生產肽的方法

專利名稱：生產肽的方法
技術領域：
本發明涉及生產肽或者其鹽的方法，該肽具有從下丘腦分泌的黃體生成素釋放激素(LHRH)的激動劑的活性。本發明還涉及中間產物肽，其生產方法，其晶體以及生產所述晶體的方法。
背景技術：
對應于日本專利申請公開公報No.50-059370/1975的美國專利4008209描述了生產下列分子式的肽的下列方法(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr(或Phe)-X-Leu(或Ile或Nle)-Arg-Pro-HH-R，其中除非另外說明，每個氨基酸殘基都是L-構型；X代表D-Leu,D-Nle,D-NVa,D-Ser,D-Abu,D-Phg,D-Phe或α-Aibu；R代表可任選地含有羥基的烷基。


在反應方案中，所有符號均具有與上述定義相同的含義。
日本專利申請公開公報No.51-6926/1996對應于美國專利3997516，其中描述了生產含有胍基的肽的方法，該方法包括用低級烷氧基苯磺酰基或三(低級)烷基-苯磺酰基保護含胍基的肽的胍基。
此外，日本專利申請公開公報No.51-100030/1996對應于美國專利No.3997516，其中描述了生產含有胍基的肽的方法，該方法包括用低級烷氧基苯磺酰基或三(低級)烷基-苯磺酰基保護含胍基的肽的胍基，并在肽縮合反應后，用鹵代磺酸或低級烷基磺酸或路易斯酸去除保護基。
為了以商業規模生產肽，各種參數如(1)原料質量，(2)生產成本，(3)施工性能(4)對于操作者的安全性和(5)污染的防治應符合特定的實際可接受水平，而且在實驗室水平上效果較好的每種方法在工廠水平上未必也是令人滿意的。因此，生產肽的商業方法的設計涉及許多問題，這些問題必須解決以滿足各種要求如肽鏈延伸方式；片段縮合位點的選擇；在片段縮合中抑制異構化的方法；選擇用于α-位置和側鏈功能基的保護基；最終去除所述保護基的方法；純化終產物肽的方法；以及這一系列步驟的適用性等。
此外，可考慮通常用于肽合成的多種方法和各種反應條件，但通常情況是，由于不能結晶，無法將該方法中所用的許多中間產物充分純化或者是需要耗時的分級分離過程，因而結果是許多方法在質量和產率的重現性方面不太令人滿意。因此，在許多情況下，作為相應生產階段的關鍵因素的中間產物的物理特征如可結晶性、穩定性以及溶解性決定了一種方法是否具商業可行性。
就生產具有下列分子式的肽的方法而言(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr(或Phe)-X-Leu(或Ile或Nle)-Arg-Pro-HH-R，在美國專利4008209(對應于日本專利申請公開公報50-059370/1975)公開的方法中，用硝基保護Arg的胍基，因此，用于保護α-氨基的Z基團幾乎不能被選擇性地還原性去除，以致要用HBr-AcOH除去Z基團。在該方法中，不可避免地產生了大量高催淚性的芐基溴副產物，此外，還必須用大量醚來分離終產物。另外，盡管通常是以氫溴化物的形式回收終產物的，但必須通過例如離子交換樹脂除去溴化氫以便在片段縮合時可抑制不利的異構化。此外，盡管在最終產物-上述肽的色譜純化中要使用梯度洗脫方法，但是濃縮梯度的較低重現性要求有精確的定性檢測，結果是不能將穩定生產均一質量的理想產物的操作方法標準化。因此，該方法不適于工業化生產。
此外，在美國專利3997516中的一種反應方案產生了具有下列分子式的肽(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg(MBS)-Pro-NH-C2H5，其中MBS表示對甲氧基苯磺酰基。但是，在該美國專利中，僅描述了反應方案，而未述及其他詳細資料如反應條件。
因此，仍需要安全便宜、高產率并具良好重現性的工業上有用的方法以生產具有LHRH激動劑活性的肽或者其鹽。
本發明人努力研究了上述問題并成功地建立了通過在水解反應步驟中抑制氨基酸殘基的異構化來有效生產中間產物肽(Ⅱ)(下述)的方法，用于結晶肽(Ⅱ)以及對下述工業規模肽(Ⅰ’)進行脫保護的方法；和用于工業規模純化目標肽(Ⅰ)(下述)的方法。因此，本發明人得到了以安全、高產和良好重現性生產所述肽(Ⅰ)的方法，并完成了本發明。
本發明公開本發明涉及(1)生產下式的肽5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-R4-Arg-Pro-R6(Ⅰ)(SEQ ID NO:6)其中R1代表His,Tyr,Trp或p-NH-Phe,R2表示Tyr或Phe,R3表示任選地取代的Gly或任選地取代的α-D-氨基酸殘基，R4表示Leu,Ile或Nle,R6表示(1)Gly-NH-R7，其中R7表示氫或可任選地用羥基取代的烷基或(2)NH-R8，其中R8表示氫或可任選地用羥基或脲基(-NH-CO-NH2)取代的烷基，或者其鹽的方法，該方法包括將下式肽5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-OH (Ⅱ)(SEQ ID NO:4)其中R1,R2和R3具有與上述定義相同的含義，或者其鹽與下式肽H-R4-R5-Pro-R6(Ⅲ)其中R4和R6具有與上述定義相同的含義，R5表示被保護的Arg，或者其鹽反應，以產生下式肽
5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-R4-R5-Pro-R6(Ⅰ’)(SEQ ID NO:5)其中R1,R2,R3,R4,R5和R6具有與上述相同的含義，或者其鹽，然后，將所得肽(Ⅰ’)進行脫保護基反應；(2)根據(1)的方法，其中R1是His,R2是Tyr,R3是可以用C1-4烷基取代的Gly、D-Leu、D-Trp、D-Val，或者是可用C1-4烷氧基、萘基或2-甲基吲哚基取代的D-Ser、D-Ala，或者可用C7-10芳烷基取代的D-His,R4是Leu,R5是用選自下列的基團保護的Arg:C1-6烷氧基苯磺酰基、三-C1-6烷基苯磺酰基和硝基，R6是下式基團NH-R8’，其中R8’是氫原子或可任選地用羥基取代的烷基；(3)根據(1)的方法，其中R1是His,R2是Tyr,R3是D-Leu,R4是Leu,R5是用C1-6烷氧基苯磺酰基保護的Arg,R6是下式基團NH-R8”，其中R8”是可任選地用羥基取代的C1-3烷基；(4)根據(1)的方法，其中肽(Ⅱ)或者其鹽與肽(Ⅲ)或者其鹽的反應在大約0-40℃下進行約30-60小時；(5)根據(1)的方法，其中在脫保護基反應中使用了一種酸；(6)根據(5)的方法，其中所述酸是C1-6鏈烷磺酸；(7)根據(5)的方法，其中將所述酸以肽(Ⅰ’)約5-25倍(重量)的比例使用；(8)回收并純化上述(1)中所定義的肽(Ⅰ)的方法，該方法包括將含有產生的游離形式油狀產物的反應混合物進行柱色譜純化，所述反應混合物是通過在存在酸的條件下，對肽(Ⅰ’)進行脫保護基反應，然后用堿中和而得到的；(9)下式的肽5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-OR9(Ⅳ)(SEQ ID