用TNFR-Ig治療哮喘的制作方法

專利名稱：：用TNFR-Ig治療哮喘的制作方法哮喘是呼吸道的一種慢性發(fā)炎性疾病，其特征在于因接觸特異性過敏原(IgE介導的反應)，鍛煉，冷空氣或緊張而復發(fā)加重。與哮喘病相關的發(fā)炎特點是存在激活的嗜酸細胞，呼吸道對非特異性刺激的敏感性增加(呼吸道過敏反應AHR)，水腫，粘液分泌過多和咳嗽。相信該發(fā)炎過程部分地由分泌各種細胞因子的Th2型淋巴細胞的產生和激活介導。細胞因子TNFα是涉及引起哮喘癥狀的一種細胞因子。復合治療劑用于治療哮喘，使用吸入β2的興奮劑(緩解急性支氣管痙攣)和作為選擇試劑的類固醇(抗發(fā)炎)。然而，據認為沒有一種治療方案是足夠有效的，但是該疾病的死亡率在逐漸增加。最迫切的醫(yī)學需要之一是需要一種可迅速逆轉在急性/嚴重哮喘中所見的嚴重發(fā)作的肺炎的試劑。另外，沒有一種治療劑可歸入疾病緩解劑。必然需要一種可迅速逆轉急性/嚴重哮喘中所見的發(fā)炎反應的藥物以及作為真正的疾病緩解劑的試劑。TNFα的作用是啟動哮喘癥狀，而申請人確定抑制TNFα的作用提供了緩解這些癥狀的途徑。現在申請人發(fā)現了一種在患有哮喘癥狀的病人中抵抗哮喘的方法，包括給所述的病人施用含有由一種或多種嵌合的TNFα結合蛋白組成的制品的組合物，所述的制品中的各蛋白質由融合到IgG上的p55TNF受體蛋白的可溶部分組成，其中所述的融合的IgG含有除了IgG重鏈恒定區(qū)的第一IgG結構域之外的所有IgG結構域，所述的組合物含有治療上的惰性載體，且所述組合物施用給所述病人以便給病人提供有效量的所述嵌合蛋白制品以抵抗所述的哮喘癥狀。該組合物可以有效地施用給患有哮喘病的病人，其中嵌合蛋白制品以足以緩解所述的疾病的影響的量來施用。該組合物也可以在哮喘病發(fā)作前以有效防止或延緩所述的疾病發(fā)作的量施用給哮喘病人。本發(fā)明涉及通過給病人施用含有由一種或多種嵌合的TNFα結合蛋白組成的制品的組合物在患有哮喘癥狀的病人中抵抗哮喘的方法。該制品中的蛋白質由融合到IgG(免疫球蛋白G)上的p55TNF受體蛋白的可溶部分組成(TNFR-Ig)，其中該IgG含有除了IgG重鏈恒定區(qū)的第一結構域之外的所有結構域。該組合物還含有治療上的惰性載體。將該組合物施用給所述的病人以便給病人提供有效量的嵌合蛋白制品以抵抗所述的哮喘癥狀。由融合到IgG上的p55TNF受體蛋白的可溶部分組成的嵌合TNFα結合蛋白用于制備治療哮喘的藥物是本發(fā)明的另一目的，其中所述的融合IgG含有除了IgG重鏈恒定區(qū)的第一IgG結構域之外的所有IgG結構域。該組合物以足以緩解哮喘發(fā)作的影響的蛋白質制品的量有效施用給處于哮喘病發(fā)作期間的病人。該組合物也可以在哮喘病發(fā)作前以有效防止或延緩該疾病發(fā)作的蛋白質制品的量施用給哮喘病人。任何TNFR-Ig，即由融合到IgG上的p55TNF受體蛋白的可溶部分組成的嵌合TNFα結合蛋白可用于本發(fā)明的制品以便在具有上面段落所述哮喘癥狀的病人中抵抗哮喘，其中所述的融合IgG含有除了IgG重鏈恒定區(qū)的第一IgG結構域之外的所有IgG結構域。IgG可以是人IgG1或IgG3，在本發(fā)明中優(yōu)選IgG1。該TNFR-Ig的例子包括在EP417563；美國專利號5,447,851和5,395,760；Lesslauer等，歐洲免疫學雜志,21(11):2883,1991；Loetscher等，生物學化學雜志，266(27):18324,1991；Ashkenazi等，美國國家科學院院報，88:10535,1991中公開的蛋白質，它們也可用在這些文獻中公開的方法獲得。優(yōu)選的本發(fā)明的TNFR-Ig分子的制品用IgG1制備并包含具有以一個或多個唾液酸殘基終止的復合寡糖并具有暴露的N-乙酰葡糖胺的蛋白質，制品中唾液酸殘基的摩爾比為每摩爾蛋白質大約4至大約7摩爾唾液酸，尤其是大約5至大約6，制品中暴露的N-乙酰葡糖胺的摩爾比是每摩爾蛋白質從大約1至大約2摩爾N-乙酰葡糖胺，制品中唾液酸殘基與N-乙酰葡糖胺殘基的摩爾比是從大約0.35至大約0.5，尤其是大約0.4至大約0.45。制品的等電點(pI)是從大約5.5至大約7.5，可用層析聚焦測定并對神經氨酸酶處理敏感。本發(fā)明的TNFR-Ig可用重組技術或蛋白質合成的常規(guī)方法獲得。編碼p55TNF受體的DNA，編碼除了第一IgG1或IgG3重鏈恒定區(qū)之外的所有結構域的DNA，且將這些序列連接在一起用于在合適的載體中表達對技術人員而言是已知的且在文獻中進行了描述。合適的克隆載體和宿主細胞是熟知的且可由技術人員進行選擇，而且已測定了合適的培養(yǎng)條件(見動物細胞培養(yǎng)實踐探索，第2版，Rickwood和Hames編輯，牛津大學出版社，NY1992)。然后可使用已知的蛋白質回收和純化方法純化TNFR-Ig。TNFR-Ig盡管也可以從宿主細胞裂解產物中回收，但優(yōu)選從培養(yǎng)基中作為分泌的多肽回收。可離心細胞培養(yǎng)基或裂解產物以去掉顆粒狀的細胞碎片。隨后從有雜質的可溶性蛋白質和多肽中純化TNFR-Ig，下面的程序作為合適的純化程序的例子在免疫親和或離子交換柱上分離；乙醇沉淀；反向HPLC；在二氧化硅或諸如DEAE的陽離子交換樹脂上層析；層析聚焦；SDS-PAGE；硫酸銨沉淀；使用例如，SephadexG-75，和蛋白A瓊脂糖柱凝膠過濾以去掉諸如IgG的污染物。諸如苯甲基磺酰氟(PMSF)的蛋白酶抑制劑也可用于抑制純化期間的蛋白水解的降解。本領域的技術人員可預料到適合于目的多肽的純化方法需要根據在重組細胞培養(yǎng)物中表達的多肽的特征的變化進行修改。具有特定pI及唾液酸和N-乙酰葡糖胺比率的本發(fā)明的TNFR-Ig可通過使用重組哺乳動物細胞表達TNFR-Ig并按例如WO96/39488所述控制哺乳動物細胞產生TNFR-Ig的培養(yǎng)條件獲得。選擇的宿主細胞應能夠將N-和O-連接的包括唾液酸的糖類連接到它們表達的蛋白質上。一個這種宿主細胞的例子是CHO細胞。合適的培養(yǎng)條件是熟知的且依賴于所選的宿主細胞。在糖蛋白生產期間增加細胞特定產量導致成熟蛋白質唾液酸含量降低，反之亦然。影響細胞特定產量的因素在本領域是熟知的，且包括但不限于，影響DNA/RNA拷貝數的因素，影響RNA的因素，如穩(wěn)定RNA的因素，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分和其它補充物，轉錄增強子濃度，培養(yǎng)物環(huán)境的重量摩爾滲透壓濃度，細胞培養(yǎng)物的溫度和pH值等。這些因素可用熟知的方法進行調節(jié)以獲得諸如唾液酸的糖蛋白的優(yōu)選含量。通過向細胞培養(yǎng)物中以大約0.1mM至大約20mM，或5至20mM的濃度加入鏈烷酸，如丁酸鈉或其鹽，并保證細胞培養(yǎng)物的重量摩爾滲透壓濃度在大約250至600mOsm之間，最好在過渡期間互相組合改變細胞培養(yǎng)物生產期的細胞特定產量來生產具有不同唾液酸量的蛋白質。大約6.0mM丁酸鈉的濃度和350-400mOsm的條件提供本發(fā)明的高度唾液酸化的TNFR-Ig，而大約12mM丁酸鈉的濃度提供本發(fā)明的較低唾液酸化的TNFR-Ig。后一濃度可與450-550mOsm的條件組合。技術人員將認識到培養(yǎng)基的重量摩爾滲透壓濃度依賴于培養(yǎng)液中的滲透的活性顆粒濃度，和配制哺乳動物復合細胞培養(yǎng)基的許多變量會影響重量摩爾滲透壓濃度。培養(yǎng)基的組成決定培養(yǎng)基的起始重量摩爾滲透壓濃度。