專利名稱：氰醇裂解酶催化合成光學活性氰醇化合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種酶催化合成光學活性氰醇化合物，進一步說用氰醇裂解酶在有機溶劑或含微水的有機溶劑體系中催化合成光學活性氰醇化合物。
氰醇化合物是重要的有機合成中間體，可以方便地轉化成α-羥基酮、α-羥基酸、β-胺基醇、胺基腈和氮丙啶等化合物。無酶催化條件下化學合成產物是外消旋的氰醇化合物，由于酶對反應的高度化學、區域和立體的專一性以及酶反應條件溫和，已從化學合成發展為酶催化合成光學活性氰醇化合物。杏仁(Almond)是一個方便的酶源，由杏仁源制得的R-氰醇裂解酶〔(R)-oxymtrilase〕催化合成光學活性氰醇化合物已進行了研究(Griengl，H等，J．Chem．Soc．，Chem．Commun．1997，1933)，用粗制酶和純酶的R-氰醇裂解酶催化反應已有報導(Kiljunen，E等，Tetrahedron，Asymmetry，1996，7．1105；1997，8，1225；1997，8，1551；Effenberger，F．Angew．，Chem．Int．Ed．Engl．，1994，33，1555；Enantiomer．，1996，1，359)。通常水相緩沖液作為滿意的反應條件(Brussee，J等，Tetrahedron，1990，46，979)以及后來發展的水-有機溶劑兩相反應體系。由于羰基化合物和酶分別具有親油性和親水性，在油水兩相反應中反應不均勻，且水相中易產生化學加成的消旋產物而導致產物ee值低，純化困難，難以工業化生產。所以，尋找R-氰醇裂解酶新的反應體系和方法仍是研究的熱點。
本發明的目的是提供一種用R-氰醇裂解酶催化反應制備光學活性氰醇化合物的反應體系和方法。
本發明的另一目的是提供一種采用上述反應體系生產光學活性的氰醇化合物的工藝方法。
本發明是用R-氰醇裂解酶催化羰基化合物和氰化物反應生成光學活性氰醇化合物的體系和方法，即以分子式為R1COR2的羰基化合物、分子式為R3CN的氰化物，在有機溶劑中和0-50℃時，R-氰醇裂解酶催化反應0．01-120小時，推薦反應時間0．05h-48h，其中R1=R4Ph，R4OPh，R4OCH2Ph，
PhCH=CH，R5CH=CH，
或R5，R2=H或C1-3的烷基，R3=H，(CH3)2COH或HCOH，R4=H或C1-4的烷基，X=O或S，R5=C1-8的烷基。所述的羰基化合物和氰化物的摩爾比為1∶0．8-20，推薦比為1∶1-5。羰基化合物和R-氰醇裂解酶的用量比為0．001-100mol羰基化合物／1克R-氰醇裂解酶，推薦0．005-20mol羰基化合物／1克R-氰醇裂解酶。所述的溶劑可以是低碳鏈的酯、醚、芳烴、取代芳烴、烷烴、鹵代烷、酮或二甲基甲酰胺等常用的溶劑。如甲酸甲酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、石油醚、辛烷、環己烷、乙醚、異丙醚，異丁醚、異戊醚、苯甲醚、苯、甲苯、二甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、二氯乙烷、三氯乙烷等。
所述的R-氰醇裂解酶可以采用粗制的杏仁酶粉。上述的有機溶劑可以含有0-1％重量的水。推薦有機溶劑中含有0．01-0．8％重量的水。
本發明中所述的有機溶劑，可以是有機溶劑中含有微量的水；也可以由醋酸或無機酸和NaCN在水中反應制備HCN后，由有機溶劑提取HCN而獲微量水的有機相中。粗制杏仁酶中通常也含有水。本發明中所述的氰化劑，可以是HCN，也可以是丙酮氰醇、甲醛氰醇等。
采用本發明的方法生產光學活性的氰醇化合物時，不僅可以在上述條件下和反應鍋內合成，而且可以采用羰基化合物、氰化物和與有機溶劑的混合物作為流動相，連續流過R-氰醇裂解酶固定床的工藝，如
