體外檢測肝細胞癌存在的方法

專利名稱：體外檢測肝細胞癌存在的方法
本申請是申請號為90110448.5，申請日為1990年12月19日，發明名稱為“肝細胞癌致癌基因”的發明專利申請的分案申請。
本發明總的來說，涉及一種肝癌細胞的蛋白質，具體地說本發明涉及一種致癌蛋白質，它是肝癌細胞的一種放大的基因表達產物。本發明還涉及到編碼這種致癌蛋白質的核苷酸片段、包含這種片段的重組分子和用它轉化的細胞。本發明還涉及到檢查病人體內肝癌存在的方法以及在此基礎上的藥盒。
流行病學表明人類的某些癌癥和其他疾病的發生與幾種DNA病毒有很密切的病因學相關性。這些病毒包括頸部癌癥(HPV16.)和疣狀表皮發育障礙中(HPV3和8)的乳頭狀瘤病毒；非洲淋巴瘤中的EB病毒；和人肝細胞癌中的乙型肝炎病毒(HBV)(Beasley et.al,In:Vyas GN,Dienstag J.L,Hoofnagle JH,eds。“病毒性肝炎和肝臟疾病”Orlando,FL,Grune and Stratton,1984,209-224)。這些發現，以及逆轉錄病毒的感染如HTLV-1在成熟的T細胞中白血病的相關性表明傳染性病毒在上述人類腫瘤和疾病的發病機理中可能起著轉導因子的作用。
根據該機制，相信傳染性病毒是通過與宿主細胞DNA進行DNA重組而產生影響的。哺乳動物基因組中含有某些基因(被稱為致癌基因前體)，在被轉移到急性轉化逆轉錄病毒基因組中時，它能獲得致癌性質(Bishop,Ann.Rev.Biochem.1983,52:301；Bishop,Cell 1985,42:23)。在特定的人類癌癥中(如，T24和EJ人膀胱癌)，已經證實鑒定出的轉化基因(H-ras-1位點)與Harvey鼠肉瘤病毒的V-rasH有關。在致癌基因前體和致癌基因中，該ras族已經被完全表征，并且對在人類肝瘤中的活化和表達進行了研究。當一種致癌基因前體經過點突變(如C-rasH)或者重排(如n-myc)，這種改變可以引起分化和生長過程中細胞調節的喪失，并且最終產生致癌性。
最近，從人(Mahlavu)肝細胞癌中得到的一種轉化DNA順序，hhcM已被鑒別并且被分子克隆成為一種大片段的部分片段(Yang et al,J.Gen.Virol.1982,63:25；Yang et al,Environmental HealthPerspectives 1985,62:231)。從另外幾種人肝細胞癌中分離出一些對NIH/3T3細胞適度轉化活性顯示為零的，hhcM相關DNA克隆。已經有兩種被部分地表征，它們是從Mahlavu肝細胞癌中得到的適當地細胞-轉化基因(hhcM)和一種從正常人體肝臟DNA中分離的，推斷的細胞同系物(C-hhc)它不具有細胞轉化活性。已經表明了二種hhcM和一種Korean hhcK3的分子克隆與C-hhc的生物活性特征并加以比較(Yang et al，白血病1988,2(12增刊)102S)。觀察了hhcM序列在來源于2個中國人，1個非洲人和17個朝鮮人肝細胞瘤的幾種基因組DNAS中的放大反應，并且與在相同肝細胞瘤中整合的HBV DNA序列的分布進行了比較，以便對hhcM的可能的作用提供一些了解。
本發明涉及到一種肝細胞癌特異的癌蛋白和一種編碼這種蛋白質的核苷酸順序。本發明還涉及到利用該癌蛋白(或它的特異抗體)和核苷酸順序進行診斷和篩選的方法(在此基礎上建立的藥盒)。
本發明的一個目的是提供一種肝細胞癌蛋白和一種編碼它的核苷酸序列。
本發明的另一個目的是提供一種肝細胞癌的存在和肝臟癌前或病理狀態的診斷檢查。
該技術中的熟練人員通過下面的描述可以清楚地知道本發明的其它目的和優點。
在一個優選方案中，本發明涉及到一種編碼了

圖1中的氨基酸序列或該序列的一種等位基因變異體或該序列的一個特定部分的DNA片段。
在另一個優選方案中，本發明涉及一種重組體DNA分子，它們合有ⅰ)一種載體，和ⅱ)上述DNA片段在另一個優選方案中，本發明涉及到用上述重組DNA分子轉化的宿主細胞。
在另一個優選方案中，本發明涉及到與上述DNA片段充分互補并與之雜化的一種核苷酸片段。
在還有一個優選方案中，本發明涉及到一種具有圖1中氨基酸序列或該序列的一種等位基因變異體或該序列的一個特定部分的蛋白質。
在另一個優選方案中，本發明涉及到上述蛋白質的特異抗體(多克隆的和/或單克隆的)。
在另一個優選方案中，本發明涉及到一種產生上述蛋白質的方法，包括在可以表達DNA片段的條件下培養一種用上述重組DNA分子轉化的宿主細胞，從而產生該蛋白質；并分離該蛋白質。
