用于前列腺癌的免疫治療和免疫診斷的化合物及方法

專利名稱：用于前列腺癌的免疫治療和免疫診斷的化合物及方法
技術領域：
本發明總體上涉及前列腺癌的治療、診斷和監視。更具體地本發明涉及至少含有前列腺蛋白質的一部分的多肽。這樣的多肽可以用于治療前列腺癌的疫苗和藥物組合物。該多肽也可以用來制備如抗體等用于前列腺癌和病人的其它可能類型的腫瘤的診斷和進程監視的化合物。
前列腺癌是男性中最常見的癌癥類型，在50歲以上的男性中估計發病率為30％。大量的臨床證據顯示人前列腺癌有轉移到骨中的傾向，并且該疾病似不可避免地從雄激素依賴型發展為雄激素不應型，從而導致病人死亡率的增加。目前這一普遍性疾病在美國男性中導致癌癥死亡的原因中列第二位。
雖然有相當多的研究用于此疾病的治療，前列腺癌仍舊難以治療。通常，治療基于手術和/或放療，但這些方法在相當百分數的病例中無效。三種前列腺特異性蛋白質前列腺特異性抗原(PSA)和前列腺酸磷酸酶(PAP)限制了診斷和治療的能力。PSA的水平并不總與前列腺癌的存在相一致，它可以在一定百分數的非前列腺癌病例包括良性前列腺增生(BPH)中呈陽性。此外，PSA的測量值與前列腺的體積相關但不指示轉移的水平。
因此，本領域仍需要用于前列腺癌的改良的疫苗和診斷方法。
本發明提供用于前列腺癌的免疫治療和診斷的化合物和方法。一方面，提供了包含有如SEQ ID No.2和4-8列出的部分序列的前列腺蛋白質或是一種僅有保守性替換和/或修飾的差異的該蛋白質的變體的至少一個免疫原性部分的多肽。
在相關方面，也提供了編碼上面多肽的DNA序列、含有這些DNA序列的表達載體以及用這些表達載體轉染或轉化的宿主細胞。在優選的實施方案中，從由大腸桿菌(E.coli)、酵母和哺乳動物細胞組成的組中選擇宿主細胞。
本發明也提供了包含有一個或多個SEQ ID No.1-8,20,21,25-31或44-57的多肽、或者SEQ ID NO.9-19,22-24或32-43的核酸以及生理學可接受的載體的藥物組合物。本發明也提供了包含有一種或多種這樣的多肽或核酸以及非特異性免疫反應增強劑的疫苗。
在另一方面，提供了抑制病人中前列腺癌發展的方法，包括給所需的病人使用有效劑量的一種或多種SEQ ID No.1-8,20,21,25-31或44-57的多肽或是SEQ ID No.9-19,22-24或32-43的核酸。
在又一方面，提供了檢測病人中前列腺癌的方法，包括(a)獲自病人的生物學樣品與能結合到SEQ ID No 1-8,20,21,25-31或44-57的多肽上的結合試劑接觸；和(b)檢測樣品中與結合試劑結合的蛋白質或多肽。
在相關方面，提供了監視病人中前列腺癌發展的方法，包括(a)獲自病人的生物學樣品與能結合到SEQ ID No 1-8,20,21,25-31或44-57的多肽上的結合試劑接觸；(b)確定樣品中與結合試劑結合的蛋白質或多肽的數量；(c)重復步驟(a)和(b)；并比較在步驟(b)和(c)中檢測到的多肽的量。
在相關范圍內，本發明提供了與上述多肽結合的抗體，優選單克隆抗體以及含有這樣的抗體的診斷試劑盒和利用這樣的抗體抑制前列腺癌發展的方法。
本發明也提供了檢測前列腺癌的方法，包括(a)從病人獲得生物學樣品；(b)用聚合酶鏈式反應中的至少兩個寡核苷酸引物接觸該樣品，至少有一個寡核苷酸引物特異于選自SEQ ID No 9-19,22-24和32-43的一個DNA序列；和(c)檢測樣品中在有該寡核苷酸引物存在時擴增的DNA序列。在一個實施方案中，寡核苷酸引物包含有選自SEQ ID No 9-19,22-24和32-43的一種DNA序列的至少約10個連續的核苷酸。
在另一方面，本發明提供了檢測病人的前列腺癌的方法，包括(a)從病人獲得生物學樣品；(b)用特異于選自SEQ ID No.9-19,22-24和32-43的一個DNA序列的寡核苷酸探針接觸該樣品；(c)檢測樣品中與該寡核苷酸探針雜交的DNA序列。在一個實施方案中，該寡核苷酸探針包括選自SEQ ID No.9-19,22-24和32-43的一個DNA序列的至少約15個連續的核苷酸。
一旦參考下面詳細的說明和附圖，本發明的這些或其他方面將顯而易見。所有此處公開的文獻均以各自獨立的方式全文引用作為參考。


圖1顯示獲自用大鼠前列腺提取物免疫的大鼠血清的Western雜交分析。
圖2顯示圖1的大鼠免疫制品的非還原性SDS-PAGE。
圖3顯示一種大鼠類固醇結合蛋白的推測的人對應同源物與孕酮和雌莫司汀的結合。
如上所述，本發明總體上涉及用于前列腺癌的免疫治療、診斷和監視的物質和方法。發明的物質總體上講是含有至少為一種顯示與人前列腺血清有免疫反應性的人前列腺蛋白質的一部分的多肽。本發明也包括與本發明的多肽結合的分子(如抗體或其片段)。這樣的分子此處稱為“結合試劑”。
具體的，本發明公開了包含由SEQ ID No.2和4-8提供的人前列腺蛋白質或者是與該蛋白質僅有保守性替換和/或修飾差異的變體的至少一部分的多肽。此處所用“多肽”一詞包括任何長度(含全長蛋白質)的氨基酸鏈，其中氨基酸殘基通過共價肽鍵相連。因此，包含有一種上述前列腺蛋白質中的一部分的多肽可以完全由該部分組成，或是該部分包含在帶有附加序列的較大的多肽中。附加序列可以源自天然蛋白質或異源蛋白質，且這樣的序列可以是免疫反應性和/或抗原性的。
此處所用人前列腺蛋白質“免疫原性部分”是與源自患自身免疫前列腺炎的人的血清反應或者能與源自自身免疫前列腺炎的大鼠模型的血清反應的部分。換言之，一個免疫原性部分能引發一種免疫反應并能結合到前列腺炎血清中存在的抗體上。自身免疫前列腺炎可以在，例如，通過注射卡介苗(BCG)(一種無致病力的牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis))治療膀胱癌之后發生。在自身免疫前列腺炎的大鼠模型中，用大鼠前列腺的去污劑提取物免疫大鼠。這些來源中任一來源的血清可以用于和此處所述的人前列腺衍生多肽反應。抗體結合測定可以利用如本領域普通技術人員已知的任一方法來進行，例如，在Harlow和Lane，《抗體實驗室手冊》(Antibody:A Laboratory Manual)冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1988中所述。例如，多肽可以固定在固相支持物(如下述)并和病人血清接觸以使血清內的抗體與固定化的多肽結合。除去未結合的血清，用如125I標記的蛋白A檢測結合的抗體。
此處所述的“變體”是與所述多肽僅有保守性替換和/或修飾差異的多肽，因而該多肽或與該多肽結合的分子的免疫治療性、抗原性和/或診斷性質均保留。對于有免疫反應性質的前列腺蛋白質，通常通過修飾上述多肽序列之一并評價該修飾過的多肽的免疫反應性而識別變體。對用于產生診斷性結合試劑的前列腺蛋白質，可以通過評價修飾過的多肽的產生檢測有無前列腺癌的抗體的能力來識別一種變體。例如，可以用此處所述的代表性方法制備和測試這種修飾過的序列。
此處所用“保守性替換”一詞是指一種氨基酸由有相近性質的另一種氨基酸取代，因而肽化學領域普通技術人員可預期到該多肽的二級結構和親水性質基本上未改變。一般地，下列氨基酸組代表保守性改變(1)ala,pro,gly,glu,asp,gln,asn,ser,thr；(2)cys,ser,tyr,thr；3)val,ile,leu,met,ala,phe；(4)lys,arg,his和(5)phe,tyr,trp,his。
此外，變體也可以含有其他修飾，包括對該多肽的抗原性質、二級結構和親水性質有最小影響的氨基酸的刪除或添加。例如，一個多肽可以偶連到該蛋白質的N端的信號(或先導)序列上，其在翻譯同時或翻譯后指導該蛋白質的轉移。此多肽也可以偶連到一個接頭或便于該多肽的合成、純化或識別的其它序列上(如聚組氨酸)上，或被偶連到增加該多肽結合到固相支持物的序列上。例如，一個多肽可被偶連到一個免疫球蛋白Fc區域上。
可以從合適的人前列腺癌細胞系如Ln Cap.fgc(ATCC No.1740-CRL)中分離具有由SEQ ID No 1-8,20,21和25-31提供的序列之一的多肽。Ln Cap.fgc是一種特別好的人前列腺癌的代表性前列腺癌細胞系。如人癌一樣，Ln Cap.fgc細胞在SCID小鼠中異種移植形成不斷生長的腫瘤，應答睪酮，分泌PSA且應答骨髓成分(如轉鐵蛋白)的存在。具體地，該多肽可以用如Sambrook等人《分子克隆》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(和其中所引用的文的以及下面詳細敘述的方法，通過表達用人前列腺炎血清篩選Ln Cap.fgc cDNA文庫分離。SEQ ID No.48和49的多肽可以通過用上面討論過的自身免疫前列腺炎的大鼠模型中的血清篩選從Ln Cap/fgc細胞系分離到。SEQ ID No.50-56的多肽可以用如實施例4中詳述的方法通過人前列腺炎血清篩選從Ln Cap/fgc細胞系中分離。SEQ ID No.44-47的多肽可以如實施例2詳述的方法從人精液中分離。一旦獲得編碼多肽的DNA序列，任何上述修飾均可利用如寡核苷酸導向的位點特異性突變的標準突變技術而方便地引入。
此處公開的多肽也可以通過合成或重組方法來產生。小于約100個氨基酸的一般地小于50個氨基酸的多肽的合成可以用本領域普通技術人員周知的技術來產生。例如，這樣的多肽合成可以用任一商業上可能的固相技術如Merrifield固相合成法來完成，其中氨基酸被順序加入到生長的氨基酸鏈上。見Merrifield美國化學協會雜志(J.Am.Chem.Soc.)85:2149-2146,1963。多肽的自動合成設備可從如AppliedBioSysterms公司(Foster City,CA)的供應商獲得，且按制造商指示操作。
此外，任何上述多肽均可以通過將編碼該多肽的DNA序列插入到表達載體并且在合適的宿主中表達該蛋白的方法重組生產。任何本領域普通技術人員知曉的表達載體均可用于表達本發明的重組多肽。表達可以在任何合適的用含有編碼重組多肽的DNA分子的表達載體轉化或轉染的宿主細胞中來實現。合適的宿主細胞包括原核細胞、酵母和高等真核細胞。優選利用的宿主細胞為大腸桿菌、酵母或者是如CHO細胞的哺乳動物細胞系。以這種方式表達的DNA序列可以編碼天然存在的多肽、天然存在的多肽的一部分或是它的其它變體。
一般地，不論其制備方法如何，此處公開的多肽以基本上純的形式制得(即用氨基酸組成和一級結構分析該多肽是均質的)。優選的，該多肽純度至少為90％，更優選的純度為至少95％，最優選的為純度至少99％。在特定的優選的實施方案中(在下面進一步詳述)，基本上純的多肽加入在藥物組合物或疫苗中用于此處公開的一種或多種方法中。
含有前列腺蛋白的一個免疫原性部分的本發明的多肽可以用于前列腺癌的免疫治療，其中該多肽刺激病人自身的針對前列腺腫瘤細胞的免疫應答。另一方面，本發明提供了利用SEQ ID No.1-8,20,21,25-31和44-57的一種或多種免疫反應性多肽(或編碼這樣的多肽的DNA)用于病人中前列腺癌的免疫治療的方法。此處所用“病人”是指任何溫血動物，優選人。病人可以受到一種疾病的困擾，也可以沒有可檢測到的疾病。因此，上述免疫反應性多肽可用于治療前列腺癌或抑制前列腺癌的發展。可在手術除去原發腫瘤和/或用放療及傳統化療藥物治療之前或之后使用該多肽。
在這些方面，該多肽通常包含在藥物組合物和/或疫苗之中。藥物組合物可以包含一種或多種多肽，每種均含有一個或多個上述序列(或其變體)以及生理學可接受的載體。疫苗可以包含一種或多種這樣的多肽以及非特異性免疫反應增強劑如一種佐劑，生物可降解的微球體(如聚乳酸乙交脂)或脂質體(該多肽整合于其中)。藥物組合物或疫苗也可以含有前列腺細胞抗原的其他表位，這些表位或整合成組合多肽(即含有多個表位的單一多肽)或為分離的多肽形式。
