專利名稱：通過調節轉錄因子活性調節t細胞亞群的制作方法
背景技術：
CD4+T輔助細胞不是同質的群體，但是可以基于細胞因子分泌劃分為至少二個稱為T輔助1型(Th1)和T輔助2型(Th2)的亞群(參見例如Mosmann,T.R.等(1986)J.Immunol.136:2348-2357；Paul,WE和Seder,R.A.(1994)Cell76:241-251；Seder,R.A.和Paul,W.E.(1994)AnnRev.Immunol.12:635-673)。Th1細胞分泌白介素-2(IL-2)和干擾素-γ(IFN-γ)而Th2細胞產生白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-10(IL-10)和白介素-13(IL-13)。這二個亞群均產生諸如腫瘤壞死因子(TNF)和粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的細胞因子。除了它們細胞因子表達的型式不同之外，據認為Th1和Th2細胞具有不同的功能活性。例如，Th1細胞參與誘導遲發型超敏反應應答，而Th2細胞參與對B淋巴細胞提供有效的“幫助”并刺激產生IgG1和IgE抗體。
現有足夠的證據表明，Th1與Th2細胞的比例與包括自身免疫病、變態反應疾病和傳染病的一大批免疫介導的臨床疾病的結果高度相關。例如，在小鼠的實驗性利什曼原蟲鼠感染中，對感染有抗性的動物主要增加Th1應答，而對進行性感染易感的動物則主要增加Th2應答(Heinzel,F.P.，等(1989)J.Exp.Med.169:59-72；Locksley,R.M.和Scott,P.(1992)Immunoparasitology Today1:A58-A61)。在鼠血吸蟲病中，觀察到Th1向Th2轉換與雌寄生蟲向組織中排卵同時發生，并與該疾病狀況的惡化相關聯(Pearce,E.J.等(1991)J.Exp.Med.173:159-166；Grzych,J-M.等，(1991)J.Immunol.141:1322-1327；Kullberg,M.C.,等(1992)J.Immunol.148:3264-3270)。包括慢性感染(例如人免疫缺陷病毒(HIV)和結核病)和某些轉移性癌的許多人類疾病的特征亦為Thl向Th2轉換(參見例如Shearer,G.M.和Clerici,M.(1992)Prog.Chem.Immunol.54:21-43；Clerici,M和Shearer,G.M.(1993)ImmunologyToday 14:107-111；Yamamura,M，等(1993)J.Clin.Invest.91:1005-1010；Pisa,P.，等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:7708-7712；Fauci,A.S.(1988)Science239:617-623)。另外，已顯示某些自身免疫病與占優勢的Th1應答相關聯。例如，類風濕性關節炎患者在滑液組織中具有占優勢的Th1細胞(Simon,AK.，等(1994)proc.Natl.Acad Sci.USA91:8562-8566)，用自體反應Th1細胞可以誘導實驗性自免疫腦脊髓炎(EAE)(Kuchroo,V.K.，等(1993)J.Immunol.151:4371-4381)。
改變或操縱Th1和Th2亞群比例的能力要求了解CD4 T輔助前體細胞(Thp)分化的機制，所述前體細胞僅分泌IL-2，選擇成為Th1或Th2效應物細胞。很清楚細胞因子自身是有效的Th細胞誘導物并形成一自調節環(參見例如Paul,W.E.和Seder,R.A.(1994)Cell76:241-251；Seder,R.A.和Paul,W.E.(1994)Ann.Rev.Immunol.12:635-673)。因此，IL-4促進Th2細胞分化并防止前體分化成為Th1細胞，而IL-12和IFN-γ則具有相反的作用。因此一種可能的改變Th1:Th2比例的方法是增加或降低選擇的細胞因子的水平。已顯示直接給予細胞因子或細胞因子的抗體對某些由或者Th1或者Th2細胞介導的疾病有效。例如，給予重組IL-4或IL-12抗體改善了Th1驅動的自身免疫病EAE(參見Racke；M.K.等(1994)J.Exp.Med.180:1961-1966；和Leonard,J.P.等(1995)J.Exp.Med.181:381-386)，而抗IL-4抗體則治愈了Th2介導的寄生蟲病大型利什曼原蟲(Sadick,M.D.等(1990)J.Exp.Med.171:115-127)。然而，做為治療的可選手段，系統給予細胞因子或抗體可能具有不良副作用，因此，仍然需要操縱Th1/Th2亞群的置換方法。
IL-4在Th2細胞中的組織特異性表達或任何T細胞細胞因子的分子基礎一直難以理解。一種可能是存在選擇性地使細胞因子沉默的阻遏蛋白。已有很多文獻描述細菌、酵母和哺乳動物基因的轉錄沉默。實例包括大腸桿菌熱調節基因(Groansson,M.等(1990)Nature344:682-685)、酵母α2交配型基因(Keleher,C.A.等(1988)Cell53:927-936)和哺乳動物MHCI型和TcRα基因(Weisman,J.D.和Singer,D.S.(1991)Mol.Cell.Biol.11:4228-4234；Winoto,A.和Blatimore,D.(1989)Cell59:649-655)。確實，涉及將IL-2基因組DNA注射入非洲爪蟾屬卵母細胞的早期實驗提示，在與與激活相對的靜息T細胞提取物中存在IL-2的阻遏蛋白(Mouzaki,A.等(1991)EMBO J.10:1399-1406)。這些研究提示、在靜息T細胞中缺乏IL-2產生應歸于通過與該IL-2啟動子的負元件相互作用使IL-2轉錄沉默的蛋白。
第二種可能性是存在Th選擇性反式激活蛋白。細胞因子基因轉錄元件的研究提供了對這些細胞因子基因調節的了解。例如，對IL-4細胞因子啟動子的分析揭示了對包括NF-AT和AP-1家族成員的幾個轉錄因子的功能關鍵位點(Rooney,J.W.等(1995)Immunity2:473-483；Szabo,S.J.等(1993)Mol.Cell.Biol.13:4793-4805)。NF-AT是含有環孢菌素A敏感性胞質磷蛋白和由AP-1家族成員蛋白組成的可誘導核組分的多亞基轉錄復合物(Flanagan,W.M.等(1991)Nature352:803-807；Jain,J.等(1992)Nature356:801-804)。NF-ATp的純化和克隆揭示了與轉錄因子的NFκB家族的Rel同源域(RHD)有限序列相同的區(McCaffey,P.G.等(1993)Science262:750-754)。三個相關基因NF-ATc、NF-AT4/x/c3和NF-AT3/c4的后續克隆和測序揭示了類似的結構域。NF-AT家族成員在該域內共有約70％序列類似性并與轉錄因子的Rel/NFκB家族的RHD有約18％序列類似性。與其在RHD中的非常有限的序列類似性一致，在NFκB和NF-AT蛋白的行為中有顯著的差異，對介導NF-AT靶基因轉錄調節的途徑知之甚少。然而，考慮到NF-AT家族成員可以結合并反式激活包括IL-2和IL-4的多個細胞因子基因的啟動子(Rooney,J.等(1995)Immunity2:545-553；Szabo,S.J.等(1993)Mol.Cell.Biol.13:4793-4805；Flanagan,W.M.等(1991)Nature352:803-807；Northrop,J.P.等(1994)Nature369:497),NF-AT蛋白不可能直接對介導Th1或Th2特異性細胞因子轉錄負責。
細胞因子啟動子調節區內的大多數(即使不是全部)NF-AT結合位點伴隨有結合通常為AP-1家族成員的輔助轉錄因子的附近位點。已顯示NF-AT和AP-1蛋白協同和協作地結合，并對IL-2和IL-4啟動子的完全活性是必需的。已顯示不同的AP-1蛋白，具體地說為c-Jun、c-Fos、Fra-1、Fra-2、Jun B和Jun D，與這些位點結合(Rao,A等(1994)Immunol.Today15:274-281；Jain,J.等(1993)Nature365:352-355；Boise,L.H.等(1993)Mol.Cell.Biol.13:1911-1919；Rooney,J.等(1995)Immunity 2:545-553；Rooney,J.等(1995)Mol.Cell.Biol.15:6299-6310)。然而，所有這些AP-1蛋白均未以Th1或Th2特異性方式表達，并且沒有AP-1家族成員差異募集至所述IL-2或IL-4復合位點的證據(Roorney,J.等(1995)Mol.Cell.Biol.15:6299-6310)。因此，或者NF-AT蛋白或者AP-1家族成員c-Jun、c-Fos、Fra-1、Fra-2、Jun B和JunD均不可能是IL-4在Th2細胞中的組織特異性轉錄的原因。
發明概述本發明涉及通過調節一種或多種調節Th2特異性細胞因子基因表達的轉錄因子的活性調節Th2相關細胞因子產生和調節Th1或Th2亞群的方法、涉及可用于這種調節的組合物。如本文進一步描述的，現已發現Th2細胞中IL-4的組織特異性表達不是因為阻遏蛋白而是因為Th2特異性反式激活。現已證實，原癌基因c-Maf對Th2相關細胞因子白介素-4的組織特異性表達負責。另外，c-Maf在非Th2細胞的細胞(例如Th1細胞、B細胞和非淋巴樣細胞)中異位表達，導致該IL-4啟動子激活并在適當條件下產生內源IL-4。另外已發現c-Maf和NF-AT協同激活Th2相關細胞因子基因表達。
另外，現已分離和特征鑒定了稱為NIP45(即NF-AT相互作用蛋白45(NF-AT Interacting Protein45))的與NF-AT蛋白家族成員相互作用的45kDa蛋白。基于它與Rel同源域(RHD)相互作用的能力分離NIP45。已顯示NIP45與NF-AT和c-Maf協同刺激細胞因子基因表達。NIP45增強由c-Maf和NF-AT介導的基因表達，使得當這三個因子(c-Maf、NF-AT和NIP45)在細胞中均有活性時，刺激高水平內源IL-4產生。另外再發現缺乏諸如p18的反式激活域的小maf蛋白可以阻遏Th2相關細胞因子基因表達，例如由c-Maf介導的表達。
因此，本發明涉及通過調節一種或多種與NF-AT家族蛋白協作以調節Th2相關細胞因子基因表達的轉錄因子的表達或活性調節Th2相關細胞因子表達的方法。在一個實施方案中，與NF-AT家族蛋白協作調節Th2相關細胞因子基因表達并因此其表達或活性受調節的轉錄因子是Th2特異性轉錄因子(例如Th2特異性maf家族蛋白)。在另一實施方案中，與NF-AT家族蛋白協作調節Th2相關細胞因子基因表達并因此其表達或活性受調節的轉錄因子是maf家族蛋白，例如c-Maf。在再一實施方案中，與NF-AT家族蛋白協作調節Th2相關細胞因子基因表達并因此其表達或活性受調節的轉錄因子是與NF-AT家族蛋白相互作用的蛋白，例如NIP45。在再一實施方案中，調節諸如p18的小maf蛋白的表述或活性。本發明的方法可以涉及調節一個轉錄因子(例如c-Maf或p18)或轉錄因子的組合(例如c-Maf+NF-AT、或NF-AT+NIP45、或c-Maf+NF-AT+NIP45)的表達或活性。
本發明的調節方法一般涉及用調節轉錄因子表達或活性的藥物接觸細胞，使得調節細胞的Th2相關細胞因子的產生。具體地說，本發明的推薦藥物在細胞內作用以調節該轉錄因子的活性。在一個實施方案中，本發明的調節方法刺激Th2相關細胞因子的產生。例如，可以在Th1細胞、B細胞或非淋巴樣細胞中刺激Th2相關細胞因子的產生。在另一實施方案中，本發明的調節方法抑制Th2相關細胞因子的產生。在該方法中受調節的Th2相關細胞因子最好為白介素-4。
可以使用各種藥物刺激調節Th2相關細胞因子基因表達的轉錄因子的表達或活性。例如，本發明的刺激性藥物可以是編碼導入該細胞并在其中表達的轉錄因子的核酸分子。或者，可以使用增強該轉錄因子的表達或活性的化學藥物做為刺激性藥物。
可以使用各種藥物抑制調節Th2相關細胞因子基因表達的轉錄因子的表達或活性。適當的抑制性藥物的實例包括與編碼該轉錄因子的基因互補的反義核酸分子、結合該轉錄因子(例如在細胞核內)的胞內抗體、該轉錄因子的抑制形式(例如顯性失活形式)和抑制該轉錄因子表達或活性的化學藥物。
本發明亦包含涉及調節兩種、三種或多種調節Th2相關細胞因子基因表達的轉錄因子的表達或活性的聯合方法。因此，在本發明的其它實施方案中，用至少一種調節至少一種對調節Th2相關細胞因子基因起作用的其它轉錄因子的活性的藥物接觸細胞。最好，該至少一種其表達或活性受調節的其它轉錄因子選自NF-AT家族蛋白、NF-AT相互作用蛋白、maf家族蛋白和AP-1家族蛋白。
可以按照本發明的方法在體外或體內調節細胞的細胞因子產生。在一個實施方案中，用調節藥物在體外接觸細胞，然后將該細胞給予受治療者以由此調節該受治療者中Th1和/或Th2亞群的發育。因此，在另一方面，本發明提供在受治療者中調節Th1或Th2亞群發育的方法。除了其中將活體外修飾的細胞給予該受治療者的實施方案之外，在另一實施方案中，這些方法涉及直接給予該受治療者調節一種或多種調節Th2相關細胞因子基因表達的轉錄因子活性的藥物，使得該受治療者中的Th1或Th2細胞的發育展受到調節。
可以用本發明的調節方法在各種臨床情況中操縱Th1∶Th2比例。例如，抑制Th2形成可以用于變態反應疾病、惡性腫瘤和傳染病中，而增強Th2形成可以用于自身免疫病和器官移植。
本發明的再一方面涉及NIP45組合物。本發明提供NIP45蛋白和分離的編碼NIP45的核酸序列的分離的組合物、與其相關的其它組合物和其使用方法。已確定NIP45蛋白的氨基酸序列(示于SEQ ID NO:6)，已分離編碼NIP45蛋白的cDNA(其核苷酸序列示于SEQ ID NO；5)。在一個方面，本發明提供編碼NIP45的分離核酸分子或其片段。在一個實施方案中，本發明提供包含編碼NIP45蛋白的核苷酸序列的分離核酸分子。在另一實施方案中，本發明提供包含編碼蛋白的核苷酸序列的分離核酸分子，其中該蛋白包含與SEQ ID NO:6的氨基酸序列同源的氨基酸序列并與NF-AT家族蛋白的Rel同源域相互作用。在再一實施方案中，本發明提供在嚴格條件下與包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列的核酸分子雜交的分離核酸分子。在再一實施方案中，本發明提供包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列的分離核酸分子。在其它實施方案中，本發明提供編碼SEQ ID NO:6的氨基酸序列的分離核酸分子。本發明亦包含編碼NIP45融合蛋白的分離核酸分子和分離反義核酸分子。
本發明的另一方面涉及含有本發明的NIP45核酸分子的載體(例如重組表達載體)和已導入這種載體的宿主細胞。在一個實施方案中，通過在合適的培養基中培養該宿主細胞，使用這種宿主細胞產生NIP45蛋白。如果需要，然后可以從該宿主細胞或該培養基分離NIP45蛋白。
本發明的再一方面涉及分離的NIP45蛋白或其部分。在一個實施方案中，本發明提供與NF-AT家族蛋白相互作用的分離的NIP45蛋白或其部分。在再一實施方案中，本發明提供包含與SEQ ID NO:6的氨基酸序列同源的氨基酸序列并與NF-AT家族蛋白相互作用的分離蛋白。本發明亦包含NIP45融合蛋白。
可以使用本發明的NIP45蛋白或其片段制備抗NIP45抗體。因此，本發明還提供特異性結合NIP45蛋白的抗體。在一個實施方案中，該抗體是單克隆的。在另一實施方案中，用可檢測物質標記該抗體。
可以使用本發明的NIP45編碼核酸分子制備非人類轉基因動物，該動物含有攜帶編碼NIP45蛋白或NIP45蛋白部分的轉基因的細胞。因此，本發明亦提供這種轉基因動物。在一個實施方案中，由該轉基因動物攜帶的該NIP45轉基因改變了編碼內源NIP45蛋白的內源基因(例如同源重組動物)。
本發明的另一方面涉及檢測NIP45蛋白或NIPmRNA在生物樣品中存在的方法。為檢測NIP45蛋白或NIPmRNA，用可以檢測NIP45蛋白(例如標記抗NIP45抗體)或NIP45mRNA(例如可以與NIP45mRNA雜交的標記核酸探針)的藥物接觸該生物樣品，使得檢測到NIP45蛋白或NIPmRNA在該生物樣品中的存在。
本發明的再一方面涉及鑒別調節NIP45的活性或表達的化合物的方法和鑒別調節NIP45與NF-AT家族蛋白之間相互作用的化合物的方法。本發明亦包含鑒別與NIP45相互作用的蛋白的篩選方法。
本發明的再一方面涉及為在宿主細胞中表達maf蛋白的組合物，該宿主細胞諸如為免疫細胞和表達maf蛋白的宿主細胞。在一個實施方案中，這些組合物包括編碼maf家族蛋白的重組表達載體，其中所述maf編碼序列操作性地連接至指導該maf家族蛋白在特定細胞類型諸如淋巴樣細胞(例如T細胞或B細胞)或造血干細胞中表達的調節序列。在另一實施方案中，這些組合物包括宿主細胞，諸如宿主淋巴樣細胞(例如宿主T細胞或宿主B細胞)或宿主造血干細胞，所述宿主細胞中已導入了編碼maf家族蛋白的重組表達載體。
本發明還提供表達c-Maf蛋白的轉基因動物。在一個最佳實施方案中，該轉基因動物是小鼠，并且該小鼠在T細胞中過量表達c-Maf，最好使用包含操作性地連接至c-mafcDNA的CD4啟動子/增強子的轉基因。
附圖簡述
圖1A是所使用的細胞融合方法的圖解，以證明細胞因子表達不是因為阻遏物引起的。
圖1B是逆轉錄酶-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)分析由未融合Th1克隆(D1.1)、未融合Th2克隆(D10)、Th1和Th2同核體和Th1-Th2異核體表達的IL-2和IL-4細胞因子、對照β-肌動蛋白、mRNA。
圖2A是Northern印跡分析，描繪在Th1細胞、Th2細胞或B淋巴瘤細胞中分離的cDNA克隆的表達。使用對GAPDH特異性的對照探針以顯示相等RNA上樣量。
圖2B是Northern印跡分析，描繪在體外正常原初脾細胞分化成為Th2細胞期間分離cDNA克隆向上調節的表達。從在標明的時間點收獲的細胞分離總RNA。通過ELISA測定適當稀釋度的培養上清液的細胞因子(IL-10)的產生，以測定分化為Th1或Th2譜系。
圖3A是直方圖，描繪在Th1克隆(AE7)中由c-Maf反式激活IL-4啟動子。用野生型IL-4 CAT報道構建物和或者對照質粒(pMEX-NeoⅠ)、c-Maf表達質粒(pMEX-Maf)或者c-Fos表達質粒(pMEX-c-Fos)共轉染AE7細胞。于轉染后24小時用抗CD3抗體刺激每個樣品的一半。在轉染后48小時收獲所有樣品，并測定相對CAT活性。
圖3B是薄層層析板的照片，描繪M12B淋巴瘤細胞中的相對CAT活性，該細胞已用野生型IL-4CAT報道構建物和或者兩種對照質粒(pMEX-NeoⅠ和pREP4)、c-Maf表達質粒和對照質粒(pMEX-Maf和pREP4)、c-Fos表達質粒和對照質粒(pMEX-c-Fos和pREP4)、c-Jun表達質粒和對照質粒(pMEX-c-Jun和pREP4)、對照質粒和NF-ATp表達質粒(pMEX-NeoⅠ和pREP-NF-ATp)、c-Maf表達質粒和NF-ATp表達質粒(pMEX-Maf和pREP-NF-ATp)或者c-Fos表達質粒和NF-ATp表達質粒(pMEX-c-Fos和pREP-NF-ATp)共轉染。于轉染后24小時用PMA和離子霉素刺激每個樣品的一半。在轉染后48小時收獲所有樣品并測定相對CAT活性。
圖4是一直方圖，描繪通過c-Maf和NF-ATp異位表達在M12細胞中內源產生IL-4。將用標明的對照質粒或表達質粒穩定轉染的細胞或者不刺激或者用PMA和離子霉素刺激24小時。對每個樣品的200μl上清液進行ELISA以進行細胞因子定量。
圖5A是使用于用抗CD3抗體刺激后的標明時間點收獲的Th2(D10,CDC35)或Th1(AE7,S53)克隆的核提取物進行的該IL-4啟動子的DNA酶Ⅰ足跡凝膠照片，它描繪在該IL-4啟動子內緊接著該推測MARE位點下游的Th2特異性足跡。用*指示在該II-4啟動子的非編碼鏈上的二個Th2特異性超敏殘基。在該DNA酶Ⅰ處理的樣品旁進行了五個泳道的IL-4啟動子探針(無核提取物)和Maxam-Gilbert A/G梯的DNA酶Ⅰ消化物。
圖5B圖解表示鼠IL-4啟動子的近端調節區。上部顯示該鼠IL-4啟動子的一級序列。標明的數字是相對于于+1的轉錄起始位點而言的。星號指示在DNA酶Ⅰ足跡上觀察到的Th2特異性超敏殘基。底部顯示在圖6和7中所示的EMSA和功能檢測中使用的野生型(-59至-28)寡核苷酸和所述4bp突變體的序列。改變的核苷酸以小寫粗體顯示并對應于上部中顯示的編號系統。
圖6是電泳遷移率變動檢測(EMSA)的照片，證實是c-Maf而不是c-Jun結合至近端IL-4啟動子并與NF-ATp形成復合體。用標明的蛋白和標記的雙鏈寡核苷酸進行EMSA。
圖7A是直方圖(上部)和薄層層析板(底部)的照片，描繪M12細胞中相對CAT活性，所述M12細胞已用c-Maf表達載體和或者野生型IL-4CAT報道構建物或者示于圖5B中的一種4bp突變體共轉染，證明c-Maf對該IL-4啟動子的反式激活反映到該MARE和Th2特異性足跡上。將三個獨立實驗的平均和一個代表性實驗分別示于上部和底部。
圖7B是使用重組c-Maf、IL-4啟動子(-59至-27)探針和標明的未標記雙鏈寡核苷酸做為競爭物進行的EMSA的照片，證明重組c-Maf與IL-4啟動子的結合反映到該MARE和Th2特異性足跡上。
圖8是三份的酵母菌落照片，它們用NIP45質粒和或者NF-ATp-RHD做為“餌”或者對照餌Max、CDK2或pEG202與LacZ報道質粒pSH18轉化，表明僅僅那些含有NIP45質粒和NF-ATp-RHD餌的菌落表達LacZ報道基因。
圖9是免疫沉淀/Western印跡實驗的照片，證明NIP45和NF-ATp在HepG2細胞中相互作用。
圖10是比較分離自酵母雙雜種篩選的原始NIP45cDNA克隆(上部)和分離自D10.G4λzapⅡ文庫的最長的NIP45cDNA克隆(底部)的結構的示意圖。
圖11描繪原始NIP cDNA克隆分離物的核苷酸序列和推測的氨基酸序列。
圖12描繪NIP45cDNA的疏水性標繪圖。
圖13是RNA印跡分析在各種組織中NIP45轉錄物水平的照片。
圖14A是BHK細胞的免疫熒光分析的照片，所述細胞用編碼HA表位標記的NIP45蛋白的表達構建物轉染并用HA肽特異性單克隆抗體做為一級抗體和indocarbocyanine標記的山羊抗小鼠二級試劑檢測。
圖14B是用DNA染色染料Hoechst33258復染的圖7A中所述相同細胞的照片。
圖14C是未刺激的BHK細胞的免疫熒光分析的照片，所述細胞用編碼NF-AT4表達構建物轉染并用抗NF-AT4特異性抗體做為一級抗體和indocarbocyanine標記的山羊抗小鼠二級試劑檢測。
圖14D是用DNA染色染料Hoechst33258復染的圖7C中所述相同細胞的照片。
圖14E是離子霉素處理的BHK細胞的免疫熒光分析的照片，所述細胞用編碼NF-AT4表達構建物轉染并用抗NF-AT4特異性抗體做為一級抗體和indocarbocyanine標記的山羊抗小鼠二級試劑檢測。
圖14F是用DNA染色染料Hoechst33258復染的圖7D中所述相同細胞的照片。
圖15是HepG2細胞中CAT檢測結果的照片(左)和定量測定CAT活性相對倍數誘導(fold induction)的直方圖(右)，所述細胞已用3X NF-AT-CAT報道基因構建物(含有三個NF-AT結合位點)和或者對照表達質粒或者僅NF-AT家族表達質粒(NF-ATp、NF-ATc、NF-AT3或NF-AT4)本身(-)或者與NIP45表達質粒的組合物(+)轉染。
圖16是HepG2細胞中CAT檢測結果的照片(左)和定量測定CAT活性相對倍數誘導的直方圖(右)，所述細胞已用IL-4-CAT報道基因構建物(延伸至IL-4啟動子的-732bp)和NF-ATp、NIP45和/或c-Maf表達構建物的組合物轉染，如標明那樣。
圖17是直方圖，描繪在M12B淋巴瘤細胞上清液中IL-4(以pg/ml計)水平，所述細胞已用NF-ATp、c-Maf的表達質粒和pCI載體對照(上部條帶)或NF-ATp、c-Maf和NIP45的表達質粒(底部條帶)瞬時共轉染。
圖18是在體外正常原初脾細胞分化成為Th2細胞期間的第0、1、3、5或7天表達的轉錄物的Northern印跡分析，描繪c-maf隨時間向上調節表達和p18隨時間向下調節表達。
圖19是薄層層析板的照片，描繪M12細胞中相對CAT活性，該細胞已用IL-4啟動子報道基因構建物和或者單獨的c-Maf表達載體(5μg)、單獨的p18表達載體(10μg)或者恒定量的c-Maf表達載體(5μg)與增加量的p18表達載體(2.5、5或μg)轉染，描繪p18阻遏IL-4啟動子活性。
圖20是使用CD4啟動子/增強子以調節c-maf cDNA表達的T細胞中c-maf轉基因過量表達的示意圖。
圖21是直方圖，描繪或者野生型小鼠或c-maf轉基因小鼠的淋巴結(LN)、脾或胸腺中總細胞數(x106)，證實c-maf轉基因小鼠表現出在淋巴器官中細胞數降低。
圖2是直方圖，描繪野生型小鼠或c-maf轉基因小鼠中血清IgE的基礎水平(ng/ml)，證實c-maf轉基因小鼠表現出血清IgE基礎水平提高。
發明詳述在一個方面，本發明涉及通過調節轉錄因子的活性而調節細胞因子表達和T亞群的方法和組合物。本發明至少部分基于以下發現Th2特異性表達白介素-4基因不是因為特定阻遏蛋白的作用(如實施例1中顯示的)，而是因為特定反式激活的作用。如本文進一步描述的，現已鑒別出對Th2特異性表達白介素-4基因負責的反式激活蛋白是c-Maf原癌蛋白，它選擇性地在分化中的和成熟Th2細胞中表達，并且不存在于Th1細胞中(參見實施例2)。c-Maf在通常不表達c-Maf的細胞(例如Th1細胞和B細胞)中異位表達，導致該IL-4啟動子反式激活(參見實施例3)并在適當條件下產生內源IL-4(參見實施例4)。另外，在Th2細胞而不是Th1細胞的核提取物中存在的一種蛋白印記了maf效應元件(MARE)區的IL-4啟動子(參見實施例5)，并且重組c-Maf于體外結合至該IL-4啟動子上(參見實施例6)。c-Maf反式激活IL-4的能力反映到該IL-4啟動子內的MARE和Th2特異性足跡上(參見實施例7)。
本發明還至少部分基于發現與NF-AT相互作用的并增強由c-Maf和NF-AT造成的轉錄激活的蛋白。基于它與NF-AT的Rel同源域(RHD)的相互作用鑒別該蛋白NIP45(參見實施例8)。共免疫沉淀實驗證實，NIP45與NF-AT于體內于哺乳動物細胞內相互作用(參見實施例9)。編碼NIP45的cDNA已被測序和表征(參見實施例10)。對NIP45mRNA的組織表達型式的檢查揭示，NIP45轉錄物優先在脾臟、胸腺和睪丸中表達(參見實施例11)。亞細胞定位研究證實，NIP45蛋白在細胞核內均勻分布(參見實施例12)。功能研究顯示，NIP45與NF-AT協同刺激來自含有NF-AT結合位點的啟動子的轉錄，并且還與NF-AT和c-Maf協同刺激來自IL-4啟動子的轉錄(參見實施例13)。另外，NIP45、NF-AT和c-Maf可以一致作用，在通常不表達IL-4的細胞(例如B細胞)中誘導內源IL-4基因表達(參見實施例14)。
本發明再至少部分基于以下發現缺乏激活域的小maf蛋白p18可以阻遏由c-Maf介導的細胞因子基因表達。體外T輔助細胞前體的分化與c-maf基因表達的向上調節和p18基因表達的向下調節相聯系(參見實施例15)。另外，與在僅存在c-Maf時的IL-4啟動子活性相比，p18與c-Maf共表達阻遏了IL-4啟動子活性(參見實施例16)。
本發明再基于在T細胞中過量表達c-Maf蛋白的c-maf轉基因動物的產生(參見實施例17)。這些動物表現出與過量表達IL-4的轉基因動物非常類似的表現型，即小胸腺和脾臟、CD+/CD8+(雙陽性)胸腺細胞數量顯著下降、CD4+陽性T細胞下降和血清IgE基礎水平增加。
為使更易理解本發明，首先定義某些術語。
本文使用的術語“Th2相關細胞因子”指優先或僅由Th2細胞而不是Th1細胞特產生的細胞因子。Th2相關細胞因子的實例包括IL4、IL-5、IL-6和IL-13。按照本發明的方法調節其產生的優選Th2相關細胞因子是白介素-4。
本文使用的術語“轉錄因子”指于細胞核內起作用以調節基因的轉錄表達的因子(例如蛋白)。術語“轉錄因子”包括直接調節轉錄的因子(例如具有固有(mstrinsic)轉錄激活或抑制活性)和間接調節轉錄的因子(例如通過與具有固有轉錄激活或抑制活性的其它因子相互作用)。
本文使用的“與激活T細胞核因子家族蛋白協作調節Th2相關細胞因子基因表達”的轉錄因子指與NF-AT蛋白協同或一致作用調節Th2相關細胞因子基因表達的轉錄因子。也就是說，與單獨存在時相比，NF-AT和該協作性轉錄因子均存在時Th2相關細胞因子基因(例如IL-4)表達較高。該協作性轉錄因子可以與NF-AT有或沒有物理聯系。與NF-AT家族蛋白協作調節Th2相關細胞因子基因表達的轉錄因子包括maf家族蛋白(例如c-Maf)和NF-AT相互作用蛋白(例如NIP45)。
本文使用的“對Th2相關細胞因子基因的調節起作用”的轉錄因子指參與Th2相關細胞因子基因轉錄調節的轉錄因子，而不論它是否與NF-AT家族蛋白協作。與NF-AT協作調節Th2相關細胞因子基因表達的轉錄因子亦是對Th2相關細胞因子基因的調節起作用的因子。然而，其它不與NF-AT協作的轉錄因子亦可對Th2相關細胞因子基因的調節起作用。據認為對Th2相關細胞因子基因的調節起作用的轉錄因子的實例包括NF-AT家族蛋白、NF-AT相互作用蛋白、maf家族蛋白、AP-1家族蛋白和Stat6(Lederer,J.等(1996)J.Exp.Med.184:397-406)。
本文使用的術語“Th2特異性轉錄因子”指在Th2細胞中而不是優先或僅在Th1細胞中表達的轉錄因子。
本文使用的術語“接觸”(即用藥物接觸細胞)包括于體外將該藥物和所述細胞共溫育(例如將該藥物加入培養中的細胞)和給予受治療者該藥物，使得該藥物和該受治療者的細胞于體內接觸。
本文使用的術語“調節”的各種形式包括刺激(例如增強或向上調節特定應答或活性)和抑制(例如降低或向下調節特定應答或活性)。
本文使用的術語“maf家族蛋白”指包括v-Maf、c-Maf、mafB、Nrl、mafK、mafF、mafG和p18的AP-1/CREB/ATF亞家族的成員。參見例如Nishizawa,M等(1989)Proc.Natl.Acad. Sci.USA86:7711-7715；Kataoka,K.等(1993)J.Virol.67:2133-2141；Swaroop,A等(1992)proc.Natl.Acad.Sci.USA89:266-270；Fujiwara,K.T.等(1993)Oncogene8:2371-2380；Igarashi,K.等(1995)J.Biol.Chem.270:7615-7624；Andrews,N.C.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:11488-11492；和Kataoka,K.等(1995)Mol.Cell.Biol.15:2180-2190。
本文使用的術語“小maf蛋白”指缺失對應于c-Maf的氨基末端激活域的結構域的maf家族蛋白。小maf蛋白的實例包括mafK、mafF、mafG和p18。
本文使用的術語“NF-AT家族蛋白”(亦可互換稱為簡單的“NF-AT”)指激活T細胞轉錄因子的核因子家族的成員，包括NF-ATp、NF-ATc、NF-AT4/x/c3和NF-AT3/c4。
本文使用的術語“NF-AT家族蛋白的Rel同源域”(縮寫為RHD域)指在NF-AT家族蛋白內具有與轉錄因子Rel/NFκB家族的RHD內約70％序列相似性的域。
本文使用的術語“NF-AT相互作用蛋白”(可與“與NF-AT家族蛋白相互作用的蛋白”交互使用)指與NF-AT家族蛋白形成物理聯系的因子(例如與NF-AT家族蛋白共免疫沉淀)。該NF-AT相互作用蛋白最好與NF-AT家族蛋白的RHD相互作用。NF-AT相互作用蛋白的實例是NIP45。
