使用具有催化性能的咪唑(如組氨酸)官能團催化劑穩定的過渡配合物進行酰基轉移的制作方法

專利名稱：使用具有催化性能的咪唑(如組氨酸)官能團催化劑穩定的過渡配合物進行酰基轉移的制作方法
技術領域：
本發明涉及化學反應的催化作用，特別是涉及酰基轉移反應的催化作用。
背景技術：
所謂酰基轉移反應包括酰基(有機酸脫除羧基的羥基后的余下部分)的轉移，可以是在一種化學物種內部進行轉移，也可以是由一種化學物種轉移到另一種化學物種之上。例如，酰胺的形成，酯交換作用和水解作用。
眾所周知，酰基轉移反應可在水溶液中由咪唑所催化，咪唑是一種強的親核物質，可與酰基形成中間反應配合物。聚合物負載的咪唑也可用作酰基轉移反應的催化劑(參見Skjujins,A.,et al.,Latv.PSR Zinat.Akad.Vestis,Kim.Ser.1998(6),720-5)。
進一步的研究表明，含有組氨酸(His)殘基(一種含有咪唑基的氨基酸)的較小的肽具有水解活性。
最近在設計結構蛋白和肽方面的研究進展，導致了一些具有相當催化活性的肽的制備(W.F.DeGrado,Nature,365,488(1993))。例如，K.Johnsson等人在Nature,365,530(1993)中公開了一種短自締合的富含Leu-Lys的螺旋肽，它可借助在一種草酰乙酸底物和一種具有靜電降低的酸常數(Ka)的胺間的一種Schiff堿性中間體加速脫羧作用。它指出二級結構對活性是非常重要的。
本發明提供了含有一種咪唑基催化官能團的設計的催化結構的改進。
發明概述根據本發明，發現如果咪唑基位于一個化學結構中，該化學結構的一面或兩面連有一個基團，該基團性質和位置可使其能穩定咪唑基和酰基間形成的過渡配合物，則上述咪唑引發的催化活性可得到很大的提高。為實現這種穩定化作用，一個或個側面連接的基團應該能與酰基配合物分子間互作用，如利用氫鍵、靜電或疏水作用、或范德華力(分子間的極化作用)。
提高的催化活性可與有或沒有立體定向性的分子內及分子間溶液反應一起使用。如果不具有立體定向性，則使肽和其它的分子進行位點選擇官能化作用是可能的。位點選擇官能化作用將尤其能使分子進行位點選擇固定化作用，如生物分子，例如抗體或其它蛋白質或多肽。
本發明的一個目的是提供一種采用咪唑基催化劑進行酰基轉移型反應的方法。
因此，本發明的第一個方面是提供一種進行涉及酰基轉移機理的化學反應的改進方法，是在可與酰基形成過渡配合物的咪唑基催化劑存在下進行的。該方法的特征在于咪唑官能團，是由一種在其的一個面或兩面連接一個基團的包括咪唑基的化學結構單元所提供的，所述基團能通過與酰基的分子作用穩定過渡配合物。這種分子間作用可選自氫鍵、靜電作用和疏水作用。
在本方法的一個優選實施方案中，該化學結構單元構成或者部分構成一種帶有官能團的較大結構，該官能團處于鄰位，使它經過上述的中間體配合物可通過酰基轉移進行特定位置的官能化作用。
本發明的另一個目的，是提供一種可提高酰基轉移反應催化性能的化學結構單元。
因此，本發明的第二個方面，是提供一種化學結構單元，該化學結構單元構成或包括一種含有一種咪唑官能團的骨架結構，該單元的特征在于咪唑官能團通過一種側基連接在所述的骨架結構的一面或兩面上，所述側基團通過與酰基的分子間相互作用可以穩定過渡配合物。
在一個實施方案中，該結構單元可為一種分子，如肽或蛋白質，它含有一種處于鄰位的官能團，該官能團經過上述的中間體配合物通過酰基轉移實現特定位置的官能化作用。
本發明的又一個目的，是提供一種采用遺傳工程制備蛋白質或肽的方法，這種蛋白質或肽構成或包括一種帶有通過一種可穩定過渡配合物的基團連接在其一面或兩面的咪唑官能團的結構單元。
因此，本發明的第三個方面，是提供一種制備蛋白質或肽的方法，這種蛋白質或肽構成或包括一種帶有如上所述咪唑官能團的結構單元，該方法包括用含有載體和編碼所述蛋白質或肽的DNA序列的重組DNA構建體轉化宿主生物，培養宿主生物以表達所述的蛋白質或肽，并將蛋白質或肽從培養基中分離出來。