在另一個實施例中，本發明涉及到一種檢查樣本中上述蛋白質存在的檢查方法，包括ⅰ)在可以使抗體與蛋白質結合的條件下將樣本與該蛋白質特異性抗體接觸，從而形成一種復合物；和ⅱ)檢測該復合物的存在。
在另一個實施例中，本發明涉及到一種檢查樣本中存在編碼上述蛋白質的核苷酸序列的方法，包括ⅰ)在可以進行雜化反應的條件下將樣本與該核苷酸序列充分互補的核苷酸片段接觸，使它們發生雜化，從而形成一種復合物；和ⅱ)檢測該復合物的存在。
在另一個實施例中，本發明涉及到一種病人肝細胞癌存在的診斷方法，包括ⅰ)將從病人的生物學樣本與上述抗體在使得抗體與樣本中蛋白結合的條件下進行接觸，從而形成一種復合物；和ⅱ)檢測這種復合物的存在。
在另一個實施例中，本發明涉及到一種診斷病人肝細胞癌存在的方法，包括ⅰ)將從病人的細胞樣本中獲得的核酸序列與上述核苷酸片段在可以進行雜化反應的條件下接觸，從而形成一種復合物；和ⅱ)檢測這種復合物的存在。
在另一個實施例中，本發明涉及到用于檢查樣本中存在上述蛋白質的一種診斷藥盒，它包括一種盛有該蛋白質特異性抗體的容器。
在另一個實施方案中，本發明涉及到一種用于檢查一種核酸序列的存在的診斷藥盒，這種核酸序列編碼了一種具有圖1所描述的氨基酸序列或該序列的一種等位基因變異體，或它的一個特定部分的蛋白質，這種藥盒包含有一個盛有上述核苷酸片段的容器。
圖1表示hhcM的完整核苷酸序列，和一種編碼了其開放閱讀框架中的52,000道爾頓蛋白質的氨基酸序列。
圖2表示產生hhcM52KD蛋白質的hhcM-Lacz嵌合質粒的結構。
圖3表示結合到從人肝細胞癌(Mahlavu)，人正常肝和從鼠(NIH/3T3)成纖維細胞中制備的大分子量DNAs上的黃曲霉素B1環氧化物。
圖4表示用一種改良的Maxam-Gilbert定序法來識別在hhcM(PM-1)DNA中的AFB1環氧化物結合的dG。在一旁列出了核苷酸序列。左側的譜帶表示對應于全部四種6脫氧核苷酸和AFB1-dG的梯形譜帶；右側的另外三個譜帶中只給出了天然dG和AFB1-dG。在全部時間過程中aG=AFB1結合的dG；°G=不與AFB1反應的dG；而°G=適度優選的dG。
圖5表示在含有pJZ102的大腸桿菌細胞中產生的蛋白質的動態分析。將質粒pJZ102和對照質粒pJZ101在大腸桿菌細胞中進行培養，直到細胞密度的Klett讀數達到80，此時，加入誘導劑、IPTG(最終濃度，10-3mol)，以激活從lac啟動子開始的轉錄，制備嵌合hhcM-lac52-KD蛋白質。在特定時間取一毫升培養物樣品，通過離心沉淀，并使之溶解，然后在Laemmli緩沖液中煮沸使蛋白質變性，取各種樣本等量的等分試樣，通過參考文獻中所述的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳方法進行分析(Somerville等人，Structural andOrganizational Aspects of MetabolicRegulation；UCLA Symposia on Molecularand Cellular Biology,New Series,Vol.133,P.181-197.New Yovk；Alan R.Liss Inc.1990)。這些譜帶代表(a)在時間為0時的pJZ102+ITPG；(b)在時間為0時的pJZ102-ITPG；(c)在時間為20小時的pJZ102-ITPG；其它分別是在30分鐘時(d)、4小時(e)，7小時(f)和20小時(g)的pJZ102+ITPG。在0時(a′)、30分鐘(b′)，4小時(e′)、7小時(f′)和20小時(g′)時pJZ102轉化的大腸桿菌細胞+ITPG的暗背景顯微圖。預先染色的分子量標記(m)以KD計算是130(頂部的淺色譜帶)，94,75,50,39,27,17。
圖6A和6B表示在細菌中產生的純化的hhcM融合蛋白質p52(圖6A)和一種多克隆抗-p52 IgG的特異性(圖6B)。圖6A表示細菌表達的p52的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。嵌合hhcM-lac融合蛋白質的細菌表達的全部條件如圖5所述譜帶d,e，和e′代表被IPTG誘導的帶有pJZ102的大腸桿菌細胞(以各種各樣的量)的總細胞提取物，而譜帶f代表帶有pJZ101的大腸桿菌細胞的陰性對照的總細胞提取物。譜帶a(5μl),b(15.μl)和c(1μl)代表用于免疫兔子的凝膠純化的p52的不同量。譜帶m代表預先染色的分子量標記，以KD計為75,57,50,39,27,17。