此外，藥物組合物或疫苗可以含有編碼一種或多種上述多肽的DNA，因而該多肽就地產生。在這樣的藥物組合物和疫苗中，該DNA可以在任何本領域技術人員知曉的給藥體系中存在，包括核酸表達體系、細菌和病毒表達體系。合適的核酸表達體系包含在病人中表達所必需的DNA序列(如合適的啟動子)。細菌給藥體系包括使用一種在其細胞表面表達前列腺細胞抗原的一個表位的細菌(如卡介菌)。在優選的實施方案中，可以利用病毒表達體系(如牛痘或其它痘病毒，反轉錄病毒或腺病毒)，其中包括利用非致病性(缺陷型)、有復制能力的病毒導入該DNA。已公開了合適的體系，如在Fisher-Hoch等人，PNAS 86:317-321,1989；Flexner等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.569:86-103,1989；Flexner等人，疫苗(Vaccine)8:17-21,1990；美國專利No.4,603,112、4,769,330和5,017,487；WO 89/01973；美國專利No.4,777,127；GB2,200,651；EP0,345,242；WO 91/02805；Berkner，生物技術(Biotechniques)6:616-627,1988；Rosenfeld等人，科學252:431-434,1991；Kolls等人，PNAS 91:215-219,1994；Kass-Eisler等人，PNAS 90:11498-11502,1993；Guzman等人，循環(Circulation)88:2838-2848,1993和Guzman等人，Cir.Res.73:1202-1207,1993。將DNA整合到這些表達體系中的方案為本領域普通技術人員知曉。該DNA也可以是“裸露”的，如公開的PCT申請WO 90/11092和Ulmer等人，科學259:1745-1749所述以及Cohen科學259:1691-1692,1993綜述。將DNA包被到能有效轉移入細胞的生物可降解的珠上可以增加裸露DNA的吸收。
用藥的途徑、次數和劑量可以隨個體不同而變化，也可以參照目前在其它疾病的免疾治療中使用的方法。一般地，藥物組合物和疫苗可以通過注射(如皮內、肌內、靜脈內或皮下)、鼻腔內(如通過吸氣)或口服給藥。第1到第10劑的給藥可持續長于3-24周時間。優選使用4劑，每劑間隔3個月，其后可定期加強用藥。對于單個病人也可以用其它方案。合適的劑量是在受治療的病人中能有效提高針對前列腺腫瘤細胞的免疫應答的多肽或DNA的量。合適的免疫應答至少比基線水平(如未處理的)要高10-50％。一般地，一劑中多肽的量的(或由一劑中DNA就地生產的)范圍從約1pg到約100mg每公斤宿主，典型地從約10pg到約1mg，優選從約100pg到約1μg。合適的劑量的體積隨病人的大小而變化，典型地范圍從約0.01毫升到約5毫升。
雖然任何本領域普通技術人員知曉的合適的載體均可用在本發明的藥物組合物中，載體的類型則依給藥方式的不同而不同。對于非腸道給藥，如皮下注射，優選的載體包括水、生理鹽水、乙醇、脂肪、蠟和/或緩沖液。對于口服給藥，任何上述載體或固相載體諸如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖和/或碳酸鎂均可以使用。生物可降解的微球體(如聚乳酸乙交脂)也可以用作本發明的藥物組合物的載體。合適的生物可降解的微球體已公開于如美國專利No.4,897,268和5,075,109中。
許多非特異性免疫反應增強劑均可用于本發明的疫苗。例如可以包括一種佐劑。大多數佐劑中包含用于防止抗原迅速分解的物質，如氫氧化鋁或礦物油以及如脂質體A、百日咳博德特氏菌(Bordella pertussis)或結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的非特異性免疫反應刺激物。這樣的佐劑可購買到，如福氏不完全佐劑和完全佐劑(Difco Laboratories,Detroit,MI)和Merck佐劑65(Merck and Company公司，Rathway,NJ)。
此處公開的多肽也可用于前列腺癌的離體治療。例如，可以利用商業化的細胞分離系統如CellPro Incorporated＇s(Bothell,WA)CEPRATETM系統(見美國專利No.5,240,856；5,215,926；WO89/06280；91/16116和92/07243)從病人的外周血中分離諸如T細胞的免疫系統細胞。分離的細胞用包含在如微球體中的一種或多種免疫活性多肽刺激以提供抗原特異性T細胞。利用標準技術使腫瘤抗原特異性T細胞群擴增并將這些細胞給回到病人中。
此外，本發明的多肽也可以用于產生諸如抗體或是其片段的能檢測轉移性人前列腺腫瘤的結合試劑。
本發明的結合試劑可以通過包括此處描述的代表性方法在內的本領域普通技術人員已知的方法制得。結合試劑能利用此處所述的代表性鑒定方法區分有和沒有前列腺癌的病人。換言之，針對前列腺蛋白或其合適的部分的抗體或其它結合試劑的出現將產生一個指示受該疾病困擾的至少約20％的病人中原發或轉移性前列腺癌存在的信號，并且產生一個指示在沒有原發或轉移性前列腺癌的至少約90％的個體中無該疾病存在的信號。這種前列腺蛋白的合適片段是指這樣的片段，它能產生一種在基本上所有的(至少約80％，優選至少約90％)利用全長蛋白質能指示前列腺癌的病人中指示原發或轉移性前列腺癌存在的結合試劑，還能在基本上所有用全長蛋白質測試時為陰性的樣品中指示不存在前列腺癌。下面敘述的代表性鑒定(如雙抗夾心鑒定)可用于評價結合試劑檢測轉移性人前列腺腫瘤的能力。
如此處所述制備的多肽產生能檢測原發或轉移性人前列腺腫瘤的能力一般可以通過產生針對該多肽的一種或多種抗體(如利用此處所述的代表性的方法)以及測定這種抗體在病人中檢測這種腫瘤的能力來評價。這種測定可以通過鑒定源自有和沒有原發或轉移性前列腺癌的病人的生物學樣品中與所產生的抗體結合的多肽的存在來完成。這樣的鑒定可以如利用下面敘述的代表性方法來完成。產生用這種方法能檢測出至少20％原發或轉移性前列腺腫瘤的抗體的多肽被認為是能夠產生可檢測原發或轉移性人前列腺腫瘤的抗體。多肽特異性抗體可以單獨或聯合使用以增加敏感性。
能檢測原發或轉移性人前列腺腫瘤的多肽可以用作診斷病人前列腺癌或監視病人的疾病進展的標記。在一實施方案中，病人的前列腺癌可以通過評價獲自病人的生物學樣品中一種或多種上述多肽相對于預先確定的閾值的水平來診斷。如此處所用，合適的“生物學樣品”包括血液、血清、尿和/或前列腺分泌物。
可以利用任何特異于這種(些)多肽的結合試劑來評價一種或多種上述多肽的水平。在本發明中一種“結合試劑”是與上述的多肽結合的任何試劑(如一種化合物或細胞)。此處所用“結合”是指兩個分離的分子(每個均是游離的(即在溶液中)或是在細胞或固相支持物表面)之間的非共價結合，于是形成“復合物”。這樣的復合物可以是游離的或(共價地或非共價地)固定在支持材料的表面。結合的能力一般通過測定形成的復合物的結合常數來評價。結合常數是復合物濃度除以組分濃度的乘積獲得的數值。一般地，在本發明中當形成的復合物的結合常數超過103L/mol時這兩種化合物稱為“結合”。可以利用本領域普通技術人員周知的方法測定結合常數。
任何滿足上述要求的試劑均可以是結合試劑。例如，結合試劑可以是帶有或不帶有肽組分的核糖體、一種RNA分子或是肽。在一優選的實施方案中，結合配體是一種抗體或其片段。這種(些)抗體可以是多克隆或單克隆的。此外，抗體可以是單鏈的、嵌合的、CDR移植的或是人源化的。可以用此處敘述的或其它本領域普通技術人員知曉的方法制備抗體。
有許多本領域普通技術人員知曉的鑒定方法用于以結合配體檢測樣品中的多肽標記。見如Harlow和Lane，抗體實驗室手冊(Antibodies:A Laboratory Manual)冷泉港實驗室，1988。在一優選的實施方案中，該鑒定包括使用固定在固相支持物上的結合配體去結合多肽并與樣品的其余部分分離。結合的多肽可以再用含有報告基團的二級結合配體檢測。合適的二級結合配體包括與結合配體/多肽復合物結合的抗體。此外，可以利用競爭性鑒定，其中用一報告基因標記多肽并在結合配體與樣品孵育后將其結合到固定化的結合配體上。樣品成分抑制標記多肽與結合配體結合的程度是該樣品與固定化結合配體的反應性的指示。
固相支持物可以是本領域普通技術人員知曉的抗原可以附著的任何材料。例如固相支持物可以是微孔板中的樣品孔或是硝酸纖維膜或其它合適的膜。此外，支持物可以是一個珠子或園盤，如玻璃、玻璃纖維、膠乳或如聚苯乙烯或聚氯乙烯的塑料材料。該支持物也可以是磁性顆粒或光纖傳感器，如美國專利No.5,359,681所公開的。可以利用本領域技術人員知曉的在專利和科學文獻中詳細敘述的多種方法將結合試劑固定到固相支持物上。在本發明中，“固定”一詞指非共價結合(如吸附)和共價連接(可以是抗原和支持物上的功能基團直接連接或者可以是通過交聯劑方式的連接)。優選通過吸附到微孔板的孔上或膜上的固定。在這種情況下，吸附可以通過在合適的緩沖液中接觸在固相支持物上的結合試劑一段合適的時間來完成。接觸時間隨著溫度變化而變化，但典型地在約1小時到約1天之間。一般地，用范圍從約10ng到約10μg優選約100ng到約1μg量的結合試劑接觸塑料微孔板的孔(如聚苯乙烯或聚氯乙烯)就足以將足夠量的結合試劑固定。
一般地，通過首先用可以與支持物和如羥基或氨基的結合試劑上的功能基團反應的雙官能試劑與支持物反應來實現結合試劑在固相支持物上的共價連接。例如，結合試劑可以利用苯醌共價地連接到有適當的聚合物包被的支持物上，也可以通過用結合配體上的氨基和活性氫與支持物上的醛基縮合來完成共價連接(見，如Pierce免疫技術目錄和手冊，1991,A12-A13)在特定實施方案中，鑒定是雙抗夾心鑒定。此鑒定方法首先用樣品接觸已固定在固相支持物(通常為微孔板的孔)上的抗體，使樣品中的多肽結合到固定化的抗體上。未結合的樣品與固定化的多肽-抗體復合物分離，再加入能結合該多肽的另外位點的二抗(含有報告基團)。利用適于特異性報告基團的方法檢測保留在固相支持物上的二抗的量。
更具體的，一旦如上述將抗體固定在支持物上，支持物上其余的蛋白質結合位點將被封閉。任何本領域普通技術人員知曉的適宜的封閉劑如牛血清白蛋白或Tween 20TM(Sigma化學公司，St.Louis,MO)均可使用。固定化的抗體和樣品一起孵育，使多肽結合到抗體上。可以在孵育前用合適的稀釋劑如磷酸緩沖鹽水(PBS)稀釋樣品。一般地，合適的接觸時間(即孵育時間)是足以檢測出獲自前列腺癌病人的樣品中該多肽的存在的時間。優選的，接觸時間是足以實現至少達到結合和未結合的多肽之間的平衡水平的95％的結合水平。本領域普通技術人員知道達到平衡所需的時間可以通過鑒定經過一段時間而發生的結合水平容易地檢測到。室溫下，一般約30分鐘的孵育時間就足夠了。
可以通過用合適的如含有0.1％Tween20TM的PBS的緩沖液洗滌固相支持物除去未結合的樣品。然后將含有報告基團的二抗加入到固相支持物上。優選的報告基團包括酶(如辣根過氧化物酶)、底物、輔助因子、抑制劑、染料、放射性核素、發光基團、熒光基團和生物素。可以用本領域普通技術人員知曉的標準方法實現抗體與報告基團的偶聯。
二抗與固定化抗體-多肽復合物孵育足以檢測結合的多肽的一段時間。可以通過檢測一段時間后發生的結合水平確定合適的時間。除去未結合的二抗并用報告基團檢測結合的二抗。用于檢測報告基團的方法取決于報告基團的性質。對于放射性基團一般適于用閃爍計數或放射自顯影方法。可以利用光學方法檢測染料、發光基團和熒光基團。可以用偶聯到不同的報告基團(通常為放射性或熒光基團或酶)的抗生物素蛋白檢測生物素。一般通過加入底物(一般經過一段時間)隨后用光學或其它方法分析反應產物來檢測酶報告基團。
