專利名稱：3－羥甲基頭孢菌素的溶劑萃取的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種從含水發酵液體培養基獲得3-羥甲基頭孢菌素濃水溶液的改進工藝。更具體地說，它涉及含水發酵液體培養基中某些3-羥甲基頭孢菌素中間體的環已酮萃取，隨后反萃到水溶液中，提供所希望的3-羥甲基頭孢菌素中間體的濃水溶液。
背景技術：
7-氨基頭孢菌素酸(7-ACA)及其各種衍生物是頭孢菌素類抗生素生產中的已知重要中間體。7-ACA及其有各種3-位取代基的衍生物可以用已知工藝從發酵衍生的頭孢菌素C得到。例如，頭孢菌素C向7-ACA的轉化可以用已知的化學工藝和酶促工藝進行。
美國專利申請4,533,632描述了一種從含水發酵液體培養基中獲得脫乙酰頭孢菌素C的工藝，并報告這種產物在頭孢菌素衍生物的生產中有優于頭孢菌素C的顯著優點。
美國專利5,424,196等其它參考文獻公開了使含水發酵液體培養基中產生的脫乙酰頭孢菌素C轉化成含有一個3-羥甲基取代基的脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA的酶促工藝。
美國專利4,908,444中的Takeda，美國專利5,221,739中的Lilly，和J.Antibiotics 47(1):64-71,1994，公開了一種用乙酸酐使水溶液中的脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA乙酰化以產生7-戊二酸單酰ACA的工藝，然后，可以用酶促法使后者高產率地水解成7-ACA。
盡管在會利用從含水發酵液體培養基生產的脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA的酶促7-ACA工藝方向上已經取得了進展，但這樣一種工藝仍然不是商業上可行的。一個嚴重的問題是，脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA是以低濃度(～1-3％)從發酵液體培養基中得到的，而且在這些濃度上不能用先有技術方法經濟地進行乙酰化。例如，據以上提到的Lilly專利和J.Antibiotics文章報告，乙酰化反應在高濃度、較好10％以上的脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA時工作得最好。迄今為止，還不可能從脫乙酰頭孢菌素C發酵液體培養基中得到足以使含水乙酰化步驟能商業上可行的濃(≥10％重量/體積)脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA水溶液。
美國專利3,573,296和3,830,809中公開了一種有如下化學式的相關頭孢菌素C衍生物，即N-carbisobutoxy頭孢菌素C，
及其雙二環己胺鹽，作為7-ACA化學合成的有用衍生物。N-carbisobutoxy頭孢菌素C這種中間體在本文中和權利要求書中稱為“頭孢菌素D”。為了利用高效價脫乙酰頭孢菌素C發酵方面改進(見諸如美國專利4,533,632)的優勢而用頭孢菌素D來生產7-ACA，有必要首先使該液體培養基中產生的脫乙酰頭孢菌素C按照美國專利3,573,296的通用程序用氯甲酸異丁酯酰化而轉化成下式的脫乙酰頭孢菌素D
然后，這樣產生的脫乙酰頭孢菌素D還需要按照美國專利4,908,444和5,221,739的通用程序用乙酸酐進行乙酰化，以給出頭孢菌素D。這種產物可以像美國專利3,830,809中公開的那樣方便以雙二環己胺鹽形式分離。
然而，如同在以上討論的脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA的乙酰化的情況下一樣，乙酰化步驟需要高濃度(≥10％重量/體積)的脫乙酰頭孢菌素D才是成本有效的。而且，如同在脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA的情況下一樣，也還沒有任何實用方法能以如此高濃度從發酵液體培養基中得到脫乙酰頭孢菌素D。
已經有多種多樣的有機溶劑用于從含水發酵液體培養基中萃取頭孢菌素產物，例如，乙酸正丁酯、二氯甲烷、甲基·異丁基酮、氯仿和乙酸乙酯。美國專利3,835,129提到，環己酮曾被認為是一種良好的N-酰基頭孢菌素C萃取溶劑，但它當用于大規模作業時產生乳液問題。美國專利4,168,375在頭孢菌素C的磺酰胺衍生物的一份可能萃取溶劑清單中公開了環己酮，但沒有提到3-羥甲基頭孢菌素的萃取。在美國專利3,986,644中用環己酮萃取某些頭孢菌素C亞磷酰胺衍生物，但也沒有提到3-羥甲基頭孢菌素。
本發明者等人已經發現，脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA和脫乙酰頭孢菌素D等3-羥甲基頭孢菌素，難以或不可能用N-封端頭孢菌素C等其它頭孢菌素化合物常用的有機溶劑萃取，但按照本發明的工藝用環己酮作為萃取溶劑使得能從發酵液體培養基中得到足夠的脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA或脫乙酰頭孢菌素D水溶液，從而能經濟地實施以上所述乙酰化步驟，得到7-戊二酸單酰ACA和頭孢菌素D，然后用已知程序把它們轉化成7-ACA。