本文使用的術語“NIP45”包括具有示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列(或由示于SEQ ID NO:5的核苷酸序列編碼的)的蛋白，以及其哺乳動物同源物(例如人類NIP45)或其保留與NF-AT的RHD相互作用能力的修飾形式(例如突變或截短形式)。
本文使用的術語“AP-1家族蛋白”指是轉錄因子AP-1家族成員的蛋白，其實例包括c-Jun、c-Fos、Fra-1、Fra-2、JunB和JunD。
本文使用的術語“核酸分子”包括DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)。該核酸分子可以是單鏈或雙鏈，但最好雙鏈DNA。
本文使用的“分離核酸分子”指不含有在該核酸源自的生物體基因組DNA中天然位于該核酸側翼的基因序列(即，在該核酸源自的生物體基因組DNA中位于該分離核酸分子鄰近的基因序列)的核酸分子。例如，在各種實施方案中，分離NIP45核酸分子可以含有小于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在該核酸源自的細胞的基因組DNA中天然位于該核酸分子側翼的核苷酸序列。另外，諸如cDNA分子的“分離”核酸分子可以不含有其它細胞物質。
本文使用的術語“在嚴格條件下雜交”描述雜交和清洗條件，在該條件下相互之間至少60％同源的核苷酸序列通常保持相互雜交。該條件最好使得相互同源性至少為至少65％、更優選為至少70％、并最優選為至少75％的序列通常保持相互雜交。這種嚴格雜交是本領域技術人員已知條件，并載于分子生物學現行方法，John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。嚴格雜交條件的推薦的非限制性實例是于約45℃在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，接著于50-65℃在0.2X SSC、0.1％SDS中清洗一次或多次。
本文使用的“天然存在的”核酸分子指具有在大自然中發生的核苷酸序列的RNA或DNA(例如編碼天然蛋白)。
本文使用的“反義”核酸包含與編碼蛋白的“有義”核酸互補的核苷酸序列，例如，與雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補、與mRNA序列互補或與基因的編碼鏈互補的核苷酸序列。因此，反義核酸可以氫鍵與有義核酸連接。
本文使用的術語“編碼區”指包含翻譯成為氨基酸殘基的密碼子的核苷酸序列區，而“非編碼區”指不翻譯成為氨基酸的核苷酸序列區(例如5’和3’非翻譯區)。
本文使用的術語“載體”指可以運輸其連接的另一核酸的核酸分子。一種載體類型是“質粒”，它指其中可以連接其它DNA區段的環形雙鏈DNA環。載體的另一類型是病毒載體，其中可以將其它DNA區段連接入該病毒基因組。某些載體可以在導入其的宿主細胞中自主復制(例如具有細菌復制起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其它載體(例如非附加型哺乳動物載體)在導入宿主細胞時被整合入宿主細胞的基因組，并因此與宿主基因組一起復制。另外，某些載體可以指導其可操作連接的基因的表達。這種載體在本文中稱為“重組表達載體”或簡稱“表達載體”。一般而言，重組DNA技術中利用的表達載體常為質粒形式。在本說明書中，可以互換使用“質粒”和“載體”，因為質粒是最常使用的載體形式。然而，本發明包括那些起相同作用的其它形式的表達載體，例如病毒載體(例如復制缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒)。
本文使用的術語“宿主細胞”指已導入諸如本發明重組表達載體的本發明核酸的細胞。本文互換使用術語“宿主細胞”和“重組宿主細胞”。應理解這種術語不僅指特定受處理細胞，而且指這種細胞的子代或潛在子代。因為由于或者突變或者環境影響，在后續世代中可能發生某些修飾，這種子代事實上可能與親代細胞不同，但仍然屬于本文使用的術語的范圍。
本文使用的“適于在細胞中表達該核酸分子的形式”的核酸分子意味著該核酸分子包括一個或多個調節序列，該核酸分子基于用于表達的宿主細胞和所需表達水平選擇，并操作性地連接至欲表達的該核酸分子，使得由所述核酸分子編碼的蛋白在該宿主細胞中表達。這種核酸分子的實例包括含有編碼欲在宿主細胞中表達的蛋白的核酸序列的重組表達載體。
本文使用的“轉基因動物”指非人類動物，優選為哺乳動物，更優選為小鼠，其中該動物的一個或多個細胞包含“轉基因”。術語“轉基因”指外源DNA，該外源DNA被整合入由其發育轉基因動物的細胞基因組中并且保留在成熟動物的基因組中，例如指導在該轉基因動物的一個或多個細胞類型或組織中表達編碼基因產物。
本文使用的“同源重組動物”指轉基因非人類動物類型，優選為哺乳動物，更優選為小鼠，其中在該動物發育之前，通過內源基因與導入該動物細胞(例如該動物的胚細胞)的外源DNA之間的同源重組乙腈改變該內源基因。
本文使用的“分離蛋白”指蛋白當其從細胞分離或由重組DNA技術產生時大致不含細胞物質或培養基、當化學合成時不含化學前體或其它化學藥品。
本文使用的術語“抗體”包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分即諸如Fab和F(ab’)2片段的含有特異性結合(與之免疫反應)抗原的抗原結合位點的分子。本文使用的術語“單克隆抗體”和“單克隆抗體組合物”指僅含有一種可以與特定抗原表位免疫反應的抗原結合位點的一群抗體分子。因此單克隆抗體組合物通常對與其免疫反應的特定抗原展示單一結合親和性。
本文使用的“胞內作用調節轉錄因子表達或活性”的藥物指在例如細胞質或核的細胞胞內區域起作用以調節轉錄因子表達或活性的藥物。因此，術語“胞內作用以調節轉錄因子表達或活性的藥物”不包括諸如抗體的結合至細胞表面的藥物。胞內作用以調節轉錄因子表達或活性的藥物的實例包括編碼該轉錄因子的核酸分子、反義核酸分子、胞內抗體、顯性失活抑制劑和進入細胞并調節(即刺激或抑制)轉錄因子表達或活性的化學藥物。
本文使用的術語“胞內結合分子”包括通過結合至蛋白自身或編碼該蛋白的核酸(例如mRNA分子)于胞內起作用抑制目的靶蛋白(例如轉錄因子)表達或活性的藥物。胞內結合分子的實例包括反義核酸、胞內抗體和顯性失活抑制劑。
在以下小節中更詳細地描述本發明的各個方面。I．Th2相關細胞因子產生的調節已鑒別出對Th2特異性表達白介素-4基因負責的轉錄因子是c-Maf原癌基因。因此，調節c-Maf的表達和/或活性提供了調節白介素-4產生的手段。因為IL-4自身在Th2細胞發育中起自我調節作用(參見例如Paul,W.E.和Seder,R.A.(1994)Cell76:241-251；Seder,R.A.和Paul,W.E.(1994)Ann.Rev.Immunol.12:635-673)，并且由此IL-4的產生可以導致通過進一步Th2分化產生諸如IL-5、IL-6、IL-10和IL-13的其它Th2相關細胞因子，調節c-Maf表達和/或活性提供了調節Th2相關細胞因子產生的一般方法。
maf蛋白家族是包括v-Maf、c-Maf、mafB、Nrl、mafK、mafF、mafG和p18的AP-1/CREB/ATF蛋白亞家族。v-maf癌基因最初分離自雞自發性肌腱膜纖維肉瘤(musculoaponeuroticfibroscarcoma)，并鑒別為鳥逆轉錄病毒的轉化基因AS42(Nishizawa,M.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:7711-7715)。V-maf編碼與c-fos和c-jun癌基因同源的42kd堿性區/亮氨酸拉鏈(b-zip)蛋白。其細胞同源物c-maf原癌基因在v-maf的編碼區內僅有二個結構變化(Kataoka,K.等(1993)J.Virol.67:2133-2141)。maf家族包括c-Maf、mafB、人類視網膜特異性蛋白Nrl(Swaroop,A.等(1992)Proc.Natl.Acad Sci.USA89:266-270)、mafK、mafF、mafG和p18。后四個(mafK、mafF、mafG和p18)各編碼缺失含有反式激活域的c-Maf氨基末端三分之二的蛋白(“小maf蛋白”)(Fujiwara,K.T.等(1993)Oncogene8:2371-2380；Igarashi,K.等(1995)J.Biol.Chem270:7615-7624；Andrews,N.C.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:11488-11492；Kataoka,K.等(1995)Mol.Cell.Biol.15:2180-2190)。C-maf和其它maf家族成員相互之間一級與Fos和Jun形成同二聚體和異二聚體，與AP-1蛋白相互之間配對的已知能力一致(Kerppola,T.K.和Curran,T.(1994)Oncogene9:675-684；Kataoka,K.等(1994)Mol.Cell.Biol.14:700-712)。命名為c-Maf效應元件(MARE)的c-Maf同二聚體結合的DNA靶序列是分別含有核心TRE(T-MARE)或CRE(C-MARE)回文序列的13或14bp元件。在本發明之前，對maf家族成員的功能知之甚少，盡管c-Maf已顯示刺激從浦肯野神經元特異性啟動子L7的轉錄(Kurscher,C.和Morgan,J.I.(1994)Mol.Cell.Biol.15:246-254)，并且Nrl已顯示驅動QRl視網膜特異性基因表達(Swaroop,A.等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:266-270)。然而，在本發明之前，未有任何報告指c-Maf或其它maf家族成員涉及在淋巴樣細胞中表達的基因調節或在任何組織中細胞因子基因的表達。
已顯示小maf當為同二聚體結合時做為α和β珠蛋白轉錄阻遏物起作用，但當做為與紅細胞類特異性因子p45NF-E2的異二聚體伙伴時，對于激活珠蛋白基因轉錄是必需的(Kataoka,K.等(1995)Mol.Cell.Biol.15:2180-2190；Igarashi,K.等(1994)Nature367:568-572)。已顯示MafK過量表達誘導紅白血病細胞分化(Igarahsi,K.等(1995)proc.Natl.Acad.Sci.USA92:7445-7449)。本發明提供小maf蛋白(例如p18)可以調節Th2相關細胞因子基因表達的證據。因此，調節小maf蛋白的表達和/或活性亦提供了調節Th2相關細胞因子基因生產的手段。
本發明另外提供NF-AT相互作用蛋白NIP45，它與NF-AT結合并協同調節Th2相關細胞因子基因表達。基于其與NF-ATp的Rel同源域的相互作用鑒別NIP45。以下更詳細描述NIP45。因此調節諸如NIP45的NF-AT相互作用蛋白的表達和/或活性亦提供了調節Th2相關細胞因子基因生產的手段。
因此，本發明提供通過調節涉及Th2相關細胞因子基因表達的一種或多種轉錄因子的表達或活性而調節細胞的Th2相關細胞因子生產的方法。在本發明方法的一個實施方案中，用調節轉錄因子表達或活性的藥物接觸細胞，使得細胞的Th2相關細胞因子的產生受調節。在一個實施方案中，被調節的轉錄因子鑒定為與NF-AT家族蛋白協作調節Th2相關細胞因子基因表達的轉錄因子(例如c-Maf或NIP45)。在另一實施方案中，被調節的轉錄因子是maf家族蛋白(例如c-Maf或諸如p18的小maf蛋白)。在再一實施方案中，所述轉錄(transcnption)為NF-AT相互作用蛋白(例如NIP45)。在一最適實施方案中，本發明的調節藥物的特征為在胞內作用調節轉錄因子的活性。在一個實施方案中，通過用刺激轉錄因子表達和/或活性的刺激性藥物接觸細胞，刺激細胞的Th2相關細胞因子產生。在本發明方法的另一實施方案中，通過用抑制轉錄因子表達和/或活性的抑制性藥物接觸細胞，抑制細胞的Th2相關細胞因子的產生。
如在實施例中證實的，盡管c-Maf對IL-4基因表達的組織特異性負責，但c-Maf與一種或多種其它轉錄因子協同作用，激活IL-4基因轉錄。具體地說，c-Maf與NF-AT蛋白協同作用，刺激IL-4基因表達。另外，已證實NF-AT蛋白和轉錄因子AP-1/CREB/TF家族的其它成員參與調節Th1和Th2相關細胞因子基因的表達。如實施例中進一步證實的，與NF-AT相互作用的蛋白NIP45與NF-AT協同作用，刺激來自含有NF-AT位點的啟動子的表達。另外，在存在所有三種因子c-Maf、NF-AT和NIP45時，增強了Th2相關細胞因子基因的表達。因此，在另一實施方案中，調節細胞Th2相關細胞因子產生的本發明的方法可以包含用調節轉錄因子表達或活性的多種藥物接觸細胞。因此，在用第一種藥物接觸細胞的本發明方法中，該方法可以再包含用調節對調節Th2相關細胞因子基因起作用的一種或多種其它轉錄因子活性的一種或多種其它藥物接觸該細胞。所述調節其它轉錄因子表達或活性的其它藥物最好選自NF-AT家族蛋白、NF-AT相互作用蛋白、maf家族蛋白和AP-1家族蛋白。
如在實施例中再證明的，小maf蛋白(例如p18)可以阻遏由正反式激活蛋白(例如c-Maf)介導的Th2相關細胞因子基因的表達。因此，在再一實施方案中，調節細胞Th2相關細胞因子產生的本發明方法包含用調節(即，刺激或抑制)小maf蛋白表達或活性的藥物自身或與調節其它轉錄因子活性的藥物(例如其它maf家族蛋白、NF-AT家族蛋白或NF-AT相互作用蛋白)聯合接觸所述細胞。該小maf蛋白最好為p18。小maf蛋白的其它實例包括mafK、mafF和mafG。
A．刺激性藥物按照本發明的方法，為刺激細胞Th2相關細胞因子的產生，用刺激調節Th2相關細胞因子基因表達的轉錄因子(例如c-Maf、NIP45、p18)表達和/或活性的刺激性藥物接觸該細胞。可以在通常不表達這種細胞因子的細胞類型(例如Th1細胞、B細胞或非淋巴樣細胞)中刺激產生Th2相關細胞因子。另外，可以在輔助前體細胞(Thp)中刺激產生Th2相關細胞因子，以促使它們沿Th2途徑分化，而不是沿Th1途徑分化。
推薦的刺激性藥物是編碼調節Th2相關細胞因子基因表達的轉錄因子的核酸分子，其中將該核酸分子以適于在細胞中表達該轉錄因子的形式導入細胞。例如，將c-Maf cDNA克隆入重組表達載體，并將該載體轉染入細胞。如在實施例3中證實的，c-maf重組表達載體在Th1細胞、B細胞或非淋巴樣細胞中異位表達導致IL-4啟動子激活。另外，在適當條件下(以下更詳細討論)，刺激內源IL-4基因轉錄，導致通常不表達該細胞因子的細胞產生IL-4(參見實施例4)。
為在細胞中表達maf家族蛋白，一般首先用標準分子生物學技術將maf家族cDNA導入重組表達載體。可以通過例如使用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增或通過篩選適當的cDNA文庫得到maf家族cDNA。本領域已知maf家族cDNA的核苷酸序列，可以將其用于設計PCR引物以通過標準PCR方法擴增cDNA或用于設計雜交探針，該探針可以用于用標準雜交方法篩選cDNA文庫。該maf家族cDNA最好為c-maf原癌基因。Kurscher C.和Morgan,J.I.(1995)Mol.Cell.Biol.15:246-254公開了哺乳動物(小鼠)c-maf cDNA的核苷酸序列和推測的氨基酸序列，并以檢索號碼S74567儲存于GenBank數據庫。這個哺乳動物c-maf與鳥v-maf序列(公開于Nishizawa,M.K.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:7711-7715和GenBank檢索號碼D28598和D28596)高度同源，表明c-maf在種間相當保守。可以使用標準分子生物學技術(例如PCR或cDNA文庫篩選)和基于小鼠或鳥序列設計的引物或探針，分離包括人類的其它哺乳動物種的c-mafcDNA。與小鼠c-mafcDNA同源的人類部分cDNA序列亦以檢索號碼H24189和N75504儲存于GenBank數據庫。本領域亦已知其它maf家族成員的序列，例如MafB(Kataoka,K.等(1994)Mol.Cell Biol.14:7581-91；GenBank檢索號碼D28600)、MafG(Kataoka等(1994)Mol.Cell Biol.14:7581-91；GenBank檢索號碼D28601和D28602)、MafF(GenBank檢索號碼D16184)和MafK(Igarashi,K.等(1995)J.Biol.Chem.270:7615-7624；GenBank檢索號碼D16187和D42124)。
分離或擴增maf家族cDNA后，將該DNA片段導入表達載體。本文使用的術語“載體”指可以運輸它連接的另一核酸的核酸分子。一種載體類型是“質粒”，其指其中可以連接其它DNA區段的環狀雙鏈DNA環。載體的另一類型是病毒載體，其中可以將其它DNA區段連接入該病毒基因組。某些載體可以在導入其的宿主細胞中自主復制(例如具有細菌復制起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其它載體(例如非附加型哺乳動物載體)在導入宿主細胞時被整合入宿主細胞的基因組，并因此與宿主基因組一起復制。另外，某些載體可以指導它可操作連接的基因的表達。這種載體在本文中稱為“重組表達載體”或簡稱“表達載體”。一般而言，重組DNA技術中利用的表達載體常為質粒形式。在本說明書中，可以互換使用“質粒”和“載體”，因為質粒是最常使用的載體形式。然而，本發明包括那些起相同作用的這種其它形式的表達載體，例如病毒載體(例如復制缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒)。
本發明的重組表達載體包含適于在宿主細胞中表達該核酸分子的形式的核酸分子，意味著所述重組表達載體包括一個或多個調節序列，所述調節序列基于用于表達的宿主細胞和所需表達水平選擇并操作性地連接至欲表達的該核酸分子。在重組表達載體內，“操作性地連接”意味著目的核苷酸序列以允許表達該核苷酸序列的方式連接至該調節序列(例如在體外轉錄/翻譯系統或當該載體導入宿主細胞時在宿主細胞中)。術語“調節序列”包括啟動子、增強子和其它表達控制元件(例如多聚腺苷酸化信號)。這種調節序列描述于例如Goeddel；Gene Expression Technology: Methods in Enzymology185,AcademicPress,San Diego,CA(1990)。調節序列包括那些在許多宿主細胞類型中指導組成型表達核苷酸序列的序列、那些僅在某些宿主細胞中指導核苷酸序列表達的序列(例如組織特異性調節序列)或那些僅在某些條件下指導核苷酸序列表達的序列(例如誘導型調節序列)。
本領域技術人員將會理解表達載體的設計可以取決于將要轉化的宿主細胞的選擇、所需的蛋白表達水平等。當用于哺乳動物細胞時，通常由病毒調節元件提供所述表達載體的控制功能。例如，常用的啟動子源自多形瘤病毒、腺病毒、細胞肥大病毒和猿猴病毒40。哺乳動物表達載體的非限制性實例包括pCDM8(Seed,B.,(1987)Nature329:840)和pMT2PC(Kaufman等(1987),EMBO J.6:187-195)。市售有攜帶不同調節序列的各種哺乳動物表達載體。為在哺乳動物宿主細胞中組成型表達所述核酸，推薦的調節序列是細胞肥大病毒啟動子/增強子。另外，本領域已知用于哺乳動物細胞的誘導型調節系統，例如其中由重金屬離子調節基因表達的系統(參見例如Mayo等(1982)Cell29:99-108；Brinster等(1982)Nature296:39-42；Searle等(1985)Mol.Cell.Biol.5:1480-1489)、由熱激調節的(參見例如Nouer等(1991)載于HeatShock Response，編輯Nouer,L.,CRC,Boca Raton,FL，第167-220頁)、由激素調節的(參見例如Lee等(1981)Nature294:228-232；Hynes等(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:2038-2042；Klock等(1987)Nature329:734-736；Israel&Kaufman(1989)Nucl.Acids Res.17:2589-2604；和PCT公布WO93/23431)、FK506相關分子調節的(參見例如PCT公布WO94/18317)或四環素調節的(Gossen,M.和Bujard,H.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5547-5551；Gossen,M.等(1995)Science 268:1766-1769；PCT公布WO94/29442；和PCT公布WO96/01313)。再有，本領域已知許多組織特異性調節序列，包括白蛋白啟動子(肝臟特異性；Pinkert等(1987)Genes Dev.1:268-277)、淋巴特異性啟動子(Calame和Eaton(1988)Adv.Immunol.43:235-275)、特別是T細胞受體啟動子(Winoto和Baltimore(1989)EMBO J.8:729-733)和免疫蛋白啟動子(Banerji等(1983)Cell33:729-740；Queen和Baltimore(1983)Cell33:741-748)的淋巴特異性啟動子(Calame和Eaton(1988)Adv.Immunol.43:235-277)、神經元特異性啟動子(例如神經絲啟動子；Byrne和Ruddle(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:5473-5477)、胰臟特異性啟動子(Edlund等(1985)Science230:912-916)和哺乳動物乳腺特異性啟動子(例如乳清啟動子；美國專利4,873,316號和歐洲申請公布號264,166)。亦包括發育調節啟動子，例如鼠hox啟動子(Kessel和Gruss(1990)Science249:374-379)和甲胎蛋白啟動子(Campes和Tilghman(1989)Genes Dev.3:537-546)。
可以通過常規轉染技術將載體DNA導入哺乳動物細胞。本文使用的各種形式的術語“轉染”指本領域認可的將外源核酸(例如DNA)導入哺乳動物宿主細胞的各種技術，包括磷酸鈣共沉淀、DEAE葡聚糖介導轉染、脂轉染或電穿孔。可在Sambrook等(分子克隆:實驗室手冊，第二版，Cold Spnng Harbor Laboratory press(1989))和其它實驗手冊中找到轉染宿主細胞的合適方法。
為穩定轉染哺乳動物細胞，已知根據使用的表達載體和轉染技術，僅有小部分細胞可能將外源DNA整合入其基因組。為鑒別和選擇這些整合體，一般將編碼可選擇標記(例如對抗生素抗性)的基因與目的基因一起導入宿主細胞。推薦的可選擇標記包括那些賦予對藥物(例如G418、潮霉素和甲氨蝶呤)抗性的標記。可以在獨立于編碼maf家族蛋白的載體上將編碼可選擇標記的核酸導入宿主細胞，或最好在同一載體上導入。可以通過藥物選擇鑒別用導入核酸穩定轉染的細胞(例如整合了該可選擇標記基因的細胞將存活，而其它細胞死亡)。
使用本領域已知或本文公開的核苷酸序列，按照上述可以制備適于在宿主細胞中表達轉錄因子的形式的編碼調節Th2相關細胞因子基因表達的其它轉錄因子的核酸分子。該核苷酸序列可以用于設計允許通過標準方法擴增cDNA的PCR引物，或用于設計使用標準雜交方法用于篩選cDNA文庫的雜交探針。NIP45的核苷酸序列和推測的氨基酸序列分別公開于SEQ IDNO:5和6。本領域已知包括p18、mafK、mafF和mafG的小maf蛋白的核苷酸序列和推測氨基酸序列(參見例如Fujiwara,K.T.等(1993)Oncogene8:2371-2380；Igarashi,K.等(1995)J.Biol.Chem.270:7615-7624；Andrews,N.C.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:11488-11492；Kataoka,K.等(1995)Mol.Cell.Biol.15:2180-2190)。本領域已知包括NF-ATp、NF-ATc、NF-AT4/x/c3和NF-AT3/c4的NF-AT家族蛋白的核苷酸序列和推測氨基酸序列。已鑒別出四個NF-AT家族成員(參見例如Emmel,E.A.等(1989)Science246:1617-1620；Flanagan,W.M.等(1991)Nature352:803-807；Jain,J.等(1993)Nature365:352-355；McCaffrey,P.G.等(1993)Science262:750-754；Rao,A.(1994)Immunol.Today15:274-281；Norhrop,J.P.等(1994)Nature369:497)。該NF-AT cDNA最好為NF-ATp的cDNA。哺乳動物NF-ATpcDNA的核苷酸序列和推測的氨基酸序列公開于McCaffrey,P.G.等(1993)Science262:750-754。哺乳動物NF-ATc cDNA的核苷酸序列和推測的氨基酸序列公開于Northrop,J.P.等(1994)Nature369:497，并以檢索號碼U08015儲存于GenBank數據庫。哺乳動物NF-AT3 cDNA和NF-AT4cDNA的核苷酸序列和推測的氨基酸序列公開于Hoey,T.等(1995)Immunity2:461-472。本領域已知AP-1家族蛋白的核苷酸序列和推測的氨基酸序列。例如，人類c-fos的核苷酸序列和推測的氨基酸序列公開于van Straaten,F.等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:3183-3187。人類c-jun的核苷酸序列和推測的氨基酸序列公開于Bohmann,D.等(1987)Science238:1386-1392。人類jun-B和jun-D的核苷酸序列和推測的氨基酸序列公開于Nomura,N.等(1990)Nucl.AcidsRes.18:3047-3048。人類fra-1和fra-2的核苷酸序列和推測的氨基酸序列公開于Matsui,M.等(1990)Oncogene5:249-255。
刺激Th2相關細胞因子在細胞中表達的另一形式的刺激藥物是刺激調節細胞中Th2相關細胞因子基因表達的內源轉錄因子(例如，諸如c-Maf或p18的maf家族蛋白、或者諸如NIP45的與NF-AT相互作用的蛋白)的表達或活性的化學化合物。使用選擇刺激該轉錄因子表達或活性的化合物的篩選檢測鑒別這種化合物。適當的篩選檢測的實例更詳細地描述于以下V小節。
除了用刺激調節Th2相關細胞因子基因表達的第一轉錄因子的表達或活性的第一藥物，本發明的刺激方法可以包括使用刺激對調節Th1或Th2相關細胞因子基因表達起作用的一種或多種其它轉錄因子的表達或活性的一種或多種其它藥物。在實施例4中，顯示在M12B淋巴瘤細胞中刺激表達內源IL-4需要導入c-Maf表達載體和NF-AT表達載體，因此證明c-Maf和NF-AT協同作用激活IL-4轉錄，而c-maf對表達的組織特異性負責。在實施例14中，再顯示通過共表達c-Maf、NF-AT和NIP45增強刺激M12 B淋巴瘤細胞中內源IL-4的表達。雖然熟練技術人員會理解某些細胞可以表達足量的內源c-Maf、NF-AT和/或NIP45，使得僅使用單一藥物即可能足以刺激Th2相關細胞因子基因的表達，但在某些情況下和某些細胞類型可能需要刺激多個轉錄因子以得到目的刺激Th2相關細胞因子產生，所述多個轉錄因子例如為c-Maf和NF-AT一起、c-Maf和NIP45一起、或所有這三種蛋白(c-Maf、NF-AT和NIP45)。
因此，在用刺激第一種轉錄因子表達或活性的第一種藥物接觸細胞的本發明方法中，該方法可以再包含用至少一種其它藥物接觸該細胞，所述至少一種其它藥物刺激對調節Th1或Th2相關細胞因子基因表達起作用的至少一種其它轉錄因子的表達或活性。所述表達或活性受調節的至少一種其它轉錄因子最好選自NF-AT家族蛋白、NF-AT相互作用蛋白、maf家族蛋白和AP-1家族蛋白。例如，本發明的刺激方法可以涉及使用第一種藥物刺激c-Maf的表達或活性，使用第二種藥物刺激或者NF-AT家族蛋白或者與NF-AT家族蛋白相互作用的蛋白(例如NIP45)的表達或活性。在另一實施方案中，本發明的刺激方法涉及使用第一種藥物刺激c-Maf的表達或活性，使用第二種藥物刺激NF-AT家族蛋白的表達或活性和使用第三種藥物刺激與NF-AT家族蛋白相互作用的蛋白(例如NIP45)的表達或活性。在細胞中刺激NF-AT或NIP45活性的推薦藥物是分別編碼NF-AT或NIP45的重組表達，其中將該重組表達載體導入該細胞，并在該細胞內表達NF-AT或NIP45。可以如上述c-Maf表達載體那樣制備NF-AT和NIP45的編碼表達載體并導入細胞。
用NF-AT或NIP45的cDNA刺激細胞內NF-AT或NIP45活性的置換方法是，可以使用一種或多種刺激細胞內NF-AT或NIP45活性的化學化合物做為本發明刺激方法的第二種(或附加)藥物。本領域已知刺激細胞內NF-AT活性的化合物(有關綜述參見Rao,A.(1994)Immunol.Today15:274-281)。例如，用佛波醇酯佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)和鈣離子載體(例如離子霉素)刺激某些細胞，導致NF-AT易位至細胞核(參見例如Flanagan,W.M.等(1991)Nature352:803-807；Jam,J.等(1993)Nature365:352-355)。另外，例如用抗CD3抗體通過T細胞受體(TcR)刺激T細胞導致T細胞中NF-AT激活。
除了NF-AT蛋白，已顯示包括c-Jun、c-Fos、Fra-1、Fra-2、Jun B和Jun D的AP-1家族成員參與調節Th1和Th2相關細胞因子基因(例如IL-2和IL-4)的表達(參見例如Rao,A.等(1994)Immunol.Today15:274-281；Jam,J.等(1993)Nature365:352-355；Boise,L.H.等(1993)Mol.Cell.Biol.13:1911-1919；Rooney,J.等(1995)Immunity2:545-553；Rooney,J.等(1995)Mol.Cell.Biol.15:6299-6310)。盡管這些因子不對所述細胞因子基因表達的Th1/Th2特異性負責，并且這些因子看來不與c-Maf協同調節IL-4基因的表達(參見實施例)，但已顯示AP-1家族成員增強Th2細胞內IL-4的表達(參見例如Rooney,J.等(1995)Immunity2:545-553)。因此，在某些情況下，除了刺激c-Maf活性(和可能刺激NF-AT活性)，亦刺激AP-1家族蛋白活性可能是有益的。因此，在一個實施方案中，本發明的刺激方法涉及使用第一種藥物刺激c-Maf表達或活性，使用第二種藥物刺激AP-1蛋白的表達或活性。在另一實施方案中，本發明涉及使用第一種藥物刺激c-Maf的表達或活性，使用第二種藥物刺激NF-AT蛋白的表達或活性使用第三種藥物刺激AP-1蛋白的表達或活性。亦可聯合用maf、AP-1和/或NF-AT家族蛋白調節NIP45活性。
在細胞中刺激AP-1活性的推薦藥物是編碼AP-1蛋白的重組表達，其中該重組表達載體被導入該細胞，并且在該細胞內表達AP-1蛋白。可以如上述c-Maf表達載體那樣制備AP-1編碼表達載體并導入細胞。或者，可以使用一種或多種刺激細胞內AP-1活性的化學化合物做為本發明刺激方法中的其它藥物。本領域已知刺激細胞內AP-1活性的化合物，包括PMA/鈣離子載體(例如離子霉素)和抗CD3抗體。