為檢測前列腺癌的存在與否，檢測自保留在固相支持物上的報告基團的信號一般可與預先確定的閾值相應的信號相比較。在一優選的實施方案中，閾值是當固定化抗體與來自無前列腺癌的病人的樣品一起孵育時測得的信號的平均值。一般地，產生高于預先確定的閾值三個標準偏差的信號的樣品認為是前列腺癌陽性。在另一優選的實施方案中，利用接收操縱曲線(Receiver Operator Curve)按照Sackett等人的方法(臨床流行病學臨床藥物的基礎科學(Clinical Epidemiology:A Basic Science for ClinicalMedicine)Little Brown and Co.,1985,106-7頁)確定閾值。簡言之，在此實施方案中，可以從成對的對應于每一用于診斷測試結果的可能閾值的真陽性率(即敏感性)和假陽性率(100％-特異性)的曲線中測出。最接近左上角(即包含最大的面積的值)的曲線中的閾值是最準確的閾值，產生高于此方法測得的閾值的信號的樣品可以認為是陽性。此外，閾值可以沿著曲線向左移動，以減少假陽性率或向右移，以減少假陰性率。一般地，產生高于此方法測得的閾值的信號的樣品可以認為是前列腺癌陽性。
在相關的實施方案中，可以用流動或條帶測試法，其中抗體固定在如硝酸纖維素膜上。在流動測試中，當樣品穿過膜時，樣品中的多肽結合到固定化的抗體上。當含有二抗的溶液流過膜時標記過的二抗就結合到抗體-多肽復合物上。可以用上述方法檢測結合的二抗。在條帶測試法中，結合有抗體的膜的一端浸入到含有樣品的溶液中。樣品沿著膜穿過含有二抗的區域移動到固定化抗體的區域。在固定化抗體區域的二抗的濃度指示前列腺癌的濃度。典型地，在那樣的位點二抗的濃度產生一種如可用肉眼看到的線性的樣式。無這樣的樣式指示陰性結果。一般地，選擇固定在膜上的抗體的量使之可以在含有用前面討論過的方法在雙抗夾心鑒定中足以產生陽性信號的多肽水平的生物樣品中產生可用肉眼辨別出的樣式。優選地，固定在膜上的抗體的量的范圍從約25ng到約1μg，更優選的從約50ng到約500ng。典型地用非常少量的生物學樣品即可完成這樣的測試。
當然，本發明的抗原和抗體適用于現有的各種其它鑒定方法中。上面的描述僅僅意在舉例。
在另一實施方案中，上面的多肽可以用作前列腺癌發展的標記。在此實施方案中，上述用于前列腺癌的診斷的鑒定方法進行一段時間后，評價反應性多肽的水平的變化。例如，可以每24-72小時測定一次，持續6個月到1年，其后在必要時進行。一般地，在那些經結合試劑檢測的多肽水平每次均增加的病人中前列腺癌是發展的。相反，當反應性多肽的水平持平或隨時間而下降時前列腺癌不發展。
用于上面方法的抗體可以用本領域普通技術人員已知的各種方法的任一種制得。見如Harlow和Lane，《抗體實驗室手冊》，冷泉港實驗室，1988。在一種這樣的技術中，將包含有抗原性多肽的免疫原初始注射到多種哺乳動物的任一種中(如小鼠、大鼠、兔、綿羊和山羊)。在此步驟中，本發明的多肽可以不經修飾用作免疫原。此外，對于相對短的多肽，如果該多肽與載體蛋白(如牛血清血蛋白或匙孔血藍蛋白)聯合使用可以引發較強的免疫反應。將免疫原注射到動物宿主中，優選根據與一次或多次加強免疫聯合的預先確定的方案，定期對動物取血。通過如利用偶聯到合適固相支持物上的多肽的親和層析的方法從抗血清中純化特異于該多肽的多克隆抗體。
可以例如利用Kohler和Milstein，歐洲免疫學雜志(Fur.J.Immunol.)6:511-519,1976的方法及其改進方法制備特異于目標抗原性多肽的單克隆抗體。簡言之，這些方法包括制備能產生具有期望的特異性抗體的永生細胞系。這種細胞系可以從例如獲自經如上所述免疫的動物的脾細胞中產生。脾細胞通過如與優選跟所免疫的動物同源的骨髓瘤細胞融合伴侶融合而永生化。可以利用多種融合技術。例如可以將脾細胞和骨髓瘤細胞與一種非離子型去污劑混合幾分鐘后以低濃度接種到支持雜合細胞生長但不支持骨髓瘤細胞生長的選擇性培養基上。優選的選擇技術是利用HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)選擇。經過足夠的時間后，通常為約1到2周，可觀察到雜交的克隆。挑選和測試單個克隆的針對該多肽的結合活性。優選有高反應性和特異性的雜交瘤。
可以從生長雜交瘤克隆的上清液中分離單克隆抗體。此外，可以利用不同技術增加產量，如將雜交瘤細胞系注射到合適的脊椎動物如鼠的腹腔中。然后可以從腹水或血中收獲單克隆抗體。可以通過常規技術如層析、凝膠過濾、沉淀和萃取除去抗體中的污染物。本發明的多肽也可以用于如親和層析步驟的純化方法中。
本發明的單克隆抗體也可以用作治療劑以縮小或消除前列腺腫瘤。抗體可以單獨使用(例如抑制轉移)也可以和一種或多種治療劑一起使用。此處所述合適的治療劑包括放射性核素、分化誘導劑、藥物、毒素及其衍生物。優選的核素包括90Y123I、125I、131I、186Re、188Re、211At和212Bi。優選的藥物包括氨甲蝶呤及嘧啶與嘌呤類似物，優選的分化誘導劑包括佛波酯和丁酸。優選的毒素包括蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、白喉毒素(diptheria toxin)、霍亂毒素、gelonin、假單胞外毒素、志賀菌毒素和美洲商陸抗病毒蛋白。
治療劑可以與合適的單克隆抗體直接或間接(如通過連接基團)偶聯(如共價連接)。當都具有一種取代基能與其它取代基反應時就可能在抗原和抗體之間直接反應。例如一種親核基團如氨基或巰基，一方面可以與含有羰基的基團如一種酸酐或酰鹵反應；另一方面可以與含有良好的離去基團的烷基(如鹵化物)反應。
此外，可以期望治療劑和抗體之間通過連接基團偶聯。連接基團可以作為間隔基使抗體與試劑間隔一定距離從而避免對結合能力的干擾。連接基團也可用于增加取代基在試劑或抗體上的化學反應性，從而增加偶聯的效率。化學反應性的增加也可以促進使用原來不可能利用的試劑或試劑上的功能性基團。
對于本領域技術人員而言顯而易見的有不同的雙功能或多功能試劑，包括同種或異種功能的(如Pierce化學公司，Rockford,IL的目錄中所述)，可以用作連接基團。例如可以通過氨基、羧基、巰基或氧化的糖殘基進行偶聯。有大量的參考文獻描述這種方法，如Rodwell等人的美國專利No.4,671,958。
對于在沒有本發明的免疫偶聯的抗體部分時更為有效的治療劑，可以期望使用一種在進入細胞過程中或一進入細胞后就可切割的連接基團。已有一系列不同的可切割的連接基團被描述。試劑從這些連接基團胞內釋放的機理包括通過二硫鍵的還原(如Spitler的美國專利No.4,489,710)，光不穩定鍵的照射(如Senter等人的美國專利No.4,625,014)，衍生氨基酸側鏈的水解(如Kohn等人的美國專利No.4,638,045)，血漿補體介導的水解(如Rodwell等人的美國專利No.4,671,958)和酸催化的水解(如Blattler等人的美國專利No.4,569,789)的方法切割。
有時期望將多種試劑偶聯到抗體上。在一實施方案中，一種試劑的多個分子偶聯到一個抗體分子上。在另一實施方案中，可以將多種類型的試劑偶聯到一種抗體上。不論具體的實施方案如何，可以通過不同方法制備與多種試劑的免疫偶聯物。例如多種試劑可以直接和一種抗體分子偶聯，或者可以利用可提供多個附著位點的接頭。此外，也可以利用載體。
載體可以多種形成包含試劑，包括直接或通過連接基團的共價鍵結合。合適的載體包括蛋白質如白蛋白(如Kato等人的美國專利No.4,507,234)、肽和多糖如氨基葡聚糖(如Shih等人的美國專利No.4,699,784)。載體也可以通過非共價鍵或通過膠囊化如在脂質體囊泡中(如美國專利No.4,429,008和4,873,088)等方法包含試劑。特異于放射性核素的載體包括放射性鹵化的小分子和鰲合化合物。例如美國專利No.4,735,792公開了代表性放射性鹵化的小分子和它們的合成。放射性核素的鰲合物可以從包括含有氮和硫原子作為用于結合金屬或金屬氧化物、核素的供體原子的鰲合復合物中形成。例如Davison等人的美國專利No.4,673,562公開的代表性鰲合化合物和它們的合成。
可以使用不同的路線用于抗體和免疫偶聯物的給藥。典型地，給藥采用靜脈內、肌內、皮下方式或在切除的腫瘤的著床部位給藥。顯然，抗體/免疫偶聯物的精確劑量依賴于所使用的抗體、腫瘤上抗原的密度和抗體的清除速率。
本發明的診斷性試劑也可以包括編碼一種或多種上述多肽或其一個或多個部分的DNA序列。例如至少在基于聚合酶鏈式反應(PCR)的鑒定中可以利用兩個寡核苷酸引物以擴增源自生物樣品的前列腺腫瘤特異性cDNA，其中至少一個該寡核苷酸引物特異于編碼本發明多肽的DNA分子。利用本領域周知的技術如凝膠電泳檢測擴增的cDNA的存在。類似地，在雜交鑒定中可以利用特異于編碼本發明多肽的DNA分子的寡核苷酸探針以檢測生物性樣品中發明多肽的存在。
此處所用“特異于DNA分子的寡核苷酸引物/探針”是指與目的DNA分子至少有約80％同源性的寡核苷酸序列，優選地至少約90％，更優選地至少約95％同源性。可以用于本發明診斷方法的寡核苷酸引物和/或探針優選地含有至少約10-40個核苷酸。在一優選的實施方案中，寡核苷酸引物包含編碼此處公開的一種多肽的DNA分子至少約10個連續的核苷酸。優選地，用于本發明診斷方法的寡核苷酸探針包含編碼此處公開的一種多肽的DNA分子的至少約15個連續的核苷酸。用于基于PCR的鑒定和雜交鑒定的技術均為本領域周知(見如Mullis等人，出處同前；Ehrlich，出處同前)。引物和探針因而可以用于在生物樣品優選地為血液、精液或前列腺和/或前列腺腫瘤組織中檢測前列腺和/或前列腺腫瘤序列。
提供下列實施例用以闡明而非限制。實施例1A．利用人前列腺炎血清從Ln Cap.fgc中分離多肽通過利用人前列腺炎血清以下列方法篩選人前列腺癌細胞系分離本發明的代表性多肽。通過從純化自人前列腺癌細胞系Ln Cap.fgc(ATCCNo.1740-CRL)的mRNA反轉錄合成，再將所得的cDNA克隆插入到λZAPⅡ(Stratagene,La Jolla,CA)的方法構建人前列腺癌cDNA表達文庫。
人前列腺炎血清獲自一診斷為服用BCG治療膀胱癌后患自身免疫前列腺炎的病人。用如Sambrook等人，《分子克隆》(Molecular Cloning:A laboratory Manual)，冷泉港實驗室，冷泉港，NY,1989中所述的方法用此血清篩選Ln Cap cDNA文庫。具體地，用約104pfu的Ln CapcDNA文庫涂布LB平板，42℃下培養4小時后獲得在異丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)浸透的硝酸纖維素濾膜上的首次噬菌斑印模。平板42℃下繼續培養5小時且通過37℃下過夜培養獲得第二次噬菌斑印模。濾膜用PBS-T洗滌3次，用PBS(含有1％Tween20TM)封閉1小時，再次用PBS-T洗滌3次，然后在攪拌下同以1∶200稀釋的人前列腺炎血清一起培養過夜。然后用PBS-T洗滌濾膜3次，并與125I標記的蛋白A(1μl/15ml PBS-T)在攪拌下培養1小時。濾膜對膠片曝光從16小時到7天范圍內的不同時間。在復制印模上有信號的噬菌斑被重新接種到LB平板上。所得噬菌斑在復制的濾膜上，用同上方法處理濾膜。將這些濾膜4℃下與人前列腺炎血清(1∶200稀釋)攪拌培養過夜。通過將濾膜對膠片曝光從16小時到11天的范圍內不同的時間用如上述125I標記的蛋白A觀察陽性噬菌斑。按照制造商指示完成陽性人前列腺炎抗原cDNA克隆的體內切出。B．多肽的表征在Applied Biosystems公司自動測序儀373A型(Foster City,CA)上利用正向和反向引物獲得陽性克隆的DNA序列。編碼所分離多肽的cDNA序列，此后稱作HPA8,HPA13,HPA15～HPA17,HPA20,HPA25,HPA28,HPA29,HPA32～HPA38和HPA41，分別列在SEQ ID No.32和33,34和35,36,9和10,11,12,13和14,15,37和38,16,39,22和23,17和18,19,24,40和41,42和43中。HPA16和HPA20的3＇序列是相同的。HPA13,HPA16,HPA20,HPA29和HPA33被認為是帶有新的5＇端點的重疊的克隆。兩個陽性克隆被確認同HPA15相同。同樣，HPA15,HPA34和HPA37也發現是重疊克隆。基于與β-半乳糖苷酶(LacZ)的N-端部分在同框架中確定的cDNA序列，分離的多肽HPA16,HPA17,HPA20,HPA25,HPA28,HPA32,HPA35,HPA36,HPA34,HPA37,HPA8,HPA13,HPA15,HPA29,HPA33,HPA38和HPA41的預期的N-端氨基酸序列分別列于SEQ ID No.1-8,20,21和25-31。