在本方法的一個優選實施方案中，結構單元是含有一種與咪唑官能團相鄰的官能團，該官能團可由咪唑官能團催化的酰基轉移實現特定位置的官能化作用。
本發明還有一個目的，是提供一種含有編碼上述蛋白質或肽的核酸序列的載體。
因此，本發明的第四個方面，是提供一種含有載體和編碼蛋白質或肽的DNA序列的重組DNA構建體，它包括上述定義的含有咪唑官能團結構單元。
在一個優選的載體實施方案中，DNA序列也編碼一種在咪唑官能團的鄰位的特定官能團，該官能團可由咪唑官能團催化的酰基轉移而被特定位置官能化。
本發明的前述的和其它的目的、方面、特點和優點，可從下面本發明的詳細說明書中得到進一步的說明，同時可加深對本發明的理解。并請參見附圖。
附圖簡要說明

圖1A和圖1B為四種設計多肽即SA-42、RA-42、PA-42(圖1A)和KO-42(圖1B)的螺旋-環-螺旋結構的示意圖，所示為它們的設計反應中心。
圖2為富馬酸單對硝基苯基酯與本發明的含有咪唑的結構(RA-42)在酰基轉移反應中，釋放對硝基苯酚的二級速率常數的對數與pH的關系曲線。點畫線表示期望的由pKa為10.4的去質子化的鳥氨酸催化的反應速率常數與pH的關系。
發明的詳細說明如上所述，本發明的目的是為了提高酰基轉移反應中的咪唑型的催化活性，它是通過提供一種其上帶有咪唑官能團的骨架結構，該骨架結構帶有在咪唑官能團的一個或兩個側面之上的側面連接基團或鏈，該側面連接基團可與所形成的咪唑-酰基配合物相互作用，從而穩定配合物。正如下面將要說明的，所期望的酰基轉移反應如酰胺化作用、酯交換作用、水解作用或硫解作用的反應速率，因而可得到相當大的提高。雖然酯類是通常的優選底物，例如酰胺和酸酐物質也是可以使用的。
此處的“咪唑官能團”可以作廣義地理解，它可包括那些具有期望的催化活性的咪唑型結構。咪唑基隨后可用不同的方法進行改性。一種有利的多功能咪唑官能團是基于氨基酸組氨酸(α-氨基-4-(或5)-咪唑丙酸)。例如咪唑官能團中的一個或兩個碳原子，可單獨地被烷基或鹵素所取代。咪唑基團也可在1位被烷基取代。烷基優選具有1-6個碳原子，尤其是1-4個碳原子，如甲基或乙基。鹵素包括氟、氯、溴和碘。
該側面連接基團包括一個鍵或鏈，如具有1-6個原子，優選地1-4個原子，通常為碳原子，它連接在端基官能團或其它的可使期望的分子與酰基過渡配合物發生相互作用的基團。
如果催化結構單元是一種肽，咪唑官能團是組氨酸殘基的一部分，則該側面連接的鏈可為其它氨基酸如選自賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸和/或組氨酸的質子供體部分的側基。
根據咪唑官能團在進行所期望的過渡配合物的穩定化作用時的最佳幾何關系，負載有催化性能的咪唑官能團的化學結構單元，優選為具有一定程度的剛性，如二級結構，以定位該側面連接基團。在一個優選的實施方案中，化學結構單元是一種具有穩定的二級結構的所謂設計多肽，如α-螺旋盤繞卷。例如，J.W.Bryson等人在Science,270,935(1995)中公開了設計螺旋肽。不過，該結構單元并不僅限于肽。相反，它可以是對本發明的技術人員來說是清楚的組成的任何一種，并包括或是其它類型的結構，如一種碳水化合物、一種天然或合成的聚合物等的一部分。化學結構的尺寸沒有限定，例如，它可以為一種少至含有五個氨基酸的肽。至于咪唑官能團和一個或多個側面連接基團間所需要的幾何關系，每個特定位置的官能團的排列，本領域技術人員閱讀了本發明即可容易地設計。
依照穩定配合物的側面連接鏈的官能團的不同，過渡配合物可與這類側面連接鏈在分子間發生相互作用。這類分子間的作用可用來選擇性的官能化肽、蛋白質和其它分子。下列給出的反應式為這類分子間反應的一個實施例。
在上述的反應式中，咪唑基結構為組氨酸(His)殘基的一部分，氨基丙基鏈為鳥氨酸(Orn)殘基的一部分，兩者均包括在設計α-螺旋多肽中相互間距離四個碳原子(即位于“i”(His)和“i+4”(Orn)),His和Orn殘基從而固定在螺旋(每圈中有4個碳原子)的同側。“I”表示一種具有活性的酯，具體是指富馬酸單對硝基酯。反應是在鳥氨酸中的氨基幾乎全部質子化的pH值下進行的，因而不能與活性酯直接進行反應。一個這類α-螺旋多肽的實施例為RA-42，如圖1A中所示的其超二級結構。RA-42具有42個氨基酸，和His-15、Orn-15和Orn-34殘基。多肽RA-42將在下列的實驗部分作更詳細的描述。