圖1所示。在反應柱(1)內裝滿R-氰醇裂解酶，該柱可有夾套(2)，以便控溫，混合罐(3)內裝有羰基化合物、氰化物和溶劑，流動相流入反應柱(1)，從另一端出口即可在儲罐(4)中收集產物。還可以是流動相進入反應柱(1)前置一恒流泵(5)，在反應柱另一端流動相出口處置一閥門(6)，以便控制流速。為了防止混合罐(3)內的流動相貯液發生化學加成反應而造成產物ee比值下降，混合罐(3)最好用冰浴冷卻。當采用恒流泵(5)時，流動相也可以從反應柱(1)底部流入，而產物相反從頂部流出。
采用本發明的體系和方法，與有機-水相兩相體系比較，操作簡便，各底物與酶易于接觸，產物易分離和純化，酶穩定和不流失，可反復循環使用，由于該體系中不易產生非酶化學加成反應，提高了反應的立體選擇性。拓展了反應溫度范圍，提高了反應速度，使酶催化反應條件更為寬松。尤其是連續流動相酶催化反應工藝，更適合工業化生產的需要。
下述實施例將有助于理解本發明，但并不限止本發明的內容。
實施例1將100克新鮮或陳年杏仁粉碎，用200ml乙酸乙酯、丙酮或乙醚攪拌1h，過濾，再重復洗滌2-4次，所獲的粗制脫酯杏仁粉即R-氰醇裂解酶貯存于冰箱中備用。
氰化鈉和冰醋酸或硫酸反應后，用溶劑提取方法獲得含氫氰酸有機溶劑溶液，無水Na2SO4干燥后使用。或者直接將HCN試劑加入含0-1％重量水的有機溶劑。將500mg上述粗制杏仁酶粉(R-氰醇裂解酶)、2．5mmol羰基化合物和在10ml溶劑中的2．5-10mmol HCN在反應瓶中攪拌，在下表所示的溫度和反應時間反應，然后過濾回收粗制酶，濾液濃縮，粗產物用硅膠柱層析純化，制成O-保護的乙酸酯或其它衍生物后，氰醇化合物的不對稱純度用CHI RALPAK AD柱進行手征性高壓液相法測定，產率和ee％值結果列于表1。
作為對比，同一體系中加入5％(v／v)0．02M檸檬酸緩沖溶液(pH5．5)的兩相體系的結果列于表2。
表1
表2
*R1=PhCH=CH，R2=H時，在水相介質中不能獲得氰醇化合物(Brussee，J等，Tetrahedron，1990，46，979)。上述化合物分析結果如下(R)-(+)-2-羥基-2-苯基乙腈[α]20D+50．1°(C．1．89CHCl3)；ee＞99％；1H NMR，δppm3．70(S，1H，OH)，5．50(S，1H，CH)；7．50(brs，5H)；IR，cm-13414，3066，3036，2250，1495，1456，1406，1196，1043，765，701；MS(m／z)133(M+，78)，132(M+-1，50)，116(29)，115(43)，106(38)，105(92)，91(14)，77(100)，59(9)，51(45)，43(21)。(R)-(+)-2-羥基-2-(4-甲氧基苯基)乙腈[α]18D+48．5°(C．0．89，CHCl3)；ee=92．4％；1H NMR，δppm3．18(S，1H，OH)，3．82(S，3H，CH3O)，5．46 (S，1H，CH)， 6．94(d，2H，J=8．7Hz)，7．43(d，2H，J=8．7Hz)；IR，cm-13398，2248，1613，1515，1023，823；MS(m／z)163(M+，2)，137(11)，136(91)，135(100)，107(15)，92(14)，77(25)，63(9)，51(5)。(R)-(+)-2-羥基-2-(2-呋喃基)乙腈[α]21D+50．0°(C．1．60，CHCl3)；ee=99％；1H NMR，δppm3．17(brs，1H，OH)，5．55(S，1H，CH)，6．43(dd，1H，J=1．9Hz，J=3．3Hz，呋喃氫)，6．