH至2_3，4℃靜置析晶，濾取結晶，水中反復結晶，得異蓮心堿鹽酸鹽，白色針型結晶。游離成堿，得異蓮心堿。
本發明方法提取物質的確認(理化及波譜鑒定)(1)異蓮心堿主要理化常數及波譜數椐白色無定型粉末(乙醚)，MP70-72℃；異蓮心堿鹽酸鹽(水)白色針型結晶，MP195-197℃。Rf值為0.52(硅膠G-CMC-Na板，苯∶乙酸乙酯∶二乙胺 7∶2∶1展開)，254nm紫外光照射，顯蘭色熒光。UVλmax95％EtOHnm 284.5，256.4nm。IRVmaxKBrcm-1，3450(-OH)、2960、1620、1520、1252、1125。MS M/Z609(M-1)、489、297、266、192、177、148、121、77、42。NMR(CDCl3)δppm2.49、2.37(各3H，2×N-CH3)；3.78(6H，2×O-CH3)；3.72(3H，O-CH3)6.00(2H，寬峰2×-OH)，6.92-6.31(11H，芳-H)。上述數據與文獻[M.Tomita et al.TetrahedronLettersNo.37 1964；2637-2642][郭毛娣等. 中草藥 1984；15(7)291][潘競先等.北京醫利大學學報1989；21(5)401][王嘉陵等.中國中藥雜志1991；16(11)673-675]相符，故可確定為異蓮心堿(Isoliensinine)，其化學名苯酚，-4-[(1，2，3，4-四氫-6-甲氧基-7-羥基-2-甲基-1-異喹啉)]甲基-2-[(1，2，3，4-四氫-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-6-甲氧基-2-甲基-7-異喹啉)氧基]-，[R-(R*，R*)]；分子量為610.72；分子式為C37H42N2O6；化學結構式為
高效液相及薄層掃描本法提取之異蓮心堿含量為93_96％。
高效液相Water’s公司810型，YWG18柱，流動相甲醇∶磷酸鉀鹽緩沖液(73∶27)，三乙胺調pH至9；柱溫28℃，流速1.0ml/min，泵壓5000Psi。與標準品比較，異蓮心堿含量92_95％。
薄層掃描CS-930型掃描儀，反射法測定，信號經計算機自動積分并給出曲線下面積，λmax287nm，薄層法及條件同上證實與標準品比較，異蓮心堿含量94_97％。
(2)蓮心堿主要理化常數及波譜數椐白色無定型粉末(乙醚)，MP95-98℃，Rf值為0.42(硅膠G-CMC-Na板，苯∶乙酸乙酯∶二乙胺7∶2∶1展開)，254nm紫外光照射，顯蘭色熒光。UVλmax95％EtOHnm282.4，，277.3，250.3nm；IRVmaxKBrcm-1，3440，2940、1610、1510、1250、1120。MS M/Z611(M+1)、503、297、206、192、176、162、146、107。NMR(CDCl3)δppm2.57、2.54(各3H，單峰2×N-CH3)；3.42、3.83、3.89(各3H，單峰3×O-CH3)，6.48-7.02(11H，多重峰，11個芳-H)。所得數據與文獻[Chao Tse-Yuan et al.ScientiaSinica 1962；11(2)215][Pan Pei-Chuan et al. Scicntia Sinica1962；11(3)321S][郭毛娣等.中草藥 1984；15(7)291][潘競先等.北京醫科大學學報1989；21(5)401][張先洲，王嘉陵等.藥物分析雜志1991；11(3)183][王嘉陵等.中國中藥雜志1991；16(11)673-675][古川宏.他.藥學雜志(日)1965；85(4)353][吳繼洲王嘉陵等.中草藥1998 29(6)364]相符，故確定為蓮心堿(Liensinine)，其英文名為Liensinine；其化學名為苯酚，-4-[(1，2，3，4-四氫-6，7-二甲氧基-2-甲基-1-異喹啉)]甲基-2-[(1，2，3，4-四氫-1-[(4-羥苯基)甲基]-6-甲氧基-2-甲基-7-異喹啉)氧基]-，[R-(R*，R*)]；分子量610.0；分子式為C37H42N2O6；化學結構式為
高效液相(條件同上)及薄層掃描(λ290nm，條件同上)證實與標準品比較，本法提取之蓮心堿含量為88-93％。
實施例2最佳非水溶性總堿提取法的比較。