利用EMBL和GenBank(Release 91)以及DNA STAR系統將所分離多肽的確定的cDNA序列和預期的氨基酸序列與基因庫中已知的序列相比較。DNA STAR系統是Swiss、PIR數據庫以及翻譯的蛋白質序列(Release 91)的聯合體。未發現與HPA17,HPA25,HPA28,HPA32,HPA35和HPA36顯著同源的。
發現HPA8確定的cDNA序列與人原癌基因BMI-1(Alkema,M.J.等人，人類分子遺傳學(Hum.Mol.Gen.)2:1597-1603,1993)有約100％的同一性。用編碼HPA13的5＇和3＇cDNA序列檢索DNA數據庫發現與來源于人未成熟髓細胞系的已知cDNA 100％相同(GenBank檢索號D63880)。用HPA13推測出的氨基酸序列檢索蛋白質數據庫發現與編碼上述相同人cDNA序列的開放閱讀框架100％相同。用HPA15預期的氨基酸序列檢索蛋白質數據庫，發現與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)預見的開放閱讀框架有高同源性(60％相同)(Swiss/PIR登記號S46677)，且與來源于調節腸液分泌的垂體腺的一種人蛋白100％相同(Lonnroth,I.，生物化學雜志(J.Bio.Chem.)35:20615-20620,1995)。發現HPA38推定的氨基酸序列與人熱休克因子蛋白2(Schuetz,T.J.等人，美國國家科學院院報88:6911-6915,1991)100％相同。用HPA415＇DNA序列檢索DNA數據庫并用推定的氨基酸序列檢索蛋白質數據庫發現與人LIM蛋白質(Rearden,A.，生物化學與生物物理學研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Commun.)201:1124-1131,1994)100％相同。窮盡發明者所知，除去LIM蛋白質，沒有任何本發明的多肽已被顯示存在于人前列腺中。
應用陽性噬菌粒的病毒顆粒感染大腸桿菌XL-1 Blue MRF＇，如Sambrook等人所述，同前。通過加入IPTG誘導重組蛋白。誘導過的和未經誘導的細胞裂解液以相同的形式進行SDS-PAGE電泳并轉移到硝酸纖維素濾膜上。濾膜分別與人前列腺炎血清(1∶200稀釋)和有LacZ N端4Kd部分反應活性的免血清(1∶200或1∶250稀釋)反應。室溫下血清孵育2小時。通過加入125I標記的蛋白A后對膠片曝光從16小時到11天范圍內的不同時間檢測結合的抗體。免疫雜交的結果總結于表Ⅰ，其中(+)表示陽性反應，(-)表示無反應。
表Ⅰ抗原人前列腺炎血清抗-lacZ血清蛋白質分子量/KdHPA8 (-) (-)HPA13(+) (+)HPA15(+) (+) 50HPA16(+) (+) 40HPA17(+) (-) 40HPA20(+) (+) 38HPA25(-) (+) 32HPA28(-) (-)HPA29(+) (+)HPA32(-) (-)HPA33(+) (+)HPA34未測 (+) 50HPA35(-) (-)HPA36(-) (-)HPA37未測 (+) 50HPA38(-) (-)HPA41未測 (+)重組人前列腺炎抗原與人前列腺炎血清和抗LacZ血清均有陽性反應表明人前列腺炎血清的反應性針對該融合蛋白。克隆的抗原顯示與人前列腺炎血清的反應性而不與抗LacZ血清反應，表明反應性蛋白可能起源于克隆內部。抗原與抗LacZ血清反應但不與人前列腺炎血清反應可能是人前列腺炎血清識別構象性表位的結果或是抗原-抗體結合動力學中免疫雜交暴露2小時尚不足夠。與兩種血清均不反應的抗原不由大腸桿菌表達，反應性表位可以在融合蛋白或內部開放閱讀框架之內。由于來自HPA13,HPA29和HPA33的重組抗原的不穩定性，無法確定重組抗原的大小。
用RT-PCR在4種不同的人細胞系(包括兩個轉移性前列腺腫瘤系LNCaP和DU145)，正常前列腺、乳房、結腸、腎、胃、肺和骨骼肌組織，9種不同的前列腺腫瘤樣本和3種不同的乳房腫瘤樣本中探查代表性人前列腺炎抗原的表達。研究結果見表Ⅱ。
表Ⅱ通過RT-PCR方法對人細胞系、正常組織和腫瘤中HPA克隆mRNA表達的分析克隆 LNCaP DU145 MCF- HBL- 前列腺 乳腺 結腸 腎 胃 肺 骨骼肌12A100hpa-17 + ++ + + + -± - - + +hpa-20 +++++++NT NT ± NT NT - NT + NThpa-28 + +++ + ++ -± + - + ±前列腺腫瘤(n=9)乳腺腫瘤(n=3)克隆 腫瘤1 腫瘤2 腫瘤3 腫瘤4 腫瘤5 腫瘤6 腫瘤7 腫瘤8 腫瘤9 腫瘤1 腫瘤2 腫瘤3hpa-17 + + + - + + ±- - + ++++hpa-20 + + NT NT NT NT NT NT NT+++++hpa-28 + + ± - + + ++ ±- ++ ++++通過RNase保護也探查了在LNCaP和正常前列腺、腎、肝、胃、肺和胰中代表性抗原的mRNA表達。研究結果見表Ⅲ。
表Ⅲ通過RNase保護對LNCaP和正常人組織中HPA克隆mRNA表達的分析克隆LNCaP前列腺腎肝胃肺胰hpa-15 + - +++++ - ++hpa-20 +++++ + + + + NTNThpa-25 + + + + ++++NThpa-32 NT +++ + NT++NThpa-35 +++ +++ NT+ + +++ +hpa-36 + + NTNT+ + +實施例2A．大鼠類固醇結合蛋白質的分離及鑒定免疫血清獲自用大鼠前列腺提取物免疫以產生針對自身前列腺抗原的抗體的大鼠。具體的，大鼠在用弗氏完全佐劑中的大鼠前列腺去污劑提取物(含有0.1％Triton的PBS)免疫之前預取血獲得對照血清。初次免疫3周后進行不完全弗氏佐劑加強免疫，6周時采血清。
用制造商的方案將上述獲得的血清進行ECL Western雜交分析，確認了一種如圖1所示的大鼠前列腺蛋白質。還原后，經SDS-PAGE發現遷移在7kD處的寬銀染色帶。不經還原，在24kD處可見強帶(圖2)。通過離子交換層析純化此蛋白并經還原條件下的凝膠電泳。可見三個帶，表明蛋白質中有三個鏈6-8kD鏈(C1),8-10kD鏈(C2)和10-12kD鏈(C3)。利用反相HPLC在DeltaTMC18 3005μm柱(柱尺寸3.9×300mm)(Waters-Millipore,Milford,MA)上進一步純化此蛋白。含有100μg蛋白的樣品溶于0.1％三氟乙酸(TFA),pH1.9，并且多肽在0.1％TFA(pH1.9)的乙腈線性梯度(0-60％)條件下以0.5ml/min的速度洗脫1小時。在214nm處監視洗脫液。獲得了C1-C3二聚體和C2-C3二聚體的2個峰。發現C2鏈的氨基末端是被封閉的。在Perkin Elmer/AppliedBiosysterms公司Procise Model 494蛋白質測序儀上測定C1和C3鏈的序列，發現具有下列氨基末端序列(分別為Seq ID No.44和45)(a)Ser-Gln-Ile-Cys-Glu-Leu-Val-Ala-His-Glu-Thr-Ile-Ser-Phe-Leu；和(b)Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Ile-Leu-asp-Glu-Val-Ile-Arg-Gly-Thr，其中Xaa可以是任何氨基酸。
利用實施例1中討論過的數據庫將這些序列同基因庫中的已知序列比較，發現與鼠類固醇結合蛋白(也稱為雌莫司汀結合蛋白(EMBP))(Forsgren,B.等人，臨床生物學研究進展(Prog.Clin.Biol.Res.)75A:391-407,1981；Forsgren,B.等人，美國國家科學院院報76:3149-53,1979)相同。此蛋白是在大鼠精液中主要的分泌蛋白且已顯示與類固醇、膽甾醇和脯氨酸富含蛋白結合。EMBP已顯示結合雌莫司汀和estromustine、雌莫司汀磷酸鹽的活性代謝產物。已報道雌莫司汀磷酸鹽用于臨床上治療對標準激素脫離治療不應答的病人的晚期前列腺癌(見例Van Poppel,H.等人，臨床生物學研究進展370:323-41,1991)。B．推測的與大鼠同源的人類固醇結合蛋白的分離從新鮮切除的大鼠前列腺中獲得純化的類固醇結合蛋白且用于皮下免疫新西蘭白色純的雌性兔(150μg純化的大鼠類固醇結合蛋白于1mlPBS和1ml含有100μg胞壁酰二肽(輔助肽，Calbiochem,La Jolla,CA)的弗氏不完全佐劑。6周后對兔用弗氏不完全佐劑中同樣的蛋白質劑量皮下加強免疫。最后，2周后用100μg蛋白質的PBS靜脈內對兔加強免疫，在最后一次免疫兩周后采血清。
用所得兔抗血清篩選Ln Cap.fgc細胞系失敗。隨后用該兔抗血清篩選用下面實施例3詳述方案的人精液的陰離子交換層析收集液。這個分析揭示了一種約18-22kD交叉反應性蛋白。目的精液部分(部分1)在非還原性條件下通過SDS-PAGE分離成單個組分，雜交到PVDF膜上，于70％甲酸中用CNBr切割和消化。所得的CNBr片段在Tris-甘氨酸(tricine)凝膠系統上分離，再次電雜交到PVDF且被切割。一個肽的序列確定如下Val-Val-Lys-Thr-Tyr-Leu-Ile-Ser-Ser-Ile-Pro-Leu-Gln-Gly-Ala-Phe-Asn-Tyr-Lys-Tyr-Thr-Ala(SEQ.ID No.46).
利用與前面相同的數據庫將這些序列與基因庫中已知序列相比較，意外發現與粗大膽囊疾病液蛋白質(gross cystic disease fluid protein)相同，該蛋白質已被發現與轉移性乳腺癌相關(Murphy,L.C.等人，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)262:15236-15241,1987)。就發明者所知，此蛋白此前未被在雄性組織中發現。
如上述部分1的與類固醇結合的能力用下面方法研究。純化的大鼠類固醇結合蛋白(RSBP)和部分1經過SDS-PAGE后轉移到硝酸纖維素濾膜上。具體地，1.5μg RSBP/凝膠泳道和4μg部分1/凝膠泳道在4-20％梯度Laemmli膠(BioRad)上平行地電泳后，再電泳轉移到硝酸纖維素濾膜上。蛋白質轉移后，濾膜室溫下于1％Tween20的PBS中封閉1小時，每次用含0.1％Tween20另加0.5M NaCl的PBS10ml洗滌3次，每次10分鐘，再用1)0.87μM偶聯到辣根過氧化物酶(HRP)的稀釋在洗滌液中的孕酮；2)0.87μM孕酮HRP和200μM雌莫司汀；或3)0.87μM孕酮HRP加上400μM未標記的孕酮和200μM的雌莫司汀進行探查。每一反應混合物均在室溫下孵育1小時且用0.1％Tween20,PBS和0.5M NaCl洗滌3次，每次10分鐘。對雜交顯色(ECL systerm,Amersham)以顯示也能結合雌莫司汀的孕酮HRP結合蛋白。