B．抑制性藥物按照本發明的方法，為抑制細胞Th2相關細胞因子的產生，用抑制調節Th2相關細胞因子基因表達的轉錄因子(例如c-Maf、NIP45、p18)表達和/或活性的抑制性藥物接觸該細胞。在一個實施方案中，用調節與NF-AT家族蛋白合作調節Th2相關細胞因子基因表達的轉錄因子的表達和/或活性的藥物接觸該細胞抑制細胞Th2相關細胞因子的產生。在另一實施方案中，通過用調節Th2特異性轉錄因子(最好為c-Mar)的表達或活性的藥物接觸細胞，抑制該細胞的Th2相關細胞因子產生。在另一實施方案中，通過用調節余NF-AT家族蛋白相互作用的蛋白(最好為NIP45)的表達或活性的藥物接觸細胞，抑制該細胞的Th2相關細胞因子產生。在再一實施方案中，通過用調節小maf蛋白表達或活性的藥物接觸細胞，抑制該細胞Th2相關細胞因子的產生。如上述刺激方法討論的，本發明的抑制方法可以包含用兩種或更多種調節兩種或更多種調節Th2相關細胞因子基因表達的轉錄因子表達或活性的藥物接觸細胞，所述轉錄因子包括maf家族蛋白、NF-AT家族蛋白、NF-AT相互作用蛋白和AP-1家族蛋白。
可以在例如Th2細胞或在輔助前體細胞(Thp)中抑制Th2相關細胞因子的產生，以促使它們沿著Th1途徑而不是Th2途徑分化。本發明的抑制性藥物可以是例如起作用抑制該轉錄因子表達或活性的胞內結合分子。本文使用的術語“胞內結合分子”包括在胞內作用通過結合至蛋白或編碼蛋白的核酸(例如mRNA分子)抑制該蛋白的表達或活性。以下更詳細描述的胞內結合分子的實例包括反義核酸、胞內抗體和顯性失活抑制劑。
在一個實施方案中，本發明的抑制性藥物是與編碼轉錄因子(例如，諸如c-Maf或p18的maf家族蛋白、或諸如NIP45的NF-AT相互作用蛋白)的基因或所述基因的部分互補的反義核酸分子、或是編碼所述反義核酸分子的重組表達載體。使用反義核酸向下調節細胞內特定蛋白的表達在本領域內眾所周知(參見例如Weintraub,H.等，作為遺傳分析分子工具的反義RNA,Reviews-Trends in Genetics，第1(1)卷1986；Askari,F.K.和McDonell,W.M.(1996)N.Eng.J.Med.334:316-318；Bennett,M.R.和Schwartz,S.M.(1995)Circulation92:1981-1993；Mercola,D.和Cohen,J.S.(1995)Cancer Gene Ther.2:47-59；Rossi,J.J.(1995)Br.Med.Bull.51:217-225；Wagner,R.W.(1994)Nature372:333-335)。反義核酸分子包含與另一核酸分子的編碼鏈(例如mRNA序列)互補的核苷酸序列，并且由此可以氫鍵連接至所述另一核酸分子的編碼鏈。與mRNA的序列互補的反義序列可以與該mRNA的編碼區內的、該mRNA的5’或3’非翻譯區或編碼區和非翻譯區之間的連接區(例如位于5’非翻譯區和編碼區的連接)中發現的序列互補。另外，反義核酸可以與編碼該mRNA的基因的調節區例如轉錄起始序列或調節元件的序列互補。反義核酸最好設計為與該編碼鏈上起始密碼子之前或跨越起始密碼子的區或mRNA的3’非翻譯區內的區互補。可以基于本文公開的或本領域已知的轉錄因子的核苷酸序列設計抑制本文討論的轉錄因子在細胞內表達的反義核酸，并按照沃森和克里克堿基配對原則進行構建。
反義核酸可以以各種不同形式存在。例如，該反義核酸可以是僅與maf家族基因的部分互補的寡核苷酸。可以用本領域已知的化學合成程序構建反義寡核苷酸。可以使用天然存在的核苷酸或各種修飾的核苷酸化學合成反義寡核苷酸，這種修飾是設計用以增強該分子的生物學穩定性或增強該反義核酸和有義核酸之間形成的雙鏈體的物理穩定性，例如可以使用硫代磷酸衍生物和吖啶取代核苷酸。為抑制培養物中細胞的轉錄因子的表達，可以將一種或多種反義寡核苷酸加入培養基中的細胞，典型的濃度為200μg寡核苷酸/ml。
或者，可以使用其中已亞克隆了以反義定位的核酸(即，從插入核酸轉錄的核酸將與目的靶核酸反義)的表達載體，在生物學上產生反義核酸。可以選擇操作性地連接至反義定位克隆的核酸的調節序列，該調節序列指導該反義RNA分子在目的細胞內表達，例如可以選擇啟動子和/或增強子或其它調節序列，它們指導反義RNA的組成型、組織特異性或誘導型表達。如上述重組表達載體那樣載體反義表達載體，除了將該cDNA(或其部分)以反義定位克隆入該載體。該反義表達載體可以是例如重組質粒、噬菌粒或減毒病毒的形式。如上述重組表達載體那樣，使用標準轉染技術將該反義表達載體導入細胞。
在另一實施方案中，用作抑制性藥物的反義核酸是核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的可以切割具有與之互補區的單鏈核酸(例如mRNA)的催化性RNA分子(有關核酶綜述參見例如Ohkawa,J.等(1995)J.Biochem.118:251-258；Sigurdsson,S.T.和Eckstem,F.(1995)TrendsBiotechnol.13:286-289；Rossi,J.J.(1995)Trends Biotechnol.13:301-306:Kiehmtopf,M.等(1995)J.Mol.Med.73:65-71)。對編碼本文討論的轉錄因子的mRNA有特異性的核酶可以基于該轉錄因子的核苷酸序列設計。例如，可以構建四膜蟲屬L-19IVS RNA衍生物，其中活性位點的堿基序列與c-mafmRNA或其它轉錄因子mRNA中的欲切割的堿基序列互補。參見例如Cech等的美國專利4,987,071號和5,116,742號。或者，可以使用c-maf mRNA(或其它轉錄因子mRNA)從RNA分子庫中選擇具有特異性核糖核酸酶活性的催化性RNA。參見例如Bartel,D．和Szostak,J.W.(1993)Science261:1411-1418。
可以用以抑制細胞內Maf蛋白表達和/或活性的另一類型抑制性藥物是對本文討論的轉錄因子特異性的胞內抗體。使用胞內抗體抑制細胞內蛋白功能是本領域已知的(參見例如Carlson,J.R.(1988)Mol.Cell.Biol.8:2638-2646；Biocca,S.等(1990)EMBO J.9:101-108；Werge,T.M.等(1990)FEBS Letters274:193-198；Carlson,J.R.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:7427-7428；Marasco,W.A.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:7889-7893；Biocca,S.等(1994)Bio/Technology12:396-399；Chen,S-Y等(1994)Human Gene Therapy5:595-601；Duan,L等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:5075-5079；Chen,S-Y.等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA9l:5932-5936；Beerli,R.R.等(1994)J.Biol.Chem.269:23931-23936；Beerli,R.R.等(1994)Biochem.Biophys.Res.Commun.204:666-672；Mhashilkar,A.M.等(1995)EMBO J.14:1542-1551；Richardson,J.H.等(1995)Proc.Natl Acad.Sci. USA92:3137-3141；Marasco等的PCT公布號WO94/02610；和Duan等的PCT公布WO95/03832。
為使用胞內抗體抑制蛋白活性，制備重組表達載體，該載體編碼的所述抗體鏈的形式使得在該載體導入細胞時，在該細胞的胞內部分做為功能抗體表達該抗體鏈。為按照本發明的抑制方法抑制轉錄因子活性，最好在該細胞的核內表達特異性結合該轉錄因子的胞內抗體。可以通過從該抗體輕鏈和重鏈基因除去編碼N末端疏水性前導序列所那些核苷酸序列，并在所述輕鏈和重鏈基因的或者N末端或者C末端加入編碼核定位信號的核苷酸序列，來達到胞內抗體的核表達(參見例如Biocca,S.等(1990)EMBO J.9:101-108；Mhashilkar,A.M.等(1995)EMBO J.14:1542-1551)。推薦的用于所述胞內抗體鏈的核導向的核定位信號是SV40大T抗原的核定位信號(參見Biocca,S.等(1990)EMBOJ.9:101-108；Mhashilkar,A.M.等(1995)EMBO J.14:1542-1551)。
為制備胞內抗體表達載體，通常從分泌對maf蛋白特異性的單克隆抗體的雜交瘤分離編碼對例如本文討論的Maf家族蛋白或其它轉錄因子的目的靶蛋白有特異性的抗體鏈的抗體輕鏈和重鏈的cDNA。本領域已描述抗Maf家族蛋白的抗血清制備(參見例如Fujiwara,K.T.等(1993)Oncogene8:2371-2380；Kataoka,K.等(1993)J.Virol.67:2133-2141；Kerppola,T.K.和Curran,T.(1994)Oncogene9:675-684；Igarashi,K等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci USA92:7445-7449)。可以通過用Maf蛋白免疫原免疫合適的對象(例如兔、山羊、小鼠或其它哺乳動物),制備抗Maf蛋白抗體。適當的免疫原制劑可以含有例如重組表達的Maf蛋白或化學合成的Maf肽。該制劑還可以包括諸如弗氏完全或不完全佐劑的佐劑或類似的免疫刺激藥物。可以從該對象得到產生抗體的細胞，并用于通過標準技術制備單克隆抗體，所述技術諸如首先由Kohler和Milstein描述的雜交瘤技術(1975,Nature256:495-497)(亦參見Brwon等(1981)J.Immunol 127:539-46；Brown等(1980)J Biol Chem255:4980-83；Yeh等(1976)PNAS76:2927-31；和Yeh等(1982)Int.J.Cancer29:269-75)。產生單克隆抗體雜交瘤的技術是眾所周知的(一般參見R.H.Kenneth，載于Monoclonal Antibodies:A New Dimension In BiologicalAnalyses,Plenum Publishing Corp.New York,New York(1980)；E.A.Lerner(1981)Yale J.Biol.Med.,54:387-402；M.L.GeRer等(1977)Somatic Cell Genet.,3:231-36)。簡言之，將無限增殖細胞系(通常為骨髓瘤)與來自用上述maf蛋白免疫原免疫的哺乳動物的淋巴細胞(通常為脾細胞)融合，并且篩選得到的雜交瘤細胞的培養上清液，以鑒別產生特異性結合該Maf蛋白的單克隆抗體的雜交瘤。許多眾所周知的用于融合淋巴細胞和無限增殖化細胞系的方案的任何一種均可應用于產生抗Maf蛋白單克隆抗體的目的(參見例如G.Galfre等(1977)Nature266:550-52；Gefter等Somatic Cell Genet.,見上述引用；Lerner,Yale J.Biol.Med.，見上述引用；Kenneth,Monoclonal Antibodies，見上述引用)。另外，一般技術人員會理解有許多這種方法的變化亦有用處。通常，該無限增殖細胞系(例如骨髓瘤細胞系)源自與該淋巴細胞相同的哺乳動物物種。例如，可以將來自用本發明的免疫原制劑免疫的小鼠的淋巴細胞與無限增殖化小鼠細胞系融合，產生鼠雜交瘤。推薦的無限增殖細胞系是對含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養基(“HAT培養基”)敏感的小鼠骨髓瘤細胞系。任何多種骨髓瘤細胞系中的任何一種均可用做按照標準技術的融合對象，例如P3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Ag14骨髓瘤系。這些骨髓瘤系可以從美國典型培養物保藏中心(ATCC)(Rockville,Md.)獲得。通常使用聚乙二醇(“PEG”)，將HAT敏感型小鼠骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞融合。然后使用HAT培養基篩選從融合得到的雜交瘤細胞，該培養基殺死未融合和未有效融合(unproductively fused)的骨髓瘤細胞(未融合脾細胞由于未轉化而將在幾天后死亡)。通過例如使用標準ELISA檢測篩選雜交瘤培養上清液的抗體鑒別產生特異性結合該maf蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞。
制備分泌單克隆抗體的雜交瘤的置換方法是，可以通過用該蛋白或其肽篩選重組組合免疫球蛋白文庫(例如抗體噬菌體展示文庫)，由此分離特異性結合該蛋白的免疫球蛋白文庫成員，而鑒別和分離結合本文討論的轉錄因子的單克隆抗體。市售有制備和篩選噬菌體展示文庫的試劑盒(例如Pharmacia的重組噬菌體抗體系統(Recombinant PhageAntibody System)，目錄號碼27-9400-01；和Stratagene SurfZAPTM的噬菌體展示試劑盒(Phage Display Ki)t，目錄號碼240612)。另外，特別適用于制備和篩選抗體顯示文庫的方法和試劑的實例可以參見例如Ladener等美國專利5,223,409號；Kang等國際公布號WO92/18619；Dower等國際公布WO91/17271；Winter等國際公布WO92/20791；Markland等國際公布號WO92/15679；Breitling等國際公布WO93/01288；McCafferty等國際公布號WO92/01047；Garrard等國際公布號WO92/09690；Fuchs等(1991)Bio/Technology9:1370-1372；Hay等(1992)Hum Antibod Hybridomas 3:81-85；Huses等(1989)Science246:1275-1281；Griffiths等(1993)EMBO J 12:725-734；Hawkins等(1992)J Mol Biol226:889-896；Clarkson等(1991)Nature 352:624-628；Gram等(1992)PNAS 89:3576-3580；Garrad等(1991)Bio/Technology 9:1373-1377；Hoogenboom等(1991)Nuc Acid Res19:4133-4137；Barbas等(1991)PNAS 88:7978-7982；和McCafferty等Nature(1990)348:552-554。
一旦鑒別對目的轉錄因子特異性的單克隆抗體(例如或者雜交瘤衍生的單克隆抗體或者來自組合文庫的重組抗體)，則通過標準分子生物學技術分離編碼該單克隆抗體輕鏈和重鏈的DNA。對于雜交瘤衍生的抗體，可以通過例如PCR擴增或cDNA文庫篩選得到輕鏈和重鏈cDNA。對于諸如來自噬菌體展示文庫的重組抗體，可以在文庫篩選過程中從分離的展示示包裝(例如噬菌體)回收編碼輕鏈和重鏈的cDNA。本領域已知可以用以制備PCR引物或cDNA文庫探針的抗體輕鏈和重鏈核苷酸序列。例如，許多這種序列公開于Kabat,E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美國衛生和人類服務部，NIH Publication No.91-3242和“Vbase”人種系序列數據庫。
一旦得到抗體輕鏈和重鏈序列，則使用標準方法將其克隆入重組表達載體。如上述討論的，將編碼輕鏈和重鏈的疏水性前導序列的序列除去、將編碼核定位信號(例如來自SV40大T抗原)于框架內連接至編碼輕鏈和重鏈的或者氨基或者羧基末端。該表達載體可以編碼幾個不同形式之一的胞內抗體。例如，在一個實施方案中，該載體編碼全長抗體輕鏈和重鏈，使得全長抗體在胞內表達。在另一實施方案中，該載體編碼全長輕鏈和僅重鏈的VH/CH1區，使得Fab片段在胞內表達。在最優選的實施方案中，該載體編碼單鏈抗體(scFv)，其中輕鏈和重鏈的可變區由柔韌肽接頭(例如(Gly4Ser)3)連接并做為單鏈分子表達。為抑制細胞中轉錄因子活性，將編碼該轉錄因子特異性胞內抗體的表達載體通過諸如上文討論的標準轉染方法導入該細胞。
本發明抑制性藥物的再一形式是本文討論的轉錄因子(例如maf蛋白)的抑制形式，本文亦稱為顯性失活抑制劑。已知maf蛋白家族與其它AP-1家族成員諸如Fos和Jun同二聚體化和異二聚體化(參見例如Kerppola,T.K.和Curran,T.(1994)Oncogene9:675-684；Kataoka,K.等(1994)Mol.Cell.Biol.14:700-712)。抑制形成二聚體的轉錄因子活性的一種手段是通過使用顯性失活抑制劑，它具有與功能性轉錄因子二聚體化的能力，但缺乏激活轉錄的能力(參見例如Petrak,D.等(1994)J.Immunol.153:2046-2051)。通過與功能性轉錄因子二聚體化，這種顯性失活抑制劑可以抑制它們的功能活性。這個過程可以天然存在做為調節基因表達的手段。例如，有一些諸如mafK、mafF、mafG和p18的“小”maf蛋白，它們缺失含有反式激活域的c-Maf三分之二的氨基末端(Fujiwara,K.T.等(1993)Oncogene8:2371-2380；Igarashi,K.等(1995)J.Biol.Chem.270:7615-7624；Andrews,N.C.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:11488-11492；Kataoka,K.等(1995)Mol.Cell.Biol.15:2180-2190)。小maf蛋白的同二聚體做為負轉錄調節劑起作用(Igarashi,K.等(1994)Nature367:568-572)，并且已顯示小maf蛋白中的三個(MafK、MafF和MafG)競爭性抑制由v-Maf癌蛋白介導的反式激活(Kataoka,K等(1996)Oncogene12:53-62)。另外，已鑒別出MafB是Ets-1的相互作用伙伴，并顯示它制Ets-1介導的運鐵蛋白受體的反式激活和抑制紅細胞類分化(Sieweke,M.H.等(1996)Cell85:49-60)。
因此，本發明的抑制性藥物可以是具有與c-Maf二聚體化的能力但缺乏激活轉錄能力的Maf蛋白的形式。Maf蛋白的這種顯性失活形式可以是例如天然缺乏反式激活域的小Maf蛋白(例如MafK、MafF、MafG)、MafB或其中除去反式激活域的c-Maf突變形式。使用通過標準轉染方法導入細胞的編碼Maf蛋白的重組表達載體，可以在該細胞中表達這種顯性失活Maf蛋白。為表達缺失反式激活域的c-Maf突變形式，通過標準重組DNA技術從c-maf cDNA除去編碼c-Maf氨基末端的反式激活域的核苷酸序列。優選除去至少氨基酸1-122。更優選除去氨基酸1-187或氨基酸1-257。保留編碼堿性-亮氨酸拉鏈區的核苷酸序列。將該截短的cDNA插入重組表達載體，然后將該載體導入細胞以在該細胞內允許表達該截短的缺失反式激活域的c-maf。
可以用以抑制細胞中maf蛋白的表達和/或活性的再一種類型的抑制性藥物是抑制細胞中內源maf家族蛋白的表達或活性的化學化合物。可以使用選擇抑制maf家族蛋白表達或活性的化合物的篩選檢測，鑒別這種化合物。在以下V小節更詳細地描述合適的篩選檢測的實例。
如上述關于刺激性藥物所討論的，本發明的抑制方法可以包括使用一種或多種其它抑制性藥物，所述其它抑制性藥物抑制對調節Th1或Th2相關細胞因子基因表達起作用的一種或多種其它轉錄因子的表達或活性。例如，在一個實施方案中，本發明的抑制方法包含用抑制maf家族蛋白的表達或活性的第一種藥物和抑制NF-AT家族蛋白或NF-AT相互作用蛋白(例如NIP45)的表達或活性的第二種藥物接觸細胞。在另一實施方案中，本發明的抑制方法包含用抑制maf家族蛋白的表達或活性的第一種藥物和抑制AP-1家族蛋白的表達或活性的第二種藥物接觸細胞。在再一實施方案中，本發明的抑制方法包含用抑制maf家族蛋白的表達或活性的第一種藥物、抑制NF-AT家族蛋白的表達或活性的第二種藥物和抑制NF-AT相互作用蛋白(例如NIP45)的表達或活性的第三種藥物接觸細胞。抑制NF-AT蛋白或NF-AT相互作用蛋白和AP-1蛋白的抑制性藥物類型的實例包括反義核酸、胞內抗體、顯性失活抑制劑和上述抑制內源蛋白的化學化合物。關于后者，本領域已知NF-ATp的核易位被免疫抑制藥物環孢菌素A和FK506抑制(參見例如Rao,A.(1994)Immunol.Today15:274-281；Rao,A.(1995)J.Leukoc.Biol.57:536-542)。因此，在抑制方法的一個實施方案中，將諸如環孢菌素A或FK506(或其它抑制鈣調磷酸酶途徑的相關藥物)的免疫抑制藥物與抑制c-Maf表達或活性的藥物聯合使用。
可以在體外或體內(后者在以下小節中進一步討論)進行調節細胞Th2相關細胞因子產生的本發明的方法。為在體外進行本方法，可以通過標準方法從受治療者得到細胞，并在體外用本發明的刺激性或抑制性藥物溫育(即培養)以分別刺激或抑制Th2相關細胞因子的產生。例如，可以從受治療者得到外周血單核細胞(PBMC)，并通過例如用Ficoll/Hypaque的密度梯度離心分離。可以通過標準方法排除或富集特定細胞群體。例如，可以通過在槊料上吸附分離單核細胞/巨噬細胞。可以通過陽性和/或陰性選擇，利用抗T細胞或B細胞表面標記的抗體富集或排除T細胞或B細胞，例如通過用特異性一級單克隆抗體(mAb)溫育細胞，然后使用包被了結合一級mAb的二級抗體的磁性珠分離結合mAb的細胞。可以通過類似技術，使用干細胞特異性mAb(例如抗CD34mAb)分離源自外周血或骨髓的造血干細胞。亦可以按照標準方法通過熒光激活細胞分選分離特定的細胞群體。本領域已知抗細胞特異性表面標記的單克隆抗體且許多有市售。
當于體外使用刺激性藥物導致刺激Th2相關細胞因子特別是IL-4產生時，可以從該培養上清液回收這些細胞因子做進一步使用。例如，可以將該培養上清液或其純化的部分用于培養中的T細胞以影響體外Th1或Th2細胞發育。或者，可以將該培養上清液或其純化的部分給予受治療者以影響，該受治療者中Th1對Th2應答的發展。
另外，可以將于體外用刺激性或抑制性藥物處理的細胞給予受治療者，以影響該受治療者中Th1對Th2應答的發展。因此，在另一實施方案中，調節細胞的Th2相關細胞因子產生的本發明方法還包含將該細胞給予受治療者，以由此調節受治療者中Th1或Th2細胞的發育。推薦的活體外修飾和再給予的細胞類型包括T細胞、B細胞和造血干細胞。為給予受治療者，可能最好在將細胞給予受治療者之前，首先從細胞除去培養物中殘留的藥物。這可以例如通過Ficoll/Hypaque梯度離心細胞完成。關于活體外遺傳修飾細胞并接著再給予受治療者的進一步討論，亦可參見W.F.Anderson等的美國專利5,399,346號。Ⅱ．調節受治療者中Th1或Th2細胞發育的方法本發明的另一方面涉及調節受治療者中Th1或Th2細胞發育的方法。術語“受治療者”包括其中可以引出免疫應答的活生物體。推薦的受治療者是哺乳動物。受治療者的實例包括人類、猴子、犬、貓、小鼠、大鼠、奶牛、馬、山羊和綿羊。如上述討論，調節受治療者中Th1/Th2比例的一種方法師在活體外用本發明的一種或多種調節藥物處理細胞(例如T細胞、B細胞或造血干細胞)，使得所述細胞的Th2相關細胞因子的產生受到調節，接著將所述細胞給予該受治療者。在另一實施方案中，通過給予該受治療者調節轉錄因子活性的藥物，所述轉錄因子調節Th2相關細胞因子基因表達，使得該受治療者中Th1或Th2細胞的發育受到調節，來調節Th1/Th2的比例。在一個最佳實施方案中，該轉錄因子是maf家族蛋白，最好為c-Maf蛋白或小maf蛋白(例如p18)。在另一最佳實施方案中，該轉錄因子是與NF-AT家族蛋白相互作用的蛋白，最好是NIP45。該Th2相關細胞因子最好是IL-4。可以通過給予本發明的一種或多種刺激性藥物促進受治療者中Th2應答的發展，而可以通過給予本發明的一種或多種抑制性藥物促進受治療者中Th1應答的發展。如上討論的，在某些情況下，可能需要附加調節多個轉錄因子(例如maf家族蛋白、NF-AT家族蛋白、NF-AT相互作用蛋白和/或AP-1家族蛋白的組合)的活性。
關于包含核酸(包括編碼轉錄因子、反義RNA、胞內抗體或顯性失活抑制劑的重組表達載體)的刺激性或抑制性藥物，可以使用本領域已知的將核酸(例如DNA)在體內導入細胞的方法，將該藥物導入受治療者的細胞。這種方法的實例包括直接注射可以通過直接將DNA注射入細胞，而將裸露的DNA導入細胞(參見例如Acsadi等(1991)Nature332:815-818；Wolff等(1990)Science247:1465-1468)。例如，可以使用將DNA注射入細胞的傳遞裝置(例如“基因槍”)。這種裝置有市售(例如BioRad)。
受體介導的DNA攝入亦可以通過將DNA復合至諸如聚賴氨酸的陽離子，而該陽離子偶聯至細胞表面受體的配體，而于體內將裸露DNA導入細胞(參見例如Wu,G和Wu,C.H.(1988)J.Biol.Chem.263:14621；Wilson等(1992)J.Biol.Chem.267:963-967；和美國專利5,166,320)。DNA-配體復合物與受體的結合有利于通過受體介導的胞吞作用攝入DNA。可以使用連接至腺病毒衣殼的DNA-配體復合物，所述腺病毒衣殼天然破壞核內體而將物質釋到入細胞質中，以避免胞內溶酶體降解該復合物(參見例如Curiel等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8850；Cristiano等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2122-2126)。
逆轉錄病毒已很好地特征記述了缺陷型逆轉錄病毒以用于基因治療目的的基因轉移(有關綜述參見Miller,A.D.(1990)Blood76:271)。可以構建具有整合入該逆轉錄病毒基因組的目的核苷酸序列的重組逆轉錄病毒。另外，可以除去該逆轉錄病毒基因組的部分，使得該逆轉錄病毒為復制缺陷型。然后將該復制缺陷型逆轉錄病毒包裝為可以用于通過標準技術通過使用輔助病毒感染靶細胞的病毒粒子。產生重組逆轉錄病毒和用這種病毒于體外或體內感染細胞的方案可以參見分子生物學現行方法，Ausubel,F.M等(編輯)Greene PublishingAssociates,(1989),9.10-9.14節和其它標準實驗室手冊。合適的逆轉錄病毒的實例包括pLJ、pZIP、pWE和pEM，它們均是本領域眾所周知的。合適的包裝病毒系的實例包括ψCrip、ψCre、ψ2和ψAm。已使用逆轉錄病毒于體外和/或體內將各種基因導入許多細胞類型，包括上皮細胞、內皮細胞、淋巴細胞、成肌細胞、肝細胞、骨髓細胞(參見例如Eglitis，等(1985)Science230:1395-1398；Danos和Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:6460-6464；Wilson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:3014-3018；Armentano等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6141-6145；Huber等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8039-8043；Ferry等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8377-8381；Chowdhury等(1991)Science 254:1802-1805；van Beusechem等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:7640-7644; Kay等(1992)Human GeneTherapy 3:641-647；Dai等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10892-10895；Hwu等(1993)J.Immunol.150:4104-4115；美國專利4,868,116號；美國專利4,980,286號；PCT申請WO89/07136；PCT申請WO89/02468；PCT申請WO89/05345；和PCT申請WO92/07573)。逆轉錄病毒載體需要靶細胞分裂，以使該逆轉錄病毒基因組(和插入其中的異源核酸)整合入宿主基因組以穩定地將核酸導入該細胞。因此，有可能必需刺激靶細胞復制。
腺病毒可以操作腺病毒的基因組使得它編碼并表達目的基因產物，但在其正常裂解病毒生命周期中復制的能力方面是未激活的。參見例如Berkner等(1988)BioTechniques6:616；Rosenfeld等(1991)Science252:431-434；和Resenfeld等(1992)Cell68:143-155。本領域技術人員已熟知源自腺病毒毒株Ad5型d1324或其它腺病毒毒株(例如Ad2、Ad3、Ad7等)的合適的腺病毒載體。重組腺病毒的優勢在于，它們不需要分裂的細胞即可成為有效的基因傳遞載體，并可用于感染廣泛的細胞類型，包括氣道上皮(Rosenfeld等(1992)，見上述引用)、內皮細胞(Lemarchand等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:6482-6486)、肝細胞(Herz和Gerard(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2812-2816)和肌肉細胞(Quantin等(1992)proc.Natl.Acad.Sci.USA89:2581-2584)。另外，導入的腺病毒DNA(和其中含有的異源DNA)不整合入宿主細胞的基因組，而保持為附加型，因此避免因為當導入的DNA被整合入宿主基因組(例如逆轉錄病毒DNA)時插入突變而可能發生的潛在問題。另外，腺病毒基因組攜帶異源DNA的能力與其它基因傳遞載體相比較大(多至8千堿基對)(Berkner等，見上述引用；HajAhmand和Graham(1986)J.Virol.57:267)。目前使用的大多數復制缺陷型腺病毒都缺失了所有或部分的病毒E1和E3基因，但保留多達80％的腺病毒遺傳物質。
腺相關病毒腺相關病毒(AAV)是天然存在的缺陷型病毒，它需要另一病毒例如腺病毒或皰疹病毒做為有效復制和生產性生活周期的輔助病毒。(有關綜述參見Muzyczka等Curr.Topics in Micro.AndImmunol.(1992)158:97-129)。它也是可以將其DNA整合入未分裂細胞的少數種病毒之一，并展示出高頻率穩定整合(參見例如Flotte等(1992)Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7:349-356；Samulski等(1989)J.Virol.63:3822-3828；和McLaughlin等(1989)J.Virol.62:1963-1973)。含有小至300堿基對的AAV的載體可以被包裝并可以整合。外源DNA的空間限制為約4.5kb。可以使用Tratschin等(1985)Mol.Cell.Biol.5:3251-3260中描述的AAV載體將DNA導入細胞。已使用AAV載體將各種核酸導入了不同細胞類型(參見例如Hermonat等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6466-6470；Tratschin等(1985)Mol.Cell.Biol.4:2072-2081；Wondisford等(1988)Mol.Endocrinol.2:32-39；Tratschin等(1984)J.Virol.51:611-619；和Flotte等(1993)J.Biol.Chem.268:3781-3790)。