發明概要本發明提供一種從以較低濃度含有脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA或脫乙酰頭孢菌素D的水溶液、較好的是含水發酵液體培養基、最好的是加工的發酵液體培養基制備脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA或脫乙酰頭孢菌素D的濃(≥10％重量/體積)水溶液的工藝，該工藝包括下列步驟(a)提供一種含有脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA或脫乙酰頭孢菌素D的水溶液、較好的是發酵液體培養基、最好的是加工的發酵液體培養基；(b)使該溶液在約1.5～約3的pH與環己酮接觸，從而把脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA或脫乙酰頭孢菌素D萃取到環己酮溶劑相中；(c)使環己酮溶劑相與水相分離；(d)使環己酮相在約5～約7.5的pH與水相接觸；和(e)分離含有所希望的脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA或脫乙酰頭孢菌素D濃水溶液的水相。
發明詳細說明如以上所指出的，進行商業規模上從脫乙酰頭孢菌素C制備7-ACA的酶促工藝要求關鍵乙酰化步驟，即脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA的乙酸酐水乙酰化而成為7-戊二酸單酰ACA的步驟的經濟產率。這個步驟的經濟產率取決于使用脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA起始原料的濃(≥10％重量/體積)水溶液。然而，當從發酵液體培養基得到這種原料時，它以低得多的濃度存在于液體培養基中，其量為～1-3％(重量/體積)，因此，有必要從發酵液體培養基中萃取脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA并將其濃縮，以使乙酰化步驟變得實用和能與制備7-ACA的化學合成方法競爭。
類似地，在用已知中間體頭孢菌素D通過傳統化學合成路線得到7-ACA時，高度理想的是利用最近在高效價脫乙酰頭孢菌素C發酵方面的改進，即把發酵期間產生的脫乙酰頭孢菌素C轉化成脫乙酰頭孢菌素D，然后從含水液體培養基中以高濃度(≥10％重量/體積)萃取這種材料，從而導致與乙酸酐的水乙基化反應步驟，以高產率給出頭孢菌素D產物。
在一個較好的實施方案中，本發明工藝用一種含有脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA或脫乙酰頭孢菌素D的加工發酵液體培養基作為起始原料。這里使用的“加工發酵液體培養基”這一術語，系指已經用諸如美國專利5,424,196中公開的那樣的酶促工藝轉化成含脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA，或者已經進行了化學轉化，例如用氯甲酸異丁酯酰化而成為含脫乙酰頭孢菌素D的液體培養基的脫乙酰頭孢菌素C發酵液體培養基。脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA或脫乙酰頭孢菌素D必須以可回收量存在于加工的液體培養基中，而且一般以約1～3％(重量/體積)的相當低濃度存在。加工的液體培養基可以直接使用，或在遭遇了pH調整和過濾等純化步驟之后使用。這種加工的液體培養基也可以用一根或多根樹脂柱進行處理以進一步使之純化；這后一種含水介質有時稱為“樹脂洗脫液”。
讓該水溶液，較好的是一種加工的發酵液體培養基，與作為萃取溶劑的環己酮接觸，并攪拌或以其它方式與該液體培養基激烈混合，以給出兩個溶劑相。在用環己酮萃取之前或期間，用一種無機酸如硫酸、硝酸或鹽酸把該溶液或混合物調整到約1.5～約3、較好約2的pH。環己酮萃取步驟的溫度不是決定性的，但較好的是在約0℃～約室溫的范圍內、最好在約5～10℃的范圍內的某一溫度做萃取。萃取之后，水相可以再次用環己酮萃取，以獲得額外量的脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA或脫乙酰頭孢菌素D，將環己酮層合并。環己酮萃取導致從液體培養基中萃取出高百分率、通常90％以上的脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA或脫乙酰頭孢菌素D。
由于產生7-戊二酸單酰ACA或頭孢菌素D的乙酰化步驟是在含水條件下進行的，因而有必要用水反萃含有脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA或脫乙酰頭孢菌素D的環己酮層，給出所希望的濃水溶液。使環己酮相與水相分離，并在約5～約7.5范圍內的pH與水接觸，再次給出兩個溶劑相，此時水相含有脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA或脫乙酰頭孢菌素D。把這兩個溶劑相分離，給出所希望的水溶液。此步驟中pH調整用的堿不是決定性的，但較好的是使用一種乙酸鹽緩沖劑例如乙酸鈉或鉀。這個萃取步驟的溫度可以與環己酮萃取步驟使用的溫度相同。用水反萃給出回收于水相中的、再次超過90％的高產率脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA或脫乙酰頭孢菌素D。
