專利名稱：10－羥基－△2－癸烯酸的提取及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于10-羥基-Δ2-癸烯酸的提取，具體涉及10-羥基-Δ2-癸烯酸的物理提取方法及其應用。
蜂王漿具有免疫調節，抗菌，抗炎，抗癌等作用在國際國內已被公認，科學實驗證明蜂王漿中起主要作用的物質是10-羥基-Δ2-癸烯酸，通用代號為10-HDA。以下用10-HDA因此如何獲取高純度的10-HDA和對其的利用，一直是世界各國科學工作者研究探索的問題。通過武漢市醫學信息中心的查新檢索與10-HDA提取密切相關的文獻有3篇，其中有“在XE-60柱上分離及測定蜂王漿中10-羥基-Δ2癸烯酸”、“(E)-10-羥基-2癸烯酸分離鑒定及其抗輻射作用”、“10-羥基-2-癸烯酸含量測定方法評價”。外文未見相同報道；中方所檢文獻有與提交課題所述的提取蜂王漿中10-HDA的相似報道，但未見蜂王漿保持研究及將10-HAD提純后加入其它中藥配制成復方制劑的相同報道。
在所檢與10-HDA提取有關的文獻中，其公開了的提取方法的是化學方法。但此方法提取的10-HDA的穩定性尚待探索，它只適用于實驗室使用。如何使10-HDA形成產品得以充分利用尚未有文獻公開。也未有文獻公開10-HDA的物理提出方法。
本發明的目的在于提供一種用物理方法從蜂王漿中提取10-羥基-Δ2-癸烯酸的方法。本發明的另一個目的是應用10-羥基-Δ2-癸烯酸與中藥配伍制成復方制劑。
為實現本發明的第一個目的，對蜂王漿進行以下處理(1)蜂王漿的消毒處理，殺死其中的耐酸菌；(2)在保溫條件下，使蜂王漿中的10-HDA充分結晶；(3)將蜂王漿中結晶的10-HDA分離出，然后進行純化，乳化處理；(4)利用冷凍真空干燥設備進行干燥處理，得到10-HDA原粉。
國內外專家學者都認為10-HDA具有多功能錫免疫調節作用，有較強的抗癌抑制細胞生長，擴散的作用。具有抑菌和殺菌作用，具有抗炎作用。以此方法提取的10-HDA不受化學漂劑的污染，保持它的純天然性。但單獨服用后，容易產生便秘的副作用。所以須與其它物質配伍使用。以此方法提取的10-HDA穩定性好，可長期保存。
為實現本發明的另一個目的，提出對10-HDA的應用是與中藥配伍制成復方制劑，其中中藥的重量比為0.012～0.09∶4。中藥由當歸、黃芪和天花組成，其重量比為0.6∶2.4∶1。
選用的當歸有補血，調經、活血止痛、潤腸通便的功效(中藥學)。德國研究人員研究指出當歸中AR-1具有重要抗腫瘤作用。AR-1用量在1.6-100mg/kg時可有效抗S-180腹水瘤，IMC癌并發現當歸熱水提取物尚有誘導干抗素產生活性(抗癌中藥大辭典)。
黃芪的藥理作用在于補氣升陽，固表止汗，托瘡生肌，利水消腫。黃芪有增加要體免疫功能，促進抗體生成，還能保護肝臟，增加血細胞，提高腫瘤細胞內環磷酸甘的含量能抑制腫瘤細胞產生，甚至使腫瘤細胞逆轉，對一些致癌性病毒的入侵和復制亦顯示出阻礙作用，亦可能發揮抗腫瘤作用(抗癌中藥大辭典)。
天花粉的藥理作用在于利小便，消於血、輕身益氣等作用。
選用當歸、黃芪、天花粉等中藥有效地克服了用10-HDA后產生的便秘的副作用，同時強化了10-HDA的作用。
對當歸、黃花、天花粉的處理可采用精洗浸泡、在生物發酵設備中進行104℃煮沸保持30分鐘，60℃保持90分鐘，40℃保持6小時以后來菌軟化，用膠體磨進行乳化處理、提取藥汁、過濾去渣、濃縮成乳劑、冷凍干燥、粉碎、分裝等工藝。