圖6B代表一種多克隆抗-p52的反應活性。通過對兔子進行免疫可以產生抗-p52多克隆IgG。用慣用技術、用SDS聚丙烯酰胺凝膠純化的p52在各為0.8到1.0mg的量對新西蘭白兔進行免疫。給予兩次輔助加強注射。將去垢劑(0.2％SDS)溶解的相當于0.2ml封裝的人肝癌細胞(1/3∶V/V)的樣本，包括Mahlavu肝細胞癌、Hp3p 21.7和HPG2,pBrpM-1轉染的BRL-1腫瘤細胞以及對照BRL-1細胞和p52以每種10μl加到樣品孔中，并使之擴散，與多克隆抗-p52IgG進行交叉反應過夜。在48小時時記錄結果。
圖7表示與32P-hhcMDNA進行的DNA-DNA雜化反應。
本發明涉及到一種由于肝細胞癌的核苷酸序列轉化而編碼的致癌蛋白以及這種轉化序列本身。本發明還涉及這種癌蛋白的特定部分(即至少5個氨基酸)，和編碼這種多肽的核苷酸序列(片段)。本發明還涉及與上述核苷酸序列(片段)充分互補的核苷酸片段，這種片段被用作為探針來檢查這種核苷酸序列(片段)的存在。本發明也涉及到用于檢查溫血動物肝細胞癌(和肝臟的癌前或病理狀態)存在的診斷和篩選方法。
本發明的這種癌蛋白是一種與肝癌特異相關的肝癌細胞的放大基因表達產物。這種蛋白質可以具有圖1所給出的完整順序，在這種情況下它被稱為hhcM。這種蛋白質也可以具有與圖1所給分子特性(如免疫學特性)基本相同的分子的氨基酸序列(加圖1序列的等位基因形式)。另外，本發明的這種蛋白質(或多肽)可以具有與圖1所給序列的某一特定部份(或它的等位基因形式)相一致的氨基酸序列。
該蛋白質可以基本純化的形式存在，也就是基本上不含有在肝臟內通常結合在一起的蛋白質和核酸。本發明的癌蛋白，包括用相應的mRNA在無細胞的提取物中制備的和用重組技術制備的，可以使用現有技術中的已知方法純化。可用本領域的已知方法將這種癌蛋白或它的特定部份用作為一種抗原來產生它的單克隆和多克隆抗體。
在另一實施方案中，本發明還涉及到如上所述的編碼了圖1所給完整氨基酸序列(圖1所給的具體的DNA序列只是一個實施例)，或它的任何特定部份的核苷酸序列(片段)(包括cDNA序列)。本發明所涉及的核苷酸序列還包括那些編碼了具有與hhcM多肽基本相同特性(如免疫學特性)的蛋白質(或多肽)的序列(例如圖1的等位基因形式的氨基酸順序)。本發明還涉及到與上述核苷酸序列(片段)充份互補并與之雜化(如在嚴格條件下)的核苷酸片段。
在另一個實施方案中，本發明涉及到一種包括一種載體和一個如上所述核苷酸序列(片段)(最好是一種編碼了圖1所示分子或具有其特性的分子的DNA序列)的重組分子。這種載體可以是一種病毒或者一種質粒載體。該序列可以存在于這種載體中并能被可操縱地連接到調節元件，包括例如一種啟動子(如Lacz啟動子)上。這種重組分子適用于轉化原核或真核細胞，最好是蛋白酶缺乏大腸桿菌細胞。
本發明一種重組分子的具體實例如圖2所示。在該實例中，通過合適的重組DNA操作，用原核生物Lacz表達/翻譯序列加上11個氨基酸的密碼子來取代hhcMp52KD的原始的N-末端18個氨基酸的密碼子，從而將hhcM核苷酸序列置于一個嵌合結構中(Yang et al.Proc.of the XIV InterSymp.Sponsored by the InternationalAssociation for Comparative Research onLeukemla and Related Diseases Nov.1989(Vale,Colorado))。在lacz啟動子的驅動下，所得到的嵌合基因在一種蛋白酶缺乏大腸桿菌突變體中于30℃下進行高水平表達。在另一個實施方案中，本發明涉及一種用上述重組分子轉化的宿主細胞。該宿主可以是原核生物(例如，細菌(最好是大腸桿菌))、低級真核生物(即真菌，包括酵母菌)或高級真核生物(即哺乳動物，包括人類)。可以利用本領域的已知方法進行有效地轉化。這些轉化的宿主細胞即可作為上述核苷酸序列的來源(這些序列構成重組分子的部份)。如果重組分子是一種表達系統的形式(見上述具體結構)，這種轉化細胞即可作為癌蛋白的來源。
本發明的癌蛋白和核酸順序既可以用于研究(如促進對肝細胞癌為什么以及怎樣發生的理解)，也可以用于臨床，例如診斷(和/或篩選)肝細胞癌(以及肝臟的癌前或病理狀態)的存在和/或發展。