使用滲透壓計，例如FisherScientific,Pittsburgh,Pennsylvania以商標名OSMETTE銷售的滲透壓計(或可從精密系統(tǒng)公司，NatickMA獲得的Osmette2007型)測量重量摩爾滲透壓濃度。為了獲得所需范圍的重量摩爾滲透壓濃度，可調節(jié)培養(yǎng)基中各組成成分的濃度?？稍谂囵B(yǎng)基中加入溶質以增加其重量摩爾滲透壓濃度，該溶質包括蛋白質，肽，氨基酸，諸如蛋白胨的水解動物蛋白質，非代謝多聚體，維生素，離子，鹽，糖類(特別是葡萄糖)，代謝產物，有機酸，脂類等。在一個實施方案中，通過在補料分批培養(yǎng)程序期間向細胞培養(yǎng)物中加入蛋白胨以及其它培養(yǎng)基成分控制重量摩爾滲透壓濃度?？墒褂眉毎囵B(yǎng)的三個時期，生長期其中選定的哺乳動物宿主細胞的細胞生長最快；接著是過渡期，其中選擇并應用如上所述的為得到成熟糖蛋白所需唾液酸含量的細胞培養(yǎng)參數；隨后是生產期，其中保持過渡期選擇的參數，生產并收獲糖蛋白產物。關于在本發(fā)明說明書中優(yōu)選的純化，可以是選擇來用于本發(fā)明的糖類的純化技術和方法?？赏ㄟ^例如，離子交換軟凝膠色譜或使用陽離子或陰離子交換樹脂的HPLC，針對含唾液酸的分子富集本發(fā)明的所需糖形式，其中收集酸性更強的餾分。本發(fā)明優(yōu)選的TNFR-Ig在純化組合物中具有一個或多個下列特征TNFR-Ig組合物的pI范圍在大約5.5至大約7.5之間，唾液酸與蛋白質的摩爾比為大約4至大約7，尤其是大約5至大約6，具有每摩爾蛋白質大約1至大約2摩爾的暴露的N-乙酰葡糖胺殘基，具有大約0.35至大約0.5且更優(yōu)選的是大約0.4至大約0.45的唾液酸與N-乙酰葡糖胺的摩爾比。獲得該優(yōu)選的TNFR-Ig的最合適的條件是采用的丁酸鈉濃度為大約0.1mM至大約6mM，重量摩爾滲透壓濃度維持在大約300至450mOsm之間，溫度在大約30℃和37℃之間的培養(yǎng)條件。技術人員使用熟知的技術可測定TNFR-Ig的上述特征。例如，如果需要，用本發(fā)明方法生產的糖蛋白的復合糖類部分容易用糖類分析的常規(guī)技術分析。因此，例如，在本領域熟知的技術，如凝集素印跡揭示了末端甘露糖或諸如半乳糖的其它糖類的比率。通過使用脫水酰肼或酶學方法從蛋白質釋放糖并經離子交換或大小排阻層析或其它本領域熟知的方法分離寡聚糖可證實單-，雙-，三-，四-支寡聚糖由唾液酸的終止。也可在用神經氨酸酶處理去掉唾液酸之前和之后測定糖蛋白的pI。神經氨酸酶處理后pI增加表明在糖蛋白上存在唾液酸。本發(fā)明的糖類結構出現在表達為N-連接的或O-連接的糖類的蛋白質上。N-連接的和O-連接的糖類主要區(qū)別在其核心結構上。N-連接的糖基化指通過GlcNAc將糖部分連接到肽鏈的天冬酰胺殘基上。N-連接的糖類也含有共同的核心結構Man1-6(Man1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-R。因此，在所述的核心結構中，R代表生產蛋白的天冬酰胺殘基。生產的蛋白質的肽序列會含有天冬酰胺-X-絲氨酸，天冬酰胺-X-蘇氨酸，和天冬酰胺-X-半胱氨酸，其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸。相反，O-連接的糖類其特征在于一個共同的核心結構，它是附著于蘇氨酸或絲氨酸羥基上的GalNAc。在N-連接的和O-連接的糖類中，最重要的是N-和O-連接的復合糖類。該復合糖類含有一些分支結構。單-，雙-，三-和四-外側結構對于增加末端唾液酸是重要的。這樣的外側鏈結構提供了特異性糖的附加位點和包含本發(fā)明的糖類的鍵。以包括本文所述的那些方法的本領域已知的任何方法可分析所得的糖類。用于糖基化分析的一些方法在本領域是已知的并在本發(fā)明的內容中是有用的。該方法提供了關于連接于肽上的寡聚糖的相同性和組成的信息。在本發(fā)明中有用的糖類分析方法包括但不限于凝集素層析；使用高pH值陰離子交換色譜的HPAEC-PAD以電荷為基礎分離寡聚糖；NMR；質譜分析法；HPLC；GPC；單糖組成分析；順序酶消化。另外，釋放寡聚糖的方法是已知的。這些方法包括1)酶，通常使用肽-N-糖苷酶F/內切-β-半乳糖苷酶進行；2)使用強堿性環(huán)境以釋放主要的O-連接結構消除法；和3)使用脫水酰肼以釋放N-和O-連接的寡聚糖的化學方法?？墒褂孟铝胁襟E進行分析1．用去離子水透析樣品以去掉所有的緩沖鹽，隨后凍干。2．用脫水酰肼釋放完整的寡聚糖鏈。3．用無水的含甲醇的HCl處理完整的寡聚糖鏈以O-甲基衍生物釋放單個的單糖。4．任意第一氨基的N-乙酰化。5．衍生化以提供高-O-三甲基硅烷基甲基糖苷。6．通過在CP-SIL8柱上毛細GLC(氣-液色譜)分離這些衍生物。7．用從GLC的滯留時間和質譜分析與已知標準相比來鑒定單個的糖苷衍生物。8．用內部標準(13-O-甲基-D-葡萄糖)以FID定量單個衍生物。以高效陰離子交換色譜結合脈沖安培計檢測(HPAE-PAD糖類系統(tǒng)，Dionex公司)可測定中性和氨基糖。例如，通過在20％(v/v)三氟乙酸中100℃水解6小時可釋放糖類。然后通過凍干或用Speed-Vac(SavantInstruments)干燥水解產物。然后將殘留物溶于1％三水乙酸鈉溶液中并按Anumula等(生化年鑒195:269-280(1991)〕所述在HPLC-AS6柱上分析?？稍谝皇饺輼悠分杏肶ao等(生化年鑒，179:332-335(1989)〕的直接比色方法分別測定唾液酸。在優(yōu)選的實施方案中，使用Warren,L.生物化學雜志238:(8)(1959)的硫代巴比妥酸(TBA)。作為選擇，可進行免疫印跡糖類分析。根據該方法，使用根據Haselbeck和Hosel[Hasebeck等，糖偶聯物雜志，7:63(1990)]所述的氧化免疫印跡方法的商用聚糖檢測系統(tǒng)(Boehringer)檢測蛋白質結合的糖類。按照廠家推薦的染色方案，除了蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯膜上代替硝酸纖維素膜之外，封閉緩沖液在10mMTris緩沖液(pH7.4)和0.9％氯化鈉中包含了5％牛血清白蛋白。檢測用在tris緩沖鹽水中1∶1000稀釋的與堿性磷酸連接物(Boehringer)連接的抗洋地黃毒苷抗體進行，使用在含100mM氯化鈉和50mM氯化鎂的100mMTris緩沖鹽水(pH9.5)中的磷酸酶底物，0.03％(w/v)4-氮藍四唑氯，和0.03％(w/v)5-溴-4氯-3-吲哚-磷酸。通常在大約10至15分鐘內觀察含糖的蛋白質帶。也可通過用肽-N-糖苷酶F消化分析糖類。根據該方法，殘留物懸浮于14μl含0.18％SDS,18mMβ-巰基乙醇，90mM磷酸鹽，3.6mMEDTA,pH8.6的緩沖液中，在100℃加熱3分鐘。冷卻到室溫后，樣品分成兩份相等的部分。一個等分樣品不作進一步處理并用作對照。第二部分調節(jié)到含有大約1％NP-40去污劑，接著加入0.2單位的肽-N-糖苷酶F(Boehringer)。兩份樣品在37℃保溫2小時，然后用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。本發(fā)明的TNFR-Ig包含PEG化的TNFR-Ig，它是指共價連接到諸如聚(亞烷基)二醇(取代的或未取代的)，特別是聚乙二醇的多聚體上的TNFR-Ig分子。