對于大鼠類固醇結合蛋白和部分1，均獲得三個帶，即結合HRP-孕酮的帶和用未標記的孕酮和雌莫司汀競爭結合的帶(Fig.3)。這些結果表明從如上述人精液中分離的三個帶結合激素且在多肽的數量上對應于大鼠類固醇結合蛋白的C1,C2和C3鏈，雖然或由于一級序列或者二級翻譯后的修飾使其分子量略大了一些。
此推測的大鼠類固醇結合蛋白的同源物也在隨后用上述兔抗血清篩選人精液時發現。具體地獲得了一種疏水性22kD/65kD聚集蛋白質，經CNBr消化22kD帶后，其提供了具有下列序列的肽Val-Val-Lys-Thr-Tyr-Leu-Ile-Ser-Ser-Ile-Pro-Leu-Gln-Ala-Phe-Asn-Tyr-Lys-Tyr-Thr-Ala(SEQ.ID No.47).發現此肽與粗大膽囊疾病液蛋白的第67殘基到第87殘基對應，且利用人自身免疫前列腺炎血清再次鑒定，如下面實施例4所討論。實施例3利用大鼠前列腺炎血清從Ln Cap.fgc中分離的多肽的分離及鑒定通過將Ln Cap.fgc細胞沉淀重懸于PBS,1％NP-40和60μg/ml苯甲基磺酰氟(PMSF)(Sigma,St.Louis,MO)后在Dounce勻漿機中經10次處理后被勻漿化(10gm細胞沉淀/10ml)。隨后為30秒探頭超聲處理和在Dounce勻漿機中再經10次處理。所得勻漿以10,000×G的速度離心，上清液用0.45μm濾膜過濾(Amicon,Beverly,MA)后用于BioRad PrepQ-20陰離子交換樹脂。蛋白質用20mM tris,pH7.5中70分鐘內0到0.8M的NaCl梯度以8ml/min的速度洗脫。收集組分冷卻后用10kD MWCO的離心型(centriprep)濃縮儀(Amicon)濃縮并在有60μg/ml PMSF存在的條件下-20℃貯存。離子交換收集液隨后用4-20％tris甘氨酸Ready-Gels(BioRad)電泳檢測后轉移到硝酸纖維素濾膜上。利用上述實施例3A中的大鼠血清通過ECL(Amersham International)Western分析鑒定目標離子交換收集液。這種分析表明一種約65kD的蛋白質在0.08到0.13MNaCl處洗脫。有大鼠血清反應性的離子交換收集液先后用HPLC和Western分析以鑒定目標蛋白部分。此蛋白質再用以在甲硫氨酸殘基處切割的CNBr飽和的70％甲酸中消化24小時。
所得CNBr片段用微孔HPLC純化，所用為Vydac C18柱(Hesperia,CA)，柱尺寸1×150mm,Perkin Elmer/Applied Biosysterms公司(Foster City,CA)的Division Model 172 HPLC。用0-60％乙腈梯度以40μl/min的速度從柱上洗脫樣品。在214nm處監測洗脫液。所得級份直接上到Perkin Elmer/Applied Biosysterms公司Procise 494蛋白質測序儀上且用標準的Edman化學法從氨基端測序。獲得了兩個具有下列序列的不同的肽(a)Xaa-Ala-Lys-Lys-Phe-Leu-Asp-Ala-Glu-His-Lys-Leu-Asn-Phe-Ala(SEQ.ID No.48)；和(b)Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Ile-Lys-Lys-Phe-Ile-Gln-Glu-Asn-Ile-Phe-Gly，其中Xaa可以是任何氨基酸(SEQ ID No.49)利用前面同樣的數據庫將這些序列與基因庫中已知的序列相比較，分別鑒定為可能的蛋白質二硫鍵異構酶ER-60前體的第286殘基到第300殘基和第228殘基到第242殘基，該前體此處以后稱作ER-60(Bado,R.J.等人，內分泌學(Endocrinology)123:1264-1273,1988)。此抗原也已知為磷脂酶C-α(見PCT WO 95/08624)。ER-60的285和227殘基為甲硫氨酸，與上述溴化氰片段的序列一致。
ER-60是具有多種生物學活性的駐留內質蛋白，包括二硫鍵異構酶和限制性半胱氨酸蛋白酶活性。具體的，ER-60已表現出優先降解鈣聯接蛋白，后者是一種參與通過Ⅰ類(ClassⅠ)主要組織相容性復合物(MHC)途徑的抗原提呈的蛋白質。ER-60和相關家族成員ER-72已被發現在結腸癌中過度表達，且截短形式的ER-60表現出增強的酶學活性(Egea,G.等人，細胞科學雜志(J.Cell.Sci.)(英國)105:819-30,1993)。然而，就發明者所知，這種多肽此前尚不知在人前列腺中出現或過度表達。最近，ER-60基因表達已被與誘導細胞增殖的接觸抑制相關聯(Greene,J.J.等人，細胞分子生物學(Cell.Mol.Biol.)41:473-80,1995)。因此，如果ER-60在前列腺癌中也被截短且是非功能性的，如其在結腸癌中那樣，缺乏接觸抑制的產物將導致致瘤性轉化和腫瘤發展。實施例4利用人前列腺炎血清從Ln CaP.fgc中分離的多肽的分離及鑒定利用如實施例3所述離子交換技術用實施例1中所述人前列腺炎血清篩選Ln CaP.fgc細胞系。用如前述的反相HPLC純化反應性離子交換收集液，利用與所述抗血清的交叉反應作為選擇標準，分離了示于SEQ IDNo.50-51的多肽。用上述數據庫將這些序列與基因庫中已知序列的比較發現如表Ⅱ所示的同源物。然而，任何這些多肽此前從未被與人前列腺相關聯。
表ⅣSEQ ID No.數據庫檢索鑒定53甘油醛-3-磷酸脫氫酶54α-人果糖二磷酸醛縮酶55鈣網蛋白56鈣網蛋白57蘋果酸脫氫酶58膽囊疾病液蛋白59膽囊疾病液蛋白實施例5源自人精液的多肽的分離和鑒定通過陰離子交換層析純化源自人精液的多肽達到同質。具體地，用0.1mM Bis-Tris丙烷緩沖液(pH7)將精液樣品稀釋10倍后上柱。利用凝膠灌注層析(gel profusion chromatography)在由0.01mM Bis-Tris丙烷緩沖液(pH7.5)平衡的Poros(Perseptive Biosysterms)146ⅡQ/M陰離子交換柱4.6mm×10mm上分部收集多肽。蛋白質以上述緩沖液中0～0.5MNaCl線性梯度洗脫。在220nm波長處監測柱洗脫液。各個流份進一步由反相HPLC在Vydac(Hesperia,CA)C18柱上純化。
如上述實施例3測定所得部分的序列。獲得了一個具有如下N-端序列的肽(c)Met-Asp-Ile-Pro-Gln-Thr-Lys-Gln-Asp-Leu-Glu-Leu-Pro-Lys-Leu(SEQ ID NO:57).如上述將這些序列與那些基因庫中已知的序列相比較發現與人胎盤蛋白14(PP14)100％相同。實施例6多肽的合成利用由HPTU(0-苯并三唑-N,N,N＇,N＇-四甲基尿鎓六氟磷酸鹽)活化的FMOC化學法在Applied Biosysterms 430A肽合成儀上合成多肽。可以在該肽的氨基端加上一個Gly-Cys-Gly序列以提供偶聯、結合到固定化的表面或標記該肽的方法。可以用下列切割混合物將該肽從固相支持物上切割下來三氟乙酸∶乙二硫醇∶苯硫基甲烷∶水∶苯酚(40∶1∶2∶2∶3)。切割2小時后，該肽可以用冷的甲基叔丁基醚沉淀。沉淀再用含有0.1％三氟乙酸(TFA)的水溶解并冷干后，用C18反相HPLC純化。可以利用水中(含0.1％TFA)的0％-60％乙腈(含0.1％TFA)梯度洗脫該肽。冷干純的級份后，利用電噴射質譜或其它類型的質譜和氨基酸分析確定該肽的特性。
從前文敘述中應當理解，雖然此處已出于說明的目的描述了本發明的具體實施方案，但可以有多種修改而不偏離本發明的精神和范圍。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人Corixa公司(ⅱ)發明題目用于前列腺癌的免疫治療和免疫診斷的化合物及方法(ⅲ)序列數57(ⅳ)通訊地址(A)地址SEED and BERRY LLP(B)街道6300 Columbia Center,701 Fifth Avenue(C)城市Seattle(D)州Washington(E)國家美國(F)郵編代碼98104-7092(ⅴ)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Release#1.0,Version# 1.30(ⅵ)當前申請數據(A)申請號(B)遞交日1997-5-14(C)分類(ⅷ)律師/代理人信息(A)姓名Maki,David J.
(B)注冊號31,392(C)參考/卷號210121.424PC(ⅸ)通訊信息(A)電話(206)622-4900(B)電傳(206)682-6031(2)SEQ ID No.1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度89氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:1的序列描述Ala Arg Ala Ser Val Met Leu Leu Gly Met Met Ala Arg Gly Lys Pro1 5 10 15Glu Ile Val Gly Ser Asn Leu Asp Thr Leu Met Ser Ile Gly Leu Asp20 25 30Glu Lys Phe Pro Gln Asp Tyr Arg Leu Ala Gln Gln Val Cys His Ala35 40 45Ile Ala Asn Ile Ser Asp Arg Arg Lys Pro Ser Leu Gly Lys Arg His50 55 60Pro Pro Phe Arg Leu Pro Gln Glu His Arg Leu Phe Glu Arg Leu Arg65 70 75 80Glu Thr Val Thr Lys Gly Phe Val His85(2)SEQ ID No.2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度89氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:2的序列描述Ala Arg Gly Arg Phe Gly Arg Leu Gly Val Gly Gly Glu Pro His Pro1 5 10 15Arg Arg Asn Pro Ala Leu Pro Thr Glu Leu Ala Glu Leu Thr Pro Gln20 25 30Val Arg Arg Ala Ala Xaa Lys Thr Gln Arg Ser Gln Val Lys Pro Arg35 40 45His Arg Arg Gly Trp Pro Pro Thr Val Pro Leu Ala Gly Arg Leu Glu50 55 60Glu Leu Lys Thr Pro Arg Ser Pro Arg Pro Pro Glu Gln Gly Leu Asp65 70 75 80Pro Ser Pro Cys Ser Leu Pro Ser Pro85(2)SEQ ID No.3的信息