本發明工藝提供≥10％濃度的脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA或脫乙酰頭孢菌素D水溶液。10～20％(重量/體積)范圍內的濃度是可達到的，且15％濃度是容易達到的，且較好用于隨后的乙酰化步驟。組合在一起的萃取和隨后的反萃工藝使得能脫除發酵鹽類以及濃縮脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA或脫乙酰頭孢菌素D。
如以上提到的，已發現環己酮是脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA和脫乙酰頭孢菌素D等3-羥甲基頭孢菌素的一種獨特萃取溶劑。常用來從發酵液體培養基中萃取N-封端頭孢菌素C等其它頭孢菌素中間體的有機溶劑不適用于3-羥甲基頭孢菌素。為了說明這一點，以下各表顯示了用各種各樣工業溶劑萃取的脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA和脫乙酰頭孢菌素D的百分率。
(加工的發酵液體培養基中)脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA的萃取溶劑 萃取％甲基·異丁基酮 5乙酸正丁酯 1乙酸正丁酯/正丁醇(20％)17正丁醇 52.5乙酸乙酯 8.4環己酮 72.5(3次萃取后98％)
(加工的發酵液體培養基中)脫乙酰頭孢菌素D的萃取溶劑 萃取％甲基·異丁基酮45.6乙酸正丁酯13.4乙酸正丁酯/正丁醇(6％)67乙酸乙酯 75.8環己酮88.4環己酮顯然是最好的萃取溶劑，盡管在脫乙酰頭孢菌素D的情況下乙酸乙酯和乙酸正丁酯加丁醇萃取得很好。然而，預料乙酸乙酯的溶劑回收效果不好，因為乙酸乙酯容易水解成乙醇和乙酸。反萃液中丁醇等醇的存在會干擾隨后的乙酰化步驟。也已發現，用環己酮作為萃取溶劑顯著減少了脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA的內酯化。本發明的總萃取/反萃工藝給出10倍以上濃度的脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA或脫乙酰頭孢菌素D，而且所得到的濃水溶液可與水乙酰化反應工藝兼容而無需進一步加工。
以下實例用來說明本發明。
實例12.7％脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA水溶液(1180ml)和環己酮(1180ml)攪拌，添加6N HCl，把混合物調至pH2.0。把該混合物轉移到分液漏斗中萃取。分層，保留環己酮層。水層再用新鮮環己酮(2×1000ml)萃取。合并的環己酮層(3220ml)進行評估，得到一種0.928％溶液。脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA的萃取效率為92％。含有脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA(0.928％)的環己酮萃取物(3215ml)用4.0M乙酸鈉(NaOAc)(90.0ml)反萃。該混合物的初始pH從pH2.4上升到pH5.87。分層，使得能以18.1％濃度提供水層(151.5ml)。脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA的反萃以92％效率完成。脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA萃取的總效率是84％。
實例22.48％脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA水溶液(910ml)和環己酮(910ml)攪拌，添加6N HCl把該混合物從pH7.2調到pH2.0。把該混合物轉移到一個分液漏斗中萃取。分層，保留環己酮層。水層再用新鮮環己酮(2×910ml)萃取。合并的環己酮層(2825ml)進行評估，得到一種0.77％溶液。脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA的萃取效率為96％。含有脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA(0.77％)的環己酮萃取物(2822ml)再用4.8M乙酸鉀(KOAc)(60.0ml)反萃。該混合物的初始pH從pH2.5上升到pH6.45。分層，使得能以14.1％濃度提供水層(122.5ml)(79％)。用1.0M KOAc(2×7.0ml)反萃給出合并水層(18.2ml)(7.6％)。脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA的反萃是以87.6％效率完成的。脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA萃取的總效率是84％。