連接可以是直接的，但優(yōu)選借助于本領域已知的各種偶聯劑來實現，例如在EP510346，EP593838，美國專利號4,766,106,4,917,888,4,902,502,4,847,325,4,179,337,5,832,657,Veronese等，應用生物化學和生物技術，11:141(1985)和Monfardini等，生物偶聯化學6:62(1995)中所公開的那些偶聯劑。PEG化的TNFR-Ig可以正如對TNFR-Ig所述的，用于哮喘治療和預防。本發(fā)明的TNFR-Ig制品對于在哮喘病人中抵抗哮喘有用。在治療具有哮喘病的病人時，這些制品可減輕疾病影響，如逆轉已經發(fā)生的炎癥，防止出現進一步的炎癥。當以預防的方式提供時，這些制品可延緩或防止哮喘病的發(fā)作，或當疾病發(fā)生時，保證疾病的嚴重性降低。根據本發(fā)明，該制品可按任何常規(guī)方式施用給病人用于治療或預防。因此本發(fā)明的制品可在常規(guī)藥用組合物中施用，該組合物包括任何常規(guī)治療上的惰性載體。該藥用組合物可含有惰性的和藥物動力學上有活性的添加劑。液體組合物可采用例如，與水混合的無菌溶液的形式。另外，也可有常規(guī)用作保護，穩(wěn)定，保濕和乳化劑的物質以及改變滲透壓的物質，如鹽，改變pH值的物質，如緩沖液和其它添加劑。如果需要，在藥用組合物中可包括諸如生育酚，N-甲基-γ-生育胺，丁基化羥基苯甲醚或丁基化羥基甲苯的抗氧化劑。用于組合物的藥學上可接受的賦形劑或載體包括鹽水，緩沖鹽溶液，葡萄糖或水。組合物也可包括特定的穩(wěn)定劑，例如糖，包括甘露糖和甘露醇，以及用于適合組合物(indictablecomposition)的局部麻醉劑，包括，例如，利度卡因鹽酸鹽。前面提到的載體物質和稀釋劑可以是有機或無機物質，例如，水，明膠，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，滑石粉，阿拉伯膠，聚(亞烷基)二醇等。前提是用于生產藥用組合物的所有佐劑和物質是無毒的。本發(fā)明的制品可經胃腸外(例如，通過皮下，靜脈內，肌肉內，眼眶內，囊內的，脊柱內，胸骨內的注射)或噴霧吸入施用?？墒褂糜糜谀c胃外或噴霧吸入用藥的任何常規(guī)藥用制品。合適的藥用組合物的例子是輸注或注射溶液。優(yōu)選的用藥方式是通過靜脈內注射。另一優(yōu)選的用藥方式是用氣溶膠。可使用任意有效量的抗哮喘的本發(fā)明的制品以減輕或逆轉疾病的影響或以防止或延緩疾病的發(fā)作。用于治療，防止或逆轉哮喘的本發(fā)明的用于腸胃外(注射)用藥的TNFR-Ig組合物的優(yōu)選劑量是每病人每千克體重大約0.1到大約5.0mg的TNFR-Ig制品(mg/kg)。特別優(yōu)選的劑量是從大約1.0到大約3.0mg/kg。用于相同目的且在噴霧用藥中的TNFR-Ig組合物的優(yōu)選劑量是占TNFR-Ig制品重量的0.03％至5.0％。在任一用藥方式中，治療劑量可在每個治療日中用藥一次，或分成更小的劑量在大約24小時期間內用藥以達到總的所給劑量。為了經腸胃外用藥快速治療哮喘病，可提供每病人每天0.1至5.0，特別是1.0-3.0mg/kg的單次劑量。為了經腸胃外用藥預防哮喘，根據病人和狀態(tài)的不同從每天的間隔，但優(yōu)選以從每周兩次到每周一次到每月一次或其它間隔期間優(yōu)選提供0.1至5.0，特別是1.0-3.0mg/kg的這種劑量。同樣，對于經噴霧用藥快速治療哮喘病，可每天吸入單次劑量。對于預防，根據病人和狀態(tài)的不同以每天的間隔，但優(yōu)選以從每周兩次到每周一次到每月一次或以其它間隔期間吸入這一劑量。施用組合物的精確劑量可根據使用的類型，使用的方式和病人的要求按技術人員的測定而變化。用于病人的精確劑量可由技術人員考慮癥狀的嚴重性，所用的具體配方和可能包含的其它藥物作具體修改。本發(fā)明的噴霧組合物可以是液體和粉末。它們可以通過鼻或通過口(鼻內或口腔)用藥。噴霧組合物的一個例子是可針對鼻和口的噴霧劑，它由通過對TNFR-Ig制品的水或鹽溶液的機械作用從噴霧器產生。另一個例子是霧化噴霧劑，其中霧狀物從該溶液產生，然后可有效地被病人吸入(不是直接噴射進鼻和口腔)。如果TNFR-Ig是粉末狀的，顆粒應足夠大以便保存在呼吸道中而不會吸入后被病人呼出。根據用于快速治療或預防的醫(yī)療方案，該噴霧劑可按對病人介紹的每天吸入一次或多次或更少的頻率。對于噴霧用藥，可通過吸入對治療或防止如上所述的哮喘有效量的本發(fā)明的TNFR-Ig來給病人用藥。對于哮喘，以這種方式使呼吸道受影響的部分(鼻腔，氣管，低級氣體通道或細支氣管)接受合適量的TNFR-Ig。本發(fā)明的噴霧劑配方優(yōu)選地按重量比提供從制品的大約0.03％到5.0％，更優(yōu)選大約0.03到0.5％，特別是大約0.1到0.3％。優(yōu)選的噴霧配制品是氣溶膠配制品，一般來說，對于噴霧劑，優(yōu)選較低劑量范圍，例如霧化配制品，對于氣溶膠，優(yōu)選更高的劑量范圍。在本發(fā)明中可使用任何常規(guī)氣溶膠配制品以提供有效量的TNFR-IG制品，優(yōu)選提供上述制品量。通過當病人呼吸時在病人口腔釋放測定劑量的氣溶膠霧狀物，將霧狀物吸入口腔并通過呼吸道進入肺來最有效地施用該制品。如上所述，有效量可一次或幾次以更小的劑量在一天內經口腔或鼻內用藥，對于快速治療以每天的劑量用藥，對于預防以每周至每月的間隔用藥。合適的氣溶膠配制品包括適當劑量的藥用活性化合物(例如，TNFR-Ig制品)和有效量的任何常規(guī)氣溶膠推進劑。也可包括任何常規(guī)表面活性劑。TNFR-Ig可與作為溶液中的液體或作為粉末(例如，以熟知的方法凍干)的推進劑組合。推進劑可以是適當液化的。在推進劑中的可溶的或可分散的那些表面活性劑是更有效的。在推進劑中可溶性更大的表面活性劑是最有效的。另外較重要的是，表面活性劑應是非刺激性的且無毒性?？墒褂靡夯幕蚍且夯募夹g人員已知的用于藥用組合物的可接受的任何常規(guī)推進劑。根據TNFR-Ig是粉末形式還是液體形式，推進劑可以是適合于與粉末一起使用的推進劑或是適合于與液體活性成分一起使用的推進劑。采用的液化推進劑可以是在室溫(65°F)和大氣壓(760mm汞柱)下為氣體的推進劑，即，在大氣壓下它可具有低于65°F的沸點且無毒性。可采用的合適的液化推進劑包括含有多達5個碳原子的低級鏈烷，如丁烷和戊烷。液化推進劑的例子是氟化的和氟氯化的低級鏈烷，如以商標“Freon”銷售的推進劑?？蛇m當采用上述推進劑的混合物?，F在已對本發(fā)明進行了一般性的描述，通過參考下面的實施例將更容易理解本發(fā)明，這些實施例以例證的方式提供并不是打算來限制本發(fā)明，除非另有說明。實施例實施例1用于生產TNFR-Ig的編碼TNFR-Ig的質粒A．細胞系用作哺乳動物宿主細胞系的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系來源于CHO-K1(ATCC號CCL61CHO-K1)。然后使用命名為CHO-K1DUX-B11(DHFR-)的CHO-K1突變型二氫葉酸還原酶(DHFR-)缺陷型細胞系(獲自哥倫比亞大學L.Chasin博士；Simonsen,C.C和Levinson,A.D.,(1983)美國國家科學院院報80:2495-2499；UrlaubG.,和Chasin,L.,(1980)美國國家科學院院報77:4216-4220)通過用含胰島素原前體cDNA的載體(Sures等；(1980)科學，208:57-59〕轉染獲得胰島素需求減少的細胞系。命名為dp12.CHO的選擇克隆生長需要甘氨酸，次黃嘌呤和胸苷，從而證實它們?yōu)镈HFR-基因型。B．