6(m，1H，呋喃氫)，7．49(m，1H，呋喃氫)IR，cm-13403，2256，1500，1400，1269，1234，1149，1030，750；MS(m／z)123 (M+，53)，106(64)，97(27)，96(87)，95(100)，91(70)，77(28)，68(42)，57(76)，43(52)。(R)-(+)-2-羥基-4-苯基-(E)-丁烯-3-腈[α]13D+26．1°(0．78，CHCl3)；ee=69．3％；1H NMR，δppm3．00(d，1H，J=7Hz，OH)，5．17(t，1H，J=5．9Hz，CH)，6．27(dd，1H，J=5．9Hz，J=15．9Hz，=CH)，6．92(d，1H，J=15．9Hz，=CH )，7．33-7．44(m，5H)；IR，cm-13358，3030，2253，1654，1492，1415，1300，1088，1024，976，925，756，695；MS(m／z)159(M+，62)，142(18)，133(96)，132(44)，131(100)，130(78)，115(35)，105(26)，104(35)，103(44)，91(35)，78(25)，77(34)，63(15)，51(24)，43(0．7)。(R)-(+)-2-羥基-2-甲基-己腈[α]22D+2．2°(C1．33，CHCl3)；ee=98．6％；1H NMR，δppm0．94(t，3H，J=7．1Hz，6-H)，1．24(t，2H，J=7Hz，5-H)，1．35-1．51(m，2H，4-H)，1．59(s，3H，1-H)，1．73-1．79(m，2H，3-H)；IR，cm-13445，2961，2938，2875，2242，1465，1379，1172，1143，1063，957，887；MS(m／z)127(M+，0．7)，121(0．2)，110(5)，102(13)，101(100)，94(1)，85(3)，83(5)，71(13)，68(6)，57(8)，43(14)。(R)-(+)-2-羥基-2-苯基丙腈[α]17D+4．6°(C 0．47，CHCl3)；ee=78．1％；1H NMR，δppmIR，cm-13421，2927，2856，2250，1494，1451，1371，1226，1101，764， 699；MS(m／z)149(M++2，9)，148(M++1，5)，147(M+，36)，132(100)，121(10)，105(55)，91(5)，77(34)，63(4)，51(20)，43(14)。(S)-2-(2)-(5-甲基噻吩)-2-羥基乙腈1H NMRδppm1．15(s，3H，CH3)，3．40(br，s，1H，OH)，6．59-7．20(m，2H，Ar-H)；MS(m／z)135(M+，25)，136(48)，127(100)。(S)-2-(2)-(5-正丁基呋喃)-2-羥基乙腈1H NMRδppm0．89(t，3H，CH3)，1．24-1．70(m，6H，(CH2)3)，3．20(br，s，1H，OH)，5．58(s，1H，CH)，6．45-7．21(m，2H，呋喃氫)；MS(m／z)179(M+，48)，162(68)，153(42)，151(100)。(R)-2-羥基-2-(對羥甲基)苯基乙腈1H NMRδppm3．35(s，1H，OH)，3．98(s，1H，OH)，4．68(s，2H，CH2)，5．43(s，1H，CH)，6．88(d，2H，Harom)，7．36(d，2H，Harom)；MS(m／z)163(M+，10)，137(21)，135(100)，77(31)。(R)-2-羥基-2-己烯-2-乙腈1H NMRδppm0．88(t，3H，CH3)，1．