(ⅰ)序列特征(A)長度858氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:3的序列描述Gln Glu Ser Glu Pro Phe Ser His Ile Asp Pro Glu Glu Ser Glu Glu1 5 10 15Thr Arg Leu Leu Asn Ile Leu Gly Leu Ile Phe Lys Gly Pro Ala Ala20 25 30Ser Thr Gln Glu Lys Asn Pro Arg Glu Ser Thr Gly Asn Met Val Thr35 40 45Gly Gln Thr Val Cys Lys Asn Lys Pro Asn Met Ser Asp Pro Glu Glu50 55 60Ser Arg Gly Asn Asp Glu Leu Val Lys Gln Glu Met Leu Val Gln Tyr65 70 75 80Leu Gln Asp Ala Tyr Ser Phe Ser Arg Lys Ile Thr Glu Ala Ile Gly85 90 95Ile Ile Ser Lys Met Met Tyr Glu Asn Thr Thr Thr Val Val Gln Glu100 105 110Val Ile Glu Xaa Phe Val Met Val Phe Gln Phe Gly Val Pro Gln Ala115 120 125Leu Phe Gly Val Arg Arg Met Leu Pro Leu Ile Trp Ser Lys Glu Pro130 135 140Gly Val Arg Glu Ala Val Leu Asn Ala Tyr Arg Gln Leu Tyr Leu Asn145 150 155 160Pro Lys Gly Asp Ser Ala Arg Ala Lys Ala Gln Ala Leu Ile Gln Asn165 170 175Leu Ser Leu Leu Leu Val Asp Ala Ser Val Gly Thr Ile Gln Cys Leu180 185 190Glu Glu Ile Leu Cys Glu Phe Val Gln Lys Asp Glu Leu Lys Pro Ala195 200 205Val Thr His Leu Leu Trp Glu Arg Ala Thr Glu Lys Val Ala Cys Cys210 215 220Pro Leu Glu Arg Cys Ser Ser Val Met Leu Leu Gly Met Met Ala Arg225 230 235 240Arg Lys Pro Glu Ile Val Gly Ser Asn Leu Asp Thr Leu Met Ser Ile245 250 255Gly Leu Asp Glu Lys Phe Pro Gln Asp Tyr Arg Leu Ala Gln Gln Val260 265 270Cys His Ala Ile Ala Asn Ile Ser Asp Arg Arg Lys Pro Ser Leu Gly275 280 285Lys Arg His Pro Pro Phe Arg Leu Pro Gln Glu His Arg Leu Phe Glu290 295 300Arg Leu Arg Glu Thr Val Thr Lys Gly Phe Val His Pro Asp Pro Leu305 310 315 320Trp Ile Pro Phe Lys Glu Val Ala Val Thr Leu Ile Tyr Gln Leu Ala325 330 335Glu Gly Pro Glu Val Ile Cys Ala Gln Ile Leu Gln Gly Cys Ala Lys340 345 350Gln Ala Leu Glu Lys Leu Glu Glu Lys Arg Thr Ser Gln Glu Asp Pro355 360 365Lys Glu Ser Pro Ala Met Leu Pro Thr Phe Leu Leu Met Asn Leu Leu370 375 380Ser Leu Ala Gly Asp Val Ala Leu Gln Gln Leu Val His Leu Glu Gln385 390 395 400Ala Val Ser Gly Glu Leu Cys Arg Arg Arg Val Leu Arg Glu Glu Gln405 410 415Glu His Lys Thr Lys Asp Pro Lys Glu Lys Asn Thr Ser Ser Glu Thr420 425 430Thr Met Glu Glu Glu Leu Gly Leu Val Gly Ala Thr Ala Asp Asp Thr435 440 445Glu Ala Glu Leu Ile Arg Gly Ile Cys Glu Met Glu Leu Leu Asp Gly450 455 460Lys Gln Thr Leu Ala Ala Phe Val Pro Leu Leu Leu Lys Val Cys Asn465 470 475 480Asn Pro Gly Leu Tyr Ser Asn Pro Asp Leu Ser Ala Ala Ala Ser Leu485 490 495Ala Leu Gly Lys Phe Cys Met Ile Ser Ala Thr Phe Cys Asp Ser Gln500 505 510Leu Arg Leu Leu Phe Thr Met Leu Glu Lys Ser Pro Leu Pro Ile Val515 520 525Arg Ser Asn Leu Met Val Ala Thr Gly Asp Leu Ala Ile Arg Phe Pro530 535 540Asn Leu Val Asp Pro Trp Thr Pro His Leu Tyr Ala Arg Leu Arg Asp545 550 555 560Pro Ala Gln Gln Val Arg Lys Thr Ala Gly Leu Val Met Thr His Leu565 570 575Ile Leu Lys Asp Met Val Lys Val Lys Gly Gln Val Ser Glu Met Ala580 585 590Val Leu Leu Ile Asp Pro Glu Pro Gln Ile Ala Ala Leu Ala Lys Asn595 600 605Phe Phe Asn Glu Leu Ser His Lys Gly Asn Ala Ile Tyr Asn Leu Leu610 615 620Pro Asp Ile Ile Ser Arg Leu Ser Asp Pro Glu Leu Gly Val Glu Glu625 630 635 640Glu Pro Phe His Thr Ile Met Lys Gln Leu Leu Ser Tyr Ile Thr Lys645 650 655Asp Lys Gln Thr Glu Ser Leu Val Glu Lys Leu Cys Gln Arg Phe Arg660 665 670Thr Ser Arg Thr Glu Arg Gln Gln Arg Asp Leu Ala Tyr Cys Val Ser675 680 685Gln Leu Pro Leu Thr Glu Arg Gly Leu Arg Lys Met Leu Asp Asn Phe690 695 700Asp Cys Phe Gly Asp Lys Leu Ser Asp Glu Ser Ile Phe Ser Ala Phe705 710 715 720Leu Ser Val Val Gly Lys Leu Arg Arg Gly Ala Lys Pro Glu Gly Lys725 730 735Ala Ile Ile Asp Glu Phe Glu Gln Lys Leu Arg Ala Cys His Thr Arg740 745 750Gly Leu Asp Gly Ile Lys Glu Leu Glu Ile Gly Gln Ala Gly Ser Gln755 760 765Arg Ala Pro Ser Ala Lys Lys Pro Ser Thr Gly Ser Arg Tyr Gln Pro770 775 780Leu Ala Ser Thr Ala Ser Asp Asn Asp Phe Val Thr Pro Glu Pro Arg785 790 795 800Arg Thr Thr Arg Arg His Pro Asn Thr Gln Gln Arg Ala Ser Lys Lys805 810 815Lys Pro Lys Val Val Phe Ser Ser Asp Glu Ser Ser Glu Glu Asp Leu820 825 830Ser Ala Glu Met Thr Glu Asp Glu Thr Pro Lys Lys Thr Thr Pro Ile835 840 845Leu Arg Ala Ser Ala Arg Arg His Arg Ser850 855(2)SEQ ID No.4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度127氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:4的序列描述Ala Arg Asp Arg Leu Val Ala Ser Lys Thr Asp Gly Lys Ile Val Gln1 5 10 15Tyr Glu Cys Glu Gly Asp Thr Cys Gln Glu Glu Lys Ile Asp Ala Leu20 25 30Gln Leu Glu Tyr Ser Tyr Leu Leu Thr Ser Gln Leu Glu Ser Gln Arg35 40 45Ile Tyr Trp Glu Asn Lys Ile Val Arg Ile Glu Lys Asp Thr Ala Glu50 55 60Glu Ile Asn Asn Met Lys Thr Lys Phe Lys Glu Thr Ile Xaa Xaa Cys65 70 75 80Asp Asn Leu Glu His Xaa Leu Asn Asp Leu Leu Lys Glu Lys Gln Ser85 90 95Val Glu Arg Lys Cys Thr Gln Leu Asn Thr Lys Val Ala Lys Leu Thr100 105 110Asn Glu Leu Lys Glu Glu Gln Glu Met Asn Lys Cys Leu Arg Ala115 120 125(2)SEQ ID No.5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度43氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:5的序列描述Ala Arg Ala Glu Val Gln Arg Trp Arg Arg Leu Val Ala Gly Arg Arg1 5 10 15Arg Ala Gly Gly Asp Gly Gly Asn Ser Gly Ser Cys Ser Arg Trp Gly20 25 30Gly Phe Thr Ser Tyr Pro Trp Asp Arg Glu Ile35 40(2)SEQ ID No.6的信息