反應是從His的咪唑殘基起始進攻具有活性的酯形成一種酰基中間體開始的，同時釋放對硝基苯酚。該酰基中間體可采用鳥氨酸側鏈來穩定，該側鏈可向酰基配合物的兩端伸縮，并通過在質子化的氨基和形成的酰基氧離子之間的氫鍵與酰基配合物發生相互作用。該酰基接著從組氨酸殘基轉移到鳥氨酸殘基上，重新釋放出游離的組氨酸。
在組氨酸殘基的另一側帶有一個附加穩定化鏈也是可行的。最終形成的過渡配合物如下圖所示。
研究表明，如果組氨酸殘基連接有另外兩個組氨酸殘基(在α-螺旋情況下，在位置i+4和i-4)，則催化活性可獲得很大的提高。
相對于位置i的組氨酸殘基，酰基化作用也可在位置i-3進行(但在位置i-4、i-1、i+2和i+3不能進行)。
可作為i+4酰基化作用基團的實例，除了上述的鳥氨酸外，還有賴氨酸和1,3-二氨基丁酸，i-3酰基化作用可以用賴氨酸舉例說明。
而且，還存在可在位置i+4和位置i-3進行酰基化的官能團，例如，賴氨酸有這類官能團。
采用在位置i、j、k等具有多于一個咪唑基官能團的結構單元也是可行的，這些官能團接著在其一個或兩個側面上連接官能團，優選是分別在位置i+4、j+4、k+4等，和i-3、j-3、k-3等連接。
采用如由簡單的過渡態聯接原理所設計的經官能化的螺旋-環-螺旋基元，來催化酰基轉移反應也是可行的，優選的配合物穩定化作用是通過引入如帶正電荷的氫鍵供體，它可與帶負電荷的底物以預定的方法進行反應。在上述的情況下，在過渡態中主要的鍵合作用是酯基官能團中的氧離子的形成。這可由對乙酸硝基苯基酯看出，它有不帶負電荷的官能團，卻具有與單富馬酸對硝基苯基酯幾乎相同的催化效果，在下述的實驗中將作詳細的說明。
體現本發明的設計多肽，如上所述的那些多肽，可由重組DNA技術(遺傳工程)制備。這種技術對本領域的技術人員來說是公知的，在此不作詳細的描述。(例如，可參見EP-B1-282042中所公開的采用重組技術制備含有相鄰His殘基的融合蛋白。)上述的反應中心的選擇性，可用來在折疊多肽中引入新的官能度。在分子間的相互作用中，該穩定化的側面基團當然不是經酰基轉移而官能化的基團，但可能是位于合適位置的其它的官能團。
位點選擇官能化作用的一個重要方面是向蛋白質和肽中引入位點選擇的碳水化合物。它是通過修飾所述的碳水化合物以含酯基官能團而實現的。碳水化合物在免疫、炎癥和其它過程的識別中有重要的作用。它也可保護蛋白質以防蛋白降解，并影響蛋白質折疊。因而，碳水化合物的位點選擇引入，可用來系統地研究碳水化合物的作用。它也可用來保護藥物以防降解。
本發明的方法可用來制備疫苗，模擬免疫系統的組成，并用于構造針對免疫系統組分的拮抗劑和激動劑。
如果側鏈具有不同的反應活性，則本發明的方法也可用來在不同的位置上逐步引入不同的官能度。我們知道，這類反應在位點選擇固定化作用和構造官能化的多肽中，有非常大的潛力，如新穎的催化劑，輔因子的引入等。
一個位點選擇性固定化實施例如下圖所示，其中如上所述的螺旋-環-螺旋型設計多肽，它有一個與側面連接的氨基烷基鏈處于穩定的關系的具有催化性能的組氨酸殘基，它是經氨基官能團而固定到固態載體的酯基官能團(R1OCO)上的。反應是在這樣的pH條件下進行的，所有的氨基官能團幾乎全部被質子化，因而不能直接與酯基官能團發生反應。
在固態載體上的固定，是采用將組氨酸殘基和氨基官能團固定到固態載體，并將酯基官能團固定到肽上的方法而實現的，當然，采用其它的方法也是可行的。
該反應也可用來引入一類殘基，它在合成肽的反應條件下不能存活，或者由于空間位阻沒有足夠的活性。如果能夠引入氨基酸殘基或肽，則新的支鏈多肽結構也是可以的。由于組氨酸可以再生，可設計一種有組氨酸參與活性位點的工程催化劑。其它可能的應用包括為特異性結合的底物或受體構造具有二級或三級結構的肽的肽庫；為血液循環中特定的內源性物質的非共價鍵合構造多肽；在變態反應診斷(和臨床)和免疫學中的應用；為抗體的制備構造拓撲分子；和疫苗的制備。