NO:3)其中R1是His、Tyr、Trp或p-NH2-Phe,R2是Tyr或Phe,R3是可任選地取代的Gly或可任選地取代的α-D-氨基酸殘基，R9是保護基，或者其鹽；(10)根據(9)的肽或者其鹽，其中R1是His,R2是Tyr,R3是可用C1-4烷基取代的Gly、D-Leu、D-Trp、D-Val，或者是可用C1-4烷氧基、萘基或2-甲基吲哚基取代的D-Ser、D-Ala，或者是可用C7-10芳烷基取代的D-His,R9是C1-6烷基、C6-10芳基或C7-12芳烷基；(11)根據(9)的肽或者其鹽，其中R1是His,R2是Tyr,R3是D-Leu,R9是C1-6烷基；(12)用于生產下式肽5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-OH(Ⅱ)(SEQ ID NO:4)其中R1是His,Tyr,Trp或p-NH2-Phe,R2是Tyr或Phe,R3是可任選地取代的Gly或可任選地取代的α-D-氨基酸殘基，或者其鹽的方法，該方法包括水解下式肽5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-OR9(Ⅳ)(SEQ ID NO:3)其中R1,R2和R3具有與上述定義相同的含義，R9是保護基；(13)下式肽5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-OH (Ⅱ)(SEQ ID NO:4)其中R1是His、Tyr、Trp或p-NH2-Phe,R2是Tyr或Phe,R3是可任選地取代的Gly或可任選地取代的α-D-氨基酸殘基，或者其鹽的晶體；(14)下式肽5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-OH (Ⅱ)(SEQ ID NO:4)其中R1是His、Tyr、Trp或p-NH2-Phe,R2是Tyr或Phe,R3是可任選地取代的Gly或可任選地取代的α-D-氨基酸殘基，或者其鹽的晶體的生產方法，該方法包括對肽(Ⅱ)或者其鹽的溶液進行老化(aging)；以及(15)根據(14)的方法，其中在溫度為約10-70℃下，對濃度為約0.01-0.05摩爾/升的肽(Ⅱ)或者其鹽的溶液進行老化約10-70小時。
附圖簡述

圖1是本發明優選方法的通用流程圖。
完成本發明的最佳方式各符號和/或縮寫的含義如下R1表示His、Tyr、Trp或p-NH2-Phe，優選His。
R2表示Tyr或Phe，優選Tyr。
作為可任選地取代的α-D-氨基酸殘基中的α-D-氨基酸殘基，是指D-Leu、D-Ile、D-Nle、D-Val、D-Nva、D-Ser、D-Abu、D-Phe、D-Phg、D-Thr、D-Met、D-Ala、D-Trp或α-Aibu。作為α-D-氨基酸殘基，優選D-Leu、D-Val、D-Ser、D-Trp、D-Ala、D-Abu和α-Aibu，更優選D-Leu。
在Gly或α-D-氨基酸殘基上的取代基指(1)單-C1-4烷基，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基，(2)二C1-4烷基，例如二甲基、二乙基，(3)三C1-4烷基，例如三甲基、三乙基，(4)C1-4烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基，(5)C6-10芳基，例如苯基、萘基，(6)C7-10芳烷基，例如芐基、苯乙基，(7)吲哚基(8)甲基吲哚基，和(9)芐基咪唑基等。其中優選甲基、二甲基、三甲基、叔丁基、叔丁氧基，2-萘基、吲哚-3-基、2-甲基吲哚基和芐基咪唑-2-基等。更優選三甲基、叔丁基、叔丁氧基、2-萘基、吲哚-3-基、2-甲基吲哚基和芐基咪唑-2-基。
R3的優選實例是指可用C1-4烷基取代的Gly、D-Leu、D-Trp,D-Val，可用C1-4烷氧基、萘基或2-甲基吲哚基取代的D-Ser、D-Ala，或可用C7-10芳烷基取代的D-His。
R3的更優選實例是指Gly、D-Leu、D-Trp、3-甲基-D-Val、D-Ser、叔丁氧基-D-Ala、2-萘基-D-Ala、2-甲基吲哚基-D-Ala、芐基咪唑-2-基-D-Ala(=Nim-芐基-D-His)。
R4表示Leu、Ile或Nle。作為R4,Leu是優選的。
作為被保護Arg中的保護基R5，是指烷氧基苯磺酰基或三烷基苯磺酰基。
優選的烷氧基苯磺酰基是C1-6烷氧基取代的苯磺酰基，例如對甲氧基苯磺酰基、對乙氧基苯磺酰基、對異丙氧基苯磺酰基等，更優選對甲氧基苯磺酰基。
三烷基苯磺酰基中的烷基部分優選是C1-6烷基，可以是相同或不同的，例如甲基、乙基、丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、叔戊基等。三個烷基可存在于苯磺酰基苯環上的任選取代位置上但優選在相對于磺酰基的2-、4-和6-位上。具體地說，通常可以是2,4,6-三甲基苯磺酰基，2,4,6-三乙基苯磺酰基，2,4,6-三丙基苯磺酰基，2,4,6-三異丙基苯磺酰基，2,4,6-三-叔丁基苯磺酰基等。
作為被保護Arg中的保護基R5的優選實例，指C1-6烷氧基苯磺酰基，更優選對甲氧基苯磺酰基、對乙氧基苯磺酰基、對丙氧基苯磺酰基、對異丙氧基苯磺酰基，甚至更優選對甲氧基苯磺酰基。
R7和R8中述及的“可任選地含有羥基的烷基”的烷基是可在任何可取代位置上含有羥基的C1-4烷基如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基，優選乙基。
可任選地含有羥基的烷基的優選實例指羥甲基、2-羥基乙基、3-羥基正丙基、4-羥基正丁基等，更優選2-羥基乙基。
作為R9的保護基，指C1-4烷基例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、正己基等，C7-10芳烷基例如芐基、苯乙基等。R9優選是C1-3烷基，更優選為乙基。
在整個說明書及所附的權利要求書中，根據IUPAC-IUB生物學命名委員會的縮寫或本領域常用的俗名來表示氨基酸和肽。若氨基酸存在光學異構體，除非特別說明，均指L化合物。
還應理解，在本發明說明書中有時還使用下列縮寫Gly甘氨酸Ala丙氨酸Val纈氨酸Leu亮氨酸Ile異亮氨酸Ser絲氨酸Thr蘇氨酸Arg精氨酸Phe苯丙氨酸Tyr酪氨酸His組氨酸Trp色氨酸Pro脯氨酸NLe正亮氨酸NVa正纈氨酸Abu 2-氨基丁酸Phg 苯甘氨酸α-Aibu α-氨基異丁酸P-NH2-Phe對氨基苯丙氨酸Z芐氧基羰基Pd 鈀Pd-C 鈀碳Et 乙基AcOH 乙酸HF 氟化氫HBr 溴化氫DCHA 二環己胺DMF N,N-二甲基甲酰胺DMA N,N-二甲基乙酰胺THF 四氫呋喃MSA 甲磺酸MBS 對甲氧基苯磺酰基DCC N,N’-二環己基碳二亞胺HONB N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亞胺HOSu N-羥基琥珀酰亞胺HOBt 1-羥基苯并三唑EDA 乙基-3-(3-二甲基氨基)丙基碳二亞胺氫氯化物NP 對硝基苯基HPLC 高效液相色譜生產肽(Ⅰ)的方法如下可用各種合成方法生產式(Ⅰ)的肽或者其鹽，可就氨基保護基和羧基保護基、形成酰胺鍵的方法、脫保護的方法以及在用于純化相應合成方法中得到的肽的方法進行多種組合。