可以使用抗本發明癌蛋白(或它的特定部分)的抗血清或單克隆抗體(用已知技術產生)來完成上述的診斷/篩選方法。例如，這種診斷方法可以采取免疫檢測的形式用于高度懷疑肝細胞癌的病人(如慢性肝炎患者)和/或肝癌地理位置高發區(如中國江蘇省的啟東區)人群的尿或血清樣本。這種篩選免疫檢測可以是簡單的浸棒型法，該方法是粘在棒上的抗原/抗體對中的一種成員與樣本中的另一成員結合時，出現顏色改變(這種浸棒型檢測方法用于各種不同的結合對已被描述)。這種簡單的試驗可以容易和廣泛地用于不容易得到分析電泳儀(用于檢查病人血清中的甲胎蛋白含量，該含量水平目前用來篩選和診斷肝細胞癌的存在)的地區的人群。
本發明的診斷方法也可以是一種包括了利用抗本發明蛋白質或多肽的抗體而進行的組織化學診斷檢查。為了能夠更準確地診斷肝癌，該試驗可使用冷凍或預先固定的肝臟薄切片樣本。
本發明的診斷方法也可以用作為與本發明的部份核酸順序充份互補并與之雜化的核酸探針，這種探針可用于例如，在時間合適的限制酶消化的基因組DNA進行電泳后，檢查內源性序列的存在，該探針可以用例如32P標記，以便進行檢測。
本發明還涉及用來實現上述方法的診斷/篩選藥盒。這種藥盒可以包括例如本發明癌蛋白(或多肽)的上述特異性抗體，或者，也可以包括上述核酸探針，以及完成該檢查所必須的任何輔劑(例如，緩沖液，可檢測的標記物，酶底物等)。
在下列非限制性實例中，本發明被進一步詳細地描述。
在下面的實施例中參考了下列方案hhcM分子克隆化用HindⅢ限制性核酸內切酶，按照下述方法，對從人體正常肝臟和Mahlavu(非洲人)肝細胞癌(HHC)中純化的基因組DNA進行完全消化。(為了克隆HHC DNA序列還嘗試使用了其他的限制性核酸內切酶，包括BamHⅠ,EcoRⅠ和PstⅠ，從HHC和肝臟DNA中分離基因組DNA片段，而用這些手段分離的克隆在轉染過程研究方面是不成功的)。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將〔3H〕黃曲霉毒素B1(AFB1)-環氧化物結合的(如下所述)和未結合的DNA樣本分離成180個組份。測定每μg DNA的〔3H〕AF1B-環氧化物特異性。將具有明顯〔3H〕AFB1-環氧化物特異活性的組分用于如下所述的對NIH3T3細胞進行DNA轉染測定。識別那些能夠顯示陽性細胞轉化的陽性聚焦組份，并平行地將未結合DNA的組份聯結到pBR322,pBR325和/或puc8質粒DNA的HindⅢ位點上進行分子克隆化，使其進行如其他文獻所描述的大腸桿菌HB101細胞的轉化。(Yang etal.,J.Gen.Vivol.1982,63:25)。對所得克隆的初級選擇是根據(1)對四環素的敏感性，和/或與含有該質粒的半乳糖苷酶編碼序列的Lacz操縱子的破壞相關的顏色改變和(2)在有或沒有AFB1結合的NIH3T3細胞的轉染測定中細胞的轉化能力；(3)在對從人Alu序列中制備的〔32P〕探針(Lawn et al.,Cell 1978.15:1157)和〔32P〕標記的HindⅢ切割的MAH、HHC、DNA片段進行的菌落雜交反應和DNA-DNA雜化反應中人類序列的存在；和(4)〔3H〕AFB1-環氧化物與該DNA的結合。通過包括〔3H〕AFB1的結合、NIH3T3細胞的轉染測定和對〔32P〕Alu和〔32P〕HindⅢ MAH,HHC,DNA探針的DNA-DNA雜化反應在內的這些四聯技術的運用，對30,000個克隆進行篩選后，可以分離出三個克隆，一個特定3.1Kb DNA限制片段構成了該hhcMDNA。質粒DNA和AFB1結合的制備用于這些研究的克隆一直被稱為PM-1。通過Holmes方法，即快速加熱法，然后以180,000×g轉速通過CsCl2-溴化乙錠等密度離心20小時來制備質粒DNA(Maniatis etal.,Molecular Cloning,Cold SpringHarbor Laboratory.Cold Spring Harbor,N.Y.1982)。通過異丙醇提取和用TEN緩沖液徹底透析，去除溴化乙錠，純化帶狀PM-1 DNA。一般可以獲得每5ml培養物25到50μg總質粒DNA的產率。通過用HindⅢ核酸內切酶消化PM-1 DNA，然后進行瓊脂凝膠電泳，并電洗脫該分離的3.1Kb譜帶。將3.1Kb hhcM DNA從PUC8 DNA和其他污染物中分離出來。將所得到的3.1Kb hhcMDNA進行同源純化，并將其用于AFB1激活實驗。
也可以將hhcM3.1Kb DNA克隆到一個除了帶有新霉素對抗基因外還帶有一種鼠逆轉錄病毒(Moloney)LTR,SV40啟動子和部份T抗原的pSVneo載體當中。當被轉染到細胞中時，這種克隆，rpMpN-1，以常高的水平進行表達，并且對于轉染測定具有特別的優越性。