可以通過本領域常規使用的標準方法，評價將核酸導入細胞的特定表達載體系統和方法的效力。例如，可以通過濾膜雜交技術(例如Southern印跡)檢測導入細胞的DNA，并通過利用Northern印跡、RNA酶保護或逆轉錄酶-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測通過導入的DNA轉錄產生的RNA。可以通過適當的檢測檢測基因產物，例如通過諸如用特異性抗體的免疫檢測產生的蛋白、或通過諸如酶學檢測的功能性檢測檢測該基因產物的功能活性。
可以將諸如刺激或抑制內源轉錄因子活性的化學化合物的調節性藥物做為藥用組合物給予受治療者。這種組合物通常包含該調節性藥物和藥學上可接受載體。本文使用的術語“藥學上可接受載體”包括任何和所有的與藥用給予相適應的溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等等。這種介質和藥物用于藥用活性物質是本領域眾所周知的。除了在任何常規介質或藥物與該活性化合物不相容的情況下，考慮了它在該組合物中的應用。亦可以將補充的活性化合物加入所述組合物中。
配制本發明的藥用組合物使其與計劃的給藥途徑相適應。例如，用于非腸道、皮內或皮下使用的溶液或懸浮液可以包括以下組分無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液、不揮發油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗氧化劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯(methyl parabens)的抗細菌劑；諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；調節滲透壓的藥物，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽的緩沖液和諸如氯化鈉或葡萄糖。可以用諸如鹽酸或氫氧化鈉的酸或堿調節pH。非腸道制劑可以包裝于安瓶、用玻璃或槊料制成的一次性注射器或多劑量西林瓶。
適于注射使用的藥用組合物包括無菌水溶液(如果是水溶性)或分散體和用于臨時制備無菌注射液或分散體的無菌粉末。對于靜脈內給藥，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸緩沖鹽水(PBS)。在所有的情況下，該組合物必須無菌并且應是流體的以易于注射。它必須在生產和儲存條件下穩定并且必須進行防腐以對抗諸如細菌和真菌的微生物的污染作用。該載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等等)和它們的適當混合物的溶劑或分散介質。可以例如通過使用諸如卵磷脂的包衣、通過在分散體的情況下保持需要的顆粒大小和通過使用表面活性劑保持適當的流體性。可以通過各種抗菌劑和抗真菌劑例如對羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等等達到防止微生物作用。在許多情況下，最好在該組合物中包括等滲劑，例如蔗糖、諸如甘露醇、山梨醇的多元醇、氯化鈉。可以通過在該組合物中包括例如單硬脂酸鋁和明膠的延遲吸收的藥物，達到可注射組合物的延長吸收。
可以通過將需要量的該活性化合物與需要的一種上述列舉的成分或其組合加入適當的溶劑中，接著進行過濾除菌制備無菌注射液。一般而言，可以將該活性化合物加入含有基本分散介質和需要的來自上述列舉的其它成分的無菌溶媒中制備分散體。在用于制備無菌注射液的無菌粉劑的情況下，推薦的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，從先前除菌過濾的溶液產生該活性成分和任何其它需要成分的粉劑。
口服組合物一般包括惰性稀釋劑或食用載體。可將它們包裹于明膠膠囊或壓制成片劑。為口服治療給藥的目的，可以將該活性化合物與賦形劑一起加入，并以片劑、錠劑或膠囊的形式使用。亦可以使用流體載體制備口服組合物，以做為漱口藥使用，其中該流體載體中的該化合物可口服、涮洗和咳吐或吞咽。可以將藥學上相容的粘合劑和/或輔助材料做為該組合物的部分包括進去。片劑、藥丸、膠囊、錠劑等可以含有以下成分或具有類似性質的化合物的任何一種粘合劑，諸如微晶纖維素、西黃蓍膠或明膠；諸如淀粉或乳糖的賦形劑、諸如藻酸、Primogel或玉米淀粉的崩解劑；潤濕劑，諸如硬脂酸鎂或Sterotes的潤滑劑；助流劑，諸如膠體二氧化硅；甜味劑，諸如蔗糖或糖精；調味劑，諸如薄荷、水楊酸甲酯或橙調味劑。
在一個實施方案中，用保護該化合物免受機體快速清除的載體制備該活性化合物，所述載體例如包括植入物和微膠囊化的傳遞系統的控釋制劑。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯、聚乳酸。制備這種制劑的方法對本領域技術人員是顯而易見的。亦可從AlzaCorporation和Nova Pharmaceuticals,Inc.市售得到該材料。亦可以使用脂質體懸浮液(包括用抗病毒抗原的單克隆抗體導向感染細胞的脂質體)做為藥學上可接受載體。這些可以按照本領域技術人員已知的方法制備，例如，如美國專利4,522,811號描述的。
以劑量單位形式配制口服或非腸道組合物特別有利于易于給藥和劑量一致性。本文使用的劑量單位形式指適于做為欲治療對象的單位劑量的物理分離單位；每個單位含有計算以與需要的藥用載體相結合產生所需治療效果的預定量的活性化合物。本發明的劑量單位形式的規格受以下因素支配并直接取決于以下因素(a)該活性化合物的獨特性質和欲達到的特定治療效果、和(b)本領域固有的配制這種用于治療個體的活性化合物的限制。Ⅲ．本發明方法的應用鑒別控制IL-4產生的轉錄因子并由此連續形成Th2細胞，使得在各種臨床情況下使用本發明的調節方法選擇性地操縱T細胞亞群。本發明的刺激方法(即，使用刺激性藥物的方法)導致產生Th2相關細胞因子，伴隨促進Th2應答和向下調節Th1應答。與之相反，本發明的抑制方法(即，使用抑制性藥物的方法)抑制產生Th2相關細胞因子，伴隨向下調節Th2應答和促進Th1應答。因此，為治療其中Th2應答是有利的病況，選擇本發明的刺激方法使得促進Th2應答并向下調節Th1應答。或者，為治療其中Th1應答是有利的病況，選擇本發明的抑制方法使得向下調節Th2應答并促進Th1應答。本發明方法應用于治療疾病調節可以導致該病況治愈、與該條件相關的癥狀類型或數量減少、或者長期或者短期(即，改善該病況)或者簡單瞬時的對受治療者有益的效果。
已鑒別出許多與占優勢Th1或Th2型應答相關的病況，這些病況可以受益于患有該病況的個體內已建立的應答類型的調節。以下更詳細描述將本發明的免疫調節方法應用于這類疾病。
A．變態反應變態反應由其產生受Th2細胞及其產生的細胞因子的活性調節的IgE抗體介導。在變態反應中，由Th2細胞產生IL-4，這進一步刺激產生IgE抗體和激活介導變態反應的細胞，即肥大細胞和嗜堿細胞。IL-4亦在嗜曙紅細胞介導的炎癥反應中起重要作用。因此，本發明的抑制方法可以用于在變態反應患者中做為向下調節致病性IgE抗體產生的手段抑制Th2相關細胞因子特別是IL-4產生。可以將抑制性藥物直接給予該受治療者，或者可以從該受治療者得到細胞(例如Thp細胞或Th2細胞)并在活體外用抑制性藥物接觸該細胞，再給予該受治療者。另外，在某些情況下，將變應原與抑制性藥物或已用抑制性藥物處理的細胞共給予該受治療者，可以有益于抑制(例如脫敏)該變應原特異性應答。以通過將諸如細胞因子IL-12或抗Th2相關細胞因子抗體(例如抗IL-4抗體)的其它Th1促進劑以足以進一步刺激Th1型應答的量給予該變態反應受治療者，進一步增強該治療。
B．癌癥據報道，在癌癥患者中Th2促進細胞因子的表達升高(參見例如Yamamura,M.，等(1993)J.Clin.Invest.91:1005-1010；Pisa,P.，等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:7708-7712)，并且惡性疾病隨著疾病病程的惡化常常與從Th1型應答轉向Th2型應答相關。因此，可以使用本發明的抑制方法抑制癌癥患者中Th2相關細胞因子的產生，以做為抵抗Th1向Th2轉換和由此促進患者中進行的Th1應答以改善疾病進程的手段。該抑制方法可以涉及或者直接將抑制性藥物給予患有癌癥的受治療者或者活體外用抑制性藥物處理從該受治療者得到的細胞(例如Thp或Th2細胞)，接著將所述細胞再給予該受治療者。可以通過將諸如細胞因子IL-12或抗Th2相關細胞因子抗體(例如抗IL-4抗體)的其它Th1促進劑以足以進一步刺激Th1型應答的量給予該接受者，進一步增強該治療。
C．傳染病亦曾報道Th2促進細胞因子的表達在各種傳染病中增強，所述傳染病包括HIV感染、結核、利什曼病、血吸蟲病、絲蟲線蟲感染和腸道線蟲感染(參見例如；Shearer,G.M.和Clerici,M.(1992)Prog.Chem.Immunol.54:21-43；Clerici,M和Shearer,G.M.(1993)Immunology Today14:107-111；Fauci,A.S.(1988)Science239:617-623；Locksley,R.M.和Scott,P.(1992)Immunoparasitology Today 1:A58-A61；Pearce,E.J.，等(1991)J.Exp.Med.173:159-166；Grzych,J-M.，等(1991)J.Immunol.141:1322-1327；Kullberg,M.C.，等(1992)J.Immunol.148:3264-3270；Bancroft,A.J.，等(1993)J.Immunol.150:1395-1402；Pearlman,E，等(1993)Infect.Immun.61:1105-1112；Else,K.J.，等(1994)J.Exp.Med.179:347-351)并且這類傳染病亦與免疫應答中Th1向Th2轉換相關。因此，可以使用本發明的抑制方法抑制患有傳染病的受治療者中Th2相關細胞因子的產生，做為抵抗Th1向Th2轉換并由此促進該患者中進行的Th1應答以改善該感染的進程的手段。該抑制方法可以包括或者直接將抑制性藥物給予患有傳染病的受治療者，或者活體外用抑制性藥物處理從該受治療者得到的細胞(例如Thp或Th2細胞)，接著將所述細胞再給予該受治療者。可以通過將諸如細胞因子IL-12或抗Th2相關細胞因子抗體(例如抗IL-4抗體)的其它Th1促進劑以足以進一步刺激Th1型應答的量給予該接受者，進一步增強該治療。
D．自身完疫病本發明的刺激方法可以治療性地用于治療與Th2型功能障礙相關的自身免疫病。許多自身免疫病是對自身組織反應和促進參與所述疾病病理學的細胞因子和自抗體產生的T細胞的不適當激活的結果。調節T輔助型應答可以對自身免疫病的進程有效應。例如，在實驗性腦變應性脊髓炎(EAE)中，在該疾病誘導時通過給予IL-4刺激Th2型應答削弱了該自身免疫病的程度(Paul,W.E.，等(1994)Cell76:241-251)。另外，已顯示動物從該疾病恢復與由Th2相關細胞因子增加所證實的Th2型應答增強相關(Koury,S.J.，等(1992)J.Exp.Med.176:1355-1364)。另外，可以抑制EAE的T細胞分泌Th2特異性細胞因子(Chen,C.，等(1994)Immunity 1:147-154)。由于EAE中刺激Th2型應答具有對抗該疾病的保護效應，因此在患有多發性硬化(EAE是其模型)的受治療者中刺激Th2應答可能有治療益處。
類似地，在小鼠I型糖尿病中刺激Th2型應答提供對抗該疾病的保護效應。確實，用IL-4(它促進Th2應答)治療NOD小鼠防止或延遲了通常在這些小鼠中發展的I型糖尿病的發病(Rapoport,M.J.，等(1993)J.Exp.Med.178:87-99)。因此，在患有或易患糖尿病的受治療者中刺激Th2應答可以改善該病的效果或抑制該病發病。
其中刺激Th2型應答可能有益的再一自身免疫病是類風濕性關節炎(RA)。研究顯示患類風濕性關節炎的病人在滑液組織中具有占優勢的Th1細胞(Simon，A.K.，等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:8562-8566)。通過在患RA的受治療者中刺激Th2應答，可以伴隨向下調節有害的Th1應答以由此改善該疾病的影響。
因此，在患有或易患其中Th2型應答對疾病進程有益的自身免疫病的受治療者中，可以使用本發明的刺激方法刺激Th2相關細胞因子產生。該刺激方法可以包括或者直接將刺激性藥物給予受治療者或者活體外用刺激性藥物處理從該受治療者得到的細胞(例如Thp、Th1細胞、B細胞、非淋巴樣細胞)，接著將所述細胞再給予該受治療者。可以通過將諸如細胞因子IL-4本身或抗Th1相關細胞因子抗體(例如抗IL-4抗體)的其它Th2促進劑以足以進一步刺激Th2型應答的量給予該接受者，進一步增強該治療。
與上述其中Th2應答是需要的自身免疫病相對比，可以通過Th1型應答改善其它自身免疫病。可以使用本發明的抑制性藥物治療這類疾病(如上述關于癌癥和傳染病所述)。可以通過以足以進一步刺激Th1型應答的量給予該受治療者Th1促進細胞因子(例如IFN-γ)進一步增強該治療。
可以在人類疾病的上述動物模型(例如EAS做為多發性硬化模型，NOD小鼠做為糖尿病模型)或其它很好地特征記述的人類自身免疫病動物模型中測試治療自身免疫病的藥物的效力。這種動物模型包括做為紅斑狼瘡模型的mrl/lpr/lpr小鼠、做為類風濕性關節炎模型的鼠膠原蛋白誘導的關節炎和鼠實驗性重癥肌無力(參見Paul編輯的Fundamental Immunology,Raven Press,New York,1989，第40-856頁)。將本發明的調節(即，刺激性或抑制性)劑給予測試動物，然后通過使用的特定模型的標準方法監測所述測試動物中的該疾病進程。與未治療動物(或用對照藥物治療的動物)相比，用該藥物治療的動物中該病況的改善即證實了該調節劑的效力。
具有可以按照本發明處理的自身免疫成分的自身免疫病和紊亂的非限制性實例包括糖尿病、關節炎(包括類風濕性關節炎、青少年類風濕性關節炎、骨關節炎、牛皮癬性關節炎)、多發性硬化、重癥肌無力、系統性紅斑狼瘡、自身免疫性甲狀腺炎、皮炎(包括特應性皮炎和濕疹性皮炎)、牛皮癬、斯耶格倫綜合癥(包括斯耶格倫綜合癥繼發的干燥性角結膜炎)、斑形脫發、節肢動物叮咬反應引起的變態反應應答、局限性回腸炎、口瘡性潰瘍、虹膜炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性結腸炎、哮喘、變應性哮喘、皮膚紅斑狼瘡、硬皮病、陰道炎、直腸炎、藥物皮炎、麻風可逆反應、麻風性結節性紅斑、自免疫眼色素層炎、變態反應性腦脊髓炎、急性壞死性出血性腦病、特發性兩側進行性感音神經性聽覺喪失、再生障礙性貧血、純紅細胞貧血、特發性血小板減少癥、多軟骨炎、韋格納肉芽腫病、慢性活動性肝炎、史蒂文斯-約翰遜綜合癥、特發性口炎性腹瀉、扁平苔蘚、局限性回腸炎、格雷夫斯眼病、結節病、原發性膽汁性肝硬變、后色素層炎和間質性肺纖維化。
E．移植雖然移植排斥或移植接受可能不僅僅歸因于移植受體中的特定T細胞亞群(即，Th1或Th2細胞)的作用(有關討論參見Dallman,M.J.(1995)Curr.Opin.Immunol.7:632-638)，許多研究顯示在延長的移植物存活中占優勢的Th2應答或移植排斥中占優勢的Th1應答。例如，移植接受已與Th2細胞因子型式產生相關聯和/或移植排斥已與Th1細胞因子型式產生相關聯(參見例如Takeuchi,T.等(1992)Transplantation53:1281-1291；Tzakis,A.G.等(1994)J.Pediatr.Surg.29:754-756；Thai,N.L.等(1995)Transplantation59:274-281)。另外，具有Th2細胞因子表現型的細胞的繼承性轉移延長了皮膚移植存活(Maeda,H.等(1994)Int.Immunol.6:855-862)并減少移植物對抗宿主疾病(Fowler,D.H.等(1994)Blood84:3540-3549；Fowler,D.H.等(1994)Prog.Clin.Biol.Res.389:533-540)。再有，給予促進Th2分化的IL-4延長了心臟同種移植物的存活(Levy,A.E.和Alexander,J.W.(1995)Transplantation60:405-406)，而與促進Th1分化的抗IL-10抗體聯合給予IL-12增強了皮膚同種移植排斥(Gorczynski,R.M.等(1995)Transplantation60:1337-1341)。
因此，可以使用本發明的刺激方法刺激移植受體中產生Th2相關細胞因子，以延長移植物的存活。該刺激方法可以用于實體(solid)器官移植和骨髓移植(例如抑制移植物對抗宿主疾病)。該刺激方法可以包括或者直接將刺激性藥物給予該移植受體，或者活體外用刺激性藥物處理從該受治療者得到的細胞(例如Thp、Th1細胞、B細胞、非淋巴樣細胞)，接著將該細胞再給予該受治療者。可以通過將諸如IL-4自身或抗Th1相關細胞因子抗體的其它Th2促進藥物以足以進一步刺激Th2型應答的量給予該受體，進一步增強該治療。
除了前述病況外，本發明的調節方法亦可以用于其它目的。例如，本發明的刺激方法(即，使用刺激性藥物的方法)可以用于體外刺激產生Th2促進細胞因子(例如IL-4)以工業生產這些細胞因子(例如可以用刺激性藥物體外接觸細胞，以衣刺激產生IL-4，并可以從該培養上清液回收IL-4，并根據需要進一步純化和包裝用于商業用途)。
另外，本發明的調節方法可以應用于疫苗接種，以促進受治療者中目的抗原的或者Th1應答或者Th2應答。即本發明的藥物可以用作輔助劑，以使對疫苗的應答為Th1應答或Th2應答。例如，為刺激對目的抗原的抗體應答(例如用于疫苗接種目的)，可以將該抗原和本發明的刺激性藥物共給予受治療者，以促進該受治療者中對該抗原的Th2應答，因為Th2應答提供有效的B細胞，幫助并促進IgG1產生。或者，為促進對目的抗原的細胞免疫應答，可以將該抗原和本發明的抑制性藥物共給予受治療者，以促進對受治療者中對該抗原的Th1應答，因為Th1應答有利于細胞介導的免疫應答的發展(例如延遲超敏反應應答)。可以將目的抗原和該調節性藥物一同配制成為單一藥用組合物或分離的組合物。在最佳實施方案中，將目的抗原和該調節性藥物同時給予該受治療者。或者，在某些情況下可能需要首先給予該抗原，然后給予該調節性藥物或相反(例如在抗原天然引起Th1應答的情況下，首先單獨給予該抗原以刺激Th1應答，然后給予該刺激性藥物自身或與抗原加強一起以將免疫應答轉換為Th2應答可能是有益的)。Ⅳ．Maf組合物本發明的另一方面涉及可以用于按照本發明的方法在受治療者中調節細胞的Th2相關細胞因子產生或Th1/Th2發育的組合物。本發明提供包含編碼maf家族蛋白的核苷酸序列的重組表達載體，所述核苷酸序列操作性地連接至指導在某些細胞類型中特異性地表達maf家族蛋白的調節序列。在最佳實施方案中，所述調節序列指導maf家族蛋白在淋巴樣細胞(例如T細胞或B細胞)中特異性表達。在一個實施方案中，所述淋巴細胞是T細胞。本領域已知T細胞特異性調節元件，例如T細胞受體基因的啟動子調節區(參見例如Winoto和Baltimore(1989)EMBO J.8:729-733；Leiden,J.M.(1994)Annu.Rev.Immunol.11:539-570；Hettman,T.和Cohen,A.(1994)Mol.Immunol.31:315-322；Redondo,J.M.等(1991)Mol.Cell.Biol.11:5671-5680)。T細胞特異性調節元件的其它實例是那些源自下述基因的調節元件CD3基因(參見例如Clevers,H.等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:8623-8627；Clevers,H.C.等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:8156-8160；Georgopoulos,K.等(1988)EMBO J.7:2401-2407)、CD4基因(參見例如Sawada,S.和Littman,D.R.(1991)Mol.Cell.Biol.11:5506-5515；Salmon,P.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:7739-7743；Hanna,Z.等(1994)Mol.Cell.Biol.14:1084-1094；亦參見GenBank檢索號U01066和S68043的人類CD4啟動子序列)和CD2基因(參見例如Zhumabekov,T.等(1995)J.Immunol.Methods 185:133-140)。可以通過標準分子生物學方法得到包含諸如T細胞受體基因的啟動子和增強子的一個或多個T細胞特異性調節元件的DNA片段，例如通過使用對應于所需區的5’和3’末端的寡核苷酸引物或來自T細胞的基因組DNA做為模板，通過PCR得到。一旦得到包含T細胞特異性調節元件的DNA片段，則可以使用標準分子生物學技術將其操作性地連接至編碼maf蛋白的cDNA(例如可以將這兩個DNA片段連接起來，使得該調節元件位于該maf序列的5’)，并導入諸如質粒載體的載體。
在另一實施方案中，該淋巴樣細胞是B細胞(即，在該重組表達載體內編碼maf家族蛋白的核苷酸序列操作性地連接至指導在B細胞中特異性地表達maf家族蛋白的調節序列)。本領域已知B細胞特異性調節元件，例如免疫球蛋白基因的啟動子調節區(參見例如Banerji等(1983)Cell 33:729-740；Queen和Baltimore(1983)Cell33:741-748)。B細胞特異性調節元件的其它實例是那些源自CD20(B1)基因的(參見例如Thevenin,C.等(1993)J.Biol.Chem.268:5949-5956；Rieckmann,P.等(1991)J.Immunol.147:3994-3999)、源自FcεRIIa基因的(參見例如Suter,U.等(1989)J.Immunol.143:3087-3092)和源自主要組織相容性Ⅱ類基因的(參見例如Glimcher,L.H.和Kara,C.J.(1992)Annu.Rev.Immunol.10:13-49；Benoist,C.和Mathis,D.(1990)Annu.Rev.Immunol.8:681-715)調節元件。可以通過標準分子生物學方法得到包含諸如免疫球蛋白基因的啟動子和增強子的B細胞特異性調節元件的DNA片段，例如通過使用對應于所需區的5’和3’末端的寡核苷酸引物或來自B細胞的基因組DNA做為模板通過PCR得到。一旦得到包含B細胞特異性調節元件的DNA片段，則可以使用標準分子生物學技術將其操作性地連接至編碼maf蛋白的cDNA(例如可以將這兩個DNA片段連接起來，使得該調節元件位于所述maf序列的5’)，并導入諸如質粒載體的載體。
在再一實施方案中，本發明提供包含編碼maf家族蛋白的核苷酸序列的重組表達載體，所述核苷酸序列操作性地連接至指導在造血干細胞中特異性地表達maf家族蛋白的調節序列。本領域已知造血干細胞特異性調節元件。最好使用源自CD34基因的調節元件(參見例如Satterthwaite,A.B.等(1992)Genomics 12:788-794；Burn,T.C.等(1992)Blood 80:3051-3059)。
本發明的另一方面涉及表達maf家族蛋白的重組宿主細胞。可以使用這種宿主細胞產生Th2相關細胞因子(例如IL-4)。亦可將這種宿主細胞給予受治療者，以在該受治療者中產生Th2相關細胞因子做為在該受治療者中操縱Th1∶Th2比例的手段。術語“宿主細胞”和“重組宿主細胞”在本文中可互換使用，指其中已導入了重組表達載體的細胞。應理解，這種術語不僅指特定對象細胞，也指這種細胞的子代。因為由于或者突變或者環境影響在后續世代中可能發生某些修飾，這種子代事實上可能與親代細胞不同，但是只要這些子代細胞保留該重組表達載體，這些子代仍然包括于本文使用的術語“宿主細胞”的范圍之內。
在一個實施方案中，本發明提供已導入編碼maf家族蛋白的重組表達載體的宿主淋巴樣細胞。該宿主淋巴樣細胞可以是T細胞或B細胞。本發明的宿主T細胞可以是例如體外培養的T細胞克隆(諸如實施例中描述的)，或者是從受治療者中分離的正常T細胞(例如外周血T細胞或脾T細胞)。本領域已知體外制備和培養T細胞克隆或分離T細胞(例如從外周血)的標準方法，例如通過使用結合T細胞特異性細胞表面標記(例如CD3)或T細胞特定亞群的表面標記(例如CD4或CD8)的mAb。可以通過各種已知的將DNA導入哺乳動物細胞的轉染方法的一種將該重組表達載體導入T細胞，所述方法包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導轉染、lipofectin或電穿孔。可以在Sambrook等(分子克隆實驗室手冊，第二版，Cold Spring HarborLaboratory出版社(1989)和其它實驗室手冊中找到轉化或轉染宿主細胞的合適方法。
在另一實施方案中，本發明的宿主淋巴樣細胞是宿主B細胞，其中已導入了編碼maf家族蛋白的重組表達載體。該B細胞可以是例如體外培養的B淋巴瘤細胞(諸如實施例中描述的M12細胞)，或者是從受治療者中分離的正常B細胞(例如外周血B細胞或脾B細胞)。本領域可得到各種B淋巴瘤細胞系并已知體外培養這種細胞的標準方法。另外，本領域已知分離正常B細胞(例如從外周血)的標準方法，例如通過使用結合B細胞特異性細胞表面標記(例如膜免疫球蛋白B7-1、CD20)的mAb。可以如上述T細胞那樣通過標準方法將該重組表達載體導入該B細胞。
在再一實施方案中，本發明提供已導入編碼maf家族蛋白的重組表達載體的宿主造血干細胞。可以使用本領域已知的分離這種干細胞的標準方法從受治療者(例如從該受治療者的外周血或骨髓)分離造血干細胞，例如通過使用結合造血干細胞特異性細胞表面標記(最好為CD34)的mAb(有關分離干細胞的進一步描述，參見例如Wagner,J.E.等(1995)Blood86:512-523；Murray,L.等(1995)Blood85:368-378；Bemardi,A.C.等(1995)Science 267:104-108；Bemstein,I.D.等(1994)Blood Cells20:15-24；Angelini,A.等(1993)Int.J.Artif.Organs 16增刊5:13-18；Kato,K.和Radburch,A.(1993)Cytometry14:384-392；Lebkowski,J.S.等(1992)Transplantation 53:1011-1019；Lebkowski,J.等(1993)J.Hematother.2:339-342)。。可以如上述T細胞那樣通過標準方法將該重組表達載體導入該造血干細胞。
熟練技術人員將會理解上述有關maf家族蛋白的組合物可以為各種不同maf家族蛋白諸如c-Maf和小maf(例如p18)制備。
本發明再提供攜帶編碼maf家族蛋白的轉基因的轉基因動物。在最佳實施方案中，該maf家族轉基因優先或僅在該動物的T細胞中表達。可以通過將轉基因中的該maf編碼序列連接至指導在特定細胞類型中表達該編碼蛋白的調節序列，達到maf家族蛋白的組織特異性表達。本領域已知這種組織特異性調節元件并將在本文中進一步描述。推薦的maf家族轉基因的T細胞特異性表達的調節元件是CD4啟動子/增強子。推薦用于轉基因的maf家族蛋白是c-maf。推薦c-maf轉基因構建物的示意圖示于圖20中。在這個構建物中，該CD4啟動子/增強子操作性地連接至小鼠c-maf基因的第一個內含子，再操作性地連接至小鼠c-mafcDNA，后者又操作性地連接至SV40多聚腺苷酸化序列。可以按照本文進一步詳細描述的制備轉基因動物的標準程序通過將c-maf轉基因構建物微注射入受精的卵母細胞制備轉基因動物。在T細胞中過量表達c-Maf蛋白的c-maf轉基因小鼠的表現型在實施例17中進一步描述。簡言之，這些動物表現出與IL-4過量表達轉基因小鼠非常類似的表現型，例如小脾臟和胸腺、雙陽性胸腺細胞和單陽性CD4+胸腺細胞數減少和血清IgE基礎水平增加。表達maf家族蛋白的轉基因動物可以用于例如評價測試化合物調節maf家族蛋白活性的能力。例如，可以給予表達maf家族蛋白的轉基因動物測試化合物，該測試化合物在該轉基因動物中的效果可以通過比較在存在該測試化合物的情況下該轉基因動物的表現型和在缺乏該測試化合物的情況下該轉基因動物的表現型而確定。Ⅴ．NIP45組合物及其使用方法A．分離的核酸分子本發明的一個方面涉及編碼NIP45或其片段的分離的核酸分子。在最佳實施方案中，本發明的分離的核酸分子包含示于SEQ ID NO:5的核苷酸序列。SEQ ID NO:5的序列對應于小鼠NIP45 cDNA。該cDNA包含編碼NIP45蛋白的序列(即，“編碼區”，從核苷酸13至1248)以及5’非翻譯序列(核苷酸1-12)和3’非翻譯序列(核苷酸1249-1946)。或者，該核酸分子可以僅包含SEQ ID NO:5的編碼區(即，核苷酸13-1248)。
另外，本發明的核酸分子可以僅包含SEQ ID NO:5的編碼區的一部分，例如，編碼NIP45的生物學活性部分的片段。術語“NIP45的生物學活性部分”包括保留與NT-AT家族蛋白的RHD相互作用能力的NIP45的部分。NIP45的部分與NF-AT RHD相互作用的能力可以在標準體外相互作用檢測中確定，例如使用NF-AT RHD融合蛋白。可以通過分離SEQ ID NO:5的部分、表達NIP45蛋白或肽的被編碼部分(例如通過在宿主細胞中重組表達)并例如使用谷胱甘肽S轉移酶(GST)-NF-AT-RHD融合蛋白評價該部分與NF-AT特別是NF-AT RHD相互作用的能力，制備編碼生物學活性NIP45部分的核酸片段。
本發明再包括由于遺傳密碼的簡并性與SEQ ID NO:5(或其片段)不同并由此編碼與SEQ ID NO:5編碼的相同的NIP45蛋白的核酸分子。因此，在另一實施方案中，本發明的分離的核酸分子具有編碼具有示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列。另外，本發明包括編碼SEQ ID NO:6的部分例如其生物學活性部分的核酸分子。
可以使用標準分子生物學技術和本文提供的序列信息，分離具有SEQ ID NO:5的核苷酸序列或其部分的核酸分子。例如，使用SEQ IDNO:5的全部或部分做為雜交探針和使用標準雜交技術(例如如描述于Sambrook,J.等，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室，冷泉港，NY,1989)，可以從cDNA文庫分離NIP45cDNA。另外，可以通過使用基于SEQ ID NO:5的序列設計的寡核苷酸引物的聚合酶鏈式反應，分離包含所有或部分SEQ ID NO:5的核酸分子。例如，可以從細胞分離mRNA(例如通過Chirgwin等(1979Biochemistry18:5294-5299的硫氰酸鈲提取程序)并可以使用逆轉錄酶(例如可以從Gibco/BRL,Bethesda,MD得到的Moloney MLV逆轉錄酶；或可以從Seikagaku America,Inc.,St.Petersburg,FL得到的AMV逆轉錄酶)制備cDNA。可以基于示于SEQ ID NO:5的核苷酸序列設計用于PCR擴增的合成寡核苷酸引物。可以使用cDNA或者基因組DNA做為模板并使用適當的寡核苷酸引物，按照標準PCR擴增技術擴增本發明的核酸。可以將如此擴增的核酸克隆入適當的載體，并通過DNA序列分析鑒定。另外，可以通過標準合成技術，例如使用自動DNA合成儀，制備對應于NIP45核苷酸序列的寡核苷酸。