分別采用苯苯浸出法、甲醇浸出法、甲醇回流法、0.5％鹽酸水浸出法，以非水溶性總堿提取物重量為指標，對最佳非水溶性總堿提取方案進行了對比。每法取5個樣本，每樣本稱取蓮子心生藥50克，全部實驗取同一批號蓮子心生藥，室溫下浸泡6天，連續浸泡3次，或回流8小時，連續3次，減壓回收溶劑。總堿提取采用0.5％鹽酸溶解，過濾除去非生物堿部分，酸性濾液用濃氨水調Ph至9左右，充分產生絮狀沉淀，氯仿萃取5次，回收氯仿，殘留物(即非水溶性總堿提取物)干燥稱重。結果列表如下不同方法提取的總堿含量比較(X±SD，n＝5)
比較的結果是，甲醇浸出法效率最高，且穩定性好。
實施例3
分別以江西瑞昌、湖南岳陽出產的蓮子心為原料，按照實施例1所述的提取工藝步驟，得到與實施例1相同的結果。
本發明提供的從蓮子心中提取、純化異蓮心堿和蓮心堿的方法，與現有的前期采用溶劑萃取法獲得脂溶性總堿，再用層析法分離其單體(制備性高效液相法、制備性薄層或柱層析法)的方法相比，具有成本低、收得率高、品質優——含量大于90％、適合于工業化生產等突出的優點。
異蓮心堿(Isoliensinine，IL)抗實驗性心律失常作用及機制研究結果與結論。
一、異蓮心堿(Isoliensinine，IL)抗實驗性心律失常作用1.IL對哇巴因誘發的豚鼠心律失常的影響哇巴因誘發心律失常劑量DrugsVP(μg/kg) VF(μg/kg)lethal(μg/kg)(mg/kg)NS 182.8±20.8278.1±59.0 332.4±64.3Qui5235.6±26.8329.4±39.9 365.0±47.6IL1.25 216.7±64.0319.2±57.8 364.4±44.7IL2.5 288.8±66.5374.8±37.3 402.7±33.32.IL對CaCl2(3.5％CaCl2，14mg/kg，iv，10s)誘發的大鼠心律失常的作用組別 例數室顫死亡存活數NS 8 7 7 1IL5mg/kg8 1 1 73.IL對冠脈結扎復灌誘發的大鼠心律失常的作用藥物 例數室顫死亡心律失常(mg/kg) 發生數/持續時間(min)NS 8 6 2 7/12.8±5.1Qui 8 8 1 0 6/6.1±4.8**IL 3 8 0 0 2/1.5±0.7**
4.IL對Adr(0.01％Adr，0.06ml/kg，iv，5s)誘發的家兔心律失常的影響藥物 例數心律失常(mg/kg) 發生數/持續時間(min)NS 8 8/3.2±1.2Qui 8 8 6/1.8±0.6*IL 3 8 8/0.64±1.1**5.IL對烏頭堿誘發的大鼠心律失常的影響烏頭堿誘發的心律失常劑量(μg/kg)Drugs(mg/kg) 室速及室顫死亡NS 42.8±4.6 153.8±51.4Qui 5 46.6±4.2 216.4±53.6IL 2.5 42.7±5.8 181.7±68.4二、異蓮心堿(Isoliensinine，IL)心肌細胞動作電位的作用1.異蓮心堿(Isoliensinine，IL)對離體豚鼠心肌細胞動作電位的影響IL(1-100μmol/L)可劑量依賴性地降低離體豚鼠右心室乳頭肌細胞動作電位的APD20，而對其他指標幾乎無作用。這與對照藥維拉帕米相似。表明其有抗鈣劑樣作用。
表IL對離體豚鼠右心室乳頭肌細胞動作電位的影響Isolinsinine(μmol/L)Paramters01310 30100Vmax(V/s) 183.2±62.6 178.5±62.3 170.5±65.2 155.4±63.6151.4±59.6146.8±45.7OS(mV) 28.3±10.1 27.8±13.326.4±13.326.1±14.1 25.3±14.1 23.8±11.9RP(-mV) 83.7±5.484.1±6.6 84.1±8.8 82.2±12.8 85±8.785.6±7.2APA(mV) 111.3±7.8 112.4±9.8111.7±9.6110.0±10.3111.2±10.4109.2±8.4APD20(ms) 105.4±24.1 101.2±23.6 93.3±16.3*86.4±21.6*83.2±17.3**81.1±25.3**APD50(ms) 181.2±19.5 171.5±21.1 167.3±19.2*156.3±26.7*148.2±31.4**141.7±33.4**APD90(ms) 217.3±21.2 198.2±30.1 199.8±25.4 193.8±28.2187.6±32.58*177±4.9*
2.異蓮心堿(Isoliensinine，IL)對高K+部分去極化的離體豚鼠乳頭肌慢反應動作電位的影響IL(1-100μmol/L)可劑量依賴性地降低高K+(24mmol/L KCl)部分去極化的離體豚鼠右心室乳頭肌細胞慢反應動作電位的最大上升速率(Vmax)、超射(OS)、動作電位幅度(APA)，IL3-10μmol/L即有明顯的作用(P＜0.05或0.01)。IL100μmol/L才對動作電位時程(APD)有明顯延長作用。表明IL主要抑制鈣離子內流，較少抑制鈉離子內流，IL對兩種電流抑制作用的有效濃度相差10倍。