從Morales實驗室，可以獲得大約15Ci/mmole特異性〔3H〕AFB1。通過HPLC將其進一步純化到同源化。所得到的〔3H〕AFB1單峰具有9,250cpm/pmole的特異活性。它可以與從肝微粒體新鮮制備的或者通過用如前所述的氯代過苯甲酸和二氯甲烷進行化學過氧化反應而新鮮制備的混合功能氧化酶一起用于激活反應(Bennett et al.,Cancer Res.1981,41:650；Garner et al.,Chem.Biol.Interact.1979,26:57)。通過動態分析對〔3H〕AFB1環氧化物與大分子量HHC或質粒DNA的結合進行監測(Yang et al.,Environmental HealthPerspective 1985,62:231 and Modali andYang,Monintoring of OccupationalGenotoxicants pp.147-158(1986))。對每個時間點采取的樣本用氯仿沖滌去除未結合的〔3H〕AFB1環氧化物，在將〔3H〕AFB1-DNA再次溶解在Tris-EDTA-NaCl(TEN)緩沖液中之前用乙醇進行沉淀，用于轉染測定或序列分析。細胞組織培養和轉染測定將6到11代NIH/3T3細胞和用于轉染測定的Buffalo鼠肝臟細胞(BRL-1)保持在含有10％熱滅活胎牛血清，青霉素(50單位ml-1)和鏈霉素(25μg ml-1)的Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM)中，置于37℃，5％CO2的環境中。
按照如前所述的方法進行DNA轉染(見Yang et al.1985 and Moaali-and Yang1986，上文已參考)。通過細心地滴定DNA-磷酸鈣復合物的混合物的PH曲線可以獲得最佳條件，通常發現PH6.75可以保證良好的復合物沉淀。組織培養細胞和癌組織DNA和RNA的制備按照其他文獻所述的方法以組織培養細胞和癌組織中提取和純化全部大分子量(HMW)DNA。(Yang et al.,1985，上文已參考)。對這樣純化的HMW DNA進行蛋白酶K消化，用苯酚-甲酚，氯仿-異戊醇、乙醚和乙醇-NaCl沉淀進行第一次有序化學純化，然后進行RNase消化和第二次有序化學純化。然后用TEN緩沖液對純化的DNA進行透析以便用于實驗。按照前面所述的方法，從組織培養細胞中提取和制備總RNA(Maniatis et al.,1982，上文已參考)。通過用寡dT纖維素(Collaborative Research,MA.)柱洗脫進行親和分離來獲得富RNA的多聚腺核苷酸。腫瘤發生將從轉染的細胞培養物中通過克隆柱方法或終端洗脫方法克隆出的轉化細胞進行擴大，并以104到106個細胞的劑量接種到無胸腺Swiss nu/nu小鼠皮下。對該激發小鼠體內的腫瘤發生進行密切監測。核苷酸序列分析和靶位點致突變運用“酶學”1980,65:499中的標準Maxam-Gilbert方法和Sanger(M13)雙脫氧定序法(Maniatiset al.,1982，上文已參考)對hhcM3.1Kb和通過靶位點致突變產生的變異體進行核苷酸定序。
用實用生物系統寡聚核苷酸合成儀來合成帶有定靶為dG…＞T突變體的20聚物的特定寡聚核苷酸序列。在產生的突變克隆中用這些序列作為模板，按照Amersham(Arlington Hts.IL)提供的方法，運用Amersham的寡聚核苷酸控制體外系統產生突變DNA克隆，通過核苷酸定序來驗證該突變克隆的DNA。通過對NIH/3T3細胞轉染測定中細胞轉化的增強和對用BRL園點印跡法在轉染細胞中RNA的表達來分析這些靶位點致突變DNA的效果(Bethesda Research Laboratovy,Rockville,MD)。
實施例1AFB1結合的劑量和在NIH/3T3細胞中hhcM細胞轉化能力的增強使AFB1環氧化物與從人肝細胞癌、人肝臟和小鼠NIH/3T3細胞中制備的大分子量DNA進行有效結合(圖3)。每個結合動力學的起始率非常快。在結合反應一分鐘之后，AFB1-環氧化物與人正常肝臟或肝癌DNA以及鼠NIH/3T3細胞DNA結合的速度則出現顯著差異。MAH HHC DNA比正常肝臟DNA表現出較快的結合速度，并且全部dG靶位較早地變得飽和。而AFB1環氧化物結合的正常肝臟DNA的速度較慢，但是全部dG最終以稍低水平飽和。人DNA比鼠NIH/3T3細胞表現出較高的AFB1結合水平。發現在這些大分子量雙鏈DNA中，總的AFB1特異活性，即AF1B-dG加合，大約是每10個核苷酸有一個dG結合。這種總特異性也要考慮到大分子量DNA二級或三級結構的存在。與這種觀點一致的發現是AFB1環氧化物與線性3.1Kb雙鏈hhcMDNA的結合為每104個核苷酸有4到8個dG結合。這種較高的結合能力反映了在線性雙鏈PM-1DNA中AFB1環氧化物可以相對容易地與dG結合，而且不能與大分子量天然雙鏈DNA的AFB1-dG結合物形成率相比。