下面采用一些特定設計多肽的實驗，對本發明作更詳細的描述。實施例合成具有催化性能的多肽SA-42、RA-42、PA-42、LA-42和KO-42多肽SA-42、RA-42、PA-42、LA-42和KO-42的氨基酸序列，示于說明書結束部分的序列表。其下粗體加線表示的RA-42、PA-42和KO-42的殘基是為構造具有催化性能的結合位點而設計的。采用表示氨基酸的單字母碼，其中A為Ala,D為Asp,E為Glu,F為Phe,G為Gly,H為His,I為Ile,K為Lys,L為Leu,N為Asn,P為Pro,Q為Gln,R為Arg,V為Val。Aib為α-氨基異丁酸，Nle為正亮氨酸。
就象從圖1A和1B和序列表中可以看出，該多肽為螺旋-環-螺旋基序。在溶液中肽二聚形成四螺旋束，但是為了簡潔起見，僅僅給出單體。
LA-42(圖中未畫出)除了用Lys-15替代Orn-15之外，與RA-42相同。
SA-42的合成，是采用Stewart,J.M.和Young,J.D.在SolidPhase Peptide Synthesis,Pierce Chem.Co.Rockford,Ill.1984中所述的方法制備的。多肽RA-42、PA-42、LA-42和KO-42是采用同樣的方法進行制備的，不同之處在于所用的氨基酸衍生物是位于所修飾的位置上。鳥氨酸的側鏈保護基團是2-Cl-CBZ(2-氯-芐氧羰基)。
多肽在一個自動肽合成儀(Biosearch 9600)中進行合成，采用t-BOC保護基團和苯基乙酰氨基甲基-(PAM)連接的樹脂。它們可在特氟隆真空管中用無水HF從樹脂中分離出來(肽研究公司)，并用尺寸排阻層析和反相和離子交換HPLC進行純化。采用電噴射質譜(VGAnalytical,ZabSpec)和氨基酸分析來確定肽的特性，用HPLC來檢驗純度。合成富馬酸單對硝基酯新鮮經蒸餾的富馬酰氯(0.9g,5.9mmol)溶于100ml的丙酮中，并與溶劑中的痕量的水反應30分鐘。將一小部分(0.2ml)轉移到一個干燥的國底燒瓶中，蒸發溶劑。將殘留混合物溶于CDCl3，并轉移到一個NMR管中。1H NMR光譜表明，混合物中含有富馬酰氯(7.10ppm,s)和部分水解的富馬酰氯(6.998和7.07ppm,dd,J=16Hz)。富馬酸僅少量溶于氯仿。然后，將水加入到丙酮溶液中，并重復NMR分析。將總量為54μl(3mmol)用注射器少量多次地加入，在每次加入后，用NMR光譜分析反應進行的程度。當溶液中不再含有富馬酰氯時，蒸發丙酮，所余下的油溶于50ml不含乙醇的氯仿中，并離心分離除去富馬酸。將上層清液轉移到一個圓底燒瓶，并加入1.8g新制備的在真空下加熱干燥直到變為亮橙色的對硝基苯酚酸鈉。漿料在攪拌下反應過夜，接著離心分離。固體物質用3×50ml的水萃取，該混合水相用0.3M的乙酸滴定至pH為6，并用5×30ml的CH2Cl2萃取，以除去對硝基苯酚。水相用0.3M的乙酸滴定至pH為4.3，并用5×30ml的CH2Cl2萃取。混合有機相在255K下放置過夜。收集到少量的晶體(40mg)，在干燥的氮氣流中蒸發部分溶劑后，收集到含有期望產物富馬酸單對硝基苯基酯的第二批產量(60mg)。產率沒有作進一步的優化。該產物由NMR光譜和質譜測定。測量富馬酸單對硝基苯酯知其它底物酰基轉移反應的二階速率常數富馬酸單對硝基苯基的酰基轉移反應的二階速率常數，是對于下述物質進行測定的多肽SA-42、RA-42、PA-42、LA-42和KO-42，以及4-甲基咪唑。