在這些可選用的合成方法中，圖1是優選的實例之一。因此，本發明的生產技術包括(1)用保護基保護Arg8的胍基，(2)合成兩種關鍵的中間產物片段，例如肽(Ⅱ)和肽(Ⅲ)，以及(3)對從Arg8的胍基縮合所述肽后得到的前體肽(Ⅰ’)脫保護以得到目的肽(Ⅰ)或者其鹽。
本發明肽的鹽指與有機酸例如甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、乙醇酸(glucollic acid)、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、對甲苯磺酸、三氟乙酸、甲磺酸、磷酸等，無機酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸等形成的鹽。
1．生產肽(a)的方法用在“Peptide Gousei-no-Kiso-to-Jikken”(肽合成基礎和試驗(Basis and Experiment of Peptide Synthesis),Nobuo Izumiya等編，Maruzen Publishers,Japan；或“The Peptide”，第1卷，76-136頁，Ebehard Schroder and Klaus Lubke中所述的方法，或與其相似的方法生產結構為Z-R2-R3-OR9的式(a)的肽。
2．從肽(a)生產肽(b)的方法在本發明的生產方法中，通過將二肽(a)與Z-Ser縮合來合成圖1所示的肽(b)Z-Ser-R2-R3-OR9。
首先，去除肽(a)的Z基團以得到脫Z的肽(a)(肽(a)減去“Z”)。作為去除反應，優選采用使用催化劑如Pd,Pd-C的催化還原反應以及HBr/AcOH處理。
催化還原反應中的溶劑可以是醇例如甲醇、乙醇、異丙醇、正丙醇、正丁醇、叔丁醇等，醚例如THF、二噁烷等，酰胺例如DMF、DMA等。其中使用DMF、DMA或THF是有利的，因為在此后反應步驟的預備階段不需進行濃縮。反應溫度為約0-50℃，優選約20-40℃。反應時間為約3-15小時，優選約5-10小時。該反應優選在常壓下完成。
另外，為了在還原反應中減少二酮哌嗪的出現，優選在催化還原反應前對脫Z的肽(a)進行加質子反應。在加質子反應中，將一種酸加到反應系統中。所說酸指無機酸或有機酸，優選鹽酸、硫酸、對甲苯磺酸。其中更優選對甲苯磺酸。酸的量優選為脫Z的肽(a)量的約0.8-1.5倍(mol/mol)，更優選為1-1.1倍(mol/mol)。
將肽(a)與HBr以及不含任何溶劑的飽和乙酸反應來完成HBr/AcOH處理。反應溫度為約-10至30℃，優選約10至20℃。反應時間為約10分鐘至2小時，優選約30分鐘至1小時。通過加入醚、乙酸乙酯等后回收出現的沉淀，然后將其干燥，由此從反應混合物中回收目標肽。
在引入Z-Ser基團的反應中使用了活性酯方法，即將所述肽轉變成活性酯，并通過優化反應溫度而成功地抑制分子內的脫氫反應。在本發明方法中，可用于引入Z-Ser的活性酯包括可用于肽合成的各種活性酯，例如含有酯化劑的酯，如N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亞胺(HONB)、N-羥基琥珀酰亞胺(HOSu)、N-羥基苯并三唑等。特別優選的是HONB酯。
為了制備Z-Ser-OH的活性酯，在溶劑如醚例如二乙醚、異丙醚、THF、二噁烷等，酰胺例如DMF、DMA等，乙腈，酸酯例如甲酸甲酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯等中，于約-5-20℃，優選約0-5℃下，將Z-Ser-OH與活性酯化劑反應約5-15小時，優選約7-10小時。
脫Z的肽(a)與Z-Ser-OH活性酯的反應是在惰性溶劑中完成的。可以使用在前面步驟的還原反應中所用的溶劑。其中優選酰胺例如DMF、DMA。在較低的溫度例如-10至10℃，優選約-5至5℃經約5至20小時，優選約7至12小時完成反應。
3．從肽(b)生產肽(c)的方法通過對肽(b)進行脫Z反應而得到的肽(脫Z的肽(b))與肽Z-Trp-OH進行縮合反應來生產肽(c)Z-Trp-Ser-R2-R3-OR9(SEQ ID NO:1)。
通過使用催化劑如Pd,Pd-C的催化還原反應或通過用HBr/AcOH處理來進行脫Z反應。通過與由肽(a)生產肽(b)的方法中述及的相似途徑完成催化還原反應和HBr/AcOH處理。
通過將肽(b)與Z-Trp-OH的活性酯反應而將Z-Trp引入由肽(b)進行脫Z反應而得到的肽中，所述Z-Trp-OH的活性酯是通過在存在縮合劑如DCC、EDA等的條件下，將Z-Trp-OH與活性酯化劑如HONB、HOBt、HOSu反應而預先產生的。另外，在存在活性酯的條件下，通過使用縮合劑將二者反應，可以縮合肽(b)和Z-Trp-OH。
作為活性酯，優選HONB；作為縮合劑，優選DCC。生產Z-Trp-OH活性酯的方法與上述方法相似。
存在縮合劑的條件下，將肽(b)和Z-Trp-OH活性酯的反應在約0-20℃，優選約5-10℃進行約5-20小時，優選約7-10小時。
4．從肽(c)和肽(d)生產肽(e)的方法可通過Hatanaka等[Takeda Research Report,35,16(1976)；生物化學和生物物理研究通訊(Biochemical and Biophysical ResearchCommunications,60,1345(1974)]的方法，或與上述相似的方法來生產肽(d):Z-5-氧代-Pro-R1-OH。
通過將肽(c)與肽(d)縮合來生產肽(e)Z-5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-OR9(SEQ ID NO:2)。在縮合反應中，必須注意His殘基的異構化。可以使用用于肽片段縮合的任何已知的抗異構化方法。抑制這種異構化的常用方法中除使用縮合劑外，還使用抗異構化試劑。縮合劑例如可以是DCC或EDA，抗異構化試劑例如可以是HONB,HOSu,HOBt,(HOSu)等。可以以任何需要的組合方式來使用這兩種試劑。常用的組合是DCC-HONB,DCC-HOSu,DCC-HOBt和EDA-HOSu等。特別優選DCC-HONB。盡管反應溫度是控制異構化的主要因素，但是優選的反應溫度是約0-20℃，優選約5-15℃，時間為30分鐘至100小時，優選約50-80小時。在反應中，使用酰胺例如DMF、DMA等，醚例如2-甲基吡咯烷酮、THF、二噁烷等作為溶劑。
5．從肽(e)生產肽(Ⅳ)的方法從肽(e)Z-5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-OR9(SEQ ID NO:2)去除Z，得到肽(Ⅳ)。通過例如使用催化劑(如Pd,Pd-C)進行的催化還原反應等，或者通過HBr/AcOH處理等方法完成脫Z反應。
在催化還原反應中，所用的溶劑是酰胺例如DMF、DMA等，醚例如2-甲基吡咯烷酮、THF、二噁烷等，或者叔丁醇，溫度為約0至50℃，優選約25至40℃，反應時間為約1至10小時，優選約3至6小時。
HBr/AcOH處理通過在從肽(a)制備肽(b)的反應中提到的類似方法完成。