實例3實驗室規模利用含有脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA溶液的氧化超濾器(UF)滲透液使用一臺Delaval分離器，過濾的含有脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA(2.41％)的發酵液體培養基(10.19L)在pH2.0用環己酮(10.19L)萃取。每次萃取均以1.9L規模進行。新鮮滲透液用來自前一次萃取的富環己酮萃取，以模擬連續萃取。來自最終溶液(1.18％)的一部分富環己酮(3830ml)用4.0M NaOAc(150ml)反萃，給出一種脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA水溶液(250ml)(16.3％)。反萃是以90％效率完成的。
實例4A．分液漏斗萃取脫乙酰頭孢菌素D溶液(17.88g,37.76mmol,1.9L)與環己酮(945ml)一起攪拌(5℃)。該溶液用鹽酸(6N,86.0ml)從pH7.18調整到pH2.27。該兩相混合物攪拌5分鐘，觀察到pH2.18。混合物轉移到分液漏斗中，分層。過濾除去少量白色乳液。環己酮層(750ml)和水層(2195ml)各采樣供HPLC分析。以77.5％產率得到脫乙酰頭孢菌素D環己酮溶液(18.5g/L)。水溶液含有其余脫乙酰頭孢菌素D(0.76g/L,9.4％)。物料平衡是86.9％。
B.用Delaval分離器萃取為便于操作，把脫乙酰頭孢菌素D溶液(4.025L)分成兩份。一份脫乙酰頭孢菌素D溶液(17.36g,36.66mmol,2.0L)與環己酮(1.0L)一起攪拌(5℃)。此溶液用鹽酸(6N,78.0ml)從pH7.7調整到pH2.5。此兩相混合物攪拌5分鐘。另一份脫乙酰頭孢菌素D溶液(17.58g.37.13mmol,2.025 L)與環己酮(1.0L)一起攪拌(5℃)。此溶液用鹽酸(6N,90.0ml)從pH7.86調整到pH2.57。此兩相混合物攪拌5分鐘。兩種混合物都轉移到一臺Delaval分離器上，使有機相與水相分離。有少量白色固體存在于環己酮層中。環己酮層(1710ml)和水層(4020ml)各采樣供HPLC分析。以87.7％產率得到脫乙酰頭孢菌素D環己酮溶液(17.92g/L)。水溶液含有其余脫乙酰頭孢菌素D(0.86g/L,9.9％)。物料平衡是97.6％。
C．反萃到水中脫乙酰頭孢菌素D環己酮溶液(13.86g,29.27mmol,750ml)與乙酸鈉(2.0M,124ml)一起攪拌(10℃)。此溶液攪拌時pH從pH2.13上升到pH5.77(35分鐘)。此溶液轉移到分液漏斗中分離。水層(170ml)和環己酮層(690ml)各采樣供HPLC分析。以92.5％產率得到脫乙酰頭孢菌素D在緩沖劑水溶液中的溶液(75.4g/L)。環己酮溶液含有殘留脫乙酰頭孢菌素D(0.46g/L,2.3％)。物料平衡是94.8％。
權利要求
1．一種從含有較低濃度脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA的水溶液制備脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA的濃(≥10％重量/體積)水溶液的工藝，該工藝包括下列步驟(a)提供一種含有脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA的水溶液；(b)使該溶液在pH為約1.5～約3與環己酮接觸，從而使脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA萃取到環己酮溶劑相中；(c)使環己酮溶劑相與水相分離；(d)使環己酮相與水在pH為約5～約7.5接觸；和(e)使含有所希望的脫乙酰-7-戊二酸單酰ACA濃溶液的水相分離。
2．權利要求1的工藝，其中，步驟(a)的水溶液是一種加工的發酵液體培養基。
3．權利要求1或權利要求2的工藝，其中，步驟(d)包括使用一種乙酸鹽緩沖劑。
4．一種從含有較低濃度脫乙酰頭孢菌素D的水溶液制備脫乙酰頭孢菌素D的濃(≥10％重量/體積)水溶液的工藝，該工藝包括下列步驟(a)提供一種含有脫乙酰頭孢菌素D的水溶液；(b)使該溶液在pH為約1.5～約3與環己酮接觸，從而使脫乙酰頭孢菌素D萃取到環己酮溶劑相中；(c)使環己酮溶劑相與水相分離；(d)使環己酮相與水在pH為約5～約7.5接觸；和(e)使含有所希望的脫乙酰頭孢菌素D濃溶液的水相分離。
5．權利要求4的工藝，其中，步驟(a)的水溶液是一種加工的發酵液體培養基。
6．權利要求4或權利要求5的工藝，其中，步驟(d)包括使用一種乙酸鹽緩沖劑。
全文摘要
頭孢菌素中間體,即脫乙酰－7－戊二酸單酰ACA和脫乙酰頭孢菌素D,是從以不太濃形式含有所述中間體的水溶液中通過利用環己酮的溶劑萃取然后反萃到水中而以濃水溶液形式得到的。中間體濃水溶液呈一種可以用于利用已知程序生產7－ACA的形式。
文檔編號C07D501/28GK1226250SQ97196848
公開日1999年8月18日 申請日期1997年7月18日 優先權日1996年7月29日
發明者G·M·F·利姆, J·M·勞比, V·H·奧迪爾 申請人:布里斯托爾-邁爾斯斯奎布公司