正如從表1所述的實驗中所見，在一種有限的劑量測定法表明AFB1環氧化物與dG的結合使hhcM的細胞轉化能力增加了10到20倍。
表1 PM-1DNA 在NUB/3T3細胞轉化中的AFB1劑量依賴性激活DNA來源AFTB1毫微微摩爾聚焦數//100ng DNA 100ng DNAhhcM(PM-1) 0 15×10-1C-Ha-ras-1 0 465C-K-ras-10 0c-hhc0 0(人肝臟同源染色體)E.coli 0 0hhcM(PM-1) 0 15×10-1hhcM(PM-1) 5 1814 2624 6635 3c-hhc0 08 015 030 040 0AFB1結合與轉染測定如方法中所述。數據計算以每100ng為基礎。在未結合的hhcMDNA測定中，用500ng至1.5μg的DNA進行轉染測定以獲得NIH/3T3細胞的合理聚集形成。以50至500ng DNA的范圍進行AFB1-環氧化物結合DNA的轉染。將數據標準化以表明AFB1-環氧化物激活對hhcM細胞轉化能力的增強。觀察到未結合的PM-1在轉化NIH/3T3細胞時的效率一般是大約15FFU/μg DNA，而AFB1環氧化物激活的PM-1DNA的理想轉化率是66FFU/100ng DNA，增加了20倍。這種增強作用的原因可考慮由于非特異性誘變帶來的。在合適的對照實驗中表明，在相同劑量測定法中，正常肝臟或大腸桿菌DNA的活性缺乏激活任何細胞轉化的能力，因此早已排除了這種增強作用是由于擴散到細胞中的游離AFB或AFB1結合物的再環化所致(Yang et al.1985，上文已參考)。而且在用從c-rask-1或c-hhc中得到的AFB1激活的DNA實驗中，以一種hhcM的正常人體肝臟同源染色體作為合適的對照物，沒有獲得NIH/3T3細胞的細胞轉化。這表明了AFB1環氧化物激活的PM-1 DNA不是一種隨機的現象。再者，PM-1 DNA在細胞轉化效率中的AFB1劑量依賴性(表1)進一步證實了AFB1環氧化物的結合在增強細胞轉化方面的特異性。盡管最佳劑量測定為24毫微微摩爾AFB1/100ng的PM-1 DNA，但是在超過45毫微微摩爾/10.0ng的PM-1 DNA的劑量測定時，觀察到了過多殺傷作用。雖然人DNA以降解的方式被結合到NIH/3T3細胞中，但是在用AFB1環氧化物結合的PM-1DNA轉染的NIH/3T3細胞中沒有獲得轉化的聚焦點(Yang etal.1985 and Modali and Yang,1986，上文已作參考)。這一發現表明，PM-1DNA的過度激活不僅產生分子的分裂，而且可能會發生降解，導致生物活性的喪失。該結果還表明，在hhcMDNA的生物活性受損和該活性的幸存有危險之前，每個PM-1DNA分子中沒有一個或者至多只有幾個AFB1-dG結合物能夠被hhcMDNA接受。而且，hhcMDNA在細胞轉化中的增強作用可能不需要或者至多需要有限量的AFB1結合。
實施例2PM-1DNA在dG上AFB1環氧化物結合的特異性天然DNA中的脫氧鳥嘌呤核苷酸被AFB1環氧化物結合后則變成堿，從而能通過六氫吡啶切割后而被識別，而在同樣的天然DNA中未結合的脫氧鳥嘌呤核苷酸如果不經過二甲硫(堿)處理則不能分裂。圖4表示在飽和條件下結合時PM-1DNA中的dG靶位點。在一系列四核苷酸中評價靶序列時，根據AFB1環氧化物與PM-1DNA中的dG的結合方式可以推斷出一種經驗分子式。表2概括了被AFB1環氧化物所識別和攻擊的一系列四核苷酸系列的核苷酸序列。如圖4所示，下列四核苷酸AGAG,AGTT,TGTT,TGAT或AGAA中任何一種序列中的dG不受AFB1環氧化物攻擊。因而在沒有預先經DMS處理的情況下不會出現序列分裂。AFB1環氧化物攻擊GGGC,CGGC,AGGC,TGGC或CGCG的序列中的dG后產生明顯的dG分裂證實了這一觀點。根據可以被AFB1環氧化物接近的dG靶的各種序列的評價，可以斷定在一種雙鏈DNA中，可能性最小的dG靶位是兩側為dA和dT的位點即Ⅲ型。最適當的dG靶的兩側是dG和/或dC，即Ⅰ型。而dG之前接有dA或T而其后接有dG和dC的四核苷酸序列是AFB1環氧化物的適度優選靶位。也即Ⅱ型位點。由于這種分析是根據線性雙鏈DNA而作的，當然就沒有考慮DNA處于天然狀態下的二級或三級結構。還應當指出的是盡管在雙鏈PM-1DNA中AFB1-環氧化物的dG結合親和性在很大程度上受到鄰位核苷酸的影響。但是沒有發現AFB1-環氧化物與單鏈DNA中的dG結合的特異性。Modali和Yang的發現(1986，上文已引用)與有關AFB1與OX174和pBR322DNA結合的其他研究基本一致(Misra et al.,Biochemistry,1983,22:3351)。