除了示于SEQ ID NO:5的NIP45核苷酸序列，本領域技術人員將會理解在種群內可以存在導致NIP45氨基酸序列改變的DNA序列多態性。NIP45基因中的這種遺傳多態性可能由于自然等位變異存在于種群內的個體之中。這種自然等位變異可以通常導致基因的核苷酸序列中1-5％的變異。做為自然等位變異的結果和不改變NIP45功能活性的NIP45中的任何和所有這種核苷酸變異和導致的氨基酸多態性均屬于本發明的范圍。另外，編碼來自其它物種的NIP45的核酸分子并因此具有不同于SEQ ID NO:5的小鼠序列但卻與該小鼠序列相關的核苷酸序列屬于本發明的范圍。對應于本發明的小鼠NIP45cDNA的自然等位變異以及人類和其它哺乳動物同源物的核酸分子可以基于其與本文公開的小鼠NIP45核酸分子的同源性，使用該小鼠cDNA或其片段做為雜交探針，按照標準雜交條件在嚴格雜交條件下分離。因此，在另一實施方案中，本發明的分離核酸分子在嚴格條件下與包含SEQ IDNO:5的核苷酸序列的核酸分子雜交。在某些實施方案中，該核酸的長度至少為15、30、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或1500個核苷酸。在嚴格條件下與SEQ ID NO:5序列雜交的本發明的分離核酸分子最好對應于天然存在的核酸分子。在一個實施方案中，該核酸編碼天然人類NIP45蛋白。在另一實施方案中，該核酸分子編碼諸如小鼠NIP45蛋白的鼠NIP45蛋白。
除了可能存在于種群中的NIP45序列的天然存在的等位變異，熟練技術人員將會進一步理解，可以通過突變將變化導入SEQ ID NO:5的核苷酸序列，由此導致被編碼蛋白的氨基酸序列變化，而不改變該NIP45蛋白的功能活性。例如，可以在SEQ ID NO:5的序列中造成導致于“非必需”氨基酸殘基的氨基酸置換的核苷酸置換。“非必需”氨基酸殘基是可以從NIP45野生型序列(例如SEQ ID NO:6的序列)改變而不改變NIP45的功能活性的殘基，這種功能活性諸如它與NF-ATRHD相互作用的能力或它與NF-AT和c-Maf在刺激基因轉錄中協同，而“必需”氨基酸殘基對于功能活性是需要的。
因此，本發明的另一方面涉及的核酸分子，它編碼在對NIP45活性非必需的氨基酸殘基中含有變化的NIP45蛋白。這種NIP45蛋白與SEQ ID NO:6的氨基酸序列不同，但卻保留NIP45活性。在一個實施方案中，該分離核酸分子包含編碼蛋白的核苷酸序列，其中該蛋白包含與SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少60％同源的氨基酸序列并與NF-AT家族蛋白的RHD相互作用。由該核酸分子編碼的該蛋白優選與SEQ ID NO:6至少70％同源、更優選與SEQ ID NO:6至少80％同源、甚至更優選與SEQ ID NO:6至少90％同源，最優選與SEQ ID NO:6至少95％同源。
為確定二個氨基酸序列(例如SEQ ID NO:6與其突變形式)的同源百分比，將這些序列對齊以進行最佳比較(例如為與另一蛋白最佳對比，可以在蛋白序列中導入空隙)。然后比較位于對應氨基酸位置的氨基酸殘基。當一個序列(例如SEQ ID NO:6)中的位置由與另一序列(例如NIP45的突變形式)中對應位置的同一氨基酸殘基占據，那么在所述分子于此位置是同源的(即，本文使用的氨基酸“同源性”與氨基酸“相等性”相等)。二個序列之間的同源性百分比是由這些序列共有的相同位置數的函數(即，同源性％=相等位置數/總位置數×100)。
可以通過將一個或多個核苷酸置換、添加或缺失導入SEQ ID NO:5的核苷酸序列，使得一個或多個氨基酸置換、添加或缺失被導入被編碼的蛋白，而制備編碼與SEQ ID NO:6的蛋白同源的NIP45蛋白的分離核酸分子。可以通過諸如定點誘變和PCR介導誘變將突變導入SEQ ID NO:5。最好在一個或多個預測的非必需氨基酸殘基進行保守氨基酸置換。“保守氨基酸置換”是其中用具有類似側鏈的氨基酸殘基替換該氨基酸殘基的置換。本領域已定義具有類似側鏈的氨基酸殘基家族，包括堿性側鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電極性側鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分枝側鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，最好用來自同一側鏈家族的另一氨基酸殘基替換NIP45蛋白中的氨基酸殘基。或者，在另一實施方案中，可以例如通過飽和誘變沿著NIP45編碼序列的全部或部分隨機導入突變，可以就與NF-AT RHD(例如使用GST-NF-AT-RHD融合蛋白)相互作用的能力篩選得到的突變體，以鑒別保留與NF-AT相互作用能力的突變體。在誘變SEQ ID NO:5后，可以在宿主細胞中重組表達該編碼的突變體蛋白，并可以用體外相互作用檢測測定該突變體蛋白與NF-AT相互作用的能力。例如，可以放射標記重組NIP45蛋白(例如SEQ ID NO:6的突變或截短的形式)并與GST-NF-AT RHD融合蛋白溫育。然后假如形成了這種復合物，將谷胱甘肽瓊脂糖膠粒加入該混合物，以沉淀NIP45-GST-NF-AT RHD復合物。在清洗該膠粒以除去非特異性結合之后，測定與該膠粒相結合的放射性蛋白的量并與殘留于洗脫液中的放射性蛋白的量比較，以由此此確定該NIP45蛋白能否有與NF-AT的RHD相互作用。
本發明的另一方面涉及與NIP45mRNA編碼鏈或基因反義的分離核酸分子。本發明的反義核酸可以與整個NIP45編碼鏈或僅其部分互補。在一個實施方案中，反義核酸分子與編碼NIP45的核苷酸序列的編碼鏈的編碼區(例如包含核苷酸13-1248的SEQ ID NO:5的整個編碼區)反義。在另一實施方案中，該反義核酸分子與編碼NIP45的核苷酸序列的編碼鏈的非編碼區反義。在某些實施方案中，本發明的反義核酸的長度至少為15、30、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或1500個核苷酸。
已知本文公開的編碼NIP45的編碼鏈序列(例如SEQ ID NO:5)，可以按照沃森和克里克堿基配對原則設計本發明的反義核酸。該反義核酸分子可以與NIP45mRNA的整個編碼區互補，或者可以是僅與NIP45mRNA的編碼區或非編碼區的一部分反義的寡核苷酸。例如，該反義寡核苷酸可以與NIP45 mRNA翻譯起始位點周圍的區互補。反義寡核苷酸的長度可以是例如約15、20、25、30、35、40、45或50個核苷酸。可以使用本領域已知的方法使用化學合成和酶連接反應構建本發明的反義核酸。例如，可以使用天然存在的核苷酸或設計用于增加該分子的生物學穩定性或增加反義和有義核酸之間形成的雙鏈體的物理穩定性的各種修飾核苷酸，化學合成反義核酸(例如反義寡核苷酸)，例如，可以使用硫代磷酸衍生物和吖啶取代的核苷酸。或者，可以使用其中已以反義定位(即，從該插入的核酸轉錄的RNA將與目的靶核酸反義，在以下小節中進一步描述)亞克隆核酸的表達載體，在生物學上產生反義核酸。
在另一實施方案中，本發明的反義核酸是核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，它可以酶切與其有互補區的諸如mRNA的單鏈核酸。可以基于本文公開的NIP45 cDNA核苷酸序列(即，SEQ ID NO:5)，設計對NIP45編碼核酸具有特異性的核酶。例如，可以構建四膜蟲屬L-19IVS RNA的衍生物，其中活性位點的堿基序列與NIP45編碼mRNA中欲酶切的堿基序列互補。參見例如Cech等美國專利4,987,071號；和Cech等美國專利5,116,742號。或者，可以使用NIP45mRNA從RNA分子庫中選擇具有特異性核糖核酸酶活性的催化性RNA。參見例如Bartel,D.和Szostak,J.W.(1993)Science261:1411-1418。
本發明的再一方面涉及編碼NIP45融合蛋白的分離核酸分子。可以通過標準重組DNA技術，制備這種包含至少操作性地連接至編碼非NIP45蛋白、多肽或肽的第二核苷酸序列的編碼NIP45蛋白、多肽或肽的第一核苷酸序列的核酸分子。在以下C小節中進一步詳細描述NIP45融合蛋白。
B．重組表達載體和宿主細胞本發明的另一方面涉及含有編碼NIP45(或其部分)的核酸的載體，最好是重組表達載體。本發明的表達載體包含適于在宿主細胞中表達該核酸的形式的本發明的核酸，這意味著該重組表達載體包括一個或多個調節序列，所述調節序列基于用于表達的宿主細胞選擇并操作性地連接至欲表達的核酸序列。在重組表達載體內，“操作性地連接”指目的核苷酸序列以允許表達該核苷酸序列的方式(例如在體外轉錄/翻譯系統或當該載體導入宿主細胞時在宿主細胞中)連接至該調節序列。術語“調節序列”包括啟動子、增強子和其它表達控制元件(例如多聚腺苷酸化信號)。這種調節序列描述于例如Goeddel；GeneExpression Technology: Methods in Enzymology185,Academic Press,SanDiego,CA(1990)。調節序列包括那些在許多宿主細胞類型中指導組成型表達核苷酸序列的序列和那些僅在某些宿主細胞中指導該核苷酸序列表達的序列(例如組織特異性調節序列)。本領域技術人員將會理解，表達載體的設計可以取決于將要轉化的宿主細胞的選擇、所需蛋白表達水平等。可以將本發明的表達載體導入宿主細胞，以由此產生由本文描述的核酸編碼的包括融合蛋白或肽的蛋白或肽(例如NIP45蛋白、NIP45蛋白的突變形式、NIP45融合蛋白等等)。
可以設計本發明的重組表達載體以在原核或真核細胞中表達NIP45蛋白。例如，可以在諸如大腸桿菌的細菌細胞、昆蟲細胞(使用桿狀病毒表達載體)、酵母細胞或哺乳動物細胞中表達NIP45。在Goeddel；Gene Expression Technology:Methods in Enzymology185,Academic Press,San Diego,CA(1990)中進一步討論合適的宿主細胞。或者，可以例如使用T7啟動子調節序列和T7聚合酶在體外轉錄和翻譯該重組表達載體。
最常用含有指導或者融合或者非融合蛋白表達的組成型或誘導型啟動子，在大腸桿菌中進行蛋白在原核生物中的表達。融合載體將一些氨基酸加至其中編碼的蛋白上，一般加至該重組蛋白的氨基末端。這種融合載體通常適合三個目的1)增加重組蛋白的表達；2)增強該重組蛋白的溶解度；和3)通過做為親和純化中的配體起作用幫助純化該重組蛋白。經常在融合表達載體中，在該融合部分和該重組蛋白的連接處導入一個蛋白酶剪切位點，以在純化該融合蛋白之后能夠從該融合等分分離該重組蛋白。這種酶及其同源識別序列包括因子Xa、凝血酶和腸激酶。典型的融合表達載體包括pGEX(PharmaciaBiotech Inc；Smith,D.B.和Johnson,K.S.(1988)Gene67:31-40)、pMAL(New England Biolabs,Beverly,MA)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,NJ)，它們分別將谷胱甘肽S-轉移酶(GST)、麥芽糖E結合蛋白或蛋白A融合至靶重組蛋白。
合適的誘導型非融合大腸桿菌表達載體的實例包括pTrc(Amann等，(1988)Gene69:301-315)和pET11d(Studier等，Gene ExpressionTechnology:Methods in Enzymology185,Academic Press,San Diego,Califormia(1990)60-89)。靶基因從pTrc載體的表達依賴于宿主RNA聚合酶從雜種trp-lac融合啟動子的轉錄。靶基因從pET 11d載體的表達依賴于從由共表達病毒RNA聚合酶(T7gnl)介導的T7gn10-1ac融合啟動子的轉錄。該病毒聚合酶由來自包含在lacUV5啟動子轉錄控制之下的T7gnl基因的存留(resident)λ原噬菌體的宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)提供。
在大腸桿菌中最大表達重組蛋白的一種策略是在蛋白酶剪切該重組蛋白的能力削弱的宿主細菌中表達該蛋白(Gottesman,S.,GeneExpression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,SanDiego,Califomia(1990)119-128)。另一策略是改變欲插入表達載體的核酸的核酸序列，使得每個氨基酸的單個密碼子是那些在大腸桿菌中優先使用的(Wada等，(1992)Nuc.Acids Res.20:2111-2118)。可以通過標準DNA合成技術進行本發明核酸序列的這種改變。
在另一實施方案中，該NIP45表達載體是酵母表達載體。在啤酒酵母中表達的載體的實例包括pYepSecl(Baldari等，(1987)EMBO J.6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz,(1982)Cell30:933-943)、pJRY88(Schultz等，(1987)Gene54:113-123)和pYES2(InvitrogenCorporation,San Diego,CA)。
或者，可以使用桿狀病毒表達載體在昆蟲細胞中表達NIP45。可用于在培養昆蟲細胞(例如Sf9細胞)中表達蛋白的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith等，(1983)Mol.Cell Biol.3:2156-2165)和pVL系列(Lucklow,V.A.和Summers,M.D.,(1989)Virology 170:31-39)。
在再一實施方案中，使用哺乳動物表達載體在哺乳動物細胞中表達本發明的核酸。哺乳動物表達載體的實例包括pMex-NeoⅠ、pCDM8(Seed,B.,(1987)Nature329:840)和pMT2PC(Kaufman等(1987),EMBOJ.6:187-195)。當用于哺乳動物細胞時，通常由病毒調節元件提供表達載體的控制功能。例如，常用的啟動子源自多形瘤、腺病毒2、細胞肥大病毒和猿猴病毒40。
在另一實施方案中，該重組哺乳動物表達載體可以優先在特定細胞類型中指導表達該核酸(例如使用組織特異性調節元件表達該核酸)。本領域已知組織特異性調節元件。合適的組織特異性啟動子的非限制性實例包括淋巴特異性啟動子(Calame和Eaton(1988)Adv.Immunol.43:235-275)、特別是T細胞受體啟動子(Winoto和Baltimore(1989)EMBO J.8:729-733)和免疫蛋白啟動子(Banerji等(1983)Cell33:729-740；Queen和Baltimore(1983)Cell33:741-748)、白蛋白啟動子(肝臟特異性；Pinkert等(1987)Genes Dev.1:268-277)、神經元特異性啟動子(例如神經絲啟動子；Byme和Ruddle(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:5473-5477)、胰臟特異性啟動子(Edlund等(1985)Science230:912-916)和乳腺特異性啟動子(例如乳清啟動子；美國專利4,873,316號和歐洲申請公布號264,166)。亦包括發育調節啟動子，例如鼠hox啟動子(Kessel和Gruss(1990)Science249:374-379)和甲胎蛋白啟動子(Campes和Tilghman(1989)Genes Dev.3:537-546)。
本發明另外提供包含以反義定位克隆入該表達載體的本發明的DNA分子的重組表達載體。即，將該DNA分子操作性地連接至調節序列，其連接方式使得表達(通過轉錄該DNA分子)與NIP45mRNA反義的RNA分子。可以選擇操作性地連接至以反義定位克隆的核酸的調節序列，該序列指導該反義RNA分子在各種細胞內連續表達，例如可以選擇病毒啟動子和/或增強子或調節序列，它們指導反義RNA的組成型、組織特異性或細胞類型特異性表達。該反義表達載體可以是例如重組質粒、噬菌粒或減毒病毒的形式，其中反義核酸在高效調節區的控制之下產生，該區的活性由導入該載體的細胞類型確定。有關使用反義基因調節基因表達的討論，參見Weintraub,H.等，作為遺傳分析分子工具的反義RNA,Reviews-Trends in Genetics，第1(1)卷1986。
本發明的另一方面涉及已導入本發明的載體、最好是重組表達載體的重組宿主細胞。宿主細胞可以是原核或真核細胞。例如，可以在諸如大腸桿菌的細菌細胞、昆蟲細胞、酵母或哺乳動物細胞(例如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或COS細胞)中表達NIP45蛋白。本領域技術人員已知其它合適的宿主細胞。可以通過常規轉化或轉染技術將載體DNA導入原核或真核細胞。本文使用的術語“轉化”和“轉染”指各種本領域認可的將異源核酸(例如DNA)導入宿主細胞的技術，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導的轉染、lipofectin或電穿孔。可以在Sambrook等(分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社(1989))和其它實驗室手冊中找到轉化或轉染宿主細胞的合適方法。
為穩定轉染哺乳動物細胞，已知根據使用的表達載體和轉染技術，僅有小部分細胞可能將外源DNA整合入其基因組。為鑒別和選擇這些整合體，一般將編碼可選擇標記(例如對抗生素抗性)的基因與目的基因一起導入宿主細胞。推薦的可選擇標記包括那些賦予對藥物(例如G418、潮霉素和甲氨蝶呤)抗性的的選擇性標記。可以在編碼NIP45的同一載體上或在獨立載體上將編碼可選擇標記的核酸導入宿主細胞。可以通過藥物選擇鑒別用導入的核酸穩定轉染的細胞(例如整合了該可選擇標記基因的細胞將存活，而其它細胞死亡)。
諸如培養中的原核或真核宿主細胞的本發明的宿主細胞可以用于生產(即表達)NIP45蛋白。因此，本發明再提供使用本發明的宿主細胞生產NIP45蛋白的方法。在一個實施方案中，該方法包含在適當的培養基中培養本發明的宿主細胞(其中已導入了編碼NIP45的重組表達載體)直至產生NIP45。在另一實施方案中，該方法再包含從該培養基或該宿主細胞分離NIP45。天然形式的NIP45蛋白是胞內蛋白，因此，可以在重組宿主細胞中胞內表達重組NIP45蛋白，然后例如通過裂解該宿主細胞并從該裂解液回收該重組NIP45蛋白，而從該宿主細胞分離重組NIP45蛋白。或者，可以通過將異源信號序列連接至該蛋白的氨基末端，使得該蛋白從該宿主細胞分泌，而制備做為胞外蛋白的重組NIP45蛋白。在這種情況下，可以從培養細胞的培養基中回收重組NIP45蛋白。
亦可以使用本發明的某些宿主細胞產生非人類轉基因動物。本發明的宿主細胞是已導入了NIP45編碼序列的受精卵母細胞或胚胎干細胞。然后，可以使用這種宿主細胞產生其基因組中已導入了外源NIP45序列的非人類轉基因動物或其中內源NIP45序列已被改變的同源重組動物。這種動物可以用于研究NIP45的功能和/或活性，和用于鑒別和/或評價NIP45活性的調節物。因此，本發明的另一方面涉及含有攜帶編碼NIP45蛋白或NIP45蛋白部分的轉基因的細胞的非人類轉基因動物。在本發明轉基因動物的一個分實施方案(subembodiment)中，該轉基因改變了編碼內源NIP45蛋白的內源基因(例如同源重組動物，其中該內源NIP45基因已被功能性破壞或“剔除”，或者該內源NIP45基因的核苷酸序列已突變或該內源NIP45基因的轉錄調節區已被改變)。
可以通過將NIP45編碼核酸例如通過微注射導入受精卵母細胞的雄原核并使該卵母細胞在假孕雌性代孕(foster)動物中發育，產生本發明的轉基因動物。可以將SEQ ID NO:5的小鼠NIP45cDNA序列做為轉基因導入非人類動物(例如小鼠)的基因組。或者，可以基于與小鼠NIP45cDNA的雜交，分離諸如人NIP45基因的小鼠NIP45基因的哺乳動物類似物，并用將其做轉基因。亦可以將內含子序列和多聚腺苷酸化信號包括于該轉基因中，以增加該轉基因的表達效率。可以將組織特異性調節序列操作性地連接至該NIP45轉基因，以指導特定細胞的NIP45蛋白表達。通過胚胎操作和微注射產生轉基因動物特別是諸如小鼠的動物的方法已成為本領域的常規方法，并描述于例如Leder等的美國專利4,736,866號和4,870,009號、Wagner等的美國專利4,873,191號和Hogan,B.,Manipulatmg the Mouse Embryo,(冷泉港實驗室出版社，冷泉港，N.Y.,1986)。使用類似的方法產生其它的轉基因動物。可以基于其基因組中NIP45轉基因的存在和/或所述動物的組織或細胞中NIP45mRNA的表達，鑒別轉基因建立動物(transgenic founderanimal)。然后可以用轉基因建立動物繁育更多的攜帶該轉基因的動物。另外，可以將攜帶編碼NIP45的轉基因的轉基因動物進一步繁育為攜帶其它轉基因的其它轉基因動物。
為產生同源重組動物，制備一載體，它含有已導入缺失、添加或置換的至少一部分NIP45基因，以由此改變(例如功能性破壞)內源NIP45基因。該NIP45基因最好是小鼠NIP45基因。例如，使用SEQ IDNO:5的小鼠NIP45cDNA做為探針，可以從小鼠基因組DNA文庫分離小鼠NIP45基因。然后可以用該小鼠NIP45基因構建適于改變小鼠基因組中內源NIP45基因的同源重組載體。在最佳實施方案中，設計該載體使得在同源重組時，該內源NIP45基因被功能性地破壞(即，不再編碼功能蛋白；亦稱為“剔除”載體)。或者，可以設計該載體使得在同源重組時，該內源NIP45基因被突變或其它改變，但仍然編碼功能蛋白(例如可以改變上游調節區以由此改變內源NIP45蛋白的表達)。在該同源重組載體中，在該NIP45基因改變部分的5’和3’端由NIP45基因的其它核酸位于其二側翼，以在由該載體攜帶的外源NIP45基因和胚胎干細胞中的內源NIP45基因之間發生同源重組。該位于二側的另一NIP45核酸有足夠的長度以成功地與該內源基因進行同源重組。通常，將幾千個堿基對的側翼DNA(5’和3’均有)包括于該載體中(參見例如Thomas,K.R.和Capecchi,M.R.(1987)Cell 51:503有關同源重組載體的描述)。將該載體導入胚胎干細胞系(例如通過電穿孔)并選擇其中導入的NIP45基因已與內源NIP45基因同源重組的細胞(參見例如Li,E.等(1992)Cell69:915)。然后將選擇的細胞注射入動物(例如小鼠)的胚泡，以形成聚集嵌合體(參見例如Bradley,A.載于Teratocarcmomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach,E.J.Robertson編輯(IRL,Oxford,1987)第113-152頁)。然后可以將嵌合胚胎植入合適的假孕雌性代孕動物，并使胚胎發育足月。可以使用在其生殖細胞中含有該同源重組DNA的子代通過該轉基因的種系傳遞繁育動物，其中該動物的所有細胞均含有該同源重組DNA。構建同源重組載體和同源重組動物的方法進一步描述于Bradley,A.(1991)CurrentOpinion in Biotechnology2:823-829和Le Mouellec等的PCT國際公布號WO90/11354；Smithies等的WO91/01140；Zijlstra等的WO92/0968；和Bems等的WO93/04169。
C．分離的NIP45蛋白和抗NIP45抗體本發明的另一方面涉及分離的NIP45蛋白、諸如其生物學活性部分的部分以及適于做為免疫原以產生抗NIP45抗體的肽片段。在一個實施方案中，本發明提供分離的NIP45蛋白制劑。該NIP45蛋白最好具有示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在其它實施方案中，該NIP45蛋白基本上與SEQ ID NO:6同源，并保留SEQ ID NO:6蛋白的功能活性，但由于自然等位變異或誘變在氨基酸序列上不同，或是SEQ IDNO:6蛋白的哺乳動物同源物(例如人類同源物)，如上述A小節中詳細描述的。因此，在另一實施方案中，該NIP45蛋白是一蛋白，它包含與SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少60％同源的氨基酸序列并與NF-AT家族蛋白的RHD相互作用。該蛋白優選與SEQ ID NO:6至少70％同源、更優選與SEQ ID NO:6至少80％同源、甚至更優選與SEQ ID NO:6至少90％同源，最優選與SEQ ID NO:6至少95％同源。
在其它實施方案中，本發明提供分離的NIP45蛋白的部分。例如，本發明還包括與NF-AT相互作用的NIP45蛋白的部分。如在實施例中證實的，NIP45蛋白與NF-AT的RHD相互作用。可以使用體外相互作用檢測(例如在上述A小節中描述的使用GST-NF-AT RHD融合蛋白)，以測定NIP45肽片段與NF-AT Rel同源域相互作用的能力，以由此鑒別與NF-AT相互作用的肽片段。
最好通過重組DNA技術生產NIP45蛋白。例如，將編碼該蛋白的核酸分子克隆入表達載體(如上述)，將此表達載體導入宿主細胞(如上述)并在該宿主細胞中表達該NIP45蛋白。然后可以使用標準蛋白純化技術，通過適當純化流程從該細胞分離NIP45蛋白。重組表達的替代方法是可以使用標準肽合成技術化學合成NIP45多肽。另外，可以從細胞(例如從T細胞)例如通過使用抗NIP45抗體的免疫沉淀，分離天然NIP45蛋白。
本發明亦提供NIP45融合蛋白。本文使用的NIP45“融合蛋白”包含操作性地連接至非NIP45多肽的NIP45多肽。“NIP45多肽”指具有對應于NIP45蛋白或其肽片段的氨基酸序列的多肽，而“非NIP45多肽”指具有對應于另一蛋白的氨基酸序列的多肽。在該融合蛋白內，術語“操作性地連接”指該NIP45多肽和該非NIP45多肽在框架內互相融合。該非NIP45多肽可以融合至該NIP45多肽的N末端或C末端。例如，在一個實施方案中，該融合蛋白是GST-NIP45融合蛋白，其中該NIP45序列融合至該GST序列的C末端。在另一實施方案中，該融合蛋白是NIP45-HA融合蛋白，其中該NIP45核苷酸序列插入pCEP4-HA載體(Herrscher,R.F.等(1995)Genesd Dev.9:3067-3082)使得該NIP45序列在框架內融合至流感血凝素表位標記。這種融合蛋白可以便于純化重組NIP45。
本發明的NIP45融合蛋白最好用標準重組DNA技術生產。例如，按照常規技術，將編碼不同多肽序列的DNA片段在框架內連接，該常規技術，例如使用平端或交錯末端進行連接、限制性酶消化以提供適當的末端、合適時填補粘性末端、堿性磷酸酶處理以避免不需要的連接和酶連接。在另一實施方案中，通過包括自動DNA合成儀的常規技術可以合成該融合基因。或者，可以使用錨定引物進行基因片段的PCR擴增，該引物在二個相鄰基因片段之間產生形成互補突出端，該懸垂隨后可以被退火并再擴增以產生嵌合基因序列(參見，例如，分子生物學現行方法，編輯Ausubel等John Wiley&Sons:1992)。另外，市售有許多已編碼融合部分(例如GST多肽或HA表位標記)的表達載體。可以將NIP45編碼核酸克隆入這種表達載體，使得該融合部分在框架內連接至該NIP45蛋白。
使用多克隆和單克隆抗體制備的標準技術，可以使用分離NIP45蛋白或其片段做為免疫原以產生結合NIP45的抗體。可以使用NIP45蛋白產生抗體，或者可以使用NIP45的抗原性肽片段做為免疫原。NIP45的抗原性肽片段通常包含示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列的至少8個氨基酸殘基并包括NIP45的表位，使得產生的抗該肽的抗體與NIP45形成特異性免疫復合物。該抗原肽優選包含至少10個氨基酸殘基、更優選包含至少15個氨基酸殘基、甚至更優選包含至少20個氨基酸殘基，最優選包含至少30個氨基酸殘基。該抗原肽包含的優選表位是位于該蛋白表面例如親水性區的NIP45的區。SEQ ID NO:6的NIP45蛋白序列的疏水性分析示于圖12。
通常使用NIP45免疫原，通過用該免疫原免疫適當的對象(例如，兔子、山羊、小鼠或其它哺乳動物)制備抗體。適當的免疫原制劑可以包括例如重組表達的NIP45蛋白或化學合成的NIP45肽。該制劑可以再包括諸如帶氏完全或不完全佐劑的佐劑或類似的免疫刺激藥物。用免疫原性NIP45制劑免疫合適的對象，誘導多克隆抗NIP45抗體應答。
因此，本發明的另一方面有關抗NIP45抗體。可以如上述通過用NIP45免疫原免疫合適的對象，制備多克隆抗NIP45抗體。可以通過標準技術，諸如使用固定化NIP45的酶聯免疫吸附檢測(ELISA)隨時間檢測被接種對象中的抗NIP45抗體的效價。如果需要，可以從該哺乳動物(例如，從血液)分離該導向NIP45的抗體分子，并通過例如蛋白A層析的眾所周知的技術進一步純化，以得到IgG部分。在免疫后的適當時間，例如當抗NIP45抗體效價最高時，可以從該對象得到抗體產生細胞并用于通過標準技術制備單克隆抗體，所述技術例如為Kohler和Milstein首先描述的雜交瘤技術(1975,Nature256:495-497)(亦參見Brown等(1981)J.Immunol 127:539-46；Brown等(1980)J Biol Chem255:4980-83；Yeh等(1976)PNAS 76:2927-31；和Yeh等(1982)Int.J.Cancer29:269-75)、近期的人B細胞雜交瘤技術(Kozbor等(1983)ImmunolToday4:72)、EBV雜交瘤技術(Cole等(1985),Monoclonal Antibodies andCancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.，第77-96頁)或trioma技術。產生單克隆抗體雜交瘤的技術是眾所周知的(一般參見R.H.Kenneth，載于Monoclonal Antibodies:A New Dimension In Biological Analyses,PlenumPublishing Corp.,New YorK,New York(1980)；E.A.Lerner(1981)Yale J.Biol.Med.,54:387-402；M.L.Gefter等(1977)Somauc Cell Genet.,3:231-36)。簡言之，將無限增殖細胞系(通常為骨髓瘤)與用NIP45免疫原如上述免疫的哺乳動物的淋巴細胞(通常為脾細胞)融合，篩選得到的雜交瘤細胞的培養上清液以鑒別產生結合NIP45的單克隆抗體的雜交瘤。
任何用于融合淋巴細胞和無限增殖化細胞系的許多眾所周知的方法均可用于產生抗NIP45單克隆抗體的目的(參見，例如，G.Galfre等(1977)Nature266:55052；Gefter等Somatic Cell Genet.，見上述引用；Lerner,Yale J.Biol.Med.，見上述引用；Kenneth,Monoclonal Antibodies,見上述引用)。另外，一般技術人員將會理解這種方法的許多變化亦有用處。通常，該無限增殖細胞系(例如，骨髓瘤細胞系)源自與所述淋巴細胞相同的哺乳動物物種。例如，可以將來自用本發明的免疫原制劑免疫的小鼠淋巴細胞與無限增殖化小鼠細胞系融合制備鼠雜交瘤。推薦的永生細胞系是對含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養基(“HAT培養基”)敏感的小鼠骨髓瘤細胞系。多種骨髓瘤細胞系的任何一種均可用做按照標準技術的融合對象，例如P3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Ag14骨髓瘤系。這些骨髓瘤系可以從美國典型培養物保藏中心(ATCC),Rockville,Md.獲得。通常使用聚乙二醇(“PEG”)將HAT敏感小鼠骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞融合。然后使用HAT培養基篩選從融合得到的雜交瘤細胞，該培養基殺死未融合和未有效融合的骨髓瘤細胞(未融合脾細胞由于未被轉化將在幾天后死亡)。通過例如使用標準ELISA，就結合NIP45的抗體方面篩選雜交瘤培養上清液，以檢測產生本發明的單克隆抗體的雜交瘤細胞。