22-1．68(m，6H，(CH2)3)，3．20(d，1H，OH)，5．10(t，1H，CH)，6．05-6．48(m，2H，CH=CH)；MS(m／z)139(M+，31)，122(64)，113(100)。(R)-2-羥基-2-(2-萘基)乙腈[α]20D+21°(C．0．78，CHCl3)；1H NMRδppm2．65(brs，1H，OH)，5．72(s，1H，CH)，7．5-7．7(m，3H，Ar-H)，7．8-8．0(m，4H，Ar-H)，MS m／z183(M+，20)，166 (65)，157(100)。
實施例2如圖1所示的裝置中，Φ為1×L45cm的反應柱(1)內裝有同實施例1所述的粗制杏仁粉酶15克，每次分別用10mmol羰基化合物，15mmol HCN和50ml的異丙醚，在室溫下，流動相流速為1ml／15min通過反應柱(1)，收集反應物，濃縮，硅膠柱層析，產物轉化成醋酸酯(H．Griengl，Tetrahedron，52(23)，7833-7840，1996)作HPLC手性拆分。結果如表3所示。
表3
流動相流速變更為1ml／1min、反應溫度為20℃時，結果列于表4。
表4
實施例3．(丙酮)氰醇的合成
丙酮氰醇和甲醛氰醇可以作為酶反應的氰基來源，取代毒性較大的HCN。同實施例2，反應溫度10℃，流動相流速為1ml／15min，酶催化苯甲醛與丙酮氰醇的結果如表5。
表5
實施例4．2-羥基-2-呋喃基乙腈的合成
同實施例2，將10mmol糠醛、15mmol氫氰酸和100ml苯溶液混和，以0．1ml／min的流速通過反應柱(1)，后處理方法相同，產率100％，ee值為93％。
實施例5同實施例4，反應溫度為15℃，流動相流速為0．8ml／min，結果列于表6中。
表權利要求
1．一種以杏仁為酶源的R-氰醇裂解酶催化合成光學活性氰醇化合物的方法，其特征是分子式為R1COR2的羰基化合物、分子式為R3CN的氰化物，在有機溶劑中和0-50℃時，R-氰醇裂解酶催化反應0．01-120小時，其中R1=R4Ph，R4OPh，R4OCH2Ph，
PhCH=CH，R5CH=CH，
或R5，R2=H或C1-3的烷基，R3=H，(CH3)2COH或HCOH，R4=H或C1-4的烷基，X=O或S，R5=C1-8的烷基，所述的羰基化合物和氰化物的摩爾比為1∶0．8-20，羰基化合物和R-氰醇裂解酶的用量比為0．001-100mol羰基化合物／1克R-氰醇裂解酶，所述的有機溶劑含有0-1％重量的水。
2．如權利要求1所述的R-氰醇裂解酶催化合成光學活性氰醇的方法，其特征是所述的羰基化合物和氰化物摩爾比1∶1-5。
3．如權利要求1所述的R-氰醇裂解酶催化合成光學活性氰醇的方法，其特征是所述的羰其化合物和R-氰醇裂解酶的用量比為0．005-20mol／1克R-氰醇裂解酶。
4．如權利要求書1所述的R-氰醇裂解酶催化合成光學活性氰醇化合物的方法，其特征是所述的有機溶劑含有0．01-0．80％重量的水。
5．如權利要求1所述的R-氰醇裂解酶催化合成光學活性氰醇化合物的方法，其特征是所述的R-氰醇裂解酶是經脫脂處理的粗杏仁酶。
6．如權利要求6所述的R-氰醇裂解酶催化合成光學活性氰醇化合物的方法，其特征是反應時間是0．05-48h。
7．如權利要求1所述的R-氰醇裂解酶催化合成光學活性氰醇化合物的方法，其特征是所述的羰基化合物、氰化物和有機溶劑混合物以流動相通過R-氰醇裂解酶固定床。
全文摘要
本發明是以杏仁為酶源的R－氰醇裂解酶催化分子式為R
文檔編號C07C255/00GK1203908SQ98110818
公開日1999年1月6日 申請日期1998年5月4日 優先權日1998年5月4日
發明者林國強, 韓世清, 李祖義 申請人:中國科學院上海有機化學研究所