圖1 10-HDA的提出工藝圖。
圖2中藥處理工藝圖。
圖3沙門氏菌試驗流程圖。
圖4霉菌總數測定程序圖。
實施例1、10-HDA的提取(1)采用60鈷消毒工藝將蜂王漿中的耐酸菌殺死。
(2)在溫度25～35℃的條件下、保持48小時，使蜂王漿中的10-HDA充分結晶。
(3)以100目過濾結晶物后，漂洗并高速離心純化結晶物，再用膠體磨進行乳化處理。
(4)在-40℃條件下對乳化物進行冷凍后升溫至35℃干燥處理；冷凍干燥全過程為18小時對干燥物進行粉碎，以每粒70mg含量分裝入膠囊中。
2、與中藥配伍和復方制劑為克服10-HDA的副作用，以10-HDA70mg與4g中藥配伍混合制成復方制劑，中藥由當歸0.6克，黃芪2.4克，天花粉1克組成。中藥按前述如圖2工藝處理。
按以上方法得到的10-HDA的復方制劑的技術要求及檢測如下衛生指標按國家衛生部規定指標進行生產。
(1)原料要求1、蜂王漿新鮮具有光澤感，無腐敗變質。
2、中藥部份干貨、新鮮、無霉變、蟲蛀等。
(2)感官要求1、10-HDA為白色細粉，微酸澀。
2、中藥部份為淡棕色細粉，氣味純正、味甘微苦。(3)衛生要求理化指標鉛＜0.5 砷＜0.3水份不超過5％菌落總數(Cfu/g)＜1000大腸菌群(cfu/g)＜40致病菌不得檢出霉菌(cfu/g)＜25酵母(cfu/g)＜25(4)衛生指標的檢測方法1、對含鉛的測定采用無火焰原子吸收法。2、對含砷的測定采用氫化物原子吸收法。3、常見致病菌--沙門氏菌檢驗方法。國家規定標準方法包括五個階段的系統鑒定。1、前增菌用無選擇性的培養基使于瀕死亡狀態的沙門氏菌復活力；2、選擇性增菌，使沙門氏菌得以增殖，而大多數其他菌受到抑制；3、選擇性平板分離沙門氏菌4、生化試驗和A-F多價D群血清的凝集試驗，鑒定到屬；5、血清學分型鑒定。試驗過程如圖34、對大腸肝菌檢驗方法一般分為三步法第一步初發酵試驗第二步平板分離第三步復發酵試驗試驗具體方法采用九管法，即選用三個稀釋度每個稀釋度接種三管。
判定標準1)初發酵試驗中若所有乳糖膽鹽發酵管都不產生，則可報告為“大腸肝菌群陰性”2)初發酵試驗中凡產氣者經平板分離后，取可疑菌落染色鏡檢，同時做復發酵。
試驗一(一)凡乳糖復了酵管產氣，革蘭氏染色為陰性，無芽胞桿菌，即可報告為“大腸菌群陰性”。(二)如乳糖管不產氣或革蘭氏染色陽性，則報告為“大腸菌群陰性”。
報告根據證實試驗(復發酵試驗)確認為大腸菌群陽性的管數，查大腸菌群最可能數檢索表，即可報告每100克檢樣內大腸菌群最可能數。
5、霉菌總數測定方法(一)檢樣處理、(二)樣品稀釋及培養、(三)菌落計數一、檢驗程序如圖4(5)10-HDA復方制劑的免疫調節測定方法1、樣品處理。樣品為淡棕色粉未，以無菌蒸餾水按試驗所需濃度配制作用。
2、動物。昆明種雄小鼠18-22克，200只湖北省醫學實驗動物中心提供。
動物批準號為鄂動醫字19-0073、分組。劑量分組為低、中、高劑量分別以0.7、1.4、2.8g/kg.bwr 10-HDA復方制劑灌胃；相當于人體的攝入量的5、10、20倍。空白對照組，灌胃蒸餾水；灌胃一月，然后進行各項試驗。
4、實驗方法
4.1試驗前后動物體重記錄。
4.2對動物淋巴器官/體重比值的影響。
