專利名稱：針對植物病原體的無毒性/致病性蛋白的抗體的制作方法
技術領域：
本發明在政府支持下完成，由美國農業部給予資助，許可號為86-CRCR-1-2234,58-43YR-5-3和58-7B30-3-465。政府在本發明中擁有一定權利。
背景技術：
無毒性(avr)基因已在許多不同的微生物植物病原體中得到確定，并被預測將在病毒和昆蟲中發現。avr基因最初在1942年(Flor,1942)由Flor描述并被證明或暗示存在于至少27種不同的植物寄主/寄生物系統中，包括銹菌、黑粉菌、腥黑穗病，霉病，瘡痂病，線蟲，昆蟲，細菌，病毒，以及甚至其它植物所引起的疾病(Day,1974)。
avr基因經常是致病性基因。與毒性相反，害蟲和病原體應攜帶無毒性的編碼基因的想法一直是個謎，并且已提出了解釋此謎的幾種不同的有效假說(Gabriel和Rolfe,1990)。近期工作已表明avr基因的整個家族也是致病性的(pth)基因(Swarup等，1991,1992；Yang等，1994；Gabriel等，1993)。此黃單胞菌avr/pth基因家族包括目前已克隆和測序的最大數目的avr基因。
黃單胞菌avr/pth基因家族的全體成員編碼具有細胞核定位信號(NLSs)的蛋白(Yang和Gabriel,1995)。這些基因已被證實對幾種不同黃單胞菌的致病性是必不可少的。基因編碼的NLSs的功能是指導蛋白質進入植物細胞核。其它已知avr/pth基因的已發表的推測肽序列的綜述公開了這些基因也編碼假定的NLSs。其中最著名的是真菌病原體黃枝胞的avr4(Joosten等，1996)，來自解淀粉歐文氏菌的hrpN(Wei等，1992)，以及來自丁香假單胞菌的hrpZ家族(致病型syringae,glycinea和西紅柿；Preston等，1995)。攜帶NLSs的原型Avr/Pth蛋白是PthA和Avrb6，其代表了黃單胞菌avr/pth基因家族。最近，使用pthA和avrb6證明，柑桔蛀孔(pthA)和棉枯萎病癥狀分別需要這些基因編碼的NLSs(Yang和Gabriel,1995和Gabriel實驗室，未發表的)。此外，在發表的avr Bs3(Bonas等，1989)，avrXal(Hopkins等，1992)DNA序列以及在Florida大學本實驗室對avrB4,pthB,pthC,pthP和pthN的工作中得到的所有未發表的DNA序列中，可以觀察到幾乎相同的NLSs。實際上，在所測的黃單胞菌avr/pth基因家族的全體成員中，NLS編碼區域是保守的。已發表的和本實驗室未發表的研究表明亞洲柑桔蛀孔病需要pthA或同源物(Swarup等，1992),False柑桔蛀孔病需要pthB或同源物，墨西哥Lime cancrosis需要pthC或同源物，細菌性的楊樹蛀孔病需要pthC或同源物，以及普通的豆枯萎病需要pthP或同源物(Yang等，1996)。已知avrXa7也是黃單胞菌avr/pth基因家族的一個成員，并且它有助于水稻黃單胞菌的致病性(稻的細菌枯萎病；Leach等，1996)。通過我們對pthA和avrb6工作結果的擴展，好象在所有已知的avr/pth基因為致病性所需或有助于致病性(柑桔蛀孔，棉枯萎病，稻的細菌枯萎病，楊樹蛀孔，和普通細菌枯萎病的所有形式)例子中，都需要從病原體中輸出，輸入植物細胞和運輸到植物細胞核。此外，攻擊其寄主的許多，如果不是最多的微生物，真菌，病毒以及甚至昆蟲害蟲的致病性似乎歸功于蛋白被導入植物細胞核的必要步驟。
De Wit等(WO 91/15585,1991)描述了保護植物抵抗病原體的方法，此方法通過將編碼特異引發蛋白的無毒性基因的多聚核苷酸序列整合到包含相應抗性基因的植物基因組中。無毒性基因以使基因表達僅發生在病原體感染植物的位置的方式調控。De Wit方法的目的是通過提供無毒性基因和使其轉錄和翻譯成活性的蛋白產物來激活植物防御反應。在De Wit方法中沒有說明或建議無毒性基因或其產物將被阻遏或干擾。相反地，本發明的目的是在無毒性基因產物有助于條件致病性的情況下抑制或阻遏無毒性基因產物的正常功能。
已描述了編碼有效地抗特異靶病毒的抗體的基因在植物中的轉移。Tavladoraki等(1993)首先證實了在植物中抗病毒疾病抗體的有效用途。但是，在本領域中沒有說明或建議針對在植物中表達對植物病原體無毒性或致病性蛋白免疫反應的抗體。