可溶性1型TNFR-IgG1嵌合體的構建通過將人1型TNFR的細胞外結構域與IgG1重鏈鉸鏈區(qū)和CH2及CH3結構域的基因融合(下文稱為TNFR1-IgG1)來構建可溶性1型TNFR-IgG1嵌合體。作為選擇，也可使用IgG3重鏈的鉸鏈區(qū)和CH2及CH3結構域。編碼人1型TNFR的DNA序列(見Loetscher等，出處同上)從質粒pRF-TNFR[Schall等，細胞，61,361(1990)]獲得。為構建該起始質粒，將2.1kb胎盤cDNA克隆(Schall等，出處同上)插入哺乳動物表達載體pRK5中，其構建在EP公開號307,247中描述。該cDNA開始于Loetscher等所報道的序列的64位核苷酸處，起始甲硫氨酸位于下游118bp處。IgG1編碼序列的來源是CD4-IgG表達質粒pRKCD42Fc1[Capon,D.J等，自然，337,525(1989)；Byrn等，自然，344,667(1990)]，該質粒含有編碼與人IgG1序列融合的成熟人CD4蛋白質1-180殘基(2個N-末端CD4可變結構域)所組成的雜交多肽的cDNA序列，該IgG1序列在216位天冬氨酸起始(將114位氨基酸作為重鏈恒定區(qū)的第1個殘基)[Kabat等，免疫學感興趣的蛋白質序列，第4版(1987)]，即在涉及重-輕鏈結合的半胱氨酸殘基后的IgG1鉸鏈的第1個殘基)并于441位殘基終止以包括IgG1的CH2和CH3Fc結構域。也見EP227110。作為選擇，可使用pCD4-Hγ3載體(DSM5523，EP394,827)。通過SstⅠ酶切去掉CD4cDNA以獲得所需的IgG3序列。通過產生質粒pRK-TNFR和pRKCD42Fc1的限制性片斷并連接它們，使用缺失誘變使成熟TNFR’s的171位蘇氨酸殘基與IgG1重鏈的216位天冬氨酸殘基并列[Kabat等，出處同上]來構建TNFR1-IgG1。所得的質粒pRKTNFR-IgG含有TNFR1-IgG1編碼序列的全部長度。然后可通過諸如磷酸鈣沉淀的常規(guī)方法將該質粒轉染進諸如CHO細胞的宿主細胞中。可用常規(guī)方法培養(yǎng)所得的細胞以表達TNFR-IgG，然后以常規(guī)方法分離之。實施例2具有大約每蛋白質5-6M.唾液酸，每蛋白質0.4-0.45MN-乙酰葡糖胺，5.5-7.5的pI的TNFR-Ig的生產細胞培養(yǎng)通過轉染將實施例1中編碼可溶性1型TNFR-IgG1的基因導入dp12.CHO細胞中。使用將DNA導入哺乳動物細胞中的磷酸鈣技術來完成轉染。轉染2天后，用胰蛋白酶消化細胞并重新涂布到選擇培養(yǎng)基(加了2％的透析血清的無甘氨酸-次黃嘌呤和胸苷的Ham’sF-12DMEM,1∶1v/v)上。隨后，篩選出分泌TNFR1-IgG1的分離株。在氨甲喋呤中擴增的表達TNFR1-IgG1的克隆在產生高表達克隆的，隨后調適到無血清中培養(yǎng)基。這些細胞處于連續(xù)選擇壓力下直到轉移至非選擇性培養(yǎng)基進行接種物的生長和擴增。為了提供產生TNFR1-IgG1的細胞培養(yǎng)物，上述細胞種群通過在不斷增大體積的容器中進行系列傳代培養(yǎng)從含氨甲喋呤的培養(yǎng)基擴增至不含氨甲喋呤的生長培養(yǎng)基。對于該方法的這些步驟，非選擇性生長培養(yǎng)基是以DMEM/HAMF-12為基礎的配制品(例如，見美國專利5,122,469)，其中一些成分的濃度有所改變，如，葡萄糖，氨基酸，鹽，糖，維生素，甘氨酸，次黃嘌呤，和胸苷；重組人胰島素，水解蛋白胨(PrimatoneHS或PrimatoneRL)，細胞保護劑如PluronicF86(多聚醇)或同等物；慶大霉素；脂類和微量元素。通過使用CO2氣體(酸)和/或Na2CO3(堿)將培養(yǎng)物控制在pH7.2+/-0.4。細胞生長期間溫度控制在37℃左右。通過直接噴入空氣和/或氧氣使溶解氧維持在空氣飽和度的5％以上。接種物擴增期間滲透壓維持在大約250mOsm和350mOsm之間。每次培養(yǎng)的生長期后是第二期或過渡期，其中培養(yǎng)參數從最適生長改變?yōu)樯a條件。在該過渡期期間培養(yǎng)系統(tǒng)的溫度一般降低到約30和35℃之間。加入丁酸鹽，從而保證一定的重量摩爾滲透壓濃度范圍。分析在該生產期期間積累的產物的唾液酸含量。在典型的生產程序中，從選擇期的接種物擴增產生大約1.2×106個細胞，其中在生長期生長的起始重量摩爾滲透壓濃度為300-450mOsm，優(yōu)選大約300。生長培養(yǎng)基補加微量元素，重組人胰島素和水解蛋白胨。細胞在此條件下生長兩天。第3天開始時降低細胞培養(yǎng)物的溫度。溫度改變的同時或之后，向細胞培養(yǎng)物中加入大約1至6mmol丁酸鈉，優(yōu)選6mmol且通過加入各種培養(yǎng)基成分保證生產所需的重量摩爾滲透壓濃度。在這些條件下培養(yǎng)細胞生長9-10天。當需要時提供細胞各種培養(yǎng)基成分。高唾液酸化組合物的pI比低唾液酸化組合物的pI低。對組合物進行等電聚焦。等電聚焦凝膠使用不同pH的兩性電解質產生的pH梯度根據其等電點pI將組合物的糖蛋白分離。使用10至4的pH梯度進行組合物分析。由層析聚焦測定上述組合物顯示的等電點范圍為大約5.5至大約7.5，其中pI對神經氨酸酶處理敏感。TNFR-IgG的回收如Capon等自然，337:525,1989所述，可通過離心細胞培養(yǎng)物并將所得的培養(yǎng)物上清通過蛋白A柱來純化IgG融合蛋白。因此，離心上述獲得的細胞培養(yǎng)物并將上清過蛋白A柱。這種親和層析法通過如由Capon等，出處同上所述的在固定化金黃色葡萄球菌蛋白A上的TNFR1-Ig制品可純化達到超過95％的同質性。糖類分析A.唾液酸含量可用Warren,L.(1959)，生物化學雜志234:1971-1975的方法進行分析。B．完整的中性和氨基糖的釋放可通過高pH陰離子交換層析結合脈沖安培計檢測來測定。使用如下的步驟進行分析1．用TNFR1-IgG1(大約50μg/ml)和合適的參照樣進行緩沖液交換，以使最終樣品包含于1％乙酸中。2．將大約90μgTNFR1-IgG1及參照樣品冷凍于干冰和乙醇浴中，冷凍樣品凍干過夜。3．凍干樣品在500μl三氟乙酸中重新配制并在120℃溫育1小時。4．酸水解后冷卻TNFR1-IgG1和參照樣品并蒸發(fā)干燥。5．樣品用水重新配制至終濃度大約為0.6mg/ml。6．通過使用DionexCarboPacPal(4×250mm)柱(Dionex公司，美國，加州，圣尼維爾)以脈沖安培計檢測的高pH陰離子交換層析在室溫下進行單糖的分離。7．通過與參照單糖進行比較確定每份單糖的量。實施例3．TNFR-Ig的制備1．使用磷酸鈣共沉淀法用質粒pSV16B.TNFR-IgG(編碼TNFR1-IgG1)和pFD11(編碼DHFR)轉染CHO細胞系DP12(EP307,247)。2．轉染獲得的細胞克隆用含2％滲濾牛血清和100nmol/L氨甲喋呤的選擇培養(yǎng)基擴增至9升懸浮培養(yǎng)物。用無氨甲喋呤的無血清培養(yǎng)基將兩個9升培養(yǎng)物接種至100升發(fā)酵罐中。用1000倍的生產培養(yǎng)基洗滌以減少殘留的血清成份后，在將細胞接種到1000升生產培養(yǎng)容器之前，將100升培養(yǎng)物用無血清培養(yǎng)基接種進400升培養(yǎng)物中。生產培養(yǎng)基為以DMEM/HAMF-12為基礎的配制品，補充有葡萄糖，氨基酸，甘氨酸，次黃嘌呤，胸苷，水解蛋白胨，pluronicF68，慶大霉素，脂類和微量元素。3．生產培養(yǎng)物用CO2氣體和/或Na2CO3維持在pH7.2+或-0.2條件下13天。