在過去兩年中，一直是將Maxam-Gilbert核苷酸定序法和利用BRL千堿基定序系統的M13雙脫氧方法結合使用來分析hhcM的核苷酸序列。將這些經驗規律用于hhcM3.1Kb核苷酸序列的的計算機分析，已推斷出hhcM的各種位點中最佳和適度優選dG靶位(表3)。雖然在AFB1-環氧化物與線性3.1Kb hhcMDNA結合研究基礎上推斷出了dG靶位點的最大數目60個，但是，通過對hhcM序列可能的二級結構和三級結構的研究表明，能夠被AFB1-環氧化物結合的dG靶位的量卻要小得多。而且，只有少數這樣導致的突變可以產生幸存價值的作用。
表2鄰近的核苷酸順序支配AFB1-環氧化物結合的dG靶位Ⅰ類最佳靶位Ⅲ類最不利的靶位* *GGGG AGAGGGGC AGTGGGGA AGAAGGGT AGACAGATCGGG TGAGAGGG TGACTGGG TGAATGACCGGC TGTGAGGC TGTATGGC TGTCTGTTCGGAAGGATGGACGGTAGGTTGGT*本表代表在用線性雙鏈PM-1 DNA進行研究中所觀察到的AFB1-環氧化物結合的dG靶位。本表沒有列出適度優選的dG靶位點，即Ⅱ型，但在其他文獻中已有記載(Modaliand Yong,1986)。
表3在hhcM核苷酸順序中AFB1-環氧化物優選攻擊的推斷的dG靶位***********CGCC CGGC GGCC GGGC GGGA AGGA TGCC TGCG TGGA TGGG GGAC* ** **CGGC GGGA AGGATGGA TGGG73748497125 98126140221223224307308371391472481494 492495539550
表3(續)***********CGCC CGGC GGCC GGGC GGGA AGGA TGCC TGCG TGGA TGGG GGAC* ** **CGGC GGGA AGGATGGA TGGG560561577692860901112513201321 13301354140414051431154315881637165217651815
表3(續)***********CGCC CGGC GGCC GGGC GGGA AGGA TGCC TGCG TGGA TGGG GGAC* ** **CGGC GGGA AGGATGGA TGGG185318621868187819862064209422052315233123522352246024822718279728842926
為了對這種AFB1誘導的dG--＞T突變的可能效應進行分析，使用帶有一個推斷的dG--＞T點突變，假定是由AFB1-環氧化物誘變所致的20聚物的多核苷酸對hhcMDNA進行靶位點致突變研究。迄今為止，只分析了幾個推斷的dG--＞dT致突變位點，這些位點總結在表4中，在這種研究中使用了帶有SV40T抗原載體中的hhcM序列加上一種抗新霉毒標記物，rpNrpM-1的重組結構，因為它提供了通過它對硫酸慶大霉素(G418)(新霉素的一種類似物)的抗性來選擇轉染細胞的優點。使用hhcM特異的mRNA的表達作為標準，我們通過Northern印跡反應，在半定量分析mRNA，即富RNA的聚A，分析了用致突變的hhcM序列轉染后的抗G418的NIH/3T3細胞中的表達。這些細胞中的點轉化監測4到6周。
從可以確定其核苷酸序列的七個突變克隆中所得的結果表明，迄今為止，未見到引起結構蛋白改變的突變對hhcM的細胞轉化的增強(表4)。另外，導致氨基酸取代的誘導dG--＞T的突變迄今也沒有改變細胞轉化或mRNA水平的表達。這包括可以引起Gly--＞val氨基酸取代的577位突變和由于搖擺編碼而不引起氨基酸取代的1005位的突變。