如抗體所表現的，核酸和蛋白常具有相同的高親和性和分子特異性水平的與其它分子結合的能力。一種全新的遺傳技術正在圍繞從大的隨機序列庫中分離極其稀少的具特異配體結合特征(與抗體相似)的核酸序列的能力而發展。所用方法是重復選擇和擴增方案，有時稱作SELEX(指通過指數富集的配體的系統演化；參考Tuerk&Gold；Gold)。所要篩選的具特異配體結合特征的分子被稱為“aptamers”(來自拉丁語aptus，裝配；參考Szostak,J.W.1992)。雖然術語aptamer最初用來描述核酸分子，但是它也同樣適用于蛋白(參考Tuerk&Gold,1990；Colas等，1996)。
描述了能夠抑制蛋白功能的編碼RNA或蛋白aptemers(能與靶蛋白高親和性結合)的基因(Conrad等；Colas等)。對于靶蛋白結合的特異性，aptemers的功能與抗體功能相似。Aptemers未在植物中表達并且在本領域中沒有說明或建議針對結合植物病原體無毒性或致病性蛋白的aptamers在植物內表達。
發明簡述主題發明涉及植物中表達的抗體，其中抗體對植物病原體和害蟲的avr/pth初級(蛋白)基因產物免疫反應。這些基因編碼的Avr/Pth蛋白典型地包括NLSs，其在指導蛋白進入植物細胞核中起重要作用。Avr/Pth蛋白從侵入的病原體中活躍地輸出，輸入到植物細胞質，并運輸到植物細胞核。通過與已表達的抗Avr/Pth抗體結合，Avr/Pth蛋白易失活，因而阻斷植物中疾病產生的必要步驟。
主題發明也涉及編碼抗體或aptemers的核苷酸分子，抗體和aptemers結合到Avr/Pth蛋白或含NLSs的蛋白上。
主題發明也涉及保護植物不受致病生物侵害的方法。avr/pth基因或編碼NLSs基因的表達在植物中提供了對包括任何細菌，真菌，病毒，昆蟲或致病性所需的其它生物的病原體的抗性。
主題發明還涉及用編碼本發明的抗Avr/Pth和aptemers的抗體多聚核苷酸分子轉化的植物和植物組織。本發明的另一方面是表達抗Avr/Pth或抗Avr/Pth aptemers抗體的植物和植物組織。附圖簡述
圖1表示用兔多克隆抗PthA抗血清標記的黃單胞菌細胞粗溶物的Western印跡。泳道1，柑橘黃單胞菌株3213(Gabriel等，1989)；泳道2,3213,Xcl.2(pthA∷npt-sac)的標志-封閉衍生物(Yang等，1995)；泳道3，野油菜黃單胞菌3048(Gabriel等，1989)；泳道4，轉接合子3048/pZit 45(PthA+)(Swarup等，1992)。星號表示PthA或其截斷的衍生物。泳道1中粗粗的頂端條帶是雙重的。序列簡述SEQ ID No.1是根據主題發明可以使用的PCR引物。
SEQ ID No.2是根據主題發明可以使用的PCR引物。
SEQ ID No.3是根據主題發明可以使用的PCR引物。
SEQ ID No.4是根據主題發明可以使用的PCR引物。
SEQ ID No.5是根據主題發明可以使用的PCR引物。
SEQ ID No.6是根據主題發明可以使用的PCR引物。
SEQ ID No.7是根據主題發明可以使用的PCR引物。
SEQ ID No.8是根據主題發明可以使用的PCR引物。發明詳述主題發明涉及與avr/pth基因的蛋白產物免疫反應的抗體。典型地，avr/pth基因產物具有細胞核定位信號(NLSs)，其功能是指導基因產物進入植物細胞核。主題發明的抗體結合到由aptamers與avr/pth基因編碼的Avr/Pth蛋白上并使其失活，于是阻止蛋白運輸到植物細胞核。主題發明的抗體和aptamers也可以用于純化Avr/Pth蛋白或用于鑒定Avr/pth蛋白的免疫組織學研究。發明范圍內所包含的avr/pth基因產物包括所有病毒，微生物，昆蟲，真菌和植物來源的avr/pth基因。
通過用Avr/Pth蛋白，或其片段，或NLS肽免疫接種合適的寄主動物，可以產生抗Avr/Pth或抗NLS抗體。在優選的實施方案中，用純化的全長Avr/Pth蛋白免疫接種動物。另一方面，可以用對應全長蛋白的氨基，羧基或中間部份免疫接種動物。可以從合適的病原體如黃單胞菌中純化或克隆蛋白或肽，或者用肽合成儀或相同方式合成蛋白或肽。也可以針對含NLS氨基酸模式如K-R/K-X-R/K的肽產生抗體(Yang,Y.和Gabriel,D.W.,1995)。