在細胞濃度達到5×106細胞/ml后，培養(yǎng)溫度從37℃改變到30℃。在第2天和第4天通過加入培養(yǎng)基成份將培養(yǎng)物的重量摩爾滲透壓濃度調節(jié)至大約450mOsm/kg。加入丁酸鈉至最終濃度為12mM。通過向培養(yǎng)物噴入空氣和或氧氣使溶解氧濃度維持在60％氣體飽和度。4．13天后收集培養(yǎng)物，通過切向流動過濾細胞從上清液中分離出來。該收獲的細胞培養(yǎng)液(HCCF)用10KD的Maxisette膜濃縮約20倍。通過加入固體NaCl至1.0M，隨后通過0.22微米Durapore濾器過濾來澄清殘留物并控制其條件以進行蛋白A層析。5．過濾后，將調耗條件的HCCF通過固定的蛋白A。上樣物質在洗脫前洗滌幾次。TNFR-IgG用0.05M檸檬酸鈉/20％(w/v)甘油，pH3.0逐步洗脫。通過加入1M檸檬酸鈉將洗脫合并液調節(jié)為pH5.0。6．調節(jié)pH后，稀釋蛋白A合并液并上樣到S-SepharoseFastFlow上。樣品經沖洗后用0.05MMOPS/0.05MNaClpH7.2分步洗脫。7．分步洗脫后，稀釋S-SepharoseFastFlow合并液，然后上樣到Q-SepharoseFastFlow柱上。使用在0.125MMOPS(pH7.2)中的從0.0125MNaCl至0.125MNaCl的線性梯度洗脫該柱。8．線性梯度洗脫后，通過加入1體積的0.1乙酸鈉/4.0M尿素/2.0M硫酸銨(pH5.0來調節(jié)Q-SepharoseFastFlow合并液，然后上樣到用0.05M乙酸鈉/2.0M尿素/1.0M硫酸銨(pH5.0)平衡過的苯基Toyopearl650M柱上。在這些條件下TNFR-IgG流過此柱。樣品隨后用平衡緩沖液沖洗，合并流出液和沖洗液，組成苯基Toyopearl合并液。9．合并兩個苯基toyophearl合并液并用10KDFiltronCentrassette膜濃縮。濃縮液通過用0.01M檸檬酸鈉/0.023M甘氨酸/0.023M甘露醇(pH6.0)中平衡過的G-25柱以產生TNFR-Ig組合物。下述實施例4-10所描述的體內實驗證明，本發(fā)明的TNFIg緩解哮喘發(fā)作效應。TNF受體融合蛋白可TNFR-Ig明顯減輕，甚至在某些情況下消除過敏性肺炎動物模型中抗原激發(fā)引起的反應。TNFR-Ig抑制作用的程度可比得上用廣譜消炎藥地塞米松獲得的程度?？s寫TNFα，腫瘤壞死因子-α；TNFR-Ig，重組的可溶性的TNF受體IgG1融合蛋白；BAL，氣管肺泡灌洗液；OA，卵清蛋白；RL，肺阻力；HBSS,Hanks平衡鹽溶液；物質P，一種用于誘導急性支氣管痙攣的神經肽，通常在文獻中稱為物質P〔例如見Selig和Tocker，歐洲藥物學雜志213(3):331-336(1992)〕。數據分析每次實驗所有數值均計算平均+/-SEM值。統(tǒng)計學差異通過兩種方法重復測量分析分級數據的方差，隨后通過使用學生Newman-Keulst-檢驗或通過學生t-檢驗的多重比較檢驗來測定。P＜0.05認為在統(tǒng)計學上顯著。計算用在PC機上運行的微軟EXCEL5.0(softmart,Exton,PA,USA)和SigmaStat(JandelScientific,SanRafael,CA,USA)軟件包進行。藥物所有藥物均以1mg/kg的劑量用藥。TNFR-Ig按實施例3所述生產和純化，貯液在檸檬酸鈉(10mM)，甘氨酸(23mM)和甘露醇(230mM)(pH6緩沖液中制備。貯液的等分樣品使用前在-20℃貯存并在無菌鹽水中進行稀釋。下列物品從Sigma化學公司(St.Louis,MO,USA)購買并在無菌鹽水中配制卵清蛋白，氫氧化鋁，烏拉坦，物質P乙酸酯，(+/-)鹽酸普萘洛爾，地塞米松21-磷酸酯和伊文斯蘭。實施例4用TNFR-Ig緩解豚鼠哮喘癥狀(氣管過敏反應)本實施例使用對OA產生過敏的豚鼠，使得隨后接觸OA將誘導氣管過敏反應的哮喘癥狀。該癥狀可被TNFR-Ig緩解，其作用也與地塞米松，一種已知緩解哮喘的類固醇，進行了比較。雄性豚鼠在0天(10μg+1mgAl(OH)3于0.5ml鹽水中)的OA，皮下注射)敏化，在第14天后接受同樣劑量的OA作為加強注射。在第21天動物用0.1％OA氣溶膠激發(fā)30分鐘。此敏化作用引起豚鼠哮喘樣癥狀，包括對物質P的氣管過敏。為了測定TNFR-Ig對此癥狀的影響，在激發(fā)前施用TNFR-Ig，將其癥狀與未激發(fā)的動物進行比較且顯示為減輕。使用地塞米松(30mg/kg，腹腔注射，激發(fā)前1小時和后4小時)對氣管過敏得到類似的效果。地塞米松是一種已知的哮喘治療劑。通過敏化，激發(fā)和治療處理的豚鼠用于如下實驗。敏化重250-300克的雄性Hartley品系豚鼠(CharlesRiver,kingston,NY,USA)在第0天和第14天用單劑皮下注射(10μgOA+1mg氫氧化鋁于0.5ml無菌鹽水中)積極地對OA敏化，在第21天和28天之間用于實驗。激發(fā)抗原激發(fā)方案以前已有描述(O’Donnell等，1994)。敏化的動物放在有機玻璃箱中，用0.1％(w/v無菌鹽水)OA氣溶膠激發(fā)30分鐘。氣溶膠用DeVilbissUltra-Neb100超聲噴霧器(呼吸服務中心，Ephrata,PA,USA)以內置風扇驅動的30L/分鐘的氣流速度傳遞。為了使過敏性反應引起的死亡數降至最小，在最初的5分鐘給藥時，噴霧器進行間隔60秒的開關循環(huán)，在這些條件下動物死亡率大約為5％。藥物治療在OA噴霧前18和1小時，動物組或接受載體(見藥物)，或接受TNFR-Ig(1或3mg/kg，腹腔注射)。對于用地塞米松進行的實驗，在OA噴霧前1小時或之后4小時動物組分別接受載體(鹽水)或地塞米松(30mg/kg，腹膜內)。根據初步的觀察結果確定TNFR-Ig和地塞米松的最佳劑量參數。本實施例的結果表明經接觸OA對OA過敏的豚鼠在OA激發(fā)后6小時表現出對物質P(1-10ug/kg靜脈注射)的氣管反應增強。對物質P的增強反應是哮喘樣敏化的特性，表明豚鼠具有由上述實驗條件誘導的過敏反應的哮喘癥狀。過敏反應受TNFR-Ig(3mg/kg，腹膜內，激發(fā)前18和1小時)抑制。使用方法如下氣管對物質P的反應根據前述方法(Selig和Tocker,1992)在接觸OA氣溶膠后6小時的敏化的未激發(fā)的和激發(fā)的豚鼠中測定。動物用烏拉坦(2g/kg，腹膜內)麻醉，用PE-50導管做頸動脈(血壓)和頸靜脈(藥物注射)插管。氣管用15號針頭插管，動物放入整體體積描記器(ModularInstruments,Malvern,PA,USA)中。用琥珀酰氯化膽堿(1.2mg/kg，靜脈注射)抑制自發(fā)呼吸，使用1ml/100g體重的潮氣量和60次呼吸/分鐘的頻率給動物機械通氣(HarvardApparatusModel683；SouthNatick,MA,USA)。體積描記器總體積為2L，動物和呼吸裝置間通氣管路的體積是10ml。體積描記器裝配有與Validyne分壓傳導器(DP45-14)相連的Fleisch呼吸速度描記器(Model#0000)用于測量氣流。通過連接在氣管插管側臂和插在第5和第6肋骨間的16號胸膜內針頭之間的第二Validyne傳導器(DP45-28)測定跨肺壓。用由IBM486DX2PC驅動的ModularInstruments(Malvern,PA,USA)M-3000數據獲得系統(tǒng)記錄氣流和跨肺壓。計算機根據AmdurMead(1958)的方法利用常規(guī)軟件(BioReport,ModularInstruments)進行肺阻力(RL)的計算。