動力學測量是在290.2K下，在10％(v/v)四氟乙醇(TFE)和90％100mM的Bis-Tris緩沖劑中進行的，也可以是在緩沖水溶液中進行的，用配置有Cary溫度控制儀的Cary4分光光度計，依次在pH為4.1、5.1或5.85時320nm的吸收增加之后測量。將待測量的底物溶于300μl的緩沖溶液中，用0.1M NaOH的10％TFE溶液滴定至相應的pH，并離心分離。將300μl澄清的物質溶液轉移到1mm的UV試管中，并放置在UV分光計的自動調溫器中。底物經稱重后溶于緩沖溶液，用移液管移取20μl到試管中，開始反應。用定量氨基酸分析測定肽的濃度，每個速率常數取二次測量的平均值。每個動力學測量至少測定兩個半衰期，并將數據擬合為一個指數函數A+A1*e-kt。在肽過量的條件下，每種肽溶液測量兩次，然后向試管中添加第二份20μl開始第二步反應。對于RA-42，如果一經與基質反應，過量速率促進作用消失，則在第二步反應中要校正肽的濃度，以補充反應中消耗的肽。基質的總濃度為0.13mM，二級速率常數的校正是很小的，低于10％。同樣的校正也適用于PA-42的速率常數。下列表1是在10％的TFE和pH為5.85條件下獲得的速率常數和相對速率，同時給出了富馬酸單對硝基苯基酯和三氟乙醇間雙分子反應的相應數據。
表1<
>如表所示，肽RA-42、PA-42和KO-42的速率常數有相當大的提高，即這些肽與4-甲基咪唑和肽SA-42相比，表現出催化活性的顯著提高。催化活性的提高是由于前述的轉移配合物的穩定化作用所引起的。這三種肽都具有帶正電荷的氫鍵給體，其所在幾何位置可穩定在His官能團和酰基或者由酰基所形成的氧離子之間的配合物。這樣，RA-42在位置11有一個具有催化活性的His，在位置15有一個穩定的Orn。PA-42在位置15有一個His，在位置11有一個穩定的Orn。KO-42在位置11、15、19、26、30和34具有His殘基。另一方面，SA-42有一個His-15殘基，但不含有穩定化官能團。如下所述，在RA-42催化的反應中，反應產物是在Orn-15的側鏈上形成的(酰胺化作用)的酰胺。在4-甲基咪唑催化的反應中，反應產物為TFE酯(酯交換作用)。
根據上述的研究方法，對分別由多肽KO-42和4-甲基咪唑(4-MeIm)所催化的富馬酸單對硝基苯基酯的酰基轉移反應與富馬酸單對硝基苯基酯和三氟乙醇(TFE)的反應進行比較。反應是在290K和pH為4.1下，在10％(v/v)的三氟乙醇和90％濃度為100mM的乙酸鈉緩沖溶液中進行的，反應產物為TFE酯(酯交換作用)。反應結果(速率常數和相對速率)如下述的表2所示。
表2
采用一種類似方法，研究了分別由多肽KO-42和4-甲基咪唑(4-MeIm)所催化的酰基轉移到氫氧根離子之上的反應(水解作用)，在290K下，pH為5.1的濃度為100mM的乙酸鈉緩沖溶液中，對下列物質進行研究富馬酸單對硝基苯基酯、乙酸對硝基苯基酯、環戊烷二羧酸單對硝基苯基酯和D-和L-色氨酸對硝基苯基酯。反應結果如下述的表3所示。
表3
多肽RA-42和LA-42的自催化位點選擇性官能化作用將上述制備的多肽RA-42(參見序列表)在溶液中折疊形成發夾螺旋-環-螺旋基序。NMR光譜和CD光譜表明，它具有一個設計反應中心，包括His-11、Orn-15和Orn-34。RA-42與富馬酸單對硝基苯基酯反應。電噴射質譜和NMR光譜表明，最終的反應產物是位于Orn-15側鏈的酰胺。
研究濃度為0.5-1mM的肽的反應。研究表明，在自官能化反應中，His-11催化Orn-15側鏈的酰基化作用，而其它的氨基則沒有進行官能化。如下所述，反應機理包括與His-11形成一種酰基中間體，隨后位點選擇的酰基由His-11轉移到Orn-15上。
在一種類似的方法中，采用上述的技術，使N-甲基煙酸的對硝基苯基酯與RA-42反應，生成相應的煙酰胺。
在一種類似的方法中，分子式如下式所示的半乳糖衍生的對硝基苯基酯，采用上述的技術，在pH為5.85的水溶液中，與多肽LA-42反應，生成相應的酰胺。用電噴射質譜儀(ES-MS)檢測反應產物(四乙酰基衍生物)。在水溶液中水解除去乙酰基。反應中所用的對硝基苯基酯，是由標準的二環己基碳二亞胺偶聯相應的羧酸和對硝基苯酚所制備的。