表IL對乳頭肌慢反應動作電位的影響(X±SD，n＝6)concentrntion(μmol/L)Paramters0 3 10 30 100Vmax(V/s)42.8±15.7 37.8±13.831.8±10.2*27.8±6.9**22.3±5.3**OS(mV) 26.1±7.620.5±61*16.6±10.3**12.8±12.6**9.2±13.1**RP(-mV) 52.7±7.552.3±8.0 54.0±10.3 52±8.3 53.8±8.4APA(mV) 78.7±4.171.4±4.3*70.1±6.1**66.0±8.1**60.2±9.4**APD20(ms) 62.3±19.2 64.5±18.667.0±26.4 75.5±29.4*79.8±32.6*APD50(ms) 117±44.1119±39 117±34 127±58 133±51*APD90(ms) 140±47 147±41 143±41 181±93 186±102*
權利要求
1.一種從蓮子心中提取純化異蓮心堿和蓮心堿的制備方法，包括以下步驟(1)從蓮子心中提取以甲基蓮心堿、異蓮心堿、蓮心堿為主要堿的非水溶性總堿；其特征在于(2)從所得的非水溶性總堿中分離出含有異蓮心堿和蓮心堿的強酚性總堿；(3)以結晶法分離強酚性總堿得異蓮心堿和蓮心堿。
2.根據權利要求1所述的從蓮子心中提取純化異蓮心堿和蓮心堿的制備方法，其特征在于從蓮子心中提取非水溶性總堿采用的是甲醇浸出法。
3.根據權利要求1所述的從蓮子心中提取純化異蓮心堿和蓮心堿的制備方法，其特征在于從蓮子心中提取非水溶性總堿采用的是甲醇回流法。
4.根據權利要求1所述的從蓮子心中提取純化異蓮心堿和蓮心堿的制備方法，其特征在于從蓮子心中提取非水溶性總堿采用的是酸水浸出或苯浸出法。
5.根據權利要求1、2、3或4所述的從蓮子心中提取純化異蓮心堿和蓮心堿的制備方法，其特征在于從非水溶性總堿中分離強酚性總堿的方法是將非水溶性總堿溶于1-1.5％的氫氧化鈉中，用氯仿提取，分離氯仿層與水層，得氫氧化鈉層，用氯化銨調節pH至8-9，有大量沉淀析出，用乙醚萃取數次，分離得乙醚層，用蒸餾水洗至中性，回收乙醚，殘留物經真空干燥后，得強酚性總堿。
6.根據權利要求1、2、3或4所述的從蓮子心中提取純化異蓮心堿和蓮心堿的制備方法，其特征在于以結晶法分離強酚性總堿得異蓮心堿和蓮心堿的方法是將酚性總堿溶于無水甲醇中，于冰水浴上降溫至4℃，滴加高氯酸調節pH至2_3，靜置于4℃析晶，濾取結晶，甲醇或乙醇中反復結晶，得蓮心堿高氯酸鹽，白色結晶，游離成堿，得蓮心堿；將過濾除去結晶——蓮心堿高氯酸鹽之母液，用氨水調pH至大量沉淀析出，乙醚(或氯仿)萃取，乙醚層經蒸餾水洗至中性，回收乙醚，殘留物經真空干燥后得無定型粉末，將該粉末溶于苯和乙酸乙酯混合溶劑中，加入濃鹽酸，調節pH至2_3，于4℃靜置析晶，濾取結晶，水中反復結晶，得異蓮心堿鹽酸鹽，白色針型結晶，游離成堿，得異蓮心堿。
7.根據權利要求5所述的從蓮子心中提取純化異蓮心堿和蓮心堿的制備方法，其特征在于以結晶法分離強酚性總堿得異蓮心堿和蓮心堿的方法是將酚性總堿溶于無水甲醇中，于冰水浴上降溫至4℃，滴加高氯酸調節pH至2_3，靜置于4℃析晶，濾取結晶，甲醇或乙醇中反復結晶，得蓮心堿高氯酸鹽，白色結晶，游離成堿，得蓮心堿；將過濾除去結晶——蓮心堿高氯酸鹽之母液，用氨水調pH至大量沉淀析出，乙醚(或氯仿)萃取，乙醚層經蒸餾水洗至中性，回收乙醚，殘留物經真空干燥后得無定型粉末，將該粉末溶于苯和乙酸乙酯混合溶劑中，加入濃鹽酸，調節pH至2_3，于4℃靜置析晶，濾取結晶，水中反復結晶，得異蓮心堿鹽酸鹽，白色針型結晶，游離成堿，得異蓮心堿。
全文摘要
一種從蓮子心中提取純化異蓮心堿和蓮心堿的制備工藝,首先用甲醇浸出法從蓮子心中提取以甲基蓮心堿、異蓮心堿、蓮心堿為主要堿的非水溶性總堿,再從非水溶性總堿中分離出含有異蓮心堿和蓮心堿的強酚性總堿,然后以結晶法分離強酚性總堿得異蓮心堿和蓮心堿;本發明提供的從蓮子心中提取、純化異蓮心堿和蓮心堿的方法,與現有的方法相比,具有成本低、收得率高、品質優——含量大于90%、適合于工業化生產等突出的優點。
文檔編號C07D215/14GK1257070SQ9812170
公開日2000年6月21日 申請日期1998年12月14日 優先權日1998年12月14日
發明者王嘉陵 申請人:同濟醫科大學