讀數以平均10秒多的間隔連續(xù)進行。校正RL值作為氣管的內部阻力(0.11cm水柱/ml/秒)。動物接受心得安(1mg/kg，靜脈注射)并在開始施用物質P前使其穩(wěn)定10分鐘。通過以大約5-10分鐘的間隔提供大劑量注射獲得物質P(1,3,5和10μg/kg，靜脈注射)的劑量-反應效應。獲得每個劑量RL的最大變化并以施用物質P前測定的基礎值的百分數來表示。ED200值定義為引起RL升高200％的物質P的劑量，通過對每個動物對數劑量-反應曲線的線性回歸進行測定。RL的基礎值為大約0.30cm水柱/ml/秒，組間無顯著差異(P＞0.05)。敏化的而未激發(fā)的豚鼠對物質P相當不敏感，需要30μg/kg的劑量使RL升高至少200％或更大(表1)。相反，OA激發(fā)后，氣管對物質P的反應顯著升高。用物質P的最大劑量獲得的RL最大值升高大約5倍(表1)時，ED200值升高大約10倍(表1)。表1TNFR-Ig和地塞米松影響OA敏化的豚鼠對物質Pa的氣管應答反應的總結。治療b-logED200c最大應答反應dne(RL升高％)未受激發(fā)f4.86+/-0.08139+/-286TNFR-Ig載體5.82+/-0.041811+/-22871mg/kg5.87+/-0.011344+/-19563mg/kg5.48+/-0.05*714+/-69*5地塞米松載體5.87+/-0.05935+/-91530mg/kg5.35+/-0.04*596+/-66*6a物質P的劑量-反應效應在用0.1％OA氣溶膠激發(fā)30分鐘后6小時測定。檢查氣管對物質P的應答反應前，用心得安(1mg/kg，靜脈注射)預處理動物10分鐘。b使用1ml/kg的劑量，用各自的載體，TNFR-Ig(OA激發(fā)前18和1小時)或地塞米松(OA激發(fā)前1小時和之后4小時)經腹膜內預處理動物。c值代表肺阻力(RL)增加了基礎值的200％所需的物質P劑量(以g/kg)的負對數(平均+/-S.EM.值)。d值(平均+/-S.E.M.值)代表由物質P(10μg/kg，靜脈注射)引起的基礎RL的升高百分數。e每組動物數。f物質P的劑量-反應效果曲線在未用OA氣溶膠激發(fā)的敏化動物組中測定。*相應載體和藥物處理組之間的值在統(tǒng)計學上有顯著(P＜0.05)的差異。給敏化動物施用TNFR-Ig(3mg/kg)顯著(P＜0.05)抑制OA誘導的呼吸道對物質P的過敏反應。物質P的ED200值降低大約3倍，RL最大值減少大約60％(表1)。較小劑量的TNFR-Ig(1mg/kg)對物質的敏感性無影響(表1)。在敏化豚鼠中用地塞米松(30mg/kg)處理也以用較大劑量的TNFR-Ig所獲得的相似程度(表1)顯著(P＜0.05)抑制OA誘導的呼吸道過敏反應。實施例5用TNFR-Ig緩解的豚鼠哮喘癥狀(炎癥細胞流入)本實施例使用實施例4所述的對OA過敏的豚鼠以便隨后接觸OA時將誘導哮喘癥狀，即炎癥細胞流入。該癥狀被TNFR-Ig緩解，也將其與地塞米松，一種已知緩解哮喘的類固醇，進行了比較。如實施例4中，使雄性豚鼠對OA敏化且按所述進行激發(fā)以誘導哮喘癥狀，包括激發(fā)后6,24,48，和72小時定量的呼吸道炎癥細胞累積。如實施例4中，為了測定TNFR-Ig對這些癥狀的影響，在激發(fā)前施用TNFR-Ig，與未激發(fā)的動物比較，這些癥狀且顯示出癥狀減輕。也在激發(fā)前施用TNFR-Ig用于炎癥，結果顯示逆轉炎癥細胞流入。用地塞米松(30mg/kg，腹膜內，激發(fā)前1小時和之后4小時)在6和24小時獲得對炎癥細胞累積的相似影響。使用方法如下在OA激發(fā)后6和24小時根據以前所述方法(Selig和Tocker,1992)通過BAL測定呼吸道炎癥細胞流入。簡單地說，豚鼠用烏拉坦(2g/kg，腹膜內)麻醉，用15號插管作氣管切口。用3×5ml不含Ca2+和Mg2+的無菌Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)(Gibco,GrandIsland,NY,USA)灌洗肺。樣品在25℃,200g離心10分鐘，用蒸餾水(1ml,30分鐘)從所得的沉淀中溶開血紅細胞，然后加入10mlHBSS恢復重量摩爾滲透壓濃度。第二次離心(25℃下，200g,10分鐘)樣品，所得的沉淀重新懸浮于1mlHBSS中。用血細胞計數器從細胞懸浮液的等分樣品以臺盼蘭(Sigma化學公司，St.Louis,MO,USA)排斥法測定總細胞數。為分類細胞計數，將細胞懸浮液的等分樣品在Cytospin中離心(5分鐘，1300rpm；ShandonSouthernInstruments,Sewickey,PA,USA)，涂片，固定，用改良瑞氏染液(Leukostat；FisherScientific,Pittsburgh,PA,USA)染色。在光鏡下分類至少300個細胞中采用標準形態(tài)學準則。數據表示為BAL細胞×106/動物。用TNFR-Ig處理(1-3mg/kg，腹膜內，18和1小時及1小時預處理，對于BAL，在6和24小時，分別顯著(P＜0.05)抑制了OA后6和24小時BAL中中性細胞和總細胞數的累積)。TNFR-Ig(3mg/kg，腹膜內)也顯著(P＜0.05)減少2個時間點BAL的嗜酸性粒細胞數目，而低劑量(1mg/kg，腹膜內)無影響。本實驗結果也表明過敏原誘導的炎癥反應中中性粒細胞成分是由TNF介導的。最明顯的是，在抗原激發(fā)后24小時，TNFR-Ig幾乎消除了敏化豚鼠的BAL的中性粒細胞的流入，其中中性粒細胞數占BAL中細胞總數的大約2％。此外用TNFR-Ig而不是地塞米松處理，在激發(fā)后6小時，引起豚鼠中性粒細胞大量下降。通過TNFR-Ig或類似拮抗劑阻斷TNF，可引起已知的有助于中性粒細胞回流進肺的因素的間接下降。敏化的，未激發(fā)的豚鼠BAL的細胞組成以前已被描述(Selig和Tocker,1992)。這些動物中總的細胞計數平均為大約1×106/動物，其中大約2-3％是嗜酸性粒細胞和中性粒細胞。OA處理后6小時，在TNFR-Ig或地塞米松的載體處理的動物中含有分別含總細胞計數的至少40和20％的嗜酸性粒細胞和中性粒細胞。BAL中嗜酸性粒細胞百分數在24小時保持恒定，而中性粒細胞計數則下降至總細胞數的大約10％。炎癥細胞數和總細胞數在TNFR-Ig和地塞米松的各自載體組之間無差異(P＞0.05)。炎癥細胞流入敏化的，激發(fā)的豚鼠BAL也受地塞米松(30mg/kg)的抑制，OA處理后6小時，BAL中嗜酸性粒細胞和總細胞數有顯著(P＜0.05)的下降，這與TNFR-Ig所引起的情況類似。6小時時間點時對中性粒細胞數無影響。OA處理后24小時，BAL中嗜酸性粒細胞，中性粒細胞和總細胞數被地塞米松顯著(P＜0.05)地抑制。與TNFR-Ig相比，地塞米松處理的動物嗜酸性粒細胞降低大約5倍(P＜0.05)。相反，盡管地塞米松處理降低了BAL中的中性粒細胞數，但是在不同細胞中這些細胞百分比保持不變(P＞0.05)，為約總細胞數的8％。在敏化豚鼠中檢查TNFR-Ig逆轉活動性炎癥反應的能力。使動物對OA敏化，然后如上所述進行激發(fā)。OA激發(fā)30分鐘后施用TNFR-Ig(3mg/kg，腹膜內)。在激發(fā)后24,48和72小時通過BAL檢測炎癥。對于48和72小時時間點，TNFR-Ig每日給藥。激發(fā)后用TNFR-Ig處理明顯逆轉敏化豚鼠BAL中炎癥細胞的流入。實施例6:TNFR-Ig緩解豚鼠的哮喘癥狀(肺水腫)本實施例使用實施例4所述的，對OA過敏的豚鼠以便隨后接觸OA將誘導哮喘癥狀，即肺水腫。