反應機理的研究如上述表1所示，在pH為5.85的10vol％的TFE中，RA-42的二級速率常數為2.8*10-2M-1s-1，它比相應的乙胺與乙酸對硝基苯基酯的反應速率高出1000多倍(Knowles,J.R.，等人，J Chem.Soc.Commun.,1967,755-757)。從表1還可看出，由His-11所催化的RA-42反應，是相同條件下由4-甲基咪唑所催化的反應的8.3倍。在水溶液中，RA-42的二級速率常數為5.07*10-2M-1s-1，而4-甲基咪唑的為1.05*10-2M-1s-1，即觀察到的速率提高了約5倍，幾乎與在10vol％的TFE中相同。
在290.2K下50mM的Bis-Tris溶液中，測定酰基轉移反應二級速率常數與pH的關系。圖2所示，為二級速率常數的對數與pH的關系曲線。反應對肽的濃度是一級反應。由圖2可知，隨著pH值的增大，二級速率常數也增大，這表明該反應取決于去質子形式的氨基酸殘基。如果產物是由Orn-15與富馬酸對硝基苯基酯直接反應而制得的，則二級速率常數的對數與pH在5-8范圍內有線性的對應關系，而鳥氨酸殘基的側鏈的pKa可能在10-11之間(Tanford,C.,Adv.Protein Chem.1962,17,69-165)。不過，觀察到的pH值證實該反應機理，并表明反應取決于pKa接近6.5的氨基酸殘基。
RA-42的氨基酸序列中含有可離子化的殘基Asp、Glu、Arg、Orn、Lys和His，以及肽骨架的C端的羧酸和N端的氨基。常用較小肽中可離子化的氨基酸殘基的pKa已經測定出來(Tanford,C.,1962，如上所述)，在RA-42中pKa值接近6.5的氨基酸只有His，其pKa為6.4。His-11側鏈的相應酸的pKa用1H NMR光譜進行測定(在290K下，采用不同單位的500NMR光譜，測定組氨酸芳烴中質子化學位移隨pH的變化關系)，研究發現，水溶液中pKa為6.55。因而，可以得出結論，由His-11的最初進攻而引起的富馬酸對硝基苯基酯的起始酰基轉移反應，可生成一種酰基中間體，并形成一種有反應活性的咪唑烷(imidazolide)。觀察到的pH依賴關系也表明第一步驟為限速步驟。
4-甲基咪唑鎓離子的pKa已有測定，發現在水溶液303K下為7.95。在不依賴pH的范圍內，二級速率常數可由pH值為5.85時所測得的數據計算而得，結果為1.33M-1s-1。在不依賴pH的范圍內，RA-42的二級速率常數可由pKa為6.55測得的數據通過計算而得，在pH為5.85時，二級速率常數為0.305。因而，在不依賴pH的范圍內，4-甲基咪唑的二級速率常數為RA-42速率常數的4.4倍。
但是，根據布朗斯特關系式(1)logk2=β*pKa+A (1)(對于乙酸對硝基苯基酯的咪唑催化水解來說，β為0.8；Bruice,T.C.，等人，J.Am.Chem.Soc.1958,80,2265-2267)和如上所述的pKa值，4-甲基咪唑的二級速率常數預期為RA-42速率常數的13.2倍。因而，肽RA-42可3倍地催化His-11酰基化作用，可能主要是由于Orn-15側鏈穩定過渡態中所形成的氧離子而引起的。
如上所述，在pH為5.85時，觀察到的RA-42的速率試劑約為4-甲基咪唑的5倍。額外提高的速率是由于較強的親核試劑4-甲基咪唑，比His-11側鏈的質子化程度更高。在pH為5.85時，如果總濃度相同，則未質子化的His-11的濃度為未質子化4-甲基咪唑的21倍。這樣，如果速率提高僅僅只受濃度的影響，則在pH為5.85時，RA-42應該是一種更為有效的催化劑，只提高1.6倍(21/13.2)。因而，觀察到的速率提高應該歸因于過渡態的穩定化作用和pKa的降低，這兩種因素通常用來解釋自然存在的催化劑。
由于最終產物為在Orn-15側鏈上的酰胺，第二步反應是一種快速的分子間反應，酰基從His-11轉移到去質子化型的Orn-15之上。分子間反應的速率提高是很高的，由于在反應條件下，在1H NMR光譜中沒有檢測到中間體，但不能對它進行測定，因為His-11的酰基化為限速步驟。快速分子間反應且中間體沒有發生聚集，與觀察到的RA-42的一級動力學也是一致的。