4.3 CONA誘導小鼠脾淋巴細胞轉化試驗方法MTT法(步驟同功能實驗程度規定)4.4二硝基氟笨(DNFB)誘導遲發型變態反應(DTH)方法耳腫脹法，用DNFB致敏小鼠后，第5天再用DNFB攻擊右耳，24H后處死動物剪下左右耳殼，用打孔器取下下徑8mm的耳片稱重，以左右耳重量之差來表示DTH的程度。
4.5血清溶血素的測定方法血凝法按照功能實驗程序操作，根據血清凝聚程度的級別計算出抗體積數。
4.6腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗方法半體內法。制備20％的雞紅細胞懸胞懸液，每只鼠腹腔注射1ml，該懸液30min后處死動物，將其仰位固定于鼠板上，開腹，經腹腔注入生理鹽水2ml，轉動鼠板1min，然后吸出腹腔洗液1ml，平均滴于2片載玻片上，37℃溫育30min；育畢用生理鹽水漂洗，涼干，以1∶1的丙酮甲醇液固定，4％Giemsa--磷酸緩沖液染色3min，再用蒸餾水漂洗涼干，油鏡下計數100個巨噬細胞按下式計算吞噬率和吞噬指數。
4.7小鼠碳廓清試驗方法依程序規定的方法，根據注入墨汁2min、10min后血中炭濃度(測吸收光質)計算出各組小鼠的吞噬指數。
10-HDA復方制劑衛生評價是按衛生部對保健品特制的衛生要求進行生產的。本實施例中，所得到的10-HDA的復方制劑的衛生要指標為鉛(mg/kg以As計) ＜0.5砷(mg/kg以Pb計) ＜0.3菌落總數(Cfu/100g)＜10致病菌未檢出大腸菌群(Cfu/100g)＜30霉菌(Cfu/g)＜10酵母(Cfu/g) ＜10對本實施例的10-HDA復方制劑免疫調功能調節測定結果如下1、見表1各動物間體重無明顯差異表1試驗前后動物體重記錄(克X±S)組別劑量 動物數 體重 增重(g/kg.bw)(只) 試驗前 試驗后 (克)空白組0 1018.7±2.029.0±2.510.4±1.8低劑量組 0.71019.1±1.330.7±1.911.5±1.5中劑量組 1.41019.6±1.630.6±2.011.0±2.1高劑量組 2.81018.4±1.629.7±2.511.1±1.02、見表2各動物間胸腺/體重比值和脾臟/體重比值無明顯差異。表2對動物淋巴器官/體重比值的影響(X±S)組別 劑量 動物數 胸腺/體重比值 脾臟/體重比值(g/kg.bw)(只)(X10-9) (X10-9)空白 0 103.13×0.495.33×0.83低劑量組 0.7103.20×0.385.18×0.68中劑量組 1.4103.22×0.415.24×0.48高劑量組 2.8103.32×0.235.26×0.443、從表3可見與對照組比較10-HDA復方制劑低、中、高劑量組顯著性增強ConA誘導的脾淋巴細胞增殖能力。表3；10-HDA復方制劑對小鼠細胞免疫功能影響組別 劑量 注ConA誘導脾淋巴細胞增殖 DNFA誘導DTH(g/kg.bw) N OD差值 N左右耳重量差(mg)空白組 010 0.033±0.005 1019.6±2.28低劑量組 0.7 10 0.044±0.008#1023.2±2.70中劑量組 1.4 10 0.056±0.011#1027.6±2.87高劑量組 2.8 10 0.042±0.006#1022.1±2.15注取0.1測定OD570值對照組比較*P＜0.05#P＜0.014見表3可以與對照組比較10-HDA復方制劑低、中、高劑量顯著性增強小鼠對DNFB誘發的DTH反應。