根據標準方法從免疫接種動物的抗體分泌細胞中產生雜交瘤。產生雜交瘤和單克隆抗體的方法在本領域內眾所周知(Kohler和Milstein,1995)。篩選產生與Avr/Pth蛋白和/或NLS肽反應的抗體的雜交瘤。為了確定抗體結合到蛋白的哪個區域，可用限制酶處理克隆的avr/pth基因產生不同的基因片段。這些可能對應基因的5’,3’，或中間區域的片段可以被亞克隆、表達和用干抗體篩選程序。優選地，篩選對蛋白具有最高結合親合性的抗體。
使用標準分子生物學技術從所選的雜交瘤中克隆編碼本發明的抗Avr/Pth抗體的多聚核苷酸序列。典型地，從所挑選的雜交瘤中分離mRNA并且逆轉錄成cDNA。在優選的實施方案中，通過使用聚合酶鏈反應(PCR)和對免疫球蛋白可變輕鏈和重鏈區特異的PCR引物，從所選的雜交瘤的cDNA序列擴增編碼抗體的多聚核苷酸序列。然后，克隆的抗體基因序列被整合到合適的表達載體中并用來轉化植物或植物組織。在本領域中用異源基因轉化植物的方法是眾所周知的。在優選的實施方案中，用幾種不同抗體基因轉化植物或植物組織，這樣植物能夠產生抗體和能結合到選自Avr/Pth蛋白氨基，羧基和中間區域的位點上。根據主題發明轉化的植物中所用表達系統可選擇誘導型地或組成型地表達抗Avr/Pth抗體。植物中表達的抗體也在此處稱為“植物抗體”。轉化的植物可以通過植物產生的主要抗體的作用防止表達avr/pth基因的病原生物入侵，其中“植物抗體”結合到avr/pth基因的蛋白產物上，由此抑制蛋白產物的功能。
主題發明的抗體可以使用存在合適融合伙伴細胞系的任何動物，從雜交瘤中制備。在列舉的實施方案中，用小鼠淋巴細胞產生雜交瘤。其它動物比如大鼠、猴、綿羊、兔，山羊和豬也可以用來產生雜交瘤。
此處所用術語“抗體”是指結合到抗原或半抗原的抗原決定基上的免疫球蛋白或其片段。在本發明的優選實施方案中，抗體是二價的并至少包含免疫球蛋白可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)。主題發明也包括抗體的單價形式。
此處所用術語“aptamer”是指具有與靶蛋白分子高度親和性和特異性結合能力的核苷酸或蛋白。
至今所測出的黃單胞菌avr/pth基因家族的每個成員的預測氨基酸序列同一性大于95％；因此，根據主題發明可以容易地制備能結合多數，如果不是全部，avr/pth基因家族的蛋白的抗體。任何黃單胞菌Avr/Pth蛋白和進入植物細胞的其它致病性蛋白可被抗體抑制并且是在本發明范圍內。本發明包括的Avr/Pth蛋白可以包括，但不限于，AvrB4,Avrb6,Avrb7,AvrBs3,AvrXa7,AvrXa10,AvrB101,AvrB102,PthA,PthB,PthC,PthN,PthPC和PthP。
本發明的另一方面是含編碼本發明抗體或aptamers的核苷酸序列的多聚核苷酸分子。多聚核苷酸分子可以由RNA或DNA組成。優選地，多聚核苷酸分子由DNA組成。主題發明多聚核苷酸分子可以整合到合適的多聚核苷酸載體中，如克隆或表達載體，所有這些對本領域技術人員是眾所周知的。本領域技術人員可以選擇載體，使得植物中主題多聚核苷酸序列轉化和表達達到最大程度。
主題發明也涉及抵抗對植物致病的生物保護植物的方法。此處所提供的方法包含使植物具有產生抗體或aptamers的能力，此抗體或aptamers有結合到和抑制侵入生物產生的蛋白的功能，此蛋白對在植物中由侵入生物致病或產生疾病是必不可少的。在優選實施方案中，用編碼抗體或aptamer的多聚核苷酸分子轉化植物，此抗體或aptamer能結合到病原生物avr/pth基因編碼的Avr/Pth蛋白上。在一個實施方案中，用編碼不同抗體和/或aptamers的多個不同多聚核苷酸分子轉化植物，此抗體和/或aptamers具有對靶蛋白的不同的結合特異性。
主題發明的另一方面是用編碼主題發明的抗體和/或aptamers的多聚核苷酸分子轉化的植物或植物組織。任何轉化植物或植物組織，使異源DNA整合到植物基因組中并在植物細胞中表達該DNA產生主題抗體或aptamer的方法都在本發明范圍內的。主題發明的植物包括單子葉和雙子葉品種。一般的本領域技術人員能夠容易地選擇和利用對特定的植物類型和品種最適合的克隆和轉化方法。本發明范圍內的植物組織可舉例為，但不限于，原生質，植物細胞，植物種子和籽苗組織。