(ⅰ)序列特征(A)長度751氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:6的序列描述Pro Ala Glu Ala His Ser Asp Ser Leu Ile Asp Thr Phe Pro Glu Cys1 5 10 15Ser Thr Glu Gly Phe Ser Ser Asp Ser Asp Leu Val Ser Leu Thr Val20 25 30Asp Val Asp Ser Leu Ala Glu Leu Asp Asp Gly Met Ala Ser Asn Gln35 40 45Asn Ser Pro Ile Arg Thr Phe Gly Leu Asn Leu Ser Ser Asp Ser Ser50 55 60Ala Leu Gly Ala Val Ala Ser Asp Ser Glu Gln Ser Lys Thr Glu Glu65 70 75 80Glu Arg Glu Ser Arg Ser Leu Phe Pro Gly Ser Leu Lys Pro Lys Leu85 90 95Gly Lys Arg Asp Tyr Leu Glu Lys Ala Gly Glu Leu Ile Lys Leu Ala100 105 110Leu Lys Lys Glu Glu Glu Asp Asp Tyr Glu Ala Ala Ser Asp Phe Tyr115 120 125Arg Lys Gly Val Asp Leu Leu Leu Glu Gly Val Gln Gly Glu Ser Ser130 135 140Pro Thr Arg Arg Glu Ala Val Lys Arg Arg Thr Ala Glu Tyr Leu Met145 150 155 160Arg Ala Glu Ser Ile Ser Ser Leu Tyr Gly Lys Pro Gln Leu Asp Asp165 170 175Val Ser Gln Pro Pro Gly Ser Leu Ser Ser Arg Pro Leu Trp Asn Leu180 185 190Arg Ser Pro Ala Glu Glu Leu Lys Ala Phe Arg Val Leu Gly Val Ile195 200 205Asp Lys Val Leu Leu Val Met Asp Thr Arg Thr Glu His Thr Phe Ile210 215 220Leu Xaa Gly Leu Arg Lys Ser Ser Glu Tyr Ser Arg Asn Arg Lys Thr225 230 235 240Ile Xaa Pro Arg Cys Val Pro Xaa Met Val Cys Leu His Lys Tyr Ile245 250 255Ile Ser Glu Glu Ser Xaa Phe Leu Val Leu Gln His Ala Glu Xaa Gly260 265 270Lys Leu Trp Ser Tyr Ile Ser Lys Phe Leu Asn Arg Ser Pro Glu Glu275 280 285Ser Phe Asp Ile Lys Glu Val Lys Lys Pro Thr Leu Ala Lys Val His290 295 300Leu Gln Gln Pro Thr Ser Ser Pro Gln Asp Ser Ser Ser Phe Glu Ser305 310 315 320Arg Gly Ser Asp Gly Gly Ser Met Leu Lys Ala Leu Pro Leu Lys Ser325 330 335Ser Leu Thr Pro Ser Ser Gln Asp Asp Ser Asn Gln Glu Asp Asp Gly340 345 350Gln Asp Ser Ser Pro Lys Trp Pro Asp Ser Gly Ser Ser Ser Glu Glu355 360 365Glu Cys Thr Thr Ser Tyr Leu Thr Leu Cys Asn Glu Tyr Gly Gln Glu370 375 380Lys Ile Glu Pro Gly Ser Leu Asn Glu Glu Pro Phe Met Lys Thr Glu385 390 395 400Gly Asn Gly Val Asp Thr Lys Ala Ile Lys Ser Phe Pro Ala His Leu405 410 415Ala Ala Asp Ser Asp Ser Pro Ser Thr Gln Leu Arg Ala His Glu Leu420 425 430Lys Phe Phe Pro Asn Asp Asp Pro Glu Ala Val Ser Ser Pro Arg Thr435 440 445Ser Asp Ser Leu Ser Arg Ser Lys Asn Ser Pro Met Glu Phe Phe Arg450 455 460Ile Asp Ser Lys Asp Ser Ala Ser Glu Leu Leu Gly Leu Asp Phe Gly465 470 475 480Glu Lys Leu Tyr Ser Leu Lys Ser Glu Pro Leu Lys Pro Phe Phe Thr485 490 495Leu Pro Asp Gly Asp Ser Ala Ser Arg Ser Phe Asn Thr Ser Glu Ser500 505 510Lys Val Glu Phe Lys Ala Gln Asp Thr Ile Ser Arg Gly Ser Asp Asp515 520 525Ser Val Pro Val Ile Ser Phe Lys Asp Ala Ala Phe Asp Asp Val Ser530 535 540Gly Thr Asp Glu Gly Arg Pro Asp Leu Leu Val Asn Leu Pro Gly Glu545 550 555 560Leu Glu Ser Thr Arg Glu Ala Ala Ala Met Gly Pro Thr Lys Phe Thr565 570 575Gln Thr Asn Ile Gly Ile Ile Glu Asn Lys Leu Leu Glu Ala Pro Asp580 585 590Val Leu Cys Leu Arg Leu Ser Thr Glu Gln Cys Gln Ala His Glu Glu595 600 605Lys Gly Ile Glu Glu Leu Ser Asp Pro Set Gly Pro Lys Set Tyr Ser610 615 620Ile Thr Glu Lys His Tyr Ala Gln Glu Asp Pro Arg Met Leu Phe Val625 630 635 640Ala Xaa Val Asp His Ser Ser Ser Gly Asp Met Ser Leu Leu Pro Ser645 650 655Ser Asp Pro Lys Phe Gln Gly Leu Gly Val Val Glu Ser Xaa Val Thr660 665 670Ala Asn Asn Thr Glu Glu Ser Leu Phe Arg Ile Cys Ser Pro Leu Ser675 680 685Gly Ala Asn Glu Tyr Ile Ala Ser Thr Asp Thr Leu Lys Thr Glu Glu690 695 700Val Leu Leu Phe Thr Asp Gln Thr Asp Asp Leu Ala Lys Glu Glu Pro705 710 715 720Thr Ser Leu Phe Xaa Arg Asp Ser Glu Thr Lys Gly Glu Ser Gly Leu725 730 735Val Leu Glu Gly Asp Lys Glu Ile His Gln Ile Phe Glu Gly Pro740 745 750(2)SEQ ID No.7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度6氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:7的序列描述Ala Arg Gly Ser Thr Gln1 5(2)SEQ ID No.8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度16氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:8的序列描述Ala Arg Gly Ser Ser Gln Val Arg Val Lys Ser Trp Arg Gly Asp Met1 5 10 15(2)SEQ ID No.9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度271堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:9的序列描述CCGCACGAGC CTCTGTCATG CTTCTTGGCA TGATGGCACG AGGAAAGCCA GAAATTGTGG 60GAAGCAATTT AGACACACTG ATGAGCATAG GGCTGGATGA GAAGTTTCCA CAGGACTACA 120GGCTGGCCCA GCAGGTGTGC CATGCCATTG CCAACATCTC GGACAGGAGA AAGCCTTCTC 180TGGGCAAACG TCACCCCCCC TTCCGGCTGC CTCAGGAACA CAGGTTGTTT GAGCGACTGC 240GGGAGACAGT CACAAAAGGC TTTGTCCACC C 271(2)SEQ ID No.10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度403堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:10的序列描述GGGTGGATAA CCTGAGGTAG GGAGTTCGAG ACCAGCCTGA CCAACATGGA GAAACCCCAT60CTCTACTAAA AATAAAAAAT TAGCCGGCGT ATTGGCGTGC GCCTGTAATC CCAGCTACTC 120AAGAGGCTGA GGCAGGAGAA TCGCCTGAAC CCAGAGGCGG AGGTTGTAGT GAGCCGAAAT 180CACACCATTG CACTCCAGCT TGGGCAACAA TAGCGAACCT CCATCTCAAA TTAAAAAAAA 240AATGCCTACA CGCTTCTTTA AAATGCAAGG CTTTCTCTTA AATTAGCCTA ACTGAACTGC 300GTTGAGCTGC TTCAACTTTG GAATATATGT TTGCCAATCT CCTTGTTTTC TAATGAATAA 360ATGTTTTTAT ATACTTTTAA AAAAAAAAAA AAAAAAACTC GAG 403(2)SEQ ID No.11的信息(ⅰ)序列特征(A)長度2276堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:11的序列描述GGAGGTTTGG GCGGCTTGGC GTCGGAGGAG AGCCCCACCC GCGGAGGAAC CCAGCCTTGC 60CAACGGAGCT GGCGGAGCTC ACTCCTCAGG TCAGGCGGGC GGCGTANAAA ACGCAGCGGA 120GCCAGGTGAA ACCAAGGCAC CGCCGTGGCT GGCCCCCGAC AGTTCCTCTA GCCGGGAGGT 180TGGAGGAGCT GAAAACGCCG CGGAGCCCTC GGCCGCCCGA GCAGGGGCTG GACCCCAGCC 240CTTGCAGCCT CCCTTCTCCT GGCACCCAAG TGCAGTCCTG GCTGCAGAAG GGGCCGCGGG 300CGCACTGAGT