在hhcM核苷酸序列中，存在著一種編碼了一種大約467個氨基酸多肽的明顯開放閱讀碼，ORF。這與55-57KD蛋白質和某些包括用hhcM特異的mRNA在兔網狀細胞溶解物系統中進行無細胞蛋白合成過程中觀察到的一種53KD蛋白質在內的較小多肽具有良好的一致性。盡管hhcM特異的mRNA水平沒有不同，但是正好在5′的第一個蛋氨酸密碼子前帶有與核糖RNA結合位點一致的序列的5′末端上73和74位核苷酸的dG--＞T突變阻遏細胞轉化。這可能是阻遏蛋白質合成的結果。同樣，由于在每種情況下都插入了一個終止密碼子(UGA)以過早地終止了蛋白合成，因此認為是在492和550處的突變也可以阻遏細胞轉化。
有意義的是要注意到在626位的dG--＞T突變產生一種與RNA聚合酶Ⅱ的強化因子序列類似的序列，據報道，它甚至在編碼序列中可以有功能作用(表4的腳注)。mRNA水平增加了1.5倍，而細胞轉化似乎是每μg DNA只有少數的聚焦點增加。這種發現表明，在本身就是一種適度轉化DNA序列的hhcM中，AFB1誘導的突變是通過增強hhcM表達來增加其轉化的可能。這類似于其他發現所說的由一種含有啟動子和強化因子序列的鼠LTR序列所驅動的細胞ras致癌基因前體的加強表達也可以在原先傾向于不變化的組織培養細胞中引起細胞轉化。
表4在hhcMDNA序列中由靶位點致突變的dG--＞dT突變的效果#on hhcM序列 mRNA合成 細胞轉化*73AGGA--＞ATGA + -@1*74AGGA--＞AGTG + -@1*492TGGG--＞TGTG + -@2*550GGAG--＞GTAG + -@2*577GGGC--＞GTGC + +*626GGGG--＞GTGG ++ ++@3*1005TGCA--＞TTCA + +@1核糖體RNA(16S)結合位點AGGA的分裂*@2終止密碼子UGA的產生*@3生產一種強化因子序列GGTGTGGTAAAG(Watson etal.,1987,Dynan and Tjian,1985,Schaffner et al.1985)和加強表達。#通過方法中所述的轉染分析測定細胞轉化并通過Northern印跡反應分析用〔32P〕3.1Kb hhcMDNA測定轉染細胞中的mRNA合成。
實施例3HhcM-p52和抗-p52以及它們在人類肝細胞癌和涉及肝臟腫瘤前病理狀態中作為篩選和診斷劑的應用。
通過上述的細菌系統以高水平產生融合蛋白HhcM-p52(圖5)。用這種蛋白質產生一組抗涉及人肝細胞癌蛋白的單克隆和多克隆抗體(見圖6A和6B)。產生了一種抗hhcM-p52的一種多價抗體，抗-p52，并且在抗非洲人(Mahlavu)肝細胞癌和費城(Philadelphia)肝細胞癌方面它具有高度特異性(圖6A和圖6B)。
腫瘤樣本提取物必須與具有或不具有放射活性或免疫熒光標記的抗-p52反應進行擴散和免疫沉淀來測定癌樣本中肝細胞癌特異蛋白p52的存在。還可以將用放射活性化合物或發色團標記的抗-p52分別用于RIPA或顏色變化測定試驗來檢查病人脫落在血清和尿樣本中的肝細胞癌相關蛋白的存在。還可以使用與一種熒光化合物或其他合適的化合物結合在一起的抗p52進行系統造影，通過熒光成像分析掃描來就地確定癌前或癌瘤部位。確定了損害部位則可以進行外科激光切除和/或其他治療。
適當標記的HhcM-p52核苷酸序列可用于活組織樣本中肝細胞癌的診斷。在懷疑有癌前結節或肝癌的病人穿刺活檢組織樣本中可以檢出HhcM相關核酸序列。這項工作的完成是通過使用hhcM-p52序列片段作為引物通過聚合酶鏈反應使“hhcM-類似”序列放大，然后用標記的hhcM-p52作為DNA-DNA雜化反應的探針來檢查活檢組織樣本中hhcM-類似序列的存在。這種舉例見圖7所示。
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權利要求
1．一種在分離的細胞樣品中體外檢測肝細胞癌存在的方法，該方法包括a)將來源于所述細胞樣品的核酸序列與一段包含圖1所示核苷酸79至1479的核酸序列的核苷酸片段進行接觸，所用的條件應使得來源于細胞樣品的核酸序列和所述核苷酸片段能夠雜交，由此形成一種復合物；b)檢測所述復合物的存在。
2．根據權利要求1的方法，其中所述核苷酸片段與可檢測標記相連。
全文摘要
本發明涉及一種對肝細胞癌有特異性的致癌蛋白質和一種編碼了這種蛋白質的核苷酸序列。本發明還涉及使用該癌蛋白(或它的特異抗體)和核苷酸序列的篩選和診斷方法和根據該方法而建立的藥盒。
文檔編號C07K14/82GK1221879SQ98116738
公開日1999年7月7日 申請日期1990年12月19日 優先權日1989年12月19日
發明者楊素 申請人:美國政府(美國商務部代表)