6．從肽(Ⅳ)生產肽(Ⅱ)的方法通過水解肽(Ⅳ)，并在需要時中和反應混合物可產生肽(Ⅱ)。該水解反應優選在較低的溫度下，于水和醇的混合物中完成。可使用的醇包括甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇等，在水-醇混合物中，醇的比例為約1-30％(v/v)，優選約1-10％(v/v)。在相同的時間內，醇的比例越大，水解反應的速度就越低，同時，His2和Ser4異構化的比率顯著增加(當R1是His時)。甚至通過在純化中所用的柱色譜系統也不能有效除去這些異構體，因此，降低了終產物肽(Ⅰ)的質量。
反應溶劑可含有上游步驟中的溶劑，即DMF、THF等，但其比例不應高到會顯著地延緩反應，即優選約1-20％(v/v)，優選約5-10％(v/v)。
存在堿的條件下進行水解。所用的堿是氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化鋇。His在2-位、Ser在4-位的水解和異構化反應速度取決于堿的用量和其在溶液中的濃度。堿用量優選為肽(Ⅳ)的約2.5至2倍(mol/mol)，優選約3-4倍(mol/mol)。具體地說，反應開始時堿在反應系統中的濃度優選為約0.05-0.3摩爾/升，最佳為約0.1-0.2摩爾/升。應將反應溫度保持在約-10至10℃，優選約-5至5℃，直到后處理即中和結束。為了保持反應溫度的恒定，優選攪拌反應系統。該反應通常在1.5至3小時內完成。為了使不利的異構化降至最低限度，優選在反應后立即進行中和過程。該中和反應中使用酸(例如鹽酸、硫酸等)在-5至5℃，優選-2至2℃下進行。
將肽(Ⅱ)通過下列方法結晶因此，將在(Ⅳ)水解后，對反應混合物進行中和而形成的凝膠加熱使其溶解，然后使其逐漸冷卻，以結晶出肽(Ⅱ)。通過加熱的溶解是在攪拌下，于約60至80℃，優選約65至75℃進行的。在冷卻期中，通過加入晶種來促進結晶。至于晶種加入的時間，則可以在該期的任何時間，只要此時加入的晶種不會溶于溶液中并且熱溶液不會再產生凝膠即可。優選的時期為溶液溫度在約35至45℃時。在15至30℃的溫度下，經約1至3小時完成逐漸冷卻。
為了完成結晶，優選對產物進行老化處理。為得到肽(Ⅱ)晶體(具有優秀的特性，而且高產)，老化時間為約30至150小時，優選約60至100小時。老化溫度優選為約10至35℃，更優選為約10至30℃，甚至更優選是約15至25℃。
在老化開始時，肽(Ⅱ)在溶液中的濃度為約0.01-0.05摩爾/升，優選約0.02-0.04摩爾/升。
在老化過程中，優選間斷地攪拌含肽(Ⅱ)的溶液，以便縮短老化時間和/或得到高產率的晶體。因此，優選開始反應后5小時，以約30-35rpm攪拌溶液約1分鐘。此后，大約每5小時，以約30-35rpm攪拌溶液約1分鐘，直到老化過程完成2/3。此后，大約每0.5小時，以約30-35rpm攪拌溶液約1分鐘直到老化完成。
具體地說，例如老化時間是60小時，在開始反應后5小時，每5小時以33rpm攪拌溶液約1分鐘直到40小時，然后，從老化開始后40小時，每隔0.5小時以33rpm攪拌溶液約1分鐘直到老化的最后步驟。
通過上述肽(Ⅱ)的結晶方法，完全避免了去除影響終產物質量的雜質的耗時操作，所述雜質例如在肽(c)的片段縮合反應至肽(e)，肽(Ⅳ)到肽(Ⅱ)的水解反應中形成的副產物His異構體，以及在肽(Ⅳ)到肽(Ⅱ)的水解反應中形成的副產物Ser異構體，也可避免分離肽(Ⅳ)的過程。
可將肽(Ⅱ)以堿金屬例如鋰、鈉、鉀、鈣、鋇等的鹽形式或有機堿例如三乙胺、環己胺、二環己基胺的鹽形式用于下步反應例如結晶中，也可用已知方法例如結晶分離或以溶液形式使用。
7．肽(Ⅲ)的制備可用Fujino等，生物化學和生物物理學文獻，154,488(1973)；化學和制藥通報，23,229(1975)的方法或用于肽合成的任何其他已知方法生產肽(Ⅲ)或者其鹽。
可將肽(Ⅲ)以鹽酸、氫溴酸、硫酸、對甲苯磺酸、三氟乙酸或甲磺酸鹽的形式用于下步反應，也可用已知的分離方法例如結晶法分離，或以溶液形式使用。但在所述情況下，形成酰胺鍵的反應之前應用堿中和或用離子交換樹脂處理來除去堿(酸)。
8．從肽(Ⅱ)和肽(Ⅲ)生產肽(Ⅰ’)在不影響反應的溶劑中，縮合肽(Ⅱ)與肽(Ⅲ)，得到肽(Ⅰ’)。可使用的溶劑包括N,N-二甲基甲酰胺(DMF),N,N-二甲基乙酰胺(DMA),N-甲基吡咯烷酮，二氯甲烷，二氯乙烷，四氫呋喃，二噁烷等，并且可將這些溶劑以適宜的混合物使用。優選的是N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二-甲基乙酰胺。
肽(Ⅲ)相對肽(Ⅱ)的比例為約0.5至2摩爾當量，優選約1至1.5摩爾當量。
反應溫度通常為約0至40℃，優選約5至25℃。溫度范圍對于抑制R3的異構化是很重要的。反應時間通常為約30至60小時，優選約40至50小時。
在肽(c)與肽(d)的縮合反應中，必須要注意R3的異構化，但可以使用用于肽片段縮合的任何已知的抗異構化方法。抑制該異構化(外消旋)的通用方法包括除縮合劑外，還使用抗異構化試劑。縮合劑可以是例如DCC或EDA，抗異構化試劑可以是例如HONB,HOSu,HOBt等。可將這兩種試劑以任何需要的組合使用。典型的組合是DCC-HONB,DCC-HOSu,DCC-HOBt和EDA-HOSu等。特別優選DCC-HONB。
以肽(Ⅱ)1-3倍(摩爾/摩爾)的比例，優選1-2倍(摩爾/摩爾)的比例使用縮合劑。抗異構化劑的用量為肽(Ⅱ)的1-4倍(摩爾/摩爾)，優選1.5-2.5倍(摩爾/摩爾)。肽(Ⅱ)的起始濃度為約0.05-0.2摩爾/升，優選0.08-1.5摩爾/升。以肽(Ⅱ)0.8-2倍(摩爾/摩爾)，優選1-1.3倍(摩爾/摩爾)的量使用肽(Ⅲ)。
9．從肽(Ⅰ’)生產肽(Ⅰ)在不影響反應的溶劑中，或不存在溶劑的條件下，用酸完成從肽(Ⅰ’)的Arg殘基除去保護基的脫保護反應。不影響該脫保護反應的溶劑包括但不限于二氯甲烷、二氯乙烷，二噁烷和三氟乙酸，并且可將這些溶劑以適宜的混合物使用。
可用于該脫保護反應的酸包括但不限于C1-6鏈烷磺酸例如甲磺酸、乙磺酸等，鹵代磺酸例如氯磺酸、氟磺酸、溴磺酸等，以及路易斯酸例如三(三氟乙酸)硼等。其中優選C1-3鏈烷磺酸，特別優選甲磺酸。
用于該脫保護反應中的酸的比例為肽(Ⅰ’)重量的約5-25(w/w)倍，優選約10-20(w/w)倍。
脫保護反應的溫度通常為約0-20℃，優選約5-15℃。
脫保護反應的時間通常為約2-8小時，優選約4-6小時。
優選在不存在溶劑的條件下，用甲磺酸完成所述脫保護反應。
在完成該脫保護反應的過程中，可加入適宜量的基團清除劑(例如酚、苯甲醚等)和/或抗氧化劑(例如巰基乙酸)。以上述反應產物計，它們的用量均為約0.8-2(w/w)倍，優選約0.05-2(w/w)倍。
當用C1-6鏈烷磺酸完成脫保護反應時，通過例如下述方法，可從反應混合物中除去鏈烷磺酸，所述方法包括用醚洗滌反應混合物，將洗滌物溶解在水中，并在陰離子交換樹脂柱上對所得溶液過柱。但是，將該方法用于商業規模的生產時，從所需硬件、可加工性和安全性來看，由于鏈烷磺酸在醚中的溶解度很低，使用大量醚帶來的危險、將大量鏈烷磺酸與水混合并在離子交換樹脂柱上對溶液過柱時突然釋放的熱所帶來的危險，以及由于釋放的熱使目的肽分解，導致該方法不太適宜。