該癥狀被TNFR-Ig緩解，也將其與地塞米松，一種已知緩解哮喘的類固醇，進行了比較。如實施例4中，使雄性豚鼠對OA敏化且按所述進行激發(fā)以誘導哮喘癥狀，包括在激發(fā)后6小時定量的水腫。如實施例4中，為了測定TNFR-Ig對這些癥狀的影響，激發(fā)前施用TNFR-Ig，將這些癥狀與未激發(fā)的動物進行比較并表明有所減輕。使用方法如下OA處理后6小時使用以前所述的方法(Wasserman等，前列腺素，血栓烷，白三烯研究進展，23:271-273,1995)以伊文斯蘭染色液外滲法定量作為肺水腫標志的呼吸道毛細血管滲漏。豚鼠用烏拉坦(2g/kg，腹膜內)麻醉并作頸靜脈插管。然后動物接受在60秒期間內給藥的伊文斯蘭染色液(30mg/kg，靜脈注射)。10分鐘后打開胸腔并將導管(PE-240管)通過左心室插入主動脈。交叉夾住心室，切開右心房并通過使用藥筒泵(Masterflex；Cole-Parmer,Chicago,IL,USA)用100ml鹽水以100ml/分鐘的速度灌注動物來排出血液。通過在肺動脈內插管并切開左心房，再用50ml鹽水灌注肺循環(huán)。整體取出肺，切下氣管(末端5mm)和主支氣管，在濾紙間吸干并稱重。在甲酰胺中提取伊文斯蘭染料(37℃,24小時)并通過用分光光度計(BeckmanInstrumentsModelDU-64,Somerset,NJ,USA)在620nm下測吸光率進行定量。組織染料含量由伊文斯蘭染料濃度(0.5-10μg/ml)標準曲線上獲得并以ng/mg組織濕重來表示。使用伊文斯蘭染料作為氣管毛細血管滲透標記時，敏化的，未激發(fā)的豚鼠氣管和主支氣管的基礎值平均為10-20ng/mg組織濕重。OA激發(fā)后6小時，氣管和主支氣管中伊文斯蘭染料含量升高了大約5倍。用TNFR-Ig(1或3mg/kg)或地塞米松(30mg/kg)處理在激發(fā)后6小時減弱了(P＜0.05)氣管和主支氣管中OA誘導的呼吸道滲透。TNFR-Ig(1或3mg/kg.腹膜內)消除了敏化豚鼠氣管和主支氣管中OA誘導的呼吸道水腫(以伊文斯蘭染料的組織含量來定量)。實施例7用TNFR-Ig緩解褐色挪威大鼠哮喘癥狀與實施例4中使用的豚鼠相似，在大鼠中誘導炎癥細胞積累(一種哮喘癥狀)并用TNFR-Ig治療。本模型與豚鼠的區(qū)別在于褐色挪威大鼠的過敏反應由IgE介導。使用方法如下使雄性褐色挪威大鼠在第0,1和2天對OA(1mgOA+100mgAl(OH)3溶于0.5mg鹽水中，腹膜內)敏化。在第21天，用1％OA氣溶膠激發(fā)動物30分鐘。激發(fā)后24小時以BAL來定量炎癥細胞積累。敏化，激發(fā)和BAL的方案相似于上文對豚鼠所述，但有如下例外。體重200至250g的雄性褐色挪威大鼠(CharlesRiver,Kingston,NY)在第1,2,3天用單劑腹膜內注射(1mgOA+100mg氫氧化鋁溶于1ml無菌鹽水中)激活其對OA敏化用于在第21天進行實驗(Elwood等，1992)。OA噴霧前1小時，各組大鼠分別接受各自的載體，TNFR-Ig(1或3mg/kg，腹膜內)或地塞米松(0.3mg/kg，腹膜內)。實驗當天，大鼠用1％OA氣溶膠激發(fā)30分鐘。激發(fā)后24小時，通過用2×1ml/100g的HBSS灌洗肺來進行BAL。用0.5ml蒸餾水溶解紅細胞，用5mlHBSS恢復重量摩爾滲透壓濃度。用TNFR-Ig(3mg/kg，腹膜內，激發(fā)前1小時)處理上述大鼠基本上消除了BAL中中性粒細胞的積累并引起嗜酸性粒細胞數和總細胞數顯著下降。用地塞米松(0.3mg/kg，腹膜內，激發(fā)前l(fā)小時)獲得類似的結果。較低劑量的TNFR-Ig(1mg/kg，腹膜內)也明顯降低了BAL中的中性粒細胞數，但對嗜酸性粒細胞和總細胞數無影響。更詳細地說，敏化的，未激發(fā)的褐色挪威大鼠在BAL中總細胞計數基礎值為大約1×106/動物，其中按比例1-2％是嗜酸性粒細胞和中性粒細胞。OA激發(fā)后24小時，載體處理的動物BAL中細胞總數升高了大約3倍，其中嗜酸性粒細胞和中性粒細胞分別占細胞總數的至少40％和25％。BAL中炎癥細胞計數和總細胞數在各自載體處理組之間無差異(P＞0.05)。用TNFR-Ig(3mg/kg，腹膜內)或地塞米松(0.3mg/kg，腹膜內)處理都以相似的程度顯著(P＜0.05)降低了BAL中嗜酸性粒細胞，中性粒細胞和總細胞數的積累。用較低劑量的TNFR-Ig(1mg/kg，腹膜內)處理也顯著(P＜0.05)抑制了BAL中中性粒細胞數，但對BAL中嗜酸性粒細胞或總細胞數的積累無影響。實施例8受傷大鼠肺中中性粒細胞的減少Sephadex(葡聚糖凝膠)顆粒誘導的大鼠肺炎模型顯示肺中嗜酸性粒細胞和中性粒細胞數上升及肉芽腫形成，這與慢性哮喘中所見的近似。該模型用于顯示TNFR-Ig緩解此慢性癥狀。使用方法如下通過施用Sephadex(葡聚糖凝膠)顆粒懸液(7.5mg/kg,.iv.)在雄性Sprague-Dawley大鼠中誘導炎癥細胞向肺中的累積。施用Sephadex(葡聚糖凝膠)后24小時和72小時，在BAL液中白細胞總數顯著升高。在24小時時，中性粒細胞數占白細胞總數的50％左右，到72小時時則下降到總數的10％左右。嗜酸性粒細胞計數維持在白細胞總數的10％左右。用TNFR-Ig(1和3mg/kg,.ip.,激發(fā)前1小時)或地塞米松(0.1和0.3mg/kg，腹膜內)預處理在施用Sephadex(葡聚糖凝膠)后24小時抑制中性粒細胞，盡管TNFR-Ig對細胞總數無明顯影響。施用Sephadex(葡聚糖凝膠)后72小時，TNFR-Ig(1和3mg/kg，腹膜內，每日)明顯減少流入BAL液的中性粒細胞，但對嗜酸性粒細胞數無抑制作用。相反，地塞米松(0.1和0.3mg/kg，腹膜內，每日)基本上消除中性粒細胞和嗜酸性粒細胞向BAL液的滲入。TNFR-Ig(1和3mg/kg，腹膜內)或地塞米松(0.1和0.3mg/kg，腹膜內)在72小時時間點明顯減少總細胞計數。實施例9靈長類特異反應性哮喘的緩解采用對Ascarissuum抗原表現出天然呼吸道敏感的野外捕捉的彌猴建立的特異反應性哮喘靈長類模型用于證明TNFR-Ig緩解哮喘癥狀呼吸道過敏反應的效應。重復接觸抗原誘導呼吸道的哮喘癥狀，尤其是增加了肺阻力(RL)。當用TNFR-Ig處理時猴子顯示RL下降。當給予重復接觸A.suum抗原時，野外捕捉的野生蛔蟲屬敏感型彌猴顯示了增強的對吸入的乙酰甲膽堿的呼吸道反應和增多了呼吸道嗜酸性粒細胞。因此使用該抗原誘導在這些猴中的過敏反應和隨后產生的哮喘癥狀的呼吸道過敏反應性。下列方案用于檢查TNFR-Ig對呼吸道過敏反應的影響。第1天測定一種類似物質P的氣管痙攣誘導劑乙酰甲膽堿(MCh)的劑量，其產生了100％(PC100)的升高的肺阻力(RL)。第3天用產生至少加倍的RL的一個蛔蟲屬抗原吸入劑量激發(fā)猴子。第5天和第8天重復第3天的實驗。第10天重復第1天的實驗，測定第1天和第10天之間PC100對數值的變化。在第1,3,5和8天施用TNFR-Ig(3mg/kg，靜脈注射)減弱了呼吸道對MCh的過敏反應。實施例10:TNFR-Ig緩解小鼠過敏性呼吸道炎癥使用OA誘導小鼠過敏性肺炎的鼠類模型證明TNFR-Ig減輕炎癥細胞流入的哮喘癥狀。反復接觸OA的敏變化小鼠逐漸形成呼吸道過敏且BAL中嗜酸性粒細胞流入增加。此模型與IgE水平升高相聯系且表現出典型的Th2細胞因子特征(如IL-4和IL-5水平升高)。在本模型中評價了TNFR-Ig減弱活動性過敏炎癥反應的能力。過敏性肺炎的鼠類模型與靈長類相似，為誘導呼吸道過敏反應和炎癥細胞流入，需要敏化的動物多次接觸過敏原。