以下是說明用于實施主題發明的材料和方法的實施例。這些實施例不應認為是限制并不準備作為本發明的材料和方法所有可能的修改的詳細記述。實施例1抗體的制備克隆到pET-19b表達載體(Novagen,Inc.,Madison,WI)的pthA編碼的蛋白產物被純化用作免疫原，產生結合到Avr/Pth蛋白上的抗體。pET-19b載體產生具有10個組氨酸殘基的N-末端前導序列的翻譯的基因融合產物，這些組氨酸殘基作為親和純化“標記”。通過使用摻入了不移動的二價陽離子(Ni++)的支持樹脂，“組氨酸結合”樹脂(Novagen)的親和層析法純化PthA蛋白。來自親和柱的蛋白洗脫液在制備SDS聚丙烯酰胺凝膠上通過蛋白電泳進一步純化，從凝膠上切下大約130kDa條帶并電洗脫蛋白。來自制備SDS/PAGE凝膠的電洗脫蛋白用來制備對PthA蛋白特異的抗體。
用純化的PthA蛋白免疫接種兔子以產生抗PthA的多克隆抗體。對于Western印跡，黃單胞菌細胞在PYGM培養液中生長，離心收獲細胞并在樣品緩沖液(50mM Tris-HCl,pH6.8,10％甘油，2％SDS,0.1％溴酚藍)中煮沸2分鐘。裂解物在11,600xg離心5分鐘，在8％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，并且分離的蛋白轉移到硝酸纖維素濾膜上。膜用抗PthA抗體探測并用堿性磷酶酶偶聯的羊抗-兔抗體(Sigma Chemical Co.)顯色。圖1表示用兔抗PthA多克隆的抗體標記的黃單胞菌細胞裂解物的Western印跡。
在另一個實施方案中，使用如上描述的純化的組氨酸標記的PthA蛋白，可以產生抗pthA基因產物的5’端，3’端和重復單位的鼠單克隆抗體。小鼠雜交瘤先與PthA蛋白的不同部分反應來篩選。從原始啟動子到StuⅠ位點的pthA5’端已在pET-196中克隆和表達；它編碼240個氨基酸的推測的肽。分別編碼660個氨基酸和260個氨基酸的推測肽的從StuⅠ到HincⅡ位點的pthA基因的中部部分和自HincⅡ的3’端，也可以分別克隆到合適的pET載體中并表達的融合的翻譯產物。這三種組氨酸標記基因融合體可在大腸桿菌或其他合適的宿主中表達并且從中獲得粗提蛋白制品。然后將蛋白制品用于ELISA檢測來篩選分泌與融合蛋白免疫反應的抗體的雜交瘤。選擇性地，蛋白制品在“組氨酸結合”樹脂上純化，然后用于抗體篩選。通過ELISA篩選顯示了對PthA蛋白的或氨基，或羧基或中間區域有強烈反應的抗體來分離和克隆編碼抗體的DNA序列。實施例2編碼抗體的和aptamer的DNA序列的制備根據ELISA和Western印跡篩選結果，產生與PthA蛋白的或氨基，或羧基，或中間區域反應的單克隆抗體的雜交瘤可以用來作為抗體基因的來源，此抗體基因用來轉化植物或植物組織。將使用的方法遵從Danielsson&Borrebaeck(1992)的方法，在此引用作為參考。
所挑選的雜交瘤細胞系在培養基中生長并用Ultraspec RNA分離系統(Biotecx Labs,Houston)提取全部RNA。分光光度計定量RNA后，用逆轉錄酶和寡(dT)引物合成mRNAs的cDNA拷貝。然后，使用結合下列PCR引物的聚合酶鏈反應(PCR)擴增對應于免疫球蛋白(Ig)mRNA輕鏈和重鏈的特異cDNA，這些PCR引物已設計用來擴增小鼠特異的抗體基因(下面的引物序列是從5’到3’表示；限制位點下面劃線)擴增可變重鏈(VH)保守區的引物
5’引物(SEQ ID NO.1)(C/G)AG GT(C/G)(A/C)A(A/G)CTG CAG(C/G)AG TC(A/T)GG 3′PstⅠ3’引物(SEQ ID NO.2)TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC 3′BstEⅡ擴增可變輕鏈(VL)保守區的引物5’引物(SEQ ID NO.3)GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCT CCA 3′SacⅠ3’引物(SEQ ID NO.4)CCG TTT CAG CTC GAG CTT GGT CCC 3′XhoⅠ可選擇的3’引物(SEQ ID No.5和SEQ ID NO.6)(如果用第一個3’引物沒有獲得PCR產物時可使用)5′CCC GAA TTC TTA GAT CTC CAG CTT GGT CCC 3′(SEQ ID NO.5)5′CCC AAG CTT GAC ATT GTG ACC CAG TCT CCA 3′(SEQ ID NO.6)用標準PCR方法擴增抗體cDNA。