5從表4可見與對照組比較10-HDA復方制劑低、中、高劑量組可顯著性升高血清溶血素含量。
表4:10-HDA的復方制劑對小鼠體液免疫功能的影響組別劑量 動物數 血清溶血素(g/kg.bw) (只)(抗體積數)對照組0 10 92.6±17.48#低劑量組 0.710150.3±32.69#中劑量組 1.410156.9±35.11#高劑量組 2.810148.7±41.17#與對照組比較*P＜0.05#P＜0.016從表5可見10-HDA復方制劑低、中、高劑量組吞噬百分數。
吞噬指數均明顯高于正常對照組。表5:10-HDA復方制劑對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響組別劑量動物數吞噬百分率 吞噬指數(g/kg.bw) (只) (％)對照組0 10 42.9±4.060.449±0.041低劑量組 0.710 51.8±4.210.551±0.04#中劑量組 1.410 56.4±3.440.592±0.04#高劑量組 2.810 49.2±3.89# 0.514±0.04#與對照組比較#P＜0.017從表6可見10-HDA復方制劑低、中、高劑量組可顯著性提高小鼠碳廓清吞噬指數。表6:10-HDA復方制劑對小鼠碳廓清功能影響組別劑量(g/kg.bw)動物數(只)吞噬指數對照組 010 6.077±0.58低劑量組0.7 10 7.671±0.54#中劑量組1.4 10 7.902±0.78#高劑量組2.8 10 7.567±0.86#與對照組比較#P＜0.0權利要求
1.10-羥基-Δ2-癸烯酸的提取，其特征方法是(1)、蜂王漿消毒處理，殺死其中的耐酸菌。(2)、在保溫條件下，使蜂漿中的10-羥基-Δ2-癸烯酸充分結晶。(3)、將蜂王漿中結晶的10-羥基-Δ2-癸烯酸分離出，然后進行純化，乳化處理。(4)、利用冷凍真空干燥設備進行冷凍干燥處理，后再粉碎得到10-羥基-Δ2-癸烯酸原粉。
2.如權利要求1所述10-羥基-Δ2-癸烯酸的提取，其特征是工序(2)中的保溫濕度為25～35℃，保持48小時。
3.如權利要求1所述10-羥基-Δ2-癸烯酸的提取，其特征是分離采用100目過濾，純化采用漂洗后高速離心的方法，乳化則采用膠體磨處理。
4．如權利要求1所述10-羥基-Δ2-癸烯酸的提取，其特征是工序(4)中的冷凍溫度-40℃，其后升溫至35℃干燥，全過程18小時。
5．一種10-羥基-Δ2-癸烯酸應用，其特征是將10-羥其-Δ2-癸烯酸與中藥配伍制成復方制劑，10-HDA與中藥的重量比例為0.012～0.09∶4；中藥由當歸、黃芪、天花粉組成，其重量比為0.6∶2.4∶1。
全文摘要
本發明公開了一種從蜂王漿中以物理方法提取10－羥基－Δ2－癸烯酸以及10－羥基－Δ2－癸烯酸的應用。其物理方法概括為:在保溫條件使蜂王漿中10－HDA充分結晶,過濾分離,純化,乳化,再冷卻干燥,并粉碎。為克服10－HDA直接服用后的副作用,將10－HDA與中醫配伍制成復方劑,中醫由當歸,黃芪,天花粉組成。10－HDA的提取及應用克服了現有化學方法提取不能實現的產業化的不足,同時克服10－HDA的副作用的影響。
文檔編號C07C51/43GK1221730SQ98121629
公開日1999年7月7日 申請日期1998年10月16日 優先權日1998年10月16日
發明者許祖逖, 吳潤洲, 李冬珍 申請人:武漢天潤生物制品有限公司