作為不存在上述問題的商業上有利的方法，有一種從反應混合物中通過直接用堿性含水介質中和而去除鏈烷磺酸的技術。但是，在涉及中和大量強酸的所述中和過程中，盡管進行大規模處理是可行的，但還會釋放大量中和熱。除必須處理大量中和溶液所產生的問題外，由于在堿性含水介質中，目的肽的肽鍵裂解和氨基酸異構化而對終產物質量的不利影響是不可避免的，以致在迄今為止所涉及的肽生產中，均認為該方法不實用。
但是，本發明人研究了用于吸收在該中和反應中所釋放的中和熱的方法以及該方法的程序，并努力優化該反應條件。結果，他們令人驚奇地發現，可以以良好的產率得到質量合格的目的化合物，并確定了用于所述中和的規模化生產方法。因此，根據本發明，在保持的低溫下，將反應混合物滴加到冷的無機或有機堿含水溶液以中和鏈烷磺酸。在所述操作方式中，可以成功地抑制目的肽中組成性氨基酸殘基的異構化，而且可以以固體或油狀的形式得到所述目的化合物。
可用于該目的的無機堿包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸鈣等，可以使用的有機堿包括吡啶，三乙胺等，碳酸鉀是優選的。當用碳酸鹽作為所述堿時，由于二氧化碳的釋放，會有很多的泡沫，但在預先加入適宜比例的有機溶劑如乙酸乙酯或苯即可控制這種泡沫。所述無機或有機堿的用量只要足以中和鏈烷磺酸即可，但優選相當于鏈烷磺酸的約1-1.3當量。
為了抑制氨基酸的異構化和肽鏈的水解裂解并避免所述無機或有機堿含水溶液的冷凍，優選將中和系統的溫度控制在約-15至15℃，優選約-5至5℃。
中和后，通常從中和系統中以固體或油狀分離出目的化合物，因此，可用適宜的已知方法例如過濾或潷出來回收所述化合物。
可用本身已知的方法從中和系統中分離出目的化合物。在相對少量的目的化合物的純化中，液相色譜是一種可選用的方法。為了純化大量的目的化合物，根據具體化合物的離子性質、極性和其他溶液特性、芳香性和分子量，可將數種已知柱色譜結合使用。
從工業化的角度看，優選的分離純化技術包括正確組合使用了下列多孔(hyperporous)樹脂例如Amberlite XAD-2(Rohm&Haas Co.,USA)或Diaion HP-20(Mitsubishi Chemical,Japan)、羧甲基纖維素(CMC,CM-23(whatman,USA))、離子交換樹脂例如Amberlite CG-50(Rohm & Haas Co.,USA)和分子篩樹脂例如Sephadex LH-20(Pharmacia Fine Chemicals,Sweden)的柱色譜系統。該方法程序上簡單安全，并在產率和質量上均可提供良好的重現性，另外，還很經濟。
一種舉證性的柱色譜系統組合可以是連續組合的Diaion HP-20(上述)(第一次分離)→CM-23(上述)→Diaion HP-20(第二次分離)→Sephadex LH-20(上述)(第三次分離)。當將含肽的溶液濃縮時，會出現大量泡沫，并需使用凍干機，或加入防泡劑。但是，所述柱色譜組合是一種有利的方法，即可免除對在各柱色譜步驟中得到的有效級分特別是對在CM-23柱色譜中得到的含有效級分的大量含水溶液的濃縮步驟。因此，就操作性和經濟性以及高質量而言，上述色譜組合是一種工業上有用的方法，所述的操作性和經濟性以及高質量取決于抑制因濃縮而引起的肽降解。
就主要目的而言，Diaion HP-20(第一次分離)柱色譜必須在脫保護反應后從反應混合物中分離的含粗目的化合物的固體或油中去除無機雜質和在脫保護步驟中加入的基團清除劑以及其反應產物，任選地加入的抗氧化劑，少量產生的目的化合物的異構體。此外，就DiaionHP-20(第一次分離)柱色譜而言，相對于目的化合物，以約20-40(v/w)倍，優選約25-35倍的比例使用Diaion HP-20。通常用丙酮、甲醇或乙醇的含水溶液進行目的化合物和雜質的洗脫。在下述示例性的描述中，使用的是乙醇。首先，將含目的化合物的水溶液過Diaion HP-20柱，用計劃量的乙酸鈉/水(已用乙酸將pH預調至5-7)、乙酸銨/水和10％(v/v)乙醇連續灌柱以洗脫有關的化合物。然后，用15％(v/v)乙醇和35％(v/v)乙醇洗脫目的化合物并收集程序級分。
CM-23柱色譜的主要目的是除去目的化合物的非離子化等同物(ionically non-equivalent)副產物。相對于目的化合物，通常以35至60倍(v/v)，優選40-55倍(v/w)的比例使用CM-23柱。在蒸餾掉來自DiaionHP-20(第一次分離)的程序洗出液的乙醇后，將溶液過CM-23柱并先用水清洗柱。然后用0.015M乙酸銨/水和0.03M乙酸銨/水連續洗脫目的化合物并收集程序級分。
Diaion HP-20(第二次分離)柱色譜的主要目的是除去洗脫CM-23柱中所用的乙酸銨并濃縮大量的洗出液。可將CM-23柱色譜后的程序洗出液(會在濃縮時產生大量泡沫的大量含水溶液)直接過Diaion HP-20(第二次分離)柱，而無需先濃縮。將所述Diaion HP-20(第二次分離)柱用乙酸鈉/水(已用乙酸將pH預調至5-7)、乙酸銨/水和水以所述順序連續灌柱。然后，用15％(v/v)乙醇和35％(v/v)乙醇洗脫目的化合物并收集程序級分。將由此從Diaion HP-20(第二次分離)柱得到的程序洗出液(已經被濃縮至來自CM-23柱的程序洗出液體積的約1/3)進行減壓濃縮，將剩余物過Sephadex LH-20柱。
Sephadex LH-20柱色譜是所述連續柱色譜的最后步驟，其目的是除去發熱物質、無機物以及其他痕量雜質。相對于目的化合物，以約20-60倍(v/w)，優選約30-50倍(v/w)的比例使用Sephadex LH-20。用0.005N乙酸/水展開LH-20柱，并收集程序洗出液。如果需要的話，將所述程序洗出液濃縮、用活性炭處理，進行膜過濾并將其凍干以得到作為終產物的目的化合物(乙酸鹽)。
由此得到的肽(Ⅰ)具有LHRL激動劑活性，并可將其以與例如美國專利4008209中所述相似的方式使用。
實施例下列實施例僅僅是為了更詳細地描述本發明，而不對本發明的范圍構成限制。參考實施例1．Z-Tyr-D-Leu-OEt的生產在0-10℃，約300ml乙酸乙酯中，用1N硫酸對Z-TyrOH·DCHA(58.8g)脫鹽。分離有機層并在無水硫酸鈉(Na2SO4)上干燥。過濾除去Na2SO4后，將24.3g D-Leu-OEt,12.6g三乙胺和26.8gDCC加到濾液中，在約5℃攪拌混合物約2小時，然后在10℃再攪拌5小時。向所述反應混合物中加入60ml 1N鹽酸并過濾混合物。放置濾液并用NaCl水溶液和NaHCO3水溶液洗滌有機層，蒸發掉乙酸乙酯。向剩余物中加入異丙醚，通過過濾收集所得的晶體物，將其在乙酸乙酯-異丙醚中再結晶并干燥。產率41.6g(77％)m.p.116-118℃旋光度[α]D25=-3.4°(c=1,DMF)參考實施例2．Z-Ser-Tyr-D-Leu-OEt的生產在約300ml DMF中溶解40.5g Z-Tyr-D-Leu-OEt和16.9g對甲苯磺酸一水合物，在20-35℃，約5克5％Pd-C存在的條件下，完成氫化反應。反應完成后，過濾除去催化劑。
分別將23.3g Z-Ser-OH和19.2g HONB溶解在300ml DMF中，然后加入22.1g DCC，在0-5℃，攪拌混合物約7小時。向該混合物中加入上述還原反應混合物。將混合物冷卻到約0℃，滴加9克三乙胺。然后在-5至5℃攪拌混合物約10小時，然后在室溫下放置過夜。