雌性C57BL/6小鼠在第0天用OA(10μg，含1mgAl(OH)3凝膠，0.1ml，腹膜內)敏化，然后，從第14-20天，每天用1％OA氣溶膠激發(fā)30分鐘。呼吸道對MCh的過敏反應和BAL在最后一次OA激發(fā)后24小時完成。固定一些來自敏化的，激發(fā)的肺用于組織學檢查，其它被勻漿用于測定TNF水平。在敏化的，激發(fā)的小鼠中炎癥細胞累積和TNF水平在用OA氣溶膠最后一次激發(fā)(第20天)后達到高峰。本實驗中，在最后一次接觸OA后立即施用TNFR-Ig(3mg/kg，腹膜內)。TNFR-Ig減弱了OA誘導的過敏反應，但對BAL中炎癥細胞流入無影響。在激發(fā)期間每日施用TNFR-Ig對BAL細胞計數也無影響。然而施用TNFR-Ig(3mg/kg，腹膜內，第20天)明顯減少了敏化的，激發(fā)的小鼠肺組織中的嗜酸性粒細胞數且清除了肺組織中的TNF水平。實施例11氣溶膠組合物下面是含有本發(fā)明的TNFR-Ig制品的實施例實施例A-氣溶膠TNFR-Ig(顆粒大小范圍1-5微米)3.0％Span85(脫水山梨醇三油酸酯)1.0氟利昂11(三氯單氟甲烷)30.0氟利昂114(二氯四氟乙烷)41.0氟利昂12(二氯二氟甲烷)25.0實施例B-氣溶膠TNFR-Ig0.5％Span850.5％推進劑B199.0％1推進劑B由10％氟利昂11,50.4％氟利昂114,31.5％氟利昂12，和8.0％丁烷組成。實施例C-氣溶膠TNFR-Ig1.00％Span850.25％氟利昂115.0％氟利昂W193.75％1氟利昂W由61.5％氟利昂114和38.5％氟利昂12組成。實施例D-氣溶膠TNFR-Ig0.50％Span850.50％推進劑(C)199.0％1推進劑C由30.0％氟利昂11和70％氟利昂W組成。實施例E-氣溶膠TNFR-Ig0.88％硫酸鈉(無水)，粉末0.88％Span851.00％推進劑，由50％氟利昂12，97.24％25％氟利昂11，和25％氟利昂114組成實施例F-氣溶膠TNFR-Ig0.06％Span850.05％氟利昂1120.0％氟利昂12/氟利昂114(20/80)78.9％實施例12注射組合物下面是含有本發(fā)明的TNFR-Ig制品的注射組合物的一個例子。成份每ml含有TNFR-IgG1*無水檸檬酸，USP1.92mg甘氨酸，USP1.70mg甘露醇，無熱源，USP41.90mg氫氧化鈉適量，pH6.0鹽酸適量，pH6.0注射水，USP適量，至1.0ml***本配方中使用的TNFR-IgG1濃度可以是1.0mg/ml至20mg/ml。該配方中TNFR-IgG1的最終量以每瓶的組合物濃度和體積為基礎來選擇。**通過凍干轉移．1mg藥瓶(用1.0mg/ml配方1ml)2.5mg藥瓶(用2.5mg/ml配方1ml)5.0mg藥瓶(用5.0mg/ml配方1ml)10mg藥瓶(用5.0mg/ml配方2ml)10mg藥瓶(用10.0mg/ml配方1ml)20mg藥瓶(用8.0mg/ml配方2.5ml)20mg藥瓶(用5.0mg/ml配方4ml)50mg藥瓶(用20mg/ml配方2.5ml)參考文獻Ackerman,V.,Marini,M.,Vittori,E.,Bellini,A.,Vassali,G.,和Mattoli,S。哮喘病人支氣管活檢標本中細胞因子及其細胞來源的檢測。呼吸道過敏反應的特異反應狀況，癥狀和水平的關系。胸科105(3):687-96,1994。Amdur,M.O.和Mead,J。未麻醉豚鼠呼吸機制。美國生理學雜志192:364-372,1958。Amrani,Y.,Martinet,N.和Bronner,C。人氣管平滑肌中腫瘤壞死因子α增強緩激肽和氯化氨甲酰膽堿誘導的鈣信號。英國藥理學雜志114(1):4-5,1995。Anderson,JA.,Miller,F.N.,Sims,D.E.和Edwards,M.J。腫瘤壞死因子不依賴于中性粒細胞和肥大細胞引起毛細血管蛋白質滲漏。外科研究雜志56(6):485-90,1994。Ashkenazi,A.,Marsters,S.A.,Capon,D.J,Chamow,S.M.,Figsri,I.S.,Pennica,D.Goeddel,D.V.,Palladino,MA.和Smith,D.H。腫瘤壞死因子受體免疫粘連蛋白防止內毒素休克。美國國家科學院院報88:10535-10539,1991。Bloemen,P.G,vandenTweel,M.C.,Henricks,P.A.,Engels,F.,Wagenaar,S.S.,Rutten,A.A.和Nijkamp,F.P。人支氣管上皮細胞粘連分子的表達和調節(jié)。美國呼吸細胞分子生物學雜志9(6):586-593,1993。Boschetto,P.,Rogers,D.F.,Fabri,L.M.,和Bames,P.J.。呼吸道毛細血管滲漏的coritcosteroid抑制。美國呼吸道疾病回顧143(3):605-609,1991。Bradding,P.,Roberts,JA.,Britten,K.M.,Montefort,S.,Djukanovic,R.,Mueller,R.,Heusser,C.H.,Howarth,P.H.和Holgate,S.T。正常和哮喘呼吸道中的白細胞介素-4,-5和-6及腫瘤壞死因子-α證明人肥大細胞是這些細胞因子的來源。美國呼吸細胞分子生物學雜志10(5):471-480,1994。Broide,D.H.,Lotz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任意一項的方法，其中融合的IgG是人IgG1。5．權利要求1至4中的任意一項的方法，其中在所述的蛋白質制品中的蛋白質具有以一個或多個唾液酸殘基終止的復合寡糖并具有暴露的N-乙酰葡糖胺，在所述的制品中唾液酸殘基的摩爾比為每摩爾蛋白質從大約4至大約7摩爾唾液酸，在所述的制品中暴露的N-乙酰葡糖胺的摩爾比是每摩爾蛋白質從大約1至大約2摩爾N-乙酰葡糖胺，在所述的制品中唾液酸殘基與N-乙酰葡糖胺殘基的摩爾比是從大約0.35至大約0.5，所述的制品的等電點是從大約5.5至大約7.5。6．權利要求5的方法，其中唾液酸與N-乙酰葡糖胺的摩爾比是從大約0.4至大約0.45，且唾液酸與蛋白質的摩爾比是從大約5.0至大約6.0。7．權利要求1至6中的任意一項的方法，其中將所述的制品以每天每病人體重每千克從0.1mg至5.0mg的劑量經注射施用給所述的病人。8．權利要求7的方法，其中劑量是每天每體重每千克從1.0mg至3.0mg。9．權利要求1至8中的任意一項的方法，其中所述的制品以口腔或鼻腔噴霧的方式用藥。10．權利要求9的方法，其中所述的噴霧是含有重量比從大約0.03％到5.0％的所述的制品的液體噴霧組合物。11．由融合到IgG上的p55TNF受體蛋白的可溶部分組成的嵌合TNFα結合蛋白在制備治療哮喘的藥物中的應用，其中所述的融合IgG含有除了IgG重鏈恒定區(qū)的第一IgG結構域之外的所有IgG結構域。全文摘要本發(fā)明涉及一種用含有效量的包含p55TNF受體的可溶部分和人IgG1或IgG3的除了重鏈恒定區(qū)的第一結構域之外的所有結構域的嵌合TNFα結合蛋白的組合物抵抗哮喘的方法,和涉及該嵌合的TNFα結合蛋白用于制備治療哮喘的藥物的應用。文檔編號C07K14/435GK1233189SQ97194455公開日1999年10月27日申請日期1997年5月2日優(yōu)先權日1996年5月8日發(fā)明者L·M·倫茨提申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司