TTCCAACCTC CGTTCAGCCT GTCTGTCTCA GGGTGCAGCC TTAATGAGAG 360GTGATTCCTA AGCTGCTGGG AACCTGAGGT TGTCAAAGGG GCGGCAGGAA ATGGACAGCA 420GTATAAAACC CAGAAGCAGA ACTTGAAGGT TAAACCACTA GCCCATTTCA CAGAATGTTT 480CATCCATTTG TGGACCAAAA GATGGAGTTG GTTTTTATTT TTAAAAAGAT AATGTTAATG 540ATCTGATACC ACTACAAATA TTTACGTGAG AAGATTCATG GACTTGTCTT TTGGTTGGAC 600TGTCACTCAT TTCTGAAAGT TTCTTCAGCC ACAATTTCTA TTTGAAAATT CAAGTATCAA 660AGGATACCAG GTTTAGAATG GTATAATGAT GTATTTTGTC TGAGGACTGC AAATTTTATA 720GAGACCACAG TTGGATTCCA GTGATATTCT GCAATCAAAG TGATTTGATA AACCTAATTT 780TGAAGCATTT TATATTTATA AGCGACATCA AAAGATGGGA GAAAAAAATG GCGATGCAAA 840AACTTTCTGG ATGGAGCTAG AAGATGATGG AAAAGTGGAC TTCATTTTTG AACAAGTACA 900AAATGTGCTG CAGTCACTGA AACAAAAGAT CAAAGATGGG TCTGCCACCA ATAAAGAATA 960CATCCAAGCA ATGATTCTAG TGAATGAAGC AACTATAATT AACAGTTCAA CATCAATAAA1020GGATCCTATG CCTGTGACTC AGAAGGAACA GGAAAACAAA TCCAATGCAT TTCCCTCTAC1080ATCATGTGAA AACTCCTTTC CAGAAGACTG TACATTTCTA ACAACAGGAA ATAAGGAAAT1140TCTCTCTCTT GAAGATAAAG TTGTAGACTT TAGAGAAAAA GACTCATCTT CGAATTTATC1200TTACCAAAGT CATGACTGCT CTGGTGCTTG TCTGATGAAA ATGCCACTGA ACTTGAAGGG1260AGAAAACCCT CTGCAGCTGC CAATCAAATG TCACTTCCAA AGACGACATG CAAAGACAAA1320CTCTCATTCT TCAGCACTCC ACGTGAGTTA TAAAACCCCT TGTGGAAGGA GTCTACGAAA1380CGTGGAGGAA GTTTTTCGTT ACCTGCTTGA GACAGAGTGT AACTTTTTAT TTACAGATAA1440CTTTTCTTTC AATACCTATG TTCAGTTGGC TCGGAATTAC CCAAAGCAAA AAGAAGTTGT1500TTCTGATGTG GATATTAGCA ATGGAGTGGA ATCAGTGCCC ATTTCTTTCT GTAATGAAAT1560TGACAGTAGA AAGCTCCCAC AGTTTAAGTA CAGAAAGACT GTGTGGCCTC GAGCATATAA1620TCTAACCAAC TTTTCCAGCA TGTTTACTGA TTCCTGTGAC TGCTCTGAGG GCTGCATAGA1680CATAACAAAA TGTGCATGTC TTCAACTGAC AGCAAGGAAT GCCAAAACTT CCCCCTTGTC1740AAGTGACAAA ATAACCACTG GATATAAATA TAAAAGACTA CAGAGACAGA TTCCTACTGG1800CATTTATGAA TGCAGCCTTT TGTGCAAATG TAATCGACAA TTGTGTCAAA ACCGAGTTGT1860CCAACATGGT 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No.17的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1397堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:17的序列描述GTTCAACTCA ATAGAAGATG ACGTTTGCCA GCTAGTGTAT GTGGAAAGAG CTGAAGTGCT60CAAATCTGAA GATGGCGCCA GCCTCCCAGT GATGGACCTG ACTGAACTCC CCAAGTGCAC 120GGTGTGTCTG GAGCGCATGG ACGAGTCTGT GAATGGCATC CTCACAACGT TATGTAACCA 180CATCTTCCAC AGCCAGTGTC TACAGCGCTG GGACGATACC ACGTGTCCTG TTTGCCGGTA 240CTGTCAAACG CCCGAGCCAG TAGAAGAAAA TAAGTGTTTT GAGTGTGGTG TTCAGGAAAA 300TCTTTGGATT TGTTTAATAT GCGGCCACAT AGGATGTGGA CGGTATGTCA GTCGACATGC 360TTATAAGCAC TTTGAGGAAA CGCAGCACAC GTATGCCATG CAGCTTACCA ACCATCGAGT 420CTGGGACTAT GCTGGAGATA ACTATGTTCA TCGACTGGTT GCAAGTAAAA CAGATGGAAA 480AATAGTACAG TATGAATGTG AGGGGGATAC TTGCCAGGAA GAGAAAATAG ATGCCTTACA 540GTTAGAGTAT TCATATTTAC TAACAAGCCA GCTGGAATCT CAGCGAATCT ACTGGGAAAA 600CAAGATAGTT CGGATAGAGA AGGACACAGC AGAGGAAATT AACAACATGA AGACCAAGTT 660TAAAGAAACA ATTGAGAAGT GTGATAATCT AGAGCACAAA CTAAATGATC TCCTAAAAGA 720AAAGCAGTCT GTGGAAAGAA AGTGCACTCA GCTAAACACA AAAGTGGCCA AACTCACCAA 780CGAGCTCAAA GAGGAGCAGG AAATGAACAA GTGTTTGCGA GCCAACCAAG TCCTCCTGCA 840GAACAAGCTA AAAGAGGAGG AGAGGGTGCT GAAGGAGACC TGTGACCAAA AAGATCTGCA 900GATCACCGAG ATCCAGGAGC AGCTGCGTGA CGTCATGTTC TACCTGGAGA CACAGCAGAA 960AGATCAACCA TCTGCCTGCC GAGACCCGGC AGGAAATCCA GGAGGGACAG ATCAACATCG1020CCATGGCCTC GGCCTCGAGC CCTGCCTCTT CGGGGGGCAG TGGGAAGTTG CCCTCCAGGA1080AGGGCCGCAG CAAGAGGGGC AAGTGACCTT CAGAGCAACA GACATCCCTG AGACTGTTCT1140CCCTGACACT GTGAGAGTGT GCTGGGACCT TCAGCTAAAT GTGAGGGTGG GCCCTAATAA1200GTACAAGTGA GGATCAAGCC ACAGTTGTTT GGCTCTTTCA TTTGCTAGTG TGTGATGTAG1260TGAATGTAAA GGGTGCTGAC TGGAGAGCTG ATAGAAAGGC GCTGCGTTCG AAAAGGTCTT1320AAGAGTTCAC TAACCTCACA TTCTAATGAC CANTTTGCCT TCCTGCTTGG TAGAAGCCCC1380ACACTCTGCT GTGCATT 1397(2)SEQ ID No.18的信息(ⅰ)序列特征(A)長度800堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:18的序列描述CGGTAATTGA GCANACTTAA AATAAGACCT GTGTTGGAAT TTAGTTTCCT CTGAAGAGGT60AGAGGGATAG GTTAGTAAGA TGTATTGTTA AACAACAGGT TTTAGTTTTT GCTTTTATAA 120TTAGCCACAG GTTTTCAAAT GATCACATTT CAGAATAGGT TTTTAGCCTG TAATTAGGCC 180TCATCCCCTT TGACCTAAAT GTCTTACATG TTACTTGTTA GCACATCAAC TGTATCACTA 240ATCACCATCT GNTTTTGTGG GATGTGCTGC AGCATTTCCC AAAAAACTTT ACGTGTAATG 300TTGCAAAATG AATGTACTCA GACATTCTTA ATTTTTACTT AGGGCAGACC AACTCTTTGA 360GTCTCTCTTG GACTTATATA TACAGATATC TTAAGAGTGG GAATGTAAAG CATAACCTAA 420TTCTCTTTCC TATAGAGATT CTATTTTATT TAAAATCTAT TTTTACACTA GTTAGAATCC 480TGCTGTTTTG GCCAAGTACT TGTCTTGCAT GTCTGACCTT GCAGAAGCTG GGGTGGATCA 540TAGCATACTA ATGAAGAGAA TTAGAAGTAG TTTACAAAGC TCGCTCACTC CTCATTTCTC 600TGTGATCCCT TCTATCCAGT GGCCCCACCA CCACCTGGGA AAACAGATTT TTCAGTACAG 660GTGGGATAAA TGCTCTGAAA GGCTGTGCCC AGAGGAATGA GCAAATAGGC AAGTGTTTCC 720AAACTACTTG GAGGTTTACA AAAAATATGT CCCAGAAAAA AAAAAAATCT TACCAAGATA 780CGTAAAAAAA AAAAAAAAAA 800(2)SEQ ID No.19的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1810堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:19的序列描述GCAGCTCCCA GGTGCGTGTT AAAAGCTGGA GGGGGGATAT GTGATCCCAG GACCAAAAGC 60GCGGGGCCAG ACTCATCGGT TCATTCAACA ACCAGTATTT AGTGCCTGCT GTGTTCTGCA 120GGCCCTGCCA TAGGCGCTTG ATACAGCGGT GCATAGCGTA TGAAAAAGAT CTGTCCTGGC 180TGAGCATCCG TAATATAAAA ATCTGAAATC TGAAATGCTC CAAAATCCTA AACTTTTTGA 240GTGCTGACAT TATGCCACAA ATGGAAAATT TCATACCTGA CCTTATGTGG GTTGCANTCA 