過濾除去已形成的晶體，然后減壓濃縮濾液。將剩余物溶解在乙酸乙酯中。用1N鹽酸、氯化鈉水溶液和碳酸氫鈉水溶液以所述順序洗滌所述乙酸乙酯溶液，然后在Na2SO4上干燥。過濾除去硫酸鈉后，減壓濃縮濾液并用異丙醚稀釋。過濾收集所得粗晶體物，在乙酸乙酯中再結晶并干燥。產率37.6g(77％)m.p.134-136℃旋光度[α]D25=-4.8°(c=1,DMF)參考實施例3．Z-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-OEt(SEQ ID NO:7)(ETSTLE)的生產在300ml DMF中溶解36.2g Z-Ser-Tyr-D-Leu-OEt，在25-35℃，約5克5％Pd-C存在的條件下，完成氫化反應。反應完成后，過濾除去催化劑。
分別將21.4g Z-Trp-OH和11.9g HONB溶解在300ml DMF中，然后加入13.7g DCC。在5-10℃，攪拌混合物約7小時。向該混合物中加入上述還原反應混合物。在10-15℃下，攪拌混合物約7小時，然后在室溫下放置過夜。
過濾除去形成的晶體，然后減壓濃縮濾液。將剩余物溶解在乙酸乙酯中。用1N鹽酸、氯化鈉水溶液和碳酸氫鈉水溶液以所述順序洗滌所述乙酸乙酯溶液，然后在硫酸鈉上干燥。過濾除去硫酸鈉后，減壓濃縮濾液并將異丙醚加到剩余物中。過濾收集所得粗晶體物，從乙酸乙酯-異丙醚中再結晶并干燥。產率41.3g(85％)旋光度[α]D25=-10.0°(c=1,EtOH)參考實施例4．Z-5-氧代-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-OEt(SEQ IDNO:8)的生產在約350ml DMF中溶解55.7g Z-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-OEt(ZTSTLE)，在約30℃，約12克5％Pd-C(濕)存在的條件下，完成氫化反應。反應完成后，過濾除去催化劑。向由此得到的濾液中加入32.6g Z-5-氧代-Pro-His-OH·1.5 H2O和27.4g HONB，冷卻到2-8℃后，加入20.5g DCC。在約8℃，攪拌混合物約60小時。在約40℃再攪拌該反應混合物約2小時，然后過濾，減壓濃縮濾液。在約60℃下，向剩余物中加入約1L乙酸乙酯。在20-25℃下攪拌混合物。過濾收集所得粗晶體，將其懸浮在DMF(約230ml)-乙酸乙酯(約530ml)中，攪拌并過濾回收。對由此得到的純化晶體(ZPGLE)無需進行干燥，而直接用于下步還原反應。參考實施例5．5-氧代-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-OEt(SEQ IDNO:9)的合成將參考實施例4中得到的ZPGLE溶解在約900ml DMF中，在約30℃，約15克5％Pd-C(濕的)存在的條件下，完成氫化反應。反應完成后，過濾除去催化劑并將濾液濃縮至約180ml，然后進行下步水解反應。參考實施例6．Z-Leu-ONP的生產將125克Z-Leu-OH和65.5g對硝基苯酚溶解在1.2L乙酸乙酯中，然后在0-5℃滴加107克DCC的乙酸乙酯溶液，并在10-25℃攪拌混合物。反應完成后，過濾除去晶體，減壓濃縮濾液。將剩余物溶解在乙醇中，過濾收集形成的晶體并真空干燥。產率142g(78％)m.p.92-94℃旋光度[α]D25=-42.5°(c=1,CH3OH)參考實施例7．Z-Arg(MBS)-Pro-NHC2H5的生產將34.1g Z-Arg(MBS)-OH·DCHA懸浮在400ml乙酸乙酯中，然后在0-10℃加入57ml 1N硫酸。攪拌混合物并靜置，用硫酸鈉水溶液洗滌有機層，并減壓濃縮。另一方面，將15.7g Z-Pro-NHC2H5溶解在30ml N,N-二甲基乙酰胺中，在2.3g 5％Pd-C存在的條件下，完成氫化反應。反應完成后，過濾除去催化劑。在濾液中溶解含Z-Arg(MBS)-OH的濃縮剩余物和9.4g HONB。向該溶液中滴加12.8g DCC的N,N-二甲基乙酰胺溶液，然后在10-20℃攪拌混合物。反應完成后，過濾除去形成的晶體并減壓濃縮濾液。將剩余物溶解在450ml乙酸乙酯中，并用1N鹽酸，氯化鈉水溶液和碳酸氫鈉水溶液以所述順連續洗滌。減壓蒸發去除乙酸乙酯，然后用乙酸乙酯-乙醇處理剩余物。從乙醇中再結晶所得到的粗晶體物并真空干燥。產率22.4g(72％)旋光度[α]D25=-33.0°(c=1,CH3OH)參考實施例8．Z-Leu-Arg(MBS)-Pro-NHC2H5(ZLAP)的生產將20.3g Z-Arg(MBS)-Pro-NHC2H5和6.4g對甲苯磺酸一水合物溶解在160ml DMF中，并在存在2.3g 5％Pd-C的條件下完成氫化反應。反應完成后，過濾除去催化劑，將3.4g三乙胺加到冰冷的濾液中。向所述混合物中加入13.6g Z-Leu-ONP，并在10-15℃攪拌混合物。反應完成后，減壓濃縮反應混合物并將剩余物溶解在120ml乙酸乙酯中。用稀釋的鹽酸、碳酸氫鈉水溶液和水連續洗滌該溶液。然后蒸發去除乙酸乙酯并將剩余物過硅膠柱。用乙酸乙酯-異丙醚(1∶1)和乙酸乙酯-甲醇(3∶2)連續展開柱，收集目的級分并將其減壓濃縮。將剩余物溶解在乙酸乙酯中，用異丙醚處理并過濾回收所得沉淀，真空下干燥。產率22.2g(92％)旋光度[α]D25=-39.0°(c=1,CH3CH2OH)實施例1．5-氧代-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-OH(SEQ IDNO:10)(PGLOH)的生產在-3至0℃，向在參考實施例5中得到的濃縮物中滴加在1L水中的8.3g氫氧化鈉溶液。在約0℃，攪拌混合物約2小時。確定反應完成后，在約0℃，通過滴加210ml 1N鹽酸來中和反應混合物。加熱溶解形成的晶體，并在加熱時加入1.5g活性炭。攪拌后，過濾除去活性炭。使濾液冷卻并在15-25℃攪拌35小時。過濾收集所得晶體，在約60℃下真空干燥。產率39.99(59.2％，以參考實施例3中所得的ZTSTLE計)旋光度[α]D25=-21.5°(c=0.5,DMF)(1)同時，在使用上述溶劑系統的反應進行1小時后，His 2-位和Ser在4-位上令人討厭的異構化在反應溫度為20℃時分別為1.3％和4.8％，而在反應溫度為0℃時分別為0.2％和0.44％。(2)盡管本發明的結晶過程可有效地除去各種結構相關的化合物，但在下文列出的所述除去效果的幾個實例主要集中在His-異構化和Ser-異構化產物上，這兩種異構化產生現最顯著相關的化合物。[表1]反應混合物 晶體[D-His2]化合物0.88％★)0.18％[D-Ser4]化合物0.44％ 0.08％★)包括在用于從肽(c)生產肽(e)之方法的片段縮合步驟中產生的[D-His2]異構體副產物。實施例2．5-氧代-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-OH(SEQ ID NO:10)(PGLOH)晶體的生產在-3至0℃，向在參考實施例5中得到的濃縮物中滴加在1L水中的8.3g氫氧化鈉溶液，在約0℃，攪拌混合物約2小時。