優選將表達的抗體基因形成二價分子。二價抗體片段在細菌中克隆和表達(Holliger等，1993)。構建二價抗體片段使得可變重鏈區的羧基末端直接與輕鏈的氨基末端融合；因此，這兩個末端自聯是不可能的。在VH和VL片段的第一次PCR擴增后，由PCR測序確定片段末端的正確DNA序列。用以正確序列信息為基礎的引物進行第二次PCR擴增。引物也可以摻入特異的限制內切酶位點以簡化到pET-226(Novagen,Madison,Wisconsin)轉錄/表達載體中的克隆，以及提供Kozak保守序列，一個閱讀框架內ATG翻譯起始位點和一個終止密碼子第2輪VH5’引物(SEQ ID NO.7)5′TCG GAT CCG GAA ACC ATG(C/G)AG GT(C/G)(A/C)A(A/G)CTG CAG(C/G)AGTC(A/T)GG 3′BamHⅠ KozakPstⅠ第2輪VL3’引物(SEQ ID NO.8)5′TCC CCG GGT ACC TCA CCG TTT CAG CTC GAG CTT GGT CC3′SmaⅠKpnⅠ *** XhoⅠ***翻譯終止密碼子最初PCR擴增所用的相同的VH3’和VL5’引物也可用于第2輪PCR擴增。
線型VH-載體-VL構建體經Klenow補平和平末端聯接形成最終的閉環分子。然后BamHⅠ到XhoⅠ限制性片段可以重新克隆到合適的表達載體中并根據已知技術用于轉化植物。例如，Bam HⅠ到XhoⅠ限制性片段可以克隆到大腸桿菌表達載體pET-226中，形成閱讀框架內融合體，此融合體編碼一個peIB前導序列(用于從大腸桿菌中輸出)和一個蛋白羧基末端(用于蛋白純化)聚組氨酸標記。在pET-226中產生基因融合后，可用NdeⅠ/XhoⅠ將包括pel B前導序列的整個構建體重新克隆到pQY29.2中，于是提供一個前導序列，此序列允許小的抗Avr/Pth抗體肽輸出到植物細胞壁。為了為任何克隆的細菌基因提供植物啟動子，本實驗室構建了載體pQY29.2(Yuan和Gabriel，未發表)。在這方面，含植物啟動子和轉錄終止子和聚腺苷酸信號的任何合適的載體同樣相當好地滿足。載體pQY29.2在一個ATG翻譯起始密碼子和來自花椰菜花葉病毒的35s啟動子的下游帶有一個為克隆插入的開放閱讀框架的多接頭。一個胭脂堿合成酶的3’轉錄終止子和聚腺苷酸信號位于多接頭的另一側。載體被設計將與攜帶一個功能GUS報告基因的第2個質粒pGN 100(Bogusz等，1990)融合，并最終與第3個質粒pGA472(An等，1985)融合并提供用于植物轉化的一個新霉素抗性基因和T-DNA的左右邊界。用標準方法通過細菌接合將最后的構建體從大腸桿菌轉移到根癌土壤桿菌株AGL1(Lazo等，1991)中。因為在pQY29.2上BamHⅠ和KpnⅠ位點是單一的，擴增的VH和VL多聚核苷酸可以以相對于pQY29.2質粒的啟動子和胭脂堿合成酶的3’轉錄終止子正確的方向插入。具有移動pel B前導序列的pQY29.2載體內多聚核苷酸構建體也可以制備和用來轉化植物。
像Turk&Gold(1990)；Szosbak(1992)；Gold(1995)；Colas等(1996)和Conrad等(1996)所描述的，生產和挑選aptamers的方法在本領域已是眾所周知；每個方法在此引入作為參考。實施例3 用編碼抗Avr/Pth抗體的DNA轉化植物使用標準材料和方法，用編碼免疫反應的抗Avr/Pth抗體或aptamers的多聚核苷酸分子轉化植物和植物組織。例如，根癌土壤桿菌已被廣泛用來用異源DNA轉化植物(Smith等，1995所述)。異源DNA被整合到根癌土壤桿菌的Ti-質粒中并且質粒重新導回細菌中。然后典型地通過在植物或植物組織的傷口部位接種，用細菌感染要轉化的植物。然后將含異源DNA的Ti質粒轉移到植物細胞核中，在細胞核中已轉移的DNA整合進寄主細胞基因組中。