制備分泌單克隆抗體的雜交瘤的置換方法是，可以通過用NIP45篩選重組組合免疫球蛋白文庫(例如，抗體噬菌體展示文庫)由此分離結合NIP45的免疫球蛋白文庫成員，而鑒別和分離單克隆抗NIP45抗體。市售有制備和篩選噬菌體展示文庫的藥盒(例如，Pharmacia重組噬菌體抗體系統，目錄號碼27-9400-01；和Stratagene的SurfZAPTM噬菌體展示藥盒t，目錄號碼240612)。另外，特別適用于產生和篩選抗體展示文庫的方法和試劑的實例可以參見例如Ladener等美國專利5,223,409號；Kang等國際公布號WO92/18619；Dower等國際公布號WO91/17271；Winter等國際公布號WO92/20791；Markland等國際公布WO92/15679；Breitling等國際公布號WO93/01288；McCafferty等國際公布號WO92/01047；Garrard等國際公布號WO92/09690；Ladner等國際公布號WO90/02809；Fuchs等(1991)Bio/Technology9:1370-1372；Hay等(1992)Hum Antibod Hybridomas3:81-85；Huses等(1989)Science246:1275-1281；Griffiths等(1993)EMBO J12:725-734；Hawkins等(1992)J Mol Biol226:889-896；C1arkson等(1991)Nature352:624-628；Gram等(1992)PNAS89:3576-3580；Garrad等(1991)Bio/Technology 9:1373-1377；Hoogenboom等(1991)Nuc Acid Res 19:4133-4137；Barbas等(1991)PNAS88:7978-7982；和McCafferty等Nature(1990)348:552-554。
另外，可以用標準重組DNA技術制備的、諸如包含人和非人類部分的嵌合和人化單克隆抗體的重組抗NIP45抗體屬于本發明的范圍。可以通過本領域已知的重組DNA技術，產生這種嵌合和人化的單克隆抗體，例如使用描述于以下方法的技術Robinson等國際專利公告PCT/US86/02269；Akira，等歐洲專利申請184,187；Taniguchi,M.，歐洲專利申請171,496；Morrison等歐洲專利申請173,494；Neuberger等PCT申請WO86/01533；Cabilly等美國專利4,816,567號；Cabilly等歐洲專利申請125,023；Better等(1988)Science240:1041-1043；Liu等(1987)PNAS84:3439-3443；Liu等(1987)J.Immunol.139:3521-3526；Sun等(1987)PNAS84:214-218；Nishimura等(1987)Canc.Res.47:999-1005；Wood等(1985)Nature314:446-449；和Shaw等(1988)J.Natl.Cancer Inst.80:1553-1559)；Morrson,S.L.(1985)Science229:1202-1207；Oi等(1986)BioTechniques4:214；Winter美國專利5,225,539；Jones等(1986)Nature321:552-525；Verhoeyan等(1988)Science239:1534；和Beidler等(1988)J.Immunol.141:4053-4060。
可以使用抗NIP45抗體(例如，單克隆抗體)通過標準技術諸如親和層析或免疫沉淀分離NIP45。抗NIP45抗體可以便于從細胞純化天然NIP45和純化在宿主細胞中表達的重組產生的NIP45。另外，可以使用抗NIP45抗體檢測NIP45蛋白(例如，在細胞裂解液或細胞上清液中)。通過將該抗體偶聯(例如，物理連接)至可檢測物質便于檢測。因此，在一個實施方案中，用可檢測物質標記本發明的抗NIP45抗體。可檢測物質的實例包括各種酶、輔基、熒光物質、發光物質和放射性物質。合適的酶的實例包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復合物的實例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合適的熒光物質的實例包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、若丹明、二氯三嗪胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發光物質的實例包括魯米諾；合適的放射性物質的實例包括125I、131I、35S或3H。
D．藥用組合物可以將本發明的NIP45蛋白和抗NIP45抗體加入適于給予的藥用組合物。這種組合物通常包含該蛋白或抗體和藥學上可接受載體。本文使用的術語“藥學上可接受載體”包括任何和所有的與藥用給予相適應的溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等等。用于藥用活性物質的這種介質和藥物是本領域眾所周知的。除了在與該活性化合物不匹配的任何常規介質或藥物的情況下，考慮了它在該組合物中的應用。亦可以將附加的活性化合物加入該組合物中。
配制本發明的藥用組合物，使其與計劃的給藥途徑相適應。例如，用于非腸道、皮內或皮下使用的溶液或懸浮液可以包括以下組分無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液、不揮發油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗氧化劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯(methyl parabens)的抗細菌劑；諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；調節滲透壓的藥物，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽的緩沖液和諸如氯化鈉或葡萄糖。可以用諸如鹽酸或氫氧化鈉的酸或堿調節pH。非腸道制劑可以包裝于安瓶、用玻璃或槊料制成的一次性注射器或多劑量西林瓶。
適于注射使用的藥用組合物包括無菌水溶液(如果是水溶性)或分散體和用于臨時制備無菌注射液或分散體的無菌粉末。對于靜脈內給藥，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸緩沖鹽水(PBS)。在所有的情況下，該組合物必須無菌并且應是流體的以易于注射。它必須在生產和儲存條件下穩定并且必須進行防腐以對抗諸如細菌和真菌的微生物的污染作用。該載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等等)和它們的適當混合物的溶劑或分散介質。可以例如通過使用諸如卵磷脂的包衣、通過在分散體的情況下保持需要的顆粒大小和通過使用表面活性劑保持適當的流體性。可以通過各種抗菌劑和抗真菌劑例如對羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等等達到防止微生物作用。在許多情況下，最好在該組合物中包括等滲劑，例如蔗糖、諸如甘露醇、山梨醇的多元醇、氯化鈉。可以通過在該組合物中包括例如單硬脂酸鋁和明膠的延遲吸收的藥物，達到可注射組合物的延長吸收。
可以通過將需要量的該活性化合物(例如NIP45蛋白或抗NIP45抗體)與需要的一種上述列舉的成分或其組合加入適當的溶劑中，接著進行過濾除菌制備無菌注射液。一般而言，可以將該活性化合物加入含有基本分散介質和需要的來自上述列舉的其它成分的無菌溶媒中制備分散體。在用于制備無菌注射液的無菌粉劑的情況下，推薦的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，從先前除菌過濾的溶液產生該活性成分和任何其它需要成分的粉劑。
口服組合物一般包括惰性稀釋劑或食用載體。可將它們包裹于明膠膠囊或壓制成片劑。為口服治療給藥的目的，可以將該活性化合物與賦形劑一起加入，并以片劑、錠劑或膠囊的形式使用。亦可以使用流體載體制備口服組合物，以做為漱口藥使用，其中該流體載體中的該化合物可口服、涮洗和咳吐或吞咽。可以將藥學上相容的粘合劑和/或輔助材料做為該組合物的部分包括進去。片劑、藥丸、膠囊、錠劑等可以含有以下成分或具有類似性質的化合物的任何一種粘合劑，諸如微晶纖維素、西黃蓍膠或明膠；諸如淀粉或乳糖的賦形劑、諸如藻酸、Primogel或玉米淀粉的崩解劑；潤濕劑，諸如硬脂酸鎂或Sterotes的潤滑劑；助流劑，諸如膠體二氧化硅；甜味劑，諸如蔗糖或糖精；調味劑，諸如薄荷、水楊酸甲酯或橙調味劑。
在一個實施方案中，用保護該化合物免受機體快速清除的載體制備該活性化合物，所述載體例如包括植入物和微膠囊化的傳遞系統的控釋制劑。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯、聚乳酸。制備這種制劑的方法對本領域技術人員是顯而易見的。亦可從AlzaCorporation和Nova Pharmaceuticals,Inc.市售得到該材料。亦可以使用脂質體懸浮液(包括用抗病毒抗原的單克隆抗體導向感染細胞的脂質體)做為藥學上可接受載體。這些可以按照本領域技術人員已知的方法制備，例如，如美國專利4,522,811號描述的。
E．檢測NIP45活性的方法本發明的另一方面有關使用本發明的各種NIP45組合物的方法。例如，本發明提供用于檢測NIP45蛋白或其mRNA在生物樣品中存在的方法。該方法涉及用可以檢測NIP45蛋白或其mRNA的藥物接觸該生物樣品，使得檢測NIP45蛋白或其mRNA在該生物樣品中的存在。推薦的檢測NIP45mRNA的藥物是可以與NIP45mRNA雜交的標記核酸探針。該核酸探針可以是例如SEQ ID NO:5的NIP45cDNA或其部分，諸如長度至少為15、30、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個核苷酸并足以在嚴格條件下與NIP45mRNA雜交的寡核苷酸。檢測NIP45蛋白的推薦藥物是可以與NIP45蛋白結合的標記抗體。抗體可以是多克隆或更優選是單克隆的。可以使用完整抗體或其部分(例如，Fab或F(ab’)2)。與該探針或抗體有關的術語“標記”包含通過將可檢測物質偶聯(即，物理連接)至該探針或抗體的探針或抗體的直接標記以及包括通過與另一直接標記的試劑的反應的探針或抗體的間接標記。間接標記的實例包括使用熒光標記的二級抗體和用生物素末端標記DNA探針使其可以被熒光標記的抗生蛋白鏈菌素檢測，而檢測一級抗體的間接標記。術語“生物學樣品”包括組織、細胞和生物體液。例如，檢測NIP45 mRNA的技術包括Northern雜交和原位雜交。檢測NIP45蛋白的技術包括酶聯免疫吸附檢測(ELISA)、Western印跡、免疫沉淀和免疫熒光。Ⅵ．聯合組合物和藥盒本發明亦提供包含調節性藥物組合的組合物。例如，可以將二個或多個編碼調節Th2相關細胞因子基因表達的轉錄因子的核苷酸序列加入重組表達載體，并導入宿主細胞。例如，本發明提供重組載體、已導入這種載體的宿主細胞，包含編碼與NF-AT家族蛋白協作調節Th2相關細胞因子基因表達的第一轉錄因子的第一核苷酸序列和編碼對調節Th2相關細胞因子基因起作用的第二轉錄因子的第二核苷酸序列。最好是，第一核苷酸序列編碼maf家族蛋白(例如，c-Maf)或NF-AT相互作用蛋白(例如，NIP45)。最好是，第二核苷酸序列編碼選自NF-AT家族蛋白、NF-AT相互作用蛋白、maf家族蛋白和AP-1家族蛋白的轉錄因子。
本發明亦包含調節Th2相關細胞因子產生或Th1/Th2亞群發育的藥盒。在一個實施方案中，本發明的藥盒包含至少一種與使用該調節性藥物調節Th2相關細胞因子產生或Th1/Th2亞群發育的說明書一起包裝的本發明調節性藥物。在一個實施方案中，該藥盒包含至少一種用于刺激Th2相關細胞因子產生或向上調節Th2亞群發育(或向下調節Th1亞群發育)的刺激性藥物。在另一實施方案中，該藥盒包含至少一種用于抑制Th2相關細胞因子產生或向下調節Th2亞群發育(或向上調節Th1亞群發育)的抑制性藥物。亦提供包含二種或多種本發明調節性(例如，刺激或抑制)藥物的聯合藥盒。Ⅶ．篩選檢測本發明的另一方面有關鑒別調節化合物的篩選檢測，所述調節化合物調節Th2相關細胞因子基因表達的轉錄因子活性。在各種實施方案中，這些篩選檢測可以鑒別例如調節所述轉錄因子表達或功能活性的化合物、與所述轉錄因子相互作用的蛋白、以及調節這些蛋白-蛋白相互作用的化合物、和在Th2相關細胞因子基因內調節所述轉錄因子與順式作用靶位點(例如，MARE)相互作用的化合物。
在一個實施方案中，本發明提供鑒別調節與激活的T細胞核因子(NF-AT)家族蛋白合作調節Th2相關細胞因子基因表達的轉錄因子的活性的化合物，包含提供指示組合物，它具有與NFAT家族蛋白協作調節Th2相關細胞因子基因表達的轉錄因子活性；使該指示組合物與測試化合物接觸；和確定測試化合物對該指示組合物中轉錄因子活性的影響，以由此鑒別調節與NFAT家族蛋白協作調節Th2相關細胞因子基因表達的轉錄因子活性的化合物。
該轉錄因子可以是例如maf家族蛋白，例如c-Maf或小maf蛋白(例如，p18)。或者，該轉錄因子可以是與NF-AT家族蛋白相互作用的因子，例如NIP45。
該指示組合物可以是無細胞組合物，或其可以是細胞組合物。例如，在一個實施方案中，該指示組合物是淋巴樣細胞，例如Th2細胞。在另一實施方案中，該指示組合物是酵母細胞。
在推薦實施方案中，該指示組合物包含指示細胞，其中所述指示細胞包含(ⅰ)該轉錄因子和(ⅱ)對該轉錄因子應答的報道基因。最好是，該指示細胞含有ⅰ)編碼該轉錄因子的重組表達載體；和ⅱ)包含可操作地連接報道基因的Th2相關細胞因子基因的調節序列的載體；并且所述方法包含a)用測試化合物接觸該指示細胞；b)測定在存在該測試化合物時該指示細胞中該報道基因的表達水平；和c)比較存在該測試化合物時指示細胞中報道基因的表達水平和不存在該測試化合物時指示細胞中報道基因的表達水平，以由此鑒別調節該轉錄因子活性的化合物。
在另一推薦實施方案中，該指示組合物包含的制劑有(ⅰ)該轉錄因子和(ⅱ)該轉錄因子結合的DNA分子，并且所述方法包含a)調測試化合物接觸該指示組合物b)測定在存在該測試化合物時該轉錄因子與該DNA分子相互作用的程度；和c)比較存在該測試化合物時該轉錄因子與該DNA分子相互作用的程度和不存在該測試化合物時該轉錄因子與該DNA分子相互作用的程度，以由此鑒別調節該轉錄因子活性的化合物。
在前述方法的一個實施方案中，該轉錄因子是maf家族蛋白并且該DNA分子包含maf效應元件(MARE)。
在另一推薦實施方案中，該方法鑒別來自Th2細胞的與該轉錄因子相互作用的蛋白。在該實施方案中，該指示組合物是指示細胞，該指示細胞包含ⅰ)可操作地連接至轉錄調節序列的報道基因；和ⅱ)編碼第一融合蛋白的第一嵌合基因，所述第一融合蛋白包括與NFAT家族蛋白協同調節Th2相關細胞因子基因表達的轉錄因子；該測試化合物包含第二嵌合基因文庫，該文庫編碼第二融合蛋白，該第二融合蛋白包括源自Th2細胞的蛋白；該報道基因的表達對第一融合蛋白、第二融合蛋白和該轉錄調節序列之間的相互作用敏感；并且其中通過測定指示細胞中該報道基因的表達水平確定該測試化合物對指示組合物中轉錄因子的影響以由此鑒別包含與該轉錄因子相互作用的源自Th2細胞的蛋白的化合物。
本發明再提供鑒別調節NIP45和NF-AT家族蛋白之間相互作用的化合物的方法，包含a)混合(ⅰ)和(ⅱ)，其中(ⅰ)NIP45或其NF-AT相互作用部分；和(ⅱ)NF-AT家族蛋白或其NIP45相互作用部分；在存在或不存在測試化合物的情況下；b)確定在存在或不存在測試化合物的情況下(ⅰ)和(ⅱ)之間相互作用的程度；和c)鑒別調節NIP45和NF-AT家族蛋白之間相互作用的化合物。
NF-AT家族蛋白的NIP45相互作用部分最好包含NF-AT家族蛋白的Rel同源域。在一個實施方案中，通過用可檢測物質標記(ⅰ)或(ⅱ)、分離未標記(ⅰ)或(ⅱ)并定量與未標記(ⅰ)或(ⅱ)結合的標記的(ⅰ)或(ⅱ)，而確定(ⅰ)和(ⅱ)之間相互作用的程度。可以使用該方法鑒別或者增強或者減弱NIP45和NF-AT家族蛋白之間相互作用的化合物。
在本發明篩選檢測的推薦實施方案中，一旦鑒別測試化合物調節目的轉錄因子活性，然后就測試該測試化合物對免疫應答的影響。因此，本發明的篩選方法可以再包含確定該化合物對免疫應答的影響以由此鑒別調節免疫應答的化合物。在一個實施方案中，通過測定該化合物對Th2相關細胞因子基因(例如，白介素-4基因)表達的影響，確定該化合物對免疫應答的影響。在另一實施方案中，通過測定該化合物對T輔助1型(Th1)或T輔助2型(Th2)細胞發育的影響，確定目的化合物對免疫應答的影響。
本領域已知可以用于在指示細胞中表達轉錄因子的重組表達載體(參見上述討論，亦可參見實施例)。在一個實施方案中，在表達載體內將該轉錄因子編碼序列可操作地連接至允許該轉錄因子在該指示細胞中組成型表達的調節序列(例如，可以使用諸如細胞肥大病毒啟動子/增強子的病毒調節序列)。最好是將允許在指示細胞中組成型表達該轉錄因子的重組表達載體用于鑒別增強或抑制該轉錄因子活性的化合物。在一個置換實施方案中，在該表達載體內，將轉錄因子編碼序列可操作地連接至內源相應轉錄因子基因的調節序列(即，源自該內源基因的啟動子調節區)。推薦將其中轉錄因子表達受內源調節序列控制的重組表達載體用于鑒別增強或抑制該轉錄因子轉錄表達的化合物。
在其中使用了Th2相關細胞因子基因的方法中，該Th2相關細胞因子最好是白介素-4。先前已顯示Th2特異性誘導型IL-4表達可以由Th2細胞中小至157bp的近端IL-4啟動子指導(Hodge,M.等(1995)J.Immunol.154:6397-6405)。因此，在一個實施方案中，本發明的方法使用含有該近端IL-4啟動子的區、最好是IL-4啟動子的核苷酸-157至+58(相對于位于+1的轉錄起始位點)的報道基因構建物。或者，可以使用諸如約3kb的上游調節序列的IL-4上游調節區的較長部分，達到較強的報道基因表達。合適的報道基因構建物描述于Todd,M.等(1993)J.Exp.Med.177:1663-1674。有關IL-4報道基因構建物的描述亦可參見實施例。
各種報道基因是本領域已知的并且適用于本發明的篩選檢測。適合的報道基因的實例包括那些編碼氯霉素乙酰轉移酶、β半乳糖苷酶、堿性磷酸酶或熒光素酶的報道基因。本領域已知測定這些基因產物活性的標準方法。
有各種細胞類型適于做為篩選檢測中的指示細胞使用。最好使用通常不表達c-Maf的細胞系，例如B細胞(例如，M12B淋巴瘤細胞系)或Th1細胞克隆(例如，AE7細胞)。亦可以使用非淋巴樣細胞系做為指示細胞，例如HepG2肝細胞癌細胞系。
在一個實施方案中，存在測試化合物時指示細胞中報道基因的表達水平高于不存在測試化合物時指示細胞中報道基因的表達水平，則該測試化合物被鑒別為刺激該轉錄因子表達或活性的化合物。在另一實施方案中，存在測試化合物時指示細胞中報道基因的表達水平低于不存在測試化合物時指示細胞中報道基因的表達水平，則該測試化合物被鑒別為抑制該轉錄因子表達或活性的化合物。
使用報道基因構建物的置換方法是，通過使用其它“讀出”鑒別調節轉錄因子表達或活性的化合物。例如，可以用轉錄因子表達載體轉染指示細胞，在存在或不存在測試化合物下培養，可以通過檢測指示細胞中細胞因子mRNA(例如，IL-4mRNA)或分泌到培養上清液中的細胞因子(例如，IL-4分泌)，評價Th2相關細胞因子產生。檢測細胞因子mRNA的標準方法例如為逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)，是本領域已知的。檢測培養上清液中細胞因子蛋白的標準方法例如為酶聯免疫吸附檢測(ELISA)，亦為本領域所知。有關檢測細胞因子mRNA和/或蛋白方法的進一步描述，亦可參見實施例。
如上所述，本發明提供鑒別與目的轉錄因子(例如c-Maf或NF-AT)或NIP45相互作用的蛋白(例如，Th2細胞中的蛋白)的篩選方法。可以基于本領域已知的雙雜種檢測系統(亦稱為相互作用陷阱檢測(interaction trap assay))(參見例如，Field美國專利5,283,173號；Zervos等(1993)Cell72:223-232；Madura等(1993)J.Biol.Chem.268:12046-12054；Bartel等(1993)Biotechniques 14:920-924；和Iwabuchi等(1993)Oncogene8:1693-1696)設計這些檢測。雙雜種檢測一般用于鑒別與特定靶蛋白相互作用的蛋白。該檢測采用基因融合，以鑒別可以相互作用以重構功能轉錄激活因子的蛋白。該轉錄激活因子由DNA結合域和反式激活域組成，其中這兩個域對于激活靶序列(例如GAL4的上游激活因子序列(UAS))下游的基因轉錄均是必需的。將編碼靶“餌”蛋白的DNA序列融合至這些域之一，并將DNA序列文庫融合至另一個域。能夠結合至該靶-融合蛋白(例如，靶GAL4-融合“餌”)的“魚”融合蛋白(由該融合文庫產生)一般將這二個域(DNA結合域和反式激活域)帶至足夠近，以激活插入在該靶序列下游的報道基因的轉錄。因此，可以通過其重構功能反式激活蛋白子(例如，功能GAL4轉錄激活因子)的能力鑒別“魚”蛋白。
通過構建靶c-Maf融合蛋白(例如，c-Maf/GAL4結合域融合物做為“餌”)和“魚”融合蛋白的cDNA文庫(例如，cDNA/GAL4激活域文庫)，并將這些構建物導入亦含有連接至對c-Maf應答的調節序列(例如，MARE序列，例如如上述討論的IL-4啟動子的一個區)的報道基因的宿主細胞，可以將這種普通雙雜種系統用于鑒別Th2細胞中與c-Maf(或者，使用類似方法與其它目的轉錄因子)相互作用的蛋白，其中該cDNA文庫制備自Th2細胞的mRNA。基于該報道基因構建物的反式激活可以鑒別編碼與c-Maf相互作用的來自Th2細胞的蛋白的cDNA。
或者，可以使用諸如描述于Sieweke,M.H.等(1996)Cell 85:49-60的“單雜種”檢測，鑒別與c-Maf相互作用的來自Th2細胞的蛋白。該檢測是上述討論的雙雜種系統的修改。在該系統中，所述“餌”是已除去反式激活域的轉錄因子(例如，已除去氨基末端反式激活域的c-Maf)，所述“魚”是非融合cDNA文庫(例如，制備自Th2細胞的cDNA文庫)。將這些構建物導入亦含有連接至對該轉錄因子應答的調節序列(例如，MARE序列，例如對c-Maf應答的該IL-4啟動子的區)的報道基因構建物的宿主細胞(例如，酵母細胞)。基于該報道基因構建物的反式激活可以鑒別編碼與c-Maf(或其它目的轉錄因子)相互作用的來自Th2細胞的蛋白的cDNA。
如上所述，本發明提供篩選檢測，以鑒別調節本發明的轉錄因子與該轉錄因子結合的DNA分子相互作用的化合物，該轉錄因子分別結合IL-4基因調節區內的諸如c-Maf和MARE。本領域已知檢測DNA結合蛋白與靶DNA序列相互作用的檢測(例如，電泳遷移率變動檢測、DNA酶I足跡檢測等等；有關進一步的描述參見實施例)。通過在存在或不存在測試化合物時進行這種檢測，可以使用這些檢測鑒別調節(例中，抑制或增強)DNA結合蛋白與其靶DNA序列相互作用的化合物。
在一個實施方案中，存在該測試化合物時與該DNA片段結合的轉錄因子的量高于不存在該測試化合物時與該DNA片段結合的轉錄因子的量，在這種情況下，該測試化合物被鑒別為增強該轉錄因子結合的化合物。在另一實施方案中，存在該測試化合物時與該DNA片段結合的轉錄因子的量低于不存在該測試化合物時與該DNA片段結合的轉錄因子的量，在這種情況下，該測試化合物被鑒別為抑制該轉錄因子結合的化合物。
在本發明的鑒別調節NIP45與NF-AT家族蛋白相互作用的藥物的方法中，可以在該方法中使用分離的NIP45和/或NF-AT家族蛋白，或者可以僅使用NIP45和/或NF-AT家族蛋白的部分。例如，可以將分離的NF-AT Rel司源域(或包括RHD的較大的NF-AT亞區)做為NF-AT的NIP45相互作用部分使用。同樣，可以使用能夠結合該NF-AT RHD的NIP45部分。在一個推薦實施方案中，(ⅰ)和(ⅱ)中的一個或二個均是融合蛋白，例如GST融合蛋白(例如，GST-NF-AT RHD可以做為NF-AT的NIP45相互作用部分使用)。通過用可檢測物質(例如，放射標記)標記其中一個蛋白、分離未標記蛋白并定量與未標記蛋白結合的可檢測物質的量而確定(ⅰ)和(ⅱ)之間相互作用的程度。可以使用該方法鑒別或者刺激或者抑制NIP45和NF-AT家族蛋白之間相互作用的藥物。基于它與不存在該藥物時的相互作用程度相比增強(ⅰ)和(ⅱ)之間相互作用程度的能力，鑒別刺激NIP45和NF-AT家族蛋白相互作用的藥物，而基于其與不存在該藥物時的相互作用程度相比降低(ⅰ)和(ⅱ)之間相互作用程度的能力，鑒別抑制NIP45和NF-AT家族蛋白相互作用的藥物。可以采用描述于Pawson的美國專利5,352,660號的鑒別調節SH2域-配體相互作用的檢測系統，鑒別調節NIP45/NF-AT RHD相互作用的藥物。
由以下不應視為限制的實施例進一步描述本發明。本中請引用的所有的參考文獻、專利和公開的專利申請的內容通過引用結合到本文中。本文引用的儲存于公共數據庫中的核苷酸序列和氨基酸序列亦通過引用結合到本文中。實施例1細胞因子特異性是由于正反式激活因子而不是因為阻遏蛋白可以通過阻遏蛋白或沉默蛋白的作用達到組織特異性。因此可能IL-2和IL-4基因分別在Th2和Th1細胞中被主動阻遏。為檢測阻遏蛋白的存在，在不同MHCⅠ類單倍型的Th1(D1.1)和Th2(D10)克隆之間進行體細胞融合。按照“懸浮細胞融合”程序(Lane,R.D.等(1986)MethodsEnzymol.121:183-192)融合Th1克隆D1.1(Kd)和Th2克隆D10(Kk)。融合后，使細胞恢復8小時，然后用PE綴合抗Kk抗體和FITC綴合抗Kd抗體(Phamingen,La Jolla,CA)雙染色。基于大小將細胞分選，以從異核體和同核體區分未融合細胞，并通過熒光鑒別單陽性和雙陽性細胞。如示于圖1A的該方法的圖解，分選三種群體大PE陽性細胞(D1.1×D1.1)、大FITC陽性細胞(D10×D10)、以及大PE和FITC陽性細胞(D1.1×D10)。表達MHCⅠ類Kb和Kk標記的細胞是異核體，而僅表達Kb或Kk的細胞代表同核體并做為對照。
然后用抗CD3抗體在培養中刺激這三種群體，以激活細胞因子基因表達，并制備用于RT-PCR和Northem印跡分析的RNA。從各群體得到約5×105細胞。通常，5-10％的細胞已進行融合。然后將這三個群體各分成二半，將-半細胞轉移至預清洗的抗CD3包被板，將剩下的一半轉移至未包被板。4小時后，收獲細胞，并使用Micro-Fast TrackTM藥盒(Statagene,La Jolla,CA)分離多腺苷酸化RNA。使用SuperScript藥盒(Gibco/BRL,Bethesda,MD)制備cDNA，并用于按照制造商說明書使用市售的對鼠IL-2、IL-4和β肌動蛋白特異性的引物(Stratagene,La Jolla,CA)的PCR分析。PCR反應包括0.5μCiα-32P-dCTP(3000Ci/mmol,NENDupont)。用乙醇沉淀PCR產物，并通過非變性PAGE分離、干燥并通過放射自顯影觀察。
細胞因子mRNA表達的RT-PCR分析結果示于圖1B中。Th1和Th2克隆以及Th同核體分別僅轉錄IL-2(Th1)或IL-4(Th2)，而Th1/Th2異核體產生這二種細胞因子。與之相反，阻遏蛋白的存在本應導致在異核體中消除這二種細胞因子。從這些實驗得出結論是在Th1對Th2細胞中的細胞因子特異性是由Th特異性正反式激活因子介導，而不是由選擇性沉默蛋白介導。實施例2從制備自抗CD3激活的Th2克隆的cDNA文庫分離Th2特異性c-maf基因在通過酵母雙雜種系統(有關該系統描述，參見例如Field美國專利5,283,173號；Zervos等(1993)Cell72:223-232；Madura等(1993)J.Biol.Chem.268:12046-12054；Bartel等(1993)Biotechniques 14:920-924；和Iwabuchi等(1993)Oncogene8:1693-1696)就NF-AT相互作用蛋白方面篩選制備自抗CD3激活的Th2克隆D10的cDNA文庫的過程中，分離了多個cDNA，這些cDNA都是極弱的相互作用因子。然后通過使用一組Th1和Th2克隆的Northern印跡分析，評價在該篩選中得到的所有cDNA的Th特異性表達。一個重復分離的(140中60)這種cDNA僅在從Th2克隆(D10、CDC35)制備的RNA檢測到轉錄物，而不是從或者Th1克隆(AR5、OS6、D1)或者從B細胞淋巴瘤M12制備的RNA檢測到轉錄物，如描繪于圖2A中的Northern印跡分析描述的。另外，在由該T細胞受體與抗CD3抗體的連接激活時，在D10Th2細胞中檢測到的轉錄物水平顯著增加。在抗CD3處理時，由該cDNA克隆檢測到的該轉錄誘導未在Th1克隆中發生。對照探針GAPDH證實，在所有泳道中RNA上樣量基本相同。因此，該cDNA克隆在該淋巴樣譜系中的表達看起來是Th2特異性的，并對通過該T細胞受體傳遞的信號敏感。對于這些Northern印跡，按照制造商說明書使用Trizol(GIBCO/BRL)制備總RNA。將每個樣品的10μg總RNA在甲醛瓊脂糖凝膠上分級分離并轉移至尼龍膜。使用隨機引物DNA標記藥盒(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)，用α-32P-dCTP標記得自該分離克隆的3’非翻譯區的300bp DraⅠ片段。按照制造商說明書使用QuikHyb(Stratagene,La Jolla,CA)進行雜交。
為確定該基因的表達是否為組織特異性并在正常Th細胞發育過程中受調節，進行以下實驗。通過在存在細胞因子和抗細胞因子抗體(對于Th1用IFNγ和抗IL-4、對于Th2用IL-4和抗IFNg)的情況下，用抗CD3處理沿Th1或Th2途徑驅動原初脾細胞(Th前體(Thp)細胞)。從6-8周齡Balb/c小鼠制備脾細胞懸液，以106細胞/ml的密度于補加了10％FCS的RPMI 1640中培養，并在存在5μg/ml抗IL4抗體(11B11)(對于Th1譜系)或5μg/ml抗IFNγ抗體(XMG-1)(對于Th2譜系)的情況下用平板結合抗CD3抗體刺激。刺激之后24小時，將50 U/ml IL2加入所有的培養物，并將500 U/ml IL4(Genzyme)加入Th2培養物。在初次刺激后7天，收獲所有的細胞、清洗細胞并用平板結合的抗CD3抗體再刺激。使用上述描述的方法，對在刺激后初次(0-8天)和再次(0-20小時)應答中的不同時間點收獲的分化中細胞進行Northern印跡分析，并通過ELISA分析培養上清液IL-10和IFNγ，確定鑒別分化為Th1或Th2的Thp細胞。如下述進行細胞因子定量的ELISA。所有的抗細胞因子抗體均購自Pharmingen。按照Pharmingen的說明進行ELISA，除了使用PBS/BSA中1∶500稀釋度的抗生物素蛋白-堿性磷酸酶(Sigrna)代替抗生物素蛋白-過氧化物酶。使用底物緩沖液(10％二乙醇胺、0.5mM MgCl2、0.02％疊氮化鈉，pH9.8)中4mg/ml的磷酸對硝基苯(GIBCO BRL)做為底物。
在其代表性結果示于圖2B的二個獨立實驗中，該分析顯示于第0天時位于基線的原初脾細胞中該cDNA的表達水平低或無法檢出。在沿著Th2途徑分化的培養物中，在初次刺激的8天和再次刺激的20小時時發生大量的轉錄物誘導。與之相反，沿Th1途徑驅動的細胞中未發生誘導。對照探針(GAPDH)顯示，在所有泳道中RNA上樣量基本相同。沿著Th1途徑驅動的細胞中存在的低水平轉錄物可能反映出存在殘留Th2細胞，因為在這個體外分化系統中未發生完全偏斜。