確定反應完成后，在約0℃，通過滴加210ml 1N鹽酸來中和反應混合物。將形成的晶體通過加熱溶解，并在加熱時加入1.5g活性炭。攪拌后，過濾除去活性炭。使濾液在18-22℃老化80小時。過濾收集所得晶體，在約60℃下真空干燥。產率42.9g(63.6％，以參考實施例3中所得的ZTSTLE計)旋光度[α]D25=-21.8°(c=0.5,DMF)實施例3．5-氧代-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg(MBS)-Pro-NHC2H5(SEQ ID NO:11)(簡稱MBSTAP)的生產將35.6g ZLAP溶解在350ml DMF中，存在7.3g 5％Pd-C的條件下完成氫化反應。反應完成后，過濾除去催化劑，并將36.9g PGLOH和16.2g HONB溶解在濾液中，然后在-4至8℃滴加14克DCC的DMF溶液。在約8℃，攪拌混合物15小時，在約20℃再攪拌約30小時。反應完成后，過濾除去所得晶體，減壓濃縮濾液并將其溶解在約200ml乙醇中。然后加入2.3L乙酸乙酯，過濾回收所得晶體。將所述粗產物溶解在約220ml乙醇中，并加入約900ml乙酸乙酯。過濾回收所得固體并用二氯甲烷洗滌以得到作為濕產物的MBSTAP。無需將所述濕產物干燥，而將其直接用于下步去除MBS的反應。HPLC分析表明MBSTAP的產率為51.5g(82％)。實施例4．5-氧代-Pro-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHC2H5·CH3COOOH(SEQ ID NO:12)(簡稱TAP-144)的生產(1)MBS的去除將60克苯酚溶解在800克甲磺酸中，在冷卻下將在實施例1中所得的濕MBSTAP(相當于51.1g MBSTAP)加到所述溶液中。在約10℃，攪拌混合物5小時。
分別將690克碳酸鉀溶解在2升水中，并與約400ml乙酸乙酯混合。將該混合物冷卻到-2至0℃，以得到堿溶液。在約0℃，向所述堿溶液中滴加上述去除MBS的反應混合物。滴加完成后，放置混合物并將緩沖液(pH4)(約3升0.1N乙酸鈉和約58ml乙酸)加到上層(油-乙酸乙酯層)以溶解油。放置所述混合物并用乙酸乙酯洗滌水層。
用20％(w/w)碳酸鉀溶液調節經洗滌的水層的pH到約6，除去分離出的油以得到TAP-144水溶液。
(2)粗TAP-144的純化將上述TAP-144水溶液過DIAIONTMHP-20柱(約1.2升)。用約2.5L 0.3M乙酸鈉/水(已用乙酸將pH調到6.2)，約3L 0.025M乙酸銨/水，和4.3L 10％乙醇連續洗滌柱。此后，使9.5L 15％乙醇和9.5L 35％乙醇以所述順序通過，然后收集目的級分并減壓濃縮以除去乙醇(S1-TAP)。
將所述S1-TAP過CMTM-23柱(約1.7L)，用2升水洗滌柱后，用15升0.015M乙酸銨/水和15升0.03M乙酸銨/水連續洗脫目的化合物，收集目的級分(S2-TAP)。
將上述所得S2-TAP過DIAIONTMHP-20柱(約0.7升)。用約2.1升0.3M乙酸鈉(已用乙酸將pH調到6.2)，約3.2升0.01M乙酸銨/水，和0.7升水連續洗滌柱后，用4.3升15％乙醇和5.4升35％乙醇以所述順序洗脫。收集目的級分并減壓濃縮至約200ml。將剩余物過SephadexTMLH-20柱(約10升)，用0.005N乙酸/水洗脫。收集目的級分并用活性炭處理，超濾，濃縮并凍干以得到31.8g(67.6％)TAP-144。含量99.8g(HPLC，內標準)旋光度[α]D20=-39.0°(c=1,1％乙酸)吸收值57(281nm),55(289nm)工業實用性本發明的方法有許多優點即ⅰ)使水解步驟中His2和Ser4的異構化降至最低水平，ⅱ)可以合格的晶體形式得到肽(Ⅱ)，而且可成功地去除縮合和水解中產生的異構體副產物，ⅲ)在用鏈烷磺酸處理除去烷氧基苯磺酰基后，可以以商業規模分離產物化合物，ⅳ)可將終產物以商業規模純化，ⅴ)可以良好產率得到中間產物肽(b)，同時可以控制副產物的形成，ⅵ)可以免去中間產物肽(e)和肽(Ⅰ’)的干燥和中間產物肽(Ⅳ)的分離步驟。因此，提供了一種用于生產具有LHRH激動劑活性的肽的工業方法。序列表SEQ ID NO:1長度4個氨基酸類型氨基酸拓撲結構線性分子類型肽特征位置1其他特征Xaa=Z-Trp位置3其他特征Xaa=Tyr或Phe位置4其他特征Xaa=任選地取代的Gly-OR(R=保護基)或任選地取代的α-D-氨基酸殘基-OR(R=保護基)序列Xaa-Ser-Xaa-Xaa1SEQ ID NO:2長度6個氨基酸類型氨基酸拓撲結構線性分子類型肽特征位置1其他特征Xaa=Z-5-氧代-Pro位置2其他特征Xaa=His,Tyr,Trp或p-NH2-Phe位置5
其他特征Xaa=Tyr或Phe位置6其他特征Xaa=任選地取代的Gly-OR(R=保護基)或任選地取代的α-D-氨基酸殘基-OR(R=保護基)序列Xaa-Xaa-Trp-Ser-Xaa-Xaa1 5SEQ ID NO:3長度6個氨基酸類型氨基酸拓撲結構線性分子類型肽特征位置1其他特征Xaa=5-氧代-Pro位置2其他特征Xaa=His,Tyr,Trp或p-NH2-Phe位置5其他特征Xaa=Tyr或Phe位置6其他特征Xaa=任選地取代的Gly-OR(R=保護基)或任選地取代的α-D-氨基酸殘基-OR(R=保護基)序列Xaa-Xaa-Trp-Ser-Xaa-Xaa1 5SEQ ID NO:4長度6個氨基酸類型氨基酸拓撲結構線性分子類型肽特征位置1其他特征Xaa=5-氧代-Pro位置2其他特征Xaa=His,Tyr,Trp或p-NH2-Phe位置5其他特征Xaa=Tyr或Phe位置6其他特征Xaa=任選地取代的Gly或任選地取代的α-D-氨基酸殘基序列Xaa-Xaa-Trp-Ser-Xaa-Xaa1 5SEQ ID NO:5長度9個氨基酸類型氨基酸拓撲結構線性分子類型肽特征位置1其他特征Xaa=5-氧代-Pro位置2其他特征Xaa=His,Tyr,Trp或p-NH2-Phe位置5其他特征Xaa=Tyr或Phe
位置6其他特征Xaa=任選地取代的Gly或任選地取代的α-D-氨基酸殘基位置7其他特征Xaa=Leu,Ile,Nle位置8其他特征Xaa=已被保護的Arg位置9其他特征Xaa=Pro-NHR(R=(1)Gly-NH-R’，其中R’表示氫原子或可任選地用羥基取代的烷基或(2)NH-R”，其中R”表示氫原子，或可任選地用羥基或脲基(-NH-CO-NH2)取代的烷基序列Xaa-Xaa-Trp-Ser-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa1 5SEQ ID NO:6長度9個氨基酸類型氨基酸拓撲結構線性分子類型肽特征位置1其他特征Xaa=5-氧代-Pro位置2其他特征Xaa=His,Tyr,Trp或p-NH2-Phe位置3其他特征Xaa=Tyr或Phe位置4其他特征Xaa=選擇性取代的Gly或選擇性取代的α-D-氨基酸殘基位置7其他特征Xaa=Leu,Ile,Nle位置9其他特征Xaa=Pro-NHR(R=(1)Gly-NH-R’，其中R’表示氫原子或可任選地用羥基取代的烷基或(2)NH-R”，其中R”表示氫原子，或可任選地用羥基或脲基(-NH-CO-NH2)取代的烷基序列Xaa-Xaa-Trp-Ser-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Xaa1 