植物和植物組織也可以用如異源DNA的原生質攝取的方法(Lorz等，1985)和通過用高速的已包被將導入植物的DNA的微粒顆粒轟擊(Klein等，1998)來轉化植物和植物組織，顆粒轟擊方法特別適合和廣泛適用于單子葉植物轉化，特別是禾本科植物的轉化。
應當理解此處所描述的實施例和實施方案僅僅是為了說明的目的，各種最佳方案，修改方案或根據其的變化將被提議給相關領域的技術人員并且包括在此申請的精神和范圍內以及附加的權利要求范圍內。
此處全文引用下列參考文獻作為參考。參考文獻
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PCT專利號.91/15585，發表于1991年10月17日。
序列表(1)基本信息(ⅰ)申請信息人(A)申請人名稱University of Florida(B)街名223 Grinter Hall(C)城市Gainesville(D)州/省名Florida(E)國家US(F)郵政編碼(ZIP):32611(G)電話(352)392-8929(H)傳真(352)392-6600(ⅱ)發明名稱抑制植物害蟲和病原體的材料和方法(ⅲ)序列數目8(ⅳ)聯系地址(A)聯系人Saliwanchik&Saliwanchik(B)街名2421 N.W.41st street,Suite A-1(C)城市Gainesville(D)州名Florida(E)國家USA(F)郵政編碼(ZIP):32606(ⅴ)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.25(ⅵ)目前申請資料(A)申請號US(B)申請日1996年3月22日(C)分類
(ⅷ)律師/代理信息(A)名稱Lloyd,Jeff(B)登記號35,589(C)參考/著錄號UF-159C1(ⅸ)電信信息(A)電話(352)375-8100(B)電傳(352)372-5800(2)關于SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度22個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型DNA(合成)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1NAGGTNNANC TGCAGNAGTC NGG 23(2)關于SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度32個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型DNA(合成)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2TGAGGAGACG GTGACCGTGG TCCCTTGGCC CC 32(2)關于SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度24個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型DNA(合成)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3GACATCGAGC TCACCCAGTC TCCA 24(2)關于SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度24個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型DNA(合成)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4CCGTTTCAGC TCGAGCTTGG TCCC 24(2)關于SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度30個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型