如上所述，在一個高度選擇的反應中，RA-42的組氨酸殘基在Orn-15的側鏈引入一個官能團，反應后又重新釋放出游離組氨酸。而另一種鳥氨酸，Orn-34，則不能形成酰胺，也沒有相鄰的組氨酸殘基。His-11與Lys-10鄰近，從而占據了空間，在反應條件下，它也不能形成酰胺。
當然，本發明并不局限于上述特定的實施方案，但可以有不遠離本發明主要思想的許多改進和變化，如下列的權利要求書如述。
序列表N-Aib-A-D-Nle-E-A-A-I-K-A-L-A-E-H-Nle-Aib-A-K1 19G-P-V-D20 23G-Aib-R-A-F-A-E-F-A-K-A-L-Q-E-A-Nle-Q-A-Aib42 24SA-42N-Aib-A-D-Nle-E-A-A-I-K-H-L-A-E-Orn-Nle-Aib-A-K119G-P-V-D20 23G-Aib-R-A-F-A-E-F-Orn-K-A-L-Q-E-A-Nle-Q-A-Aib4224RA-42N-Aib-A-D-Nle-E-A-A-I-A-Orn-L-A-E-H-Nle-Aib-A-K119G-P-V-D20 23G-Aib-R-A-F-A-E-F-Orn-A-A-L-Orn-E-A-Nle-Q-A-Aib42 24PA-42N-Aib-A-D-Nle-E-A-A-I-K-H-L-A-E-H-Nle-Aib-A-H1 19G-P-V-D20 23G-Aib-R-A-F-A-E-F-H-K-A-L-H-E-A-Nle-H-A-Aib42 24KO-4權利要求
1．一種進行試劑和底物間化學反應的方法，包括一種酰基轉移機理，是在一種可與底物形成一種過渡配合物的咪唑基催化劑存在下進行的，其特征在于具有催化性能的咪唑官能團，是由一種含有一種非必須取代的咪唑基團的化學結構單元提供的，咪唑基團在一個或兩個側面連接有可通過與酰基的分子間相互作用穩定該過渡配合物的一種或多種基團。
2．權利要求1所述的方法，其特征在于分子間相互作用選自氫鍵、靜電相互作用和疏水相互作用。
3．權利要求1或2所述的方法，其特征在于側面連接基團含有一個帶有1-6個鏈原子鍵或鏈，優選為C1-4烷基鏈，連接在一個可與過渡配合物進行所述的分子間相互作用的端基上。
4．權利要求1、2或3所述的方法，其特征在于選擇pH條件使所述的酰基轉移反應中的將要與底物進行反應的試劑能被質子化到一個相當高的程度。
5．權利要求1-4任一項所述的方法，其特征在于所述的側面連接基團是一種帶正電荷的氫鍵給體。
6．權利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于所述的化學結構單元是一種具有足夠剛性的結構，其可使咪唑基和一個或多個側面連接基團以幾何位置相對固定的關系進行排列。
7．權利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于所述的化學結構單元是一種肽或多肽。
8．權利要求1-7任一項所述的方法，其特征在于所述的咪唑官能團是由一種非必須取代的組氨酸殘基所提供的。
9．權利要求7或8所述的方法，其特征在于所述的化學結構單元是一種設計蛋白質或多肽的一部分，如螺旋-環-螺旋型。
10．權利要求7、8或9所述的方法，其特征在于所述的化學結構單元是α-螺旋型，而且，相對位于位置i的咪唑官能團，有一個側面連接基團排列在位置i+4處。
11．權利要求7-10任一項所述的方法，其特征在于所述的化學結構單元是α-螺旋型，而且，相對位于位置i的咪唑官能團，有一個側面連接基團排列在位置i-3處。
12．權利要求7-11任一項所述的方法，其特征在于所述的側面基團選自組氨酸、鳥氨酸、賴氨酸和精氨酸。
13．權利要求1-12任一項所述的方法，其特征在于所述的化學結構單元構成或部分構成帶有一個官能團的較大結構，所述官能團處在這樣的鄰位使它可被底物通過所述的酰基轉移經分子間反應的過渡配合物而被選擇官能化。