5SEQ ID NO:7長度4個氨基酸類型氨基酸拓撲結構線性分子類型肽特征位置1其他特征Xaa=Z-Trp位置4其他特征Xaa=D-Leu-O-C2H5序列Xaa-Ser-Tyr-Xaa1SEQ ID NO:8長度6個氨基酸類型氨基酸拓撲結構線性分子類型肽特征位置1其他特征Xaa=Z-5-氧代-Pro位置6其他特征Xaa=D-Leu-O-C2H5序列Xaa-His-Trp-Ser-Tyr-Xaa1 5SEQ ID NO:9長度6個氨基酸類型氨基酸拓撲結構線性分子類型肽特征位置1其他特征Xaa=5-氧代-Pro位置6其他特征Xaa=D-Leu-O-C2H5序列Xaa-His-Trp-Ser-Tyr-Xaa1 5SEQ ID NO:10長度6個氨基酸類型氨基酸拓撲結構線性分子類型肽特征位置1
其他特征Xaa=5-氧代-Pro序列Xaa-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu1 5SEQ ID NO:11長度9個氨基酸類型氨基酸拓撲結構線性分子類型肽特征位置1其他特征Xaa=5-氧代-Pro位置8其他特征Xaa=已被對甲氧基苯磺酰基保護的Arg位置9其他特征Xaa=Pro-NH-C2H5序列Xaa-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Xaa-Xaa1 5SEQ ID NO:12長度9個氨基酸類型氨基酸拓撲結構線性分子類型肽特征位置1其他特征Xaa=5-氧代-Pro位置9
其他特征Xaa=Pro-NH-C2H5序列Xaa-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Xaa1 權利要求
1．生產具有下式肽5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-R4-Arg-Pro-R6(Ⅰ)其中R1表示His、Tyr、Trp或p-NH2-Phe,R2表示Tyr或Phe，R3表示任選地取代的Gly或任選地取代的α-D-氨基酸殘基，R4表示Leu、Ile或Nle,R6表示(1)Gly-NH-R7，其中R7表示氫或可任選地用羥基取代的烷基或(2)NH-R8，其中R8表示氫或可任選地用羥基或脲基(-NH-CO-NH2)取代的烷基，或者其鹽的方法，該方法包括將下式肽5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-OH(Ⅱ)其中R1,R2和R3具有與上述定義相同的含義，或者其鹽與下式肽H-R4-R5-Pro-R6(Ⅲ)其中R4和R6具有與上述相同的含義，R5表示被保護的Arg，或者其鹽反應，以產生下式肽5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-R4-R5-Pro-R6(Ⅰ’)其中R1,R2,R3,R4,R5和R6具有與上述相同的含義，或者其鹽，然后將所得肽(Ⅰ’)進行脫保護基反應。
2．根據權利要求1的方法，其中R1是His,R2是Tyr,R3是可用C1-4烷基取代的Gly、D-Leu、D-Trp、D-Val，或可用C1-4烷氧基、萘基或2-甲基吲哚基取代的D-Ser、D-Ala，或可用C7-10芳烷基取代的D-His,R4是Leu,R5是用選自下列的基團保護的Arg:C1-6烷氧基苯磺酰基、三-C1-6烷基苯磺酰基和硝基，R6是具有下式的基團NH-R8’，其中R8’是氫原子或可任選地用羥基取代的烷基。
3．根據權利要求1的方法，其中R1是His,R2是Tyr,R3是D-Leu,R4是Leu,R5是用C1-6烷氧基苯磺酰基保護的Arg,R6是具有下式的基團NH-R8”，其中R8”是可任選地用羥基取代的C1-3烷基。
4．根據權利要求1的方法，其中肽(Ⅱ)或者其鹽與肽(Ⅲ)或者其鹽的反應在大約0-40℃的溫度下進行約30-60小時。
5．根據權利要求1的方法，其中在脫保護基反應中使用酸。
6．根據權利要求5的方法，其中所述酸是C1-6鏈烷磺酸。
7．根據權利要求5的方法，其中將所述酸以肽(Ⅰ’)的約5-25倍(重量)的比例使用。
8．回收并純化權利要求1中所定義的肽(Ⅰ)的方法，該方法包括將含有油狀游離形式產物的反應混合物進行柱色譜純化，所述反應混合物是通過在存在酸的條件下，對肽(Ⅰ’)進行脫保護基反應，然后用堿中和而得到的。
9．下式肽5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-OR9(Ⅳ)其中R1是His、Tyr、Trp或p-NH2-Phe,R2是Tyr或Phe,R3是任選地取代的Gly或任選地取代的α-D-氨基酸殘基，R9是保護基，或者其鹽。
10．根據權利要求9的肽或者其鹽，其中R1是His,R2是Tyr,R3是可用C1-4烷基取代的Gly、D-Leu、D-Trp、D-Val，或可用C1-4烷氧基取代的D-Ser、D-Ala，或可用萘基或2-甲基吲哚基取代的D-Ala，或可用C7-10芳烷基取代的D-His,R9是C1-6烷基、C6-10芳基或C7-12芳烷基。
11．根據權利要求9的肽或者其鹽，其中R1是His,R2是Tyr,R3是D-Leu,R9是C1-6烷基。
12．用于生產下式肽5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-OH (Ⅱ)其中R1是His,Tyr,Trp或p-NH2-Phe,R2是Tyr或Phe,R3是任選地取代的Gly或任選地取代的α-D-氨基酸殘基，或者其鹽的方法，該方法包括水解下式肽5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-OR9(Ⅳ)其中R1,R2和R3具有與上述定義相同的含義，R9是保護基，或者其鹽。
13．下式肽5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-OH (Ⅱ)其中R1是His,Tyr,Trp或p-NH2-Phe,R2是Tyr或Phe,R3是任選地取代的Gly或任選地取代的α-D-氨基酸殘基，或者其鹽的晶體。
14．下式肽5-氧代-Pro-R1-Trp-Ser-R2-R3-OH(Ⅱ)其中R1是His,Tyr,Trp或p-NH2-Phe,R2是Tyr或Phe,R3是任選地取代的Gly或任選地取代的α-D-氨基酸殘基，或者其鹽的晶體的生產方法，該方法包括對肽(Ⅱ)或者其鹽的溶液進行老化。
15．根據權利要求14的方法，其中在溫度為約10-70℃下，將濃度為約0.01-0.05摩爾/升的肽(Ⅱ)或者其鹽的溶液老化約10-70小時。
全文摘要
以工業化規模生產具有下式肽:5－氧代－Pro－R
文檔編號C07K7/23GK1222916SQ97195678
公開日1999年7月14日 申請日期1997年6月19日 優先權日1996年6月21日
發明者畑中千年, 阿部保明, 山野光久 申請人:武田藥品工業株式會社