(ⅱ)分子類型DNA(合成)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5CCCGAATTCT TAGATCTCCA GCTTGGTCCC 30(2)關于SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度30個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型DNA(合成)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6CCCAAGCTTG ACATTGTGAC CCAGTCTCCA 30(2)關于SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度41個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型DNA(合成)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7TCGGATCCGG AAACCATGNA GGTNNANCTG CAGNAGTCNG G41(2)關于SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征
(A)長度38個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型DNA(合成)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8TCCCCGGGTA CCTCACCGTT TCAGCTCGAG CTTGGTCC 38
權利要求
1．一種抗體，aptamer或其抗原結合片段，其中所述的抗體或aptamer結合到植物病原體的無毒性或致病性蛋白上。
2．權利要求1的抗體，其中所述的蛋白至少包括一個NLS。
3．根據權利要求1所述的抗體或aptamer，其中所述的蛋白由選自包括avr和pth基因的群體中的基因編碼。
4．權利要求3的抗體或aptamer，其中所述的基因選自包含黃單胞菌avr和pth基因的群體。
5．根據權利要求1所述的抗體或aptamer，其中所述的蛋白選自包含Avr4,hrpN,hrpZ,AvrB4,Avrb6,Avrb7,AvrBs3,AvrXa7,AvrXa10,AvrB101,AvrB102和PthA,PthB,PthC,PthN,PthPC和PthP的群體。
6．根據權利要求1所述的抗體或aptamer，其中所述的抗體包含VL和VH免疫球蛋白結構域。
7．根據權利要求1所述的抗體或aptamer，其中所述的抗體是單價的或二價的。
8．根據權利要求1所述的抗體或aptamer，其中所述的抗體在植物細胞中表達。
9．含編碼根據權利要求1所述的抗體或aptamer的核苷酸序列的多聚核苷酸分子。
10．一種保護植物免受植物病原體或害蟲侵害的方法，該方法包括將權利要求9的多聚核苷酸分子嵌合進該植物基因組中。
11．用權利要求9的多聚核苷酸分子轉化的植物。
12．根據權利要求11所述的植物，其中所述的植物是雙子葉植物。
13．根據權利要求11所述的植物，其中所述的植物是單子葉植物。
14．用權利要求9的多聚核苷酸分子轉化的植物組織。
15．根據權利要求14所述的植物組織，其中所述的植物組織選自包含原生質體，植物細胞，植物種子和籽苗組織。
全文摘要
主題發明關于賦予植物對植物病原體和害蟲抗性的材料和方法。描述了能免疫反應或結合和抑制無毒性和/或致病性基因的蛋白表達產物作用的抗體和aptamer,該基因包括,但不限于,上述基因的黃單胞菌avr/pth家族。主題發明的抗體功能通過在avr/pth基因的最初蛋白產物運輸到植物細胞核前將其阻止和變性來阻遏avr/pth基因的最初蛋白產物的作用。主題發明的方法涉及用編碼抗體的多聚核苷酸轉化植物。植物中抗體的表達帶來對病原體和害蟲的抗性。主題發明也關于編碼主題抗體的多聚核苷酸分子,以及用編碼主題抗體的多聚核苷酸分子轉化的植物和植物組織。
文檔編號C07K16/12GK1232502SQ97194125
公開日1999年10月20日 申請日期1997年3月25日 優先權日1996年3月25日
發明者D·W·加布里爾 申請人:佛羅里達大學