綜合來看，這些實驗揭示該分離cDNA選擇性地在Th2克隆中表達，它在T細胞激活時被誘導，并且它不存在于Th1克隆和B淋巴瘤。另外，當沿著Th2譜系驅動時該基因在正常Thp中被誘導，而不在Th1發育中被誘導。
使用從酵母雙雜種篩選中得到的cDNA做為探針從D10Th2細胞cDNA文庫通過標準雜交方法分離全長cDNA。從該Th2細胞文庫分離4.3kb cDNA并用標準方法測序。序列分析揭示，該Th2特異性基因在序列方面對應于c-maf原癌基因。實施例3c-Maf在Th1和B細胞中的異位表達導致IL-4啟動子激活描述于實施例2中的分離cDNA鑒別為AP-1/CREB/ATF基因家族的成員以及其在Th2細胞中選擇性表達，提高了c-Maf控制的IL-4基因組織特異性轉錄的可能性。另外，Th2細胞中和檢測的四個轉化肥大細胞系中的三個中，編碼c-maf的轉錄物的存在與IL4的表達很相關。為測試是否c-Maf可以反式激活IL-4啟動子，進行了共轉染實驗。
Thl克隆和B淋巴瘤M12.4.C3(M12)既不表達c-maf又不轉錄IL-4基因。如果c-Maf是對控制IL-4基因表達關鍵的轉錄因子，那么在這些細胞中強制表達應使得IL-4基因表達。為檢測此點，將全長(4.3kb)c-maf cDNA克隆插入pMex-NeoI哺乳動物表達載體的SalⅠ位點，該載體利用CMV增強子驅動插入序列的表達。然后將該c-Maf表達載體與IL-4啟動子報道構建物共轉染入Th1克隆AE7和B淋巴瘤M12。在Hodge,M.等(1995)J.hnmunol.154:6397-6405中描述了制備含有可操作地連接至氯霉素乙酰轉移酶基因的從-157至+68的IL4啟動子片段的野生型IL4CAT報道構建物。將該Th1克隆培養于補加了10％FCS和10％Con-A刺激的大鼠脾細胞上清液的RPMI1640中，并通過用適當的抗原和APC每二周刺激一次保持。將M12細胞培養于補加了10％FCS的RPMI1640中。
通過用20μg(AE7)或5μg(M12)的各種質粒于室溫預溫育0.4ml細胞10分鐘瞬時轉染Thl克隆AE7或M12B淋巴瘤細胞，該0.4ml細胞含有在無血清RPMI 1640中的2×107細胞/ml AE7或3×106細胞/mlM12細胞。然后用設定于975μF、280V的BIO-RAD基因脈沖發生器(BIO-RAD,Richmond,CA)對樣品進行電穿孔，并立即置于冰上10分鐘。使轉染的細胞在完全培養基中恢復過夜，并用平板結合抗CD3抗體({Pharmningen,San Diego,CA}于1XPBS中的1μ/ml于4℃過夜)或用50ng/ml PMA(Sigma,St.Louis,MO)和1μM離子霉素(CalbiochemCorp.,La Jolla,Califomia)刺激24小時。通過于0.25M Tris-Cl,pH7.8中冷凍-解凍裂解制備細胞裂解液。將等量的蛋白(5-20μg)用于CAT檢測。如Todd,M等(1993)J.Exp.Med.177:1663-1674所述進行CAT檢測。
先前已顯示Th2特異性誘導型IL-4表達可以由Th2細胞中小至157bp的近端IL-4啟動子指導(Hodge,M.等(1995)J.Irmmunol.154:6397-6405)。在結果概括于圖3A中的共轉染實驗中，證實c-Maf在Th1克隆AE7中異位表達導致通過T細胞受體刺激后該IL-4啟動子報道物的顯著活性。觀察到的倍數誘導約是僅用空載體觀察到的5倍。盡管先前未觀察到含有近端(-157至+58)IL-4啟動子序列的報道構建物在本文使用的AE7細胞亞克隆中表達，但已證實可以通過RT-PCR在AE7的其它克隆中檢測到少量的IL-4mRNA。為更嚴格地測試c-Maf在非IL-4產生細胞中反式激活IL-4啟動子的能力，在B淋巴瘤細胞系M12中進行同樣的實驗。正常B細胞和B淋巴瘤細胞不產生IL-4。共轉染實驗的代表性結果描繪于圖3B，三個獨立實驗的概要示于以下表1中。
表1
*在實驗Ⅰ中，將20mg細胞裂解液溫育2小時。在實驗Ⅱ和Ⅲ中，僅將5mg細胞裂解液溫育1小時，以揭示c-Maf和NF-ATp之間的協同作用**ND=未做M12B淋巴瘤細胞中的結果證實了在Th1克隆中的發現。c-Maf的異位表達導致在或者用或者不用PMA/Ca++離子載體刺激的M12細胞中IL-4啟動子的顯著活性。與對照載體轉染相比，在未刺激M12細胞中觀察到的倍數誘導平均約為50。用PMA/Ca++子載體刺激M12細胞，這種刺激應該導致NF-AT易位至核和誘導其它AP-1家族成員(Flanagan,W.M.(1991)Nature352:803-807；Jain,J.等(1993)Nature365:352-355)，增加IL-4啟動子的基礎活性，但仍然存在由c-Maf引起的啟動子活性的顯著誘導(平均約為25倍)。C-Maf不反式錄激活由NF-AT多體驅動的對照報道物，證實反式激活的特異性。
做為與其它AP-1家族成員相反的c-Maf特異性的對照，利用在哺乳動物表達載體pMEX-NeoⅠ中編碼c-Fos和JunD的鼠全長cDNA和IL-4報道質粒的M12細胞中亦過量表達c-Fos和c-Jun蛋白。通過在M12細胞中過量表達這二個AP-1家族成員之一，不能達到IL-4啟動子活性。因此，c-Maf具有獨特的能力驅動M12B細胞中IL-4基因的轉錄。另外，在肝細胞癌細胞系HepG2中強制表達c-Maf亦導致IL-4啟動子反式激活。這些實驗證實，供應c-Maf給c-Maf陰性Th1或B細胞或給非淋巴樣細胞(例如，肝細胞癌細胞系)使得該細胞反式激活IL-4啟動子。
已顯示NF-AT蛋白在調節IL-4和IL-2細胞因子中均極其重要。NF-ATp是該家族的第一個被分離的成員(McCaffrey,P.G.等(1993)Science262:750-754)。AE7和M12細胞均有內源NF-ATp蛋白，但卻不轉錄IL-4。盡管NF-ATp因此不是選擇性IL-4基因轉錄的原因，但有意義的是測試是否在未刺激或刺激的M12細胞中過量表達NF-ATp會進一步增強由c-maf造成的IL-4啟動子的反式激活。用IL-4報道構建物和或者NFAPp表達載體(pREP4-NF-ATp，它亦攜帶潮霉素抗性基因)自身或者NFAPp表達載體與c-Maf表達載體共轉染M12細胞。在M12細胞中僅過量表達NF-ATp導致IL-4啟動子的有節制表達。該反式激活被c-Maf的異位表達顯著地增強，該增強不是疊加型的而是協同的(參見圖3B和表1)。與之對照，c-Fos過量表達不會進一步增強由NF-ATp達到的有節制反式激活。這些結果表明，c-maf和NF-ATp相互作用，以達到該IL-4啟動子的最大表達，該組織特異性由c-Maf提供。實施例4c-Maf的異位表達激活內源IL-4基因在B淋巴瘤中的轉錄如在實施例3中證實的，c-Maf在Th1、B和非淋巴樣細胞中的瞬時轉染檢測中反式激活IL-4啟動子。為測試c-maf在非IL-4產生細胞中表達是否可以激活內源IL-4轉錄，用編碼c-maf、NF-ATp或編碼二者、或編碼junD的表達載體及用或不用NF-ATp做為對照穩定轉染B淋巴瘤M12。為穩定轉染，如上述實施例3中轉染M12細胞。在加入濃度均為400μg/ml的新霉素(GIBCO/BRL,Gaithersburg,MD)和潮霉素(Calbiochem,Corp.)之前使轉染的細胞在完全培養基中恢復48小時。每隔一天用新鮮培養基補加轉染的細胞。
將穩定轉染的M12細胞以相同密度鋪平板，并于24小時后收獲上清液，通過ELISA測定細胞因子。如實施例2中描述的進行ELISA。示于圖4中的結果證實，在這些實驗中用c-maf、junD或NF-ATp自身轉染的M12細胞不產生ELISA可測定的IL-4。然而，用c-maf和NF-ATp一起穩定轉染的M12細胞產生ELISA可檢測的、但為低水平的IL-4。這些結果為對來自這些轉染細胞的RNA的RT-PCR證實。相反，這些細胞不產生可檢測的IL-2。同時需要c-maf和NF-ATp與M12細胞中瞬時轉染實驗中注意到的這些因子在反式激活IL-4啟動子的協同效應一致。與之對照，轉染可以增強IL-4在Th2細胞中表達的AP-1家族成員的junD自身或與NF-ATp一起轉染，未導致IL-4產生。這些結果證實，c-Maf在指導組織特異性內源IL-4產生中的必需的和選擇性作用。實施例5IL-4啟動子中的一個位點被Th2克隆而不是Th1克隆的提取物足跡覆蓋實施例3和4描述的實驗證實c-maf在控制組織特異性IL-4表達中的清楚的作用。另外，c-maf轉錄物在Th2細胞中而不是在Th1細胞中表達。然而，當使用制備自Th2細胞的核提取物時，通過電泳遷移率變動檢測(EMSA)未檢測到DNA-蛋白復合物。為進一步檢測是否Th2核提取物中的蛋白可以結合MARE或附近序列，使用了更敏感的DNA酶Ⅰ足跡技術。通過將T細胞受體與平板結合抗CD3抗體連接，激活二個Th2克隆(D10、CDC35)和二個Th1克隆(AE7、S53)，并于0時(未刺激)、2小時和6小時后制備核提取物。然后按照標準方法，使用克列諾末端標記的IL-4啟動子片段(-157至+68)進行DNA酶Ⅰ足跡分析。結果示于圖5A。來自Th1和Th2細胞的刺激核提取物均足跡覆蓋二個NF-AT位點和先前描述的遠側NF-AT位點上游的AP-1位點(Rooney,J.等(1995)Immunity2:545-553)，與證實的NF-AT和AP-1蛋白調節IL-2和IL-4啟動子的功能一致(Rooney,J.等(1995)Immunity2:545-553；Rooney,J.等(1995)Mol.Cell.Biol.15:6299-6310)。另外，檢查該放射自顯影揭示，當使用來自刺激的Th2而不是刺激的Th1細胞的提取物時，在非編碼鏈的殘基-28和-29處有超敏區。未刺激的Th細胞提取物不足跡覆蓋該區。觀察到的Th2足跡是不濃的，但在二個實驗中可重復，并位于先前證實對IL-4啟動子在Th2細胞中激活是關鍵的位點(Hodge,M.等(1995)J.Immunol.154:6397-6405)。由足跡分析檢測的在IL-4啟動子中占據的位點的圖解概要示于圖5B中。這些結果表明先前顯示為功能重要的在近端IL-4啟動子中的位點位于激活的Th2細胞中，而不是位于激活的Th1細胞中。實施例6重組c-maf結合至IL-4啟動子中的MARE位點該Th2特異性足跡不含有c-maf效應元件(MARE)。但是，檢查該近端IL-4啟動子揭示緊靠該近端NF-AT位點(殘基-56至-51)下游的半個c-maf結合位點(MARE)(殘基-42至-37)(示于圖5B)。先前已證實該位點的突變消除了Th2細胞中該IL-4啟動子的活性(Hodge,M.等(1995)J.Immunol.154:6397-6405)。為檢測c-Maf是否結合該位點，將含有b-拉鏈域(氨基酸171-371)的截短的c-Maf重組蛋白在大腸桿菌中表達，并在S-標記瓊脂糖柱上純化，并用于使用放射標記的MARE寡核苷酸的電泳遷移率變動檢測中。
通過將編碼c-Maf氨基酸殘基171-317的cDNA片段(公開于Kurschner C.和Morgan,J.I.(1995)Mol.Cell.Biol.15:246-254)插入pET29(Novagen,Inc.Madison,WI)的NotⅠ位點，構建重組c-Maf的表達載體。使用T7聚合酶在BL21(DE3)株中表達該截短的c-Maf蛋白。通過加入1mM IPTG并于37℃溫育3小時誘導細胞。將誘導的細胞在lX結合/清洗緩沖液(20mM Tris-HCl pH7.5、150mM NaCl、0.1％TritonX-100)并接著通過超聲處理裂解。使用S-標記純化藥盒(Novagen)按照制造商的說明書，從可溶性部分純化c-Maf蛋白。二個其它的蛋白NF-ATp和c-Jun亦用于EMSA檢測中。使用含有編碼鼠NF-ATp的Rel域的cDNA片段的體外轉錄/翻譯載體TP7-NF-ATp，表達含有鼠NF-ATp的Rel域的重組NF-ATp。通過將全長鼠c-Jun cDNA插入pGEM4的PstⅠ位點，構建c-Jun表達載體pGEM-c-Jun。從該T7啟動子轉錄了1μg的每種質粒DNA，并通過使用TnT偶聯轉錄/翻譯藥盒(Promega,Madison,WI)在兔網織紅細胞裂解液中翻譯。
如下述進行電泳遷移率變動檢測(EMSA)。將100ng的雙鏈寡核苷酸用γ-32P-dATP(DuPont NEN Research Product,wilmington,DE)用T4多核苷酸激酶(Pharmacia LKB Biotechnology,Inc.,Piscataway,NJ)末端標記。將該標記的雙鏈寡核苷酸在15-20％聚丙烯酰胺凝膠上分級分離，在1X TE中于37℃洗脫過夜并在乙醇中沉淀。于室溫進行結合檢測20分鐘，該檢測使用了在15μl體積的20mM HEPES(pH7.9)、100mMKCl、5％甘油、1mM EDTA、5mM DTT、0.1％NP-40和0.5mg/ml BSA中的0.5μg重組蛋白或0.4μl體外翻譯產物、500ng多聚(dI-dC)和20,000cpm探針。然后在含有0.5X TBE的4％非變性聚丙烯酰胺凝膠中于室溫將該樣品分級分離。
用于EMSA中的源自鼠IL4啟動子的寡核苷酸是:-59至-27:5’-CTCATTTTCCCTTGGTTTCAGCAACTTTAACTC-3’(SEQ ID NO:1)；-79至-60:5’-ATAAAATTTTCCAATGTAAA-3’(SEQ ID NO:2)；和-88至-61:5’-TGGTGTAATAAAATTTTCCAATGTAAA-3’(SEQ ID NO:3)。用于EMSA中的MARE寡核苷酸的序列是5’-GGAATTGCTGACTCAGCATTACT-3’(SEQ ID NO:4)．將所有的寡核苷酸與其相應的反向互補鏈退火，以形成雙鏈寡核苷酸。
使用重組c-Maf的EMSA的結果示于圖6。該重組c-Maf蛋白與共有MARE寡核苷酸和存在于該IL-4中含有該NF-AT位點和MARE的33bp寡核苷酸均很好地結合。結合被未標記同源物而不是對照探針特異性地競爭。另外，c-Maf5不與僅含有重組NF-ATp良好結合的NF-AT靶序列的寡核苷酸結合。c-Maf與該IL-4啟動子探針結合的能力是特異性的，因為體外翻譯的c-Jun蛋白不與該寡核苷酸結合。該c-Jun蛋白是功能性的，因為它可以與含有核心TRE位點的共有MARE結合。這些結果表明，c-Maf而不是另一AP-1家族成員(c-Jun)可以與近端IL-4啟動子內的MARE位點結合。
NF-AT與AP-1家族成員蛋白協作地相互作用，在EMSA上形成在IL-2和IL-4啟動子DNA上遷移率較高的復合物(Jain,J.(1993)Nature365:353-355；Rooney,J.等(1995)Immunity2:545-553)。先前實施例中描述的功能研究提示NF-AT蛋白可能與c-maf相互作用。為確定在存在DNA時c-Maf是否與NF-AT相互作用，在使用含有該NF-AT位點和鄰近MARE位點的33bp寡核苷酸的EMSA中，獨立或一起使用重組NF-ATp和c-Maf。結果示于圖6。單獨的每種蛋白結合至IL-4啟動子DNA。重組c-Maf加重組NF-ATp蛋白產生這些復合物，并另外形成遷移率較高的復合物。當使用c-Jun和NF-ATp時未觀察到較高遷移率的復合物，與c-Jun不能結合該位點一致。這些結果表明，c-Maf可以特異性地體外結合至位于近端IL-4啟動子內的序列，該序列先前顯示在Th2細胞中是功能關鍵的，并且如其它AP-1蛋白一樣，c-Maf可以體外與NF-AT蛋白相互作用。實施例7c-Maf轉錄激活IL-4啟動子的能力反映到MARE和Th-2特異性足跡上通過高分辨率誘變已特征鑒定了恰好位于TATA元件上游的IL-4啟動子的必需區(Hodge,M.等(1995)J.Immunol.154:6397-6405)。對該33bp區(-59至-28)的誘變證實對在Th2細胞中誘導型IL-4轉錄所必需的多個位點。這些位點包括NF-AT靶序列、Th2提取物足跡覆蓋的區、和現在識別為MARE的位點。使用了一系列包含跨越該區產生的四堿基對接頭掃描突變體的IL-4報道基因構建物，以標記被c-Maf在M12細胞中體內利用的靶序列。用該c-maf表達載體和該系列突變IL-4啟動子構建物共轉染這些細胞。這些結果示于圖7A。MARE(mut3和4)或由Th2足跡定義的位點(mut2)的突變取消(mut2和4)或部分取消(mut3)了轉染的c-maf驅動IL-4轉錄的能力。亦在破壞該NF-AT序列的突變體8中觀察到降低c-maf反式激活的溫和效應，與M12細胞中存在內源NF-ATp一致并與在先前實施例中證實的NF-ATp和c-maf之間的協同作用一致。突變體6和7沒有顯著的效應，而突變體5具有增強的反式激活能力與先前在Th2細胞中觀察到的一致(Hodge,M.等(1995)J.Immunol.154:6397-6405)。該反式激活數據與用重組c-Maf蛋白和做為探針的含有該33bp區的寡核苷酸和做為冷競爭物的同一系列突變寡核苷酸進行的EMSA一致。這些EMSA實驗的結果示于圖7B。這些實驗表明c-Maf特異性地結合至并反式激活近端IL-4啟動子內的MARE，并且該鄰近Th2特異性元件密切參與c-Maf的結合和功能。實施例8使用酵母雙雜種相互作用陷阱檢測分離NIP45cDNA使用酵母雙雜種相互作用陷阱檢測分離可以直接結合NF-ATp的RHD的蛋白。通過將鼠NF-ATp的跨越氨基酸228-520的900bp片段(McCaffrey,P.G.等(1993)Science262:750-754)克隆入載體pEG202(Gyuris,J.等(1993)Cell75:791-803)的BamHⅠ位點，制備NF-ATp(RHD)-Gal4融合蛋白做為酵母雙雜種檢測中的“餌”。通過DNA序列分析確認了該NF-AT(p)多肽序列與該Gal4序列的框架內融合。使用本領域已知的方法(參見Gyuris,J.等(1993)Cell75:791-803)，將該餌用于篩選制備自鼠T細胞系D10的cDNA文庫、構建于質粒pJG4-5中，以選擇編碼與該餌相互作用的多肽的克隆。
分離了一類編碼具有對NF-ATp(RHD)-Gal4餌明顯高親和性(通過高水平β-半乳糖苷酶活性和賦予亮氨酸原養型的能力表現)的融合蛋白的相互作用因子并命名為NIP45(NF-AT相互作用蛋白45)。圖8顯示酵母菌落的照片(每個質粒組合三個代表)，該酵母已用NIP45質粒和或者該NF-ATp-RHD餌或者對照餌(Max-Gla4,CDK2-Gal4和對照載體pEG202，僅表達表位標記Gal4蛋白)以及LacZ報道質粒pSH18共轉化。將所述酵母菌落在適當的培養基上選擇，并點到含有Xgal和非阻遏碳源半乳糖的平板上。用NIP45質粒和NF-ATp-RHD餌共轉化的酵母菌落為藍色，證實該LacZ報道質粒表達(指示NIP-45/NF-ATp-RHD相互作用)，而用該NIP45質粒和該對照餌轉化的酵母菌落為白色，表明NIP45與對照餌無相互作用。亦在含有半乳糖缺乏亮氨酸的培養基上測試轉化體，僅那些含有該NIP45質粒和該NF-ATp-RHD餌的酵母生長，進一步表明NIP45與NF-ATp-RHD的特異性相互作用。通過該雙雜種檢測分離的NIP45cDNA是1.9kb DNA片段。實施例9NIP45與NF-ATp在哺乳動物細胞內體內相互作用在哺乳動物細胞內檢測了NIP45多肽特異性地與NF-ATp體內相互作用的能力。將在酵母雙雜種系統(實施例8中所述的)中選擇的1.9kb NIP45cDNA插入片段亞克隆入哺乳動物表達載體，該載體將編碼區融合至來自流感血凝聚素(HA)肽的表位標記、載體pCEP4-HA(Herrshcer,R.F.等(1995)Genes Dev.9:3067-3082)，以產生表達載體NIP45-HA。然后將該標記的構建物與NF-ATp表達質粒共轉染入HepG2細胞(該細胞表達低水平的NF-ATp)。做為對照，亦用NIP45-HA與NF-ATp構建物的親代表達載體(即，沒有該NF-ATp插入片段的表達載體)或用該NF-ATp表達載體與具有該表位標記的NIP45框架外融合物共轉染HepG2細胞。從轉染的細胞制備裂解液，并用抗NF-ATp抗體免疫沉淀。然后使用或者抗NF-ATp抗體或抗HA抗體對該免疫沉淀物質進行Westem印跡分析。
該實驗的結果示于圖9。使用HA特異性單克隆抗體(mAb)對這些樣品進行的western印跡分析證實，用于免疫沉淀的抗NF-ATp抗體與該HA標記的NIP45多肽共免疫沉淀。顯示僅用NIP45-HA轉染的泳道(中間泳道)揭示在這些細胞中存在低內源水平的NF-ATp。通過用NF-ATp表達質粒共轉染，進一步增加了免疫沉淀的HA標記的NIP45蛋白的量，證實該相互作用的特異性(右邊泳道)。未處理裂解液的Western印跡分析證實在測試NIP45-HA抗NF-ATp抗體共免疫沉淀的樣品中表達了相同水平的NIP45-HA多肽。另外，當使用正常兔血清進行免疫沉淀時沒有檢測到對或者NF-ATp或者該HA標記蛋白的免疫反應性物質。這些實驗證實，NF-AT和NIP45在哺乳動物細胞中體內物理結合。實施例10NIP45cDNA結構分析將使用雙雜種檢測分離的克隆的1.9kb NIP45cDNA插入片段(描述于實施例1)用于篩選D10.G4 T細胞λzap Ⅱ cDNA文庫(Stratagene)，以鑒別全長克隆。篩選含有約8×105克隆的文庫產生了7個雜交克隆，它們大都不超過原始分離物的5’末端。然而，最長克隆(2.8kb)的序列分析證實與原始克隆在5’末端的同一性。在圖10中比較了原始1.9kbcDNA分離物和最長的2.8kb cDNA分離物的結構。該2.8kb cDNA分離物含有位于原始克隆5’末端下游868bp的180bp的另一片段。在該180核苷酸片段末端的連接序列表明它是未剪接內含子并且在該區內的核苷酸序列的概念翻譯(conceptual translation)揭示出一個框架內終止密碼子。在該克隆內的該另一序列的大部分都位于3’末端并代表后接多腺苷酸化尾的延伸性3’非翻譯區(參見圖10)。在許多基因內都觀察到這種延伸性3’非翻譯區。如果剪接該小內含子并翻譯該單個可讀框區，預期該2.8kb cDNA克隆編碼與原始1.9kb分離物相同的多肽。
該1.9kb cDNA分離物的核苷酸序列和預期的氨基酸序列示于圖11(并分別示于SEQ ID NO:5和6)。從第一個起始密碼子至框架內的第一個終止密碼子顯示該編碼區。將核苷酸和氨基酸位置標明于原始序列的右邊。該1.9kb核苷酸序列的概念翻譯揭示了具有45Kd分子量的412個氨基酸的多肽，并因此將該蛋白命名為NF-AT相互作用蛋白45(NIP45)。檢查NIP45的氨基酸序列揭示在N末端的一個高度堿性域，其中32個氨基酸中的13個是堿性的。在圖11中將該區標下劃線。該堿性區看起來是圖12中顯示的疏水性圖中的親水性延伸(stretch)。實施例11NIP45mRNA的組織表達進行來自不同鼠組織的RNA的Northem印跡分析以調查NIP45mRNA的組織表達。將來自各種組織的10μg總RNA在變性瓊脂糖凝膠上分離、印跡并與放射標記的1.4kb MP45cDNA片段雜交。通過比較溴化乙錠熒光控制樣品的等量RNA上樣。該Northern印跡分析的結果示于圖13。該雜交揭示約3.1kb的轉錄物，它的大小與最長的cDNA克隆相當。來自睪丸的RNA懷疑另外的1.4Kb雜交種類。在脾臟、胸腺和睪丸中觀察到最高的NIP45轉錄物水平。在淋巴器官中的優先表達可能表明NIP45在免疫系統中的特定功能。在該T細胞cDNA文庫中NIP45cDNA克隆的低強度雜交信號和極少發生表明NIP45RNA是相對稀少的信息。實施例12NIP45的亞細胞定位通過間接免疫熒光測定表位標記的NIP45蛋白的亞細胞定位。使用本領域已知的方法(參見Heald,R.等(1993)Cell74:463-474)，用1μg編碼HA表位標記的NIP45(pCEP4-HA)的表達構建物轉染BHK細胞。如所述將轉染的細胞過夜培養、固定、透化(Heald,R.等(1993)見上述)并用抗HA mAb 12CA5(Boehringer Mannheim)和indocarbocyanine標記的驢抗鼠抗體(Jackson ImmunoResearch)探測，然后用染料Hoechst33258復染。結果示于圖14A-B。通過與用DNA染料Hoechst33258復染的相同細胞(參見圖14B)比較，用indocarbocyanine標記的二級試劑觀察到了NIP45的核染色(參見圖14A)。熒光型式表明NIP45在核中均勻地分布。另外，該型式符合在用NF-AT4轉染并用離子霉素刺激的細胞中觀察到的情況(Shibasaki,F.等(1996)Nature382:370-373；亦參見以下)。用PMA和/或離子霉素刺激不影響該NIP45的亞細胞定位。
亦對用NF-AT4轉染的BHK細胞進行了對照實驗。將細胞在培養基中培養過夜，并或者直接固定或者在固定之前首先用1mM離子霉素刺激10分鐘，并接著如上述進行。結果示于圖14C-F。用抗NF-AT4特異性抗體，接著用indocarbocyanine標記的二級試劑和Hoechst33258探測未刺激的(圖14C和14D)和離子霉素處理的(圖14E和14F)NF-AT4轉染子。Indocarbocyanine熒光證實，在未刺激的轉染子(圖14C)中胞質定位的NF-AT4和在刺激的細胞中核定位的NF-AT4(圖14E)的染色型式。鄰近的板(分別為圖14D和14F)顯示了曝光以檢測通過用Hoechst33258染色的核的同一區域。
亦調查了NIP45對NF-AT4核易位的影響。用或者NF-AT4或者NF-AT4加上NIP45轉染HepG2細胞，并于次日用1μM離子霉素刺激0、2、4、8或15分鐘。對于一個樣品，用離子霉素刺激細胞15分鐘，然后用新鮮培養基清洗并使之再靜置15分鐘(在表1中以“15分鐘+15分鐘靜置”標明)。設計該分析以檢測NIP45做為核保留因子的功能。已顯示15分鐘對于NF-AT4輸出至細胞質是充足的時間(Shibasaki,F.等(1996)Nature382:370-373)。然后固定所有的樣品，并如上述通過免疫熒光分析NF-AT4易位。結果概括于以下表2。NF-AT4在細胞質中的亞細胞定位用(-)標明，NF-AT4的核易位用(+)標明。
表2NF-AT4的核易位
存在NIP45時沒有觀察到NF-AT4核輸入或輸出速率的差別，表明對胞內鈣水平變化應答的NF-AT4核運輸不受外源NIP45過量表達的影響。實施例13NIP45在調節基因表達中的功能活性為檢測NIP45在NF-AT驅動的轉錄中的功能作用，以在HepG2細胞中高水平表達NIP45。選擇HepG2細胞是因為它們具有低水平的內源NF-AT，并且NF-AT家族成員蛋白的異位表達已顯示在缺乏外源刺激時在該細胞系中反式激活NF-AT驅動的轉錄(Hoey,T.等(1995)Immunity2:461-472)。用來自IL-2基因的3X NF-AT-CAT報道基因(Venkataraman,L.等(1994)Immunity1:189-196)和NIP45和NF-AT家族成員(NF-ATp、NF-ATc、NF-AT3、NF-AT4)的對照質粒或表達載體轉染HepG2細胞。通過描述于Hoey,T.等(1995)見上述的DEAE葡聚糖方法轉染HepG2細胞，并按照標準方法進行CAT檢測。結果示于圖15。將每個組合的一個代表性檢測示于代表各組的相對CAT活性的直方圖鄰近。通過歸一化用該CAT報道基因轉染的細胞的CAT活性，并將每個親代表達載體歸一化至1，計算倍數誘導。數值代表超出該對照轉染的CAT表達的相對水平。顯示的每個代表性放射自顯影都進行了至少三次轉染。
僅將NIP45轉染入具有3X NF-AT-CAT報道基因的HepG2細胞未導致CAT表達的顯著增長，證實NIP45不能僅靠自身式激活NF-AT靶序列。單獨的NF-ATp過量表達導致該NF-AT-CAT報道基因的大量反式激活(超出對照載體6倍)，與先前的報道(Hoey,T.等(1995)見上述)一致。NIP45加NF-ATp的共轉染導致相對于僅用NF-ATp轉染的CAT活性增加4-5倍，并超過僅用載體轉染的25-30倍。當使用突變3X NF-AT-CAT報道基因或對照MHCⅡ類啟動子報道基因時未觀察到這種增加，因此證明其靶位點的特異性。為確認該NIP45cDNA編碼的該多肽產物對該增強的反式激活負責，通過于核苷酸50制造二個堿基缺失將移碼突變導入該編碼區。該變化導致于氨基酸13導入錯義突變和在附加的22個殘基后該多肽終止。使用該NIP45Δ構建物的檢測證實它不能在存在或不存在NF-ATp時反式激活該NF-AT報道基因，因此確認觀察到的增強的反式激活是因為從NIP45cDNA表達的多肽。亦在B細胞系M12和T細胞克隆D10中進行反式激活實驗，得到類似但顯著性較低的結果，可能是因為在這些以后的細胞系中高水平的內源NIP45或NF-ATp。這些實驗證實，NIP45顯著地和特異性地增強由NF-ATp誘導的轉錄，該活性需要與NF-ATp相互作用。
NF-AT蛋白在RHD內共享約70％同一性，提高了NIP45亦可以與其它NF-AT家族成員相互作用的可能性。為測試該可能性，將NIP45與編碼或者NF-ATc、NF-AT3或NF-AT4的表達構建物加上3X NF-AT-CAT報道質粒如上述共轉染。這些實驗的結果亦示于圖8。先前已證實，當在HepG2細胞中過量表達時，所有的NF-AT家族成員都可以反式激活含有三份拷貝的NF-AT/AP1位點的報道基因，盡管水平不同(Hoey,T.等(1995)見上述)。在缺乏NIP45時，NF-ATp是最有效的NF-AT-CAT報道基因的反式激活蛋白，其次是NF-ATc和NF-AT3,NFAT4只有微弱的反式激活，與先前的數據(McCaffrey,P.G.等(1993)Science262:750-754)一致。當NF-ATc、NF-AT3或NF-AT4與NIP45共轉染時，NIP45顯著增強NF-ATc和NF-AT3驅動的反式激活，并微弱地增強NF-AT4介導的反式激活(圖15)。與NF-ATc在HepG2細胞中協作同NIP45與NF-ATcRHD餌在酵母細胞中相互作用的觀察一致。總體上，NIP45過量表達導致NF-ATc引起的反式激活增加4倍，NF-AT3驅動的反式激活增加3倍，NF-AT4驅動的轉錄增加2倍。已知NF-AT家族成員的RHD的高度序列保守性，NIP45增強所有的NF-AT家族成員的活性的能力是不奇怪的。NF-AT RHD域的序列比較揭示，與羧基末端相比，氨基末端部分的序列同一性較高(Hoey,T.等(1995)見上述)。因此，有可能該NIP45/NF-AT相互作用位點位于該RHD的5’部分。