14．權利要求13所述的方法，其特征在于所述的官能團是所述的側面連接基團或其中之一。
15．權利要求14所述的方法，其特征在于所述的官能團相對位于位置i的咪唑官能團排列在位置i+4處，且是一種鳥氨酸、賴氨酸或二氨基丁酸殘基。
16．權利要求14或15所述的方法，其特征在于所述的官能團相對位于位置i的咪唑官能團排列在位置i-3處，且是一種賴氨酸殘基。
17．權利要求15和16所述的方法，其特征在于所述的官能團相對位于位置i的咪唑官能團，是位于位置i+4和i-3處；官能團是例如賴氨酸。
18．權利要求15-17任一項所述的方法，其特征在于所述的結構單元提供多于一種咪唑官能團，其中每個咪唑官能團可與官能團在其一個或兩個側面連接。
19．權利要求18所述的方法，其特征在于所述的官能團相對位于位置i、j、k等處的咪唑官能團位于位置i+4、j+4、k+4等處。
20．權利要求18所述的方法，其特征在于所述的官能團相對位于位置i、j、k等處的咪唑官能團位于位置i-3、j-3、k-3等處。
21．權利要求12-20任一項所述的方法，其特征在于所述的官能團是由含碳水化合物的殘基進行選擇官能化的。
22．權利要求12-21任一項所述的方法，其特征在于所述的底物置于一種固體載體上的，從而將化學結構單元固定在載體之上。
23．一種由權利要求1-20任一項所述的方法所定義的設計化學結構單元。
24．一種用于涉及一種酰基轉移機理反應的化學催化劑，其特征在于該催化劑含有一種由權利要求1-20所述的任一方法所定義的化學結構單元。
25．一種制備含有一種由權利要求7-20和22任一項所述方法所定義的化學結構單元的蛋白質或肽的方法，其特征在于該方法包括用含有一種載體和一種編碼所述結構單元的DNA序列的重組DNA構建體轉化宿主生物，培養宿主生物以表達所述的肽、多肽或蛋白質，并將后者從培養物中分離出來。
26．一種重組DNA構建體，其含有一種載體和一種編碼權利要求7-23任一項所述的方法所定義的化學結構單元的DNA序列。
27．一種在化學化合物的特定位置引入所期望的化學官能團的方法，其特征在于提供具有一種由權利要求1-23任一項所述的方法所定義的結構單元的化學化合物，并使該化合物與一種可提供所期望官能團的底物進行反應。
28．權利要求27所述的方法，其特征在于底物含有一種碳水化合物殘基。
29．權利要求28所述方法在防止蛋白質的蛋白降解中的用途。
30．權利要求28所述方法在影響蛋白質折疊中的用途。
31．權利要求17-20任一項所述的方法的用途，其特征在于可對多于一個官能團進行選擇官能化。
32．權利要求17-20任一項所述的方法的用途，其特征在于所述的官能團是被含有碳水化合物殘基所選擇官能化的。
33．權利要求17-22、31和32任一項所述的方法在疫苗制備中的應用。
34．權利要求12-22、31和32任一項所述的方法在模擬天然存在的免疫系統組分中的應用。
35．權利要求17-22、31和32任一項所述方法在為免疫系統的組分構造拮抗劑中的用途。
36．權利要求17-21、31和32任一項所述的方法在為免疫系統的組分構造激動劑中的用途。
37．權利要求34所述的方法在免疫系統拮抗劑的結構單元的制備中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種進行試劑和底物間化學反應的方法,包括一種酰基轉移機理,是在一種可與底物形成一種過渡配合物的咪唑基催化劑存在下進行的。具有催化性能的咪唑官能團,是由一種含有一種非必須取代的咪唑基團的化學結構單元提供的,非必須取代的咪唑基團在其一個或兩個側面連接有可通過與酰基的分子間相互作用可穩定該過渡配合物的一種或多種基團。本發明還涉及這類設計化學結構單元以及采用重組DNA技術和其載體制備結構單元的方法。
文檔編號C07K1/10GK1225641SQ9719551
公開日1999年8月11日 申請日期1997年5月13日 優先權日1996年5月14日
發明者P·阿爾伯格, L·巴爾澤 申請人:A+科學投資股份公司