盡管含有多拷貝NF-AT結合位點的報道構建物提供了測定由NF-AT和NIP45引起的反式激活的敏感方法，但我們尋求確定在天然NF-AT依賴性啟動子的情況下NIP45是否有功能。IL-4表達是高度組織特異性的并局限于T細胞的Th2亞群和肥大細胞。該IL-4啟動子含有已顯示對IL-4表達關鍵的多個NF-AT結合位點(Rooney,J.w.等(1995)Immunity2:473-483)。另外，已顯示原癌基因c-Maf指導IL-4的組織特異性表達(實施例3和4)。因此，該IL-4啟動子在HepG2細胞系中不活躍但可以通過導入NF-ATp和c-Maf被激活。在如上述進行的共轉染實驗中，用IL-4-CAT報道構建物(延伸至該IL-4啟動子的-732bp)和NIP45、NF-ATp和c-Maf的表達載體或對照轉染HepG2細胞。NIP45的對照是于氨基酸13的移碼突變體。NF-ATp和c-Maf的對照分別是空表達載體pREP4和pMEX(Ho,I.C.等(1996)Cell85:973-983)。這些實驗的結果示于圖16(如在圖15中描繪代表性CAT檢測和直方圖)。該數據表明，與NF-ATp和c-Maf一同導入NIP45導致相對于僅用NF-ATp和c-Maf觀察到的IL-4啟動子活性再增加9倍。NIP45亦增加缺乏轉染的NF-ATp時IL-4啟動子活性，該效應有可能是因為與內源NF-ATp相互作用。實施例14瞬時過量表達NIP45與NF-ATp和c-Maf導致內源IL-4產生為確定NIP45、NF-ATp和c-Maf的組合是否足以誘導正常不產生IL-4的細胞內源IL-4表達，用NF-ATp和c-Maf的表達載體與NIP45或pCI載體對照瞬時共轉染M12B淋巴瘤細胞。如先前描述通過電穿孔瞬時轉染M12細胞(Ho,I.C.等(1996)Cell85:973-983)，即于975μF、280V電穿孔之前于室溫將0.4ml PBS中的3x106細胞與5μg的每種質粒溫育10分鐘。通過市售IL-4ELISA(Pharmingen)按照制造商說明書除了所述的修飾(Ho,I.C.等(1996)見上述)測定72小時后收獲的細胞上清液的IL-4水平。進行了獨立的四組瞬時轉染，并檢測該培養上清液中IL-4的分泌。這四個獨立實驗之一的代表實驗結果示于圖17。對于每組轉染，包括NIP45導致顯著增加IL-4產生。用NIP45轉染的細胞比未接受NIP45的細胞多產生50-200倍的內源IL-4，其中IL-4產生接近檢測的極限。實施例15體外T輔助細胞分化期間p18mRNA表達被向下調節Maf家族蛋白p18是缺失含有反式激活域的c-Maf三分之二的氨基末端的“小”maf蛋白成員之一。為檢測在正常T輔助細胞分化成為Th2表現型期間p18轉錄物的表達，如上述實施例2中所述進行體外分化實驗。通過在存在細胞因子和抗細胞因子抗體(對于Th1用IFNγ和抗IL-4，對于Th2用IL-4和抗IFNγ)的情況下用抗CD3處理，沿Th1或Th2途徑驅動原初脾細胞(Th前體(Thp)細胞)。對在刺激后的各時間點(第0、1、3、5、或7天)收獲的分化細胞進行Northem印跡分析，以分析p18和c-maf轉錄物的表達。體外分化Th2細胞c-maf和p18表達的結果示于圖18。與上述結果一致，于第0天時c-maf轉錄物表達是低水平或無法檢出，但在沿著Th2途徑分化時其表達增加。與之相反，p18轉錄物表達于第0天(即未分化T細胞中)時是可檢測的，但在所述該細胞沿Th2途徑分化時降至基本不可檢測的水平。這些結果表明，在正常T輔助細胞分化為Th2表現型期間，p18表達被向下調節。實施例16p18阻遏IL-4啟動子活性為檢測p18表達是否影響IL-4啟動子活性，在M12B淋巴瘤細胞中進行共轉染實驗。這些實驗使用的方法是上述實施例3中描述的。將IL-4啟動子/CAT報道基因構建物與或者c-Maf表達載體、p18表達載體或者c-Maf和p18表達載體一起轉染入M12細胞。CAT檢測的代表性結果示于圖19。僅表達c-Maf(5μg質粒)導致該IL-4啟動子構建物激活(參見圖19的泳道2)，由該M12細胞中可檢測的CAT活性所證實。共轉染p18表達載體(2.5、5或10μg)與c-Maf導致CAT活性降低(參見圖19的泳道3、4和5),p18量增加導致觀察到的CAT活性更加降低。在M12細胞中僅表達p18未導致在細胞中可檢測的CAT活性(參見圖19的泳道6)。這些結果證實，p18可以阻遏由c-Maf刺激的IL-4啟動子活性。實施例17過量表達c-Maf的轉基因小鼠本實施例描述在轉基因小鼠的T細胞中過量表達c-Maf蛋白。該c-maf轉基因構建物的示意圖示于圖20。該構建物包含4kb小鼠c-mafcDNA和小鼠c-maf基因的第一個內含子。該c-maf cDNA的表達受CD4啟動子/增強子調節區控制，該區可操作地連接至c-maf第一個內含子的5’末端，由此賦予該構建物T細胞特異性表達。將一個SV40多聚腺苷酸化位點連接至該c-mafcDNA的3’末端。將該c-maf轉基因構建物微注射入受精的小鼠卵母細胞，并按照標準程序制備轉基因小鼠。
使用幾種不同的檢測將該c-maf轉基因動物的表現型與野生型動物的表現型比較。首先，定量測定淋巴器官(淋巴結、脾臟和胸腺)中的總細胞數，其結果示于圖21。該實驗證實，c-maf轉基因小鼠表現出在檢測的所有三個淋巴器官中與野生型小鼠相比細胞數降低。其次，使用流式細胞儀，比較c-maf轉基因小鼠和野生型小鼠中特定胸腺細胞群體的豐度。定量測定了雙陽性(CD4+CD8+)、雙陰性(CD4-CD8-)和單陽性胸腺細胞(CD4+或CD8+)。亦測定了CD4與CD8細胞的比例(CD4/CD8)。結果概括于以下表3中。
表3c-Maf轉基因小鼠中特定胸腺細胞群體體的豐度
這些結果證實與野生型小鼠相比，c-maf轉基因小鼠的雙陽性胸腺細胞數顯著降低。另外，c-maf轉基因小鼠的CD4+單陽性胸腺細胞數顯著降低。最后，定量測定了c-maf轉基因小鼠和野生型小鼠血清中IgE的基礎水平。結果示于圖22。該實驗證實與野生型小鼠相比，c-maf轉基因小鼠表現出血清IgE基礎水平增加。
上述c-maf轉基因小鼠的表現型(即脾臟和胸腺小、雙陽性胸腺細胞和單陽性CD4+胸腺細胞數降低、血清IgE基礎水平增加)與IL-4過量表達轉基因小鼠描述的表現型(參見Tepper等(1990)Cell62:457；和Lewis等(1991)J.Exp.Med.173:89)非常類似。等價物本領域技術人員將會識別或可以確定使用常規實驗的本文描述的本發明的特定實施方案的許多等價方案。這種等價方案包括在以下權利要求書內。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人(A)名稱President and Fellows of Harvard College(B)街道124Mount Auburn Street(C)城市Cambrige(D)州Massachusetts(E)國家美國(F)郵編02138(ⅱ)發明名稱通過調節轉錄因子活性調節T細胞亞群的方法和組合物(ⅲ)序列數量6(ⅳ)聯系地址(A)聯系人LAHIVE&COCKFIELD(B)街道60State Street,suite510(C)城市Boston(D)州Massachusetts(E)國家美國(F)郵編02109-1875(ⅴ)計算機可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機IBMPC兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.25(ⅵ)當前申請數據(A)申請號US(B)提交日期(C)分類(ⅵ)在先申請數據(A)申請號US08/636,602(B)提交日期1996年4月23日(C)分類(ⅵ)在先申請數據(A)申請號US08/755,592(B)提交日期1996年11月25日(C)分類(ⅵ)在先申請數據(A)申請號US08/755,584(B)提交日期1996年11月25日(C)分類(ⅷ)代理律師/代理人信息(A)姓名Kara,Catherine J.
(B)注冊號P41,106(C)參考/檔案號HUI-021CPPC(ⅸ)電信信息(A)電話(617)227-7400
(B)傳真(617)227-5941(2)SEQ IDNO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1CTCATTTTCC CTTGGTTTCA GCAACTTTAA CTC 33(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2ATAAAATTTT CCAATGTAAA20(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性
(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3TGGTGTAATA AAATTTTCCA ATGTAAA27(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4GGAATTGCTG ACTCAGCATT ACT23(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1946個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵CDS(B)位置13...1248(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5ACAGTGTGGG AG ATG GCG GAA CCA CTG AGG GGA CGT GGT CCG AGG TCC 48Met Ala Glu Pro Leu Arg Gly Arg Gly Pro Arg Ser1 5 10CGC GGT GGC CGA GGC GCT CGG AGA GCC CGA GGC GCC CGT GGC CGG TGT 96Arg Gly Gly Arg Gly Ala Arg Arg Ala Arg Gly Ala Arg Gly Arg Cys15 20 25CCT CGC GCC CGG CAG TCT CCG GCT AGG CTC ATT CCA GAC ACC GTG CTT 144Pro Arg Ala Arg Gln Ser Pro Ala Arg Leu Ile Pro Asp Thr Val Leu30 35 40GTG GAC TTG GTC AGT GAC AGC GAC GAA GAG GTC TTG GAA GTC GCA GAC 192Val Asp Leu Val Ser Asp Ser Asp Glu Glu Val Leu Glu Val Ala Asp45 50 55 60CCA GTA GAG GTG CCG GTC GCC CGC CTC CCC GCG CCG GCT AAA CCT GAG 240Pro Val Glu Val Pro Val Ala Arg Leu Pro Ala Pro Ala Lys Pro Glu65 70 75CAG GAC AGC GAC AGT GAC AGT GAA GGG 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ACC CTA AAG 960Phe Gly Glu Ser Glu Leu Ser Pro Thr Ala Thr Pro Ser Thr Leu Lys305 310 315CTT GGA GTG GCT GAC ATC ATT GAT TGT GTG GTG CTA GCA AGC TCT TCA 1008Leu Gly Val Ala Asp Ile Ile Asp Cys Val Val Leu Ala Ser Ser Ser320 325 330GAG GCC ACA GAG ACA TCC CAG GAG CTC CGG CTC CGG GTG CAG GGG AAG 1056Glu Ala Thr Glu Thr Ser Gln Glu Leu Arg Leu Arg Val Gln Gly Lys335 340 345GAG AAA CAC CAG ATG TTG GAG ATC TCA CTG TCT CCT GAT TCT CCT CTT 1104Glu Lys His Gln Met Leu Glu Ile Ser Leu Ser Pro Asp Ser Pro Leu350 355 360AAG GTT CTC ATG TCA CAC TAT GAG GAA GCC ATG GGA CTC TCT GGA CAC 1152Lys Val Leu Met Sar His Tyr Glu Glu Ala Met Gly Leu Ser Gly His365 370 375 380AAG CTC TCC TTC TTC TTT GAT GGG ACA AAG CTT TCA GGC AAG GAG CTG 1200Lys Leu Ser Phe Phe Phe Asp Gly Thr Lys Leu Ser Gly Lys Glu Leu385 390 395CCA GCT GAT CTG GGC CTG GAA TCC GGA GAT CTC ATC GAA GTC TGG GGC 1248Pro Ala Asp Leu Gly Leu Glu Ser Gly Asp Leu Ile Glu Val Trp Gly400 405 410TGAAGCTCTC ACCCTGTTCG GACGCAAAGC CAAGACATGG AGACAATAGC TCCCAATTTT1308ATTATTGTGA TTTTTCGCCC CATAAGGGCT AACAGAAACT GAATTAGAAC TTGTTTACTT1368ATTTATTTCT GGTGCTGGGG ATTGAACCCC AGACTATGCA CATGCTAAGG ATGTATGAAG1428TGGAGGCAAA ACCAAGGCAT TACCTTTAGC CAGCCTCTAG TAGACTGTAG TGTCAAGCAA1488GTGGCTACTT GGTAGTTGTG TGGCTCTGTG TATGTTTGTG CTGTATTTGG CAGCCCCTGG1548GGCACATAGA AGGGACCTTG GCTTCCCTAC CATTTCACGT TCGCTGGTGC CCTTTCCTTC1608ATCAGATGAC TTCTGTGAAG CTGCCTATGT TGAGTGTGTT GAACTAAATG AGCTCTGCTT1668TGGGTGTCCA GGCCTGGGGT TTGTGCCGCA GTTGGAGCCA GCAGTGACTT CACTCTGACT 1728TGGGACTGAG AATGCATTTC CTGGTGGAGA CACTCGGGTG CAGAAATATA ACAGAAGGTG 1788ACATACATGC TGAAGCTGAG GACTAGGTCG AAAGTTAACG ACGTTGCATT TTCAGCCTTG 1848GGTATCCTCT CTGCCTGCCA GGACTCTAGC CAGTGTCTGG TACACACTTC TTGGCATGGA 1908CACCTAGGTC GACGCGGGCG CGATTCGGCC GACTCGAG 1946(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度412個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6Met Ala Glu Pro Leu Arg Gly Arg Gly Pro Arg Ser Arg Gly Gly Arg1 5 10 15Gly Ala Arg Arg Ala Arg Gly Ala Arg Gly Arg Cys Pro Arg Ala Arg20 25 30Gln Ser Pro Ala Arg Leu Ile Pro Asp Thr Val Leu Val Asp Leu Val35 40 45Ser Asp Ser Asp Glu Glu Val Leu Glu Val Ala Asp Pro Val Glu Val50 55 60Pro Val Ala Arg Leu Pro Ala Pro Ala Lys Pro Glu Gln Asp Ser Asp65 70 75 80Ser Asp Ser Glu Gly Ala Ala Glu Gly Pro Ala Gly Ala Pro Arg Thr85 90 95Leu Val Arg Arg Arg Arg Arg Arg Leu Leu Asp Pro Gly Glu Ala Pro100 105 110Val Val Pro val Tyr Ser Gly Lys val Gln Ser Ser Leu Asn Leu Ile115 120 125Pro Asp Asn Ser Ser Leu Leu Lys Leu Cys Pro Ser Glu Pro Glu Asp130 135 140Glu Ala Asp Leu Thr Asn Ser Gly Ser Ser Pro Ser Glu Asp Asp Ala145 150 155 160Leu Pro Ser Gly Ser Pro Trp Arg Lys Lys Leu Arg Lys Lys Cys Glu165 170 175Lys Glu Glu Lys Lys Met Glu Glu Phe Pro Asp Gln Asp Ile Ser Pro180 185 190Leu Pro Gln Pro Ser Ser Arg Asn Lys Ser Arg Lys His Thr Glu Ala195 200 205Leu Gln Lys Leu Arg Glu Val Asn Lys Arg Leu Gln Asp Leu Arg Ser210 215 220Cys Leu Ser Pro Lys Gln His Gln Ser Pro Ala Leu Gln Ser Thr Asp225 230 235 240Asp Glu Val Val Leu Val Glu Gly Pro Val Leu Pro Gln Ser Ser Arg245 250 255Leu Phe Thr Leu Lys Ile Arg Cys Arg Ala Asp Leu Val Arg Leu Pro260 265 270Val Arg Met Ser Glu Pro Leu Gln Asn Val Val Asp His Met Ala Asn275 280 285His Leu Gly Val Ser Pro Asn Arg Ile Leu Leu Leu Phe Gly Glu Ser290 295 300Glu Leu Ser Pro Thr Ala Thr Pro Ser Thr Leu Lys Leu Gly Val Ala305 310 315 320Asp Ile Ile Asp Cys Val Val Leu Ala Ser Sar Ser Glu Ala Thr Glu325 330 335Thr Ser Gln Glu Leu Arg Leu Arg Val Gln Gly Lys Glu Lys His Gln340 345 350Met Leu Glu Ile Ser Leu Ser Pro Asp Ser Pro Leu Lys Val Leu Met355 360 365Ser His Tyr Glu Glu Ala Met Gly Leu Ser Gly His Lys Leu Set Phe370 375 380Phe Phe Asp Gly Thr Lys Leu Ser Gly Lys Glu Leu Pro Ala Asp Leu385 390 395 400Gly Leu Glu Ser Gly Asp Leu Ile Glu Val Trp Gly405 410
權利要求
1．調節細胞的T輔助2型(Th2)相關細胞因子產生的方法，包含用調節轉錄因子表達或活性的藥物接觸該細胞，使得調節細胞的Th2相關細胞因子的產生，其中該轉錄因子與激活的T細胞核因子(NF-AT)家族蛋白合作調節Th2相關細胞因子的表達。
2．權利要求1的方法，其中該轉錄因子是Th2特異性轉錄因子。
3．權利要求1的方法，其中該轉錄因子是maf家族蛋白。
4．權利要求3的方法，其中該maf家族蛋白是c-Maf。
5．權利要求3的方法，其中該maf家族蛋白是小maf蛋白。
6．權利要求5的方法，其中該小maf蛋白是p18。
7．權利要求1的方法，其中該轉錄因子與NF-AT家族蛋白相互作用。
8．權利要求7的方法，其中該轉錄因子與NF-AT家族蛋白的Rel同源域相互作用。
9．權利要求8的方法，其中該轉錄因子是NIP45。
10．權利要求1-9的任一項的方法，其中該藥物在胞內起作用調節該轉錄因子的表達或活性。
11．權利要求1-9的任一項的方法，其中該藥物是編碼該轉錄因子的核酸分子，其中該核酸分子以適于在該細胞中表達該轉錄因子的形式被導入該細胞。
12．權利要求1-9的任一項的方法，其中該藥物是胞內結合分子。
13．權利要求1-9的任一項的方法，其中用至少一種其它藥物接觸該細胞，所述其它藥物調節至少一種對調節Th2相關細胞因子基因起作用的其它轉錄因子的活性。
14．權利要求13的方法，其中至少一種其它轉錄因子選自NF-AT家族蛋白、NF-AT相互作用蛋白、maf家族蛋白和AP-1家族蛋白。
15．權利要求11的方法，其中將至少一種其它核酸分子導入該細胞，所述至少一種其它核酸分子編碼至少一種對調節Th2相關細胞因子基因起作用的其它轉錄因子。
16．權利要求15的方法，其中該至少一種其它轉錄因子選自NF-AT家族蛋白、NF-AT相互作用蛋白、maf家族蛋白和AP-1家族蛋白。
17．權利要求1-9的任一項的方法，其中該細胞是T輔助1型(Th1)細胞、B細胞或非淋巴樣細胞。
18．權利要求1-9的任一項的方法，其中刺激該細胞Th2相關細胞因子的產生。
19．權利要求1-9的任一項的方法，其中抑制該細胞Th2相關細胞因子的產生。
20．權利要求1-9的任一項的方法，其中該Th2相關細胞因子是白介素-4。
21．權利要求1-9的任一項的方法，再包含將該細胞給予受治療者，以由此調節受治療者中T輔助1型(Th1)或T輔助2型(Th2)細胞的發育。
22．重組表達載體，它包含編碼maf家族蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列操作性地連接至指導該maf家族蛋白在淋巴樣細胞中特異性表達的調節序列。
23．權利要求22的重組表達載體，其中該調節序列指導該maf家族蛋白特異性地在T細胞中表達。
24．權利要求22的重組表達載體，其中該調節序列指導該maf家族蛋白特異性地在B細胞中表達。
25．重組表達載體，它包含編碼maf家族蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列操作性地連接至指導該maf家族蛋白在造血干細胞中特異性表達的調節序列。
26．已導入編碼maf家族蛋白的重組表達載體的宿主細胞，其中該宿主細胞是淋巴樣細胞。
27．權利要求26的宿主細胞，它是T細胞。
28．權利要求26的宿主細胞，它是B細胞。
29．已導入編碼maf家族蛋白的重組表達載體的宿主細胞，其中該宿主細胞是造血干細胞。
30．分離的核酸分子，它包含編碼NIP45或其生物學活性部分的核苷酸序列。
31．分離核酸分子，它包含編碼蛋白的核苷酸序列，其中該蛋白包含與SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少60％同源的氨基酸序列，并與NF-AT家族蛋白的Rel同源域相互作用。
32．權利要求31的分離的核酸分子，其中該蛋白包含與SEQ IDNO:6的氨基酸序列至少70％同源的氨基酸序列。
33．權利要求31的分離的核酸分子，其中該蛋白包含與SEQ IDNO:6的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列。
34．權利要求31的分離的核酸分子，其中該蛋白包含與SEQ IDNO:6的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
35．長度至少為15個核苷酸的分離的核酸分子，它在嚴格條件下與包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列的核酸分子雜交。
36．權利要求35的分離的核酸分子，它包含天然存在的核苷酸序列。
37．權利要求36的分離的核酸分子，它編碼小鼠NIP45。
38．權利要求36的分離核酸分子，它編碼人類NIP45。
39．包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列編碼區的分離的核酸分子。
40．權利要求39的分離的核酸分子，包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列。
41．編碼SEQ ID NO:6的氨基酸序列的分離的核酸分子。
42．編碼NIP45融合蛋白的分離的核酸分子。
43．與權利要求30的核酸分子反義的分離的核酸分子。
44．分離的核酸分子，它與包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列的核酸分子的編碼鏈反義。
45．權利要求44的分離的核酸分子，它與SEQ ID NO:5的核苷酸序列編碼鏈的編碼區反義。
46．權利要求44的分離的核酸分子，它與SEQ ID NO:5的核苷酸序列編碼鏈的非編碼區反義。
47．包含權利要求30-46中任一項的核酸分子的載體。
48．權利要求47的載體，它是重組表達載體。
49．含有權利要求47或48的載體的宿主細胞。
50．生產NIP45蛋白的方法，包含在適當的培養基中培養權利要求49的宿主細胞直至產生NIP45蛋白。
51．權利要求50的方法，再包含從該培養基或該宿主細胞分離NIP45蛋白。
52．分離的NIP45蛋白或其生物學活性部分。
53．分離的蛋白，它包含與SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少60％同源的氨基酸序列，并與NF-AT家族蛋白的Rel同源域相互作用。
54．權利要求53的分離的蛋白，它與SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少70％同源。
55．權利要求53的分離的蛋白，它與SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少80％同源。
56．權利要求53的分離的蛋白，它與SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少90％同源。
57．包含操作性地連接至非NIP45多肽的NIP45多肽的融合蛋白。
58．NIP45的抗原肽，它包含示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列的至少8個氨基酸殘基，該肽包含NIP45表位，使得制備的抗該肽的抗體與NIP45形成特異性免疫復合體。
59．特異性結合NIP45蛋白的抗體。
60．權利要求59的抗體，它是單克隆抗體。
61．權利要求59的抗體，它被偶聯至可檢測物質上。
62．藥用組合物，它包含權利要求59-61中任一項的抗體和藥學上可接受載體。
63．非人類轉基因動物，它含有攜帶編碼NIP45蛋白的轉基因的細胞。
64．權利要求63的非人類轉基因動物，它包含具有改變的內源NIP45基因的細胞。
65．非人類轉基因動物，含有攜帶編碼maf家族蛋白的轉基因的細胞。
66．權利要求65的非人類轉基因動物，其中該maf家族蛋白優先在該動物的T細胞中表達。
67．鑒別調節轉錄因子活性的化合物的方法，其中所述轉錄因子與激活的T細胞核因子(NF-AT)家族蛋白合作調節Th2相關細胞因子基因的表達，該方法包括提供指示組合物，它具有與NF-AT家族蛋白合作調節Th2相關細胞因子基因表達的轉錄因子的活性；用測試化合物接觸該指示組合物；和確定該測試化合物對該指示組合物中的該轉錄因子活性的影響以由此鑒別調節與NFAT家族蛋白合作調節Th2相關細胞因子基因表達的轉錄因子活性的化合物。
68．權利要求67的方法，其中該轉錄因子是maf家族蛋白。
69．權利要求68的方法，其中該maf家族蛋白是c-Maf。
70．權利要求68的方法，其中該maf家族蛋白是小maf蛋白。
71．權利要求67的方法，其中該轉錄因子與NF-AT家族蛋白相互作用。
72．權利要求71的方法，其中該轉錄因子是NIP45。
73．權利要求67的方法，其中該指示組合物是淋巴樣細胞。
74．權利要求73的方法，其中該淋巴樣細胞是Th2細胞。
75．權利要求67的方法，其中該指示組合物是酵母細胞。
76．權利要求67-75中任一項的方法，其中該指示組合物包含指示細胞，其中所述指示細胞包含(ⅰ)該轉錄因子和(ⅱ)對該轉錄因子應答的報道基因。
77．權利要求76的方法，其中所述指示細胞含有ⅰ)編碼該轉錄因子的重組表達載體；和ⅱ)包含操作性地連接報道基因的Th2相關細胞因子基因調節序列的載體；并且所述方法包括a)用測試化合物接觸該指示細胞；b)確定在存在該測試化合物時該指示細胞中該報道基因的表達水平；和c)比較存在該測試化合物時指示細胞中該報道基因的表達水平和不存在該測試化合物時指示細胞中該報道基因的表達水平，以由此鑒別調節該轉錄因子活性的化合物。
78．權利要求67-72的任一的方法，其中該指示組合物包含下述的制劑(ⅰ)該轉錄因子和(ⅱ)該轉錄因子結合的DNA分子，并且所述方法包括a)用測試化合物接觸該指示組合物；b)確定存在該測試化合物時該轉錄因子與該DNA分子相互作用的程度；和c)比較存在該測試化合物時該轉錄因子與該DNA分子相互作用的程度和不存在該測試化合物時該轉錄因子與該DNA分子相互作用的程度，以由此鑒別調節該轉錄因子活性的化合物。
79．權利要求78的方法，其中該轉錄因子是maf家族蛋白并且該DNA分子包含maf效應元件(MARE)。
80．權利要求67-75中任一項的方法，它鑒別來自Th2細胞的與該轉錄因子相互作用的蛋白，其中該指示組合物是指示細胞，該指示細胞包含ⅰ)操作性地連接至轉錄調節序列的報道基因；和ⅱ)編碼第一融合蛋白的第一嵌合基因，所述第一融合蛋白包含與NFAT家族蛋白合作調節Th2相關細胞因子基因表達的轉錄因子；該測試化合物包含第二嵌合基因的文庫，該文庫編碼第二融合蛋白，該第二融合蛋白包括源自Th2細胞的蛋白。表達對第一融合蛋白、第二融合蛋白和該轉錄調節序列之間的相互作用敏感的報道基因；和其中通過確定該指示細胞中該報道基因的表達水平，來確定該測試化合物對該指示組合物中的該轉錄因子的作用，以由此鑒別包含來自Th2細胞的與該轉錄因子相互作用的化合物。
81．鑒別調節NIP45與NF-AT家族蛋白之間相互作用的化合物的方法，包含a)存在或不存在測試化合物時混合(ⅰ)NIP45或其NF-AT相互作用部分；和(ⅱ)NF-AT家族蛋白或其NIP45相互作用部分；b)在存在和不存在該測試化合物時，確定(ⅰ)和(ⅱ)之間相互作用的程度；和c)鑒別調節NIP45與NF-AT家族蛋白相互作用的化合物。
82．權利要求81的方法，其中該NF-AT家族蛋白的NIP45相互作用部分包含該NF-AT家族蛋白的Rel同源域。
83．權利要求81的方法，其中通過用可檢測物質標記(ⅰ)或(ⅱ)、分離未標記(ⅰ)或(ⅱ)、并定量測定與未標記(ⅰ)或(ⅱ)結合的標記(ⅰ)或(ⅱ)的量，確定(ⅰ)和(ⅱ)之間相互作用的程度。
84．權利要求67-75或81-83的任一的方法，再包括確定該化合物對免疫應答的影響，以由此鑒別調節免疫應答的化合物。
85．權利要求84的方法，其中通過測定該化合物對Th2相關細胞因子基因表達的影響確定該化合物對免疫應答的影響。
86．權利要求85的方法，其中該Th2相關細胞因子基因時白介素-4基因。
87．權利要求84的方法，其中通過測定該化合物對T輔助類型1(Th1)或T輔助類型2(Th2)細胞發育的影響確定目的化合物對免疫應答的影響。
全文摘要
公開了通過調節與NF－AT家族蛋白合作調節Th2相關細胞因子基因表達的一種或多種轉錄因子的活性,調節T輔助2型(Th2)相關細胞因子、特別是白介素－4產生的方法。在一個實施方案中,調節maf家族蛋白(例如c－Maf或小maf蛋白,諸如p18)的活性。在另一實施方案中,調節與NF－AT家族蛋白相互作用的蛋白(例如NIP45)的活性。本發明也包括組合方法,例如其中調節maf家族蛋白和NF－AT蛋白的活性或調節maf蛋白 和NF－AT相互作用蛋白的活性。也公開了使用調節轉錄因子活性的藥物調節T輔助1型(Th1)或T輔助2型(Th2)亞群發育的方法。本發明也提供NIP45組合物,包括編碼NIP45的分離的核酸分子、反義核酸分子、含有NIP45核酸分子的重組表達載體,也提供已導入這種表達載體的宿主細胞和攜帶NIP45轉基因的非人類轉基因動物。本發明還提供分離的NIP45蛋白和肽、NIP45融合蛋白和抗NIP45抗體。也公開了使用本發明NIP45組合物的方法。
文檔編號C07K14/435GK1225682SQ97195740
公開日1999年8月11日 申請日期1997年4月23日 優先權日1996年4月23日
發明者L·H·格里姆徹爾, M·R·霍德格, I·C·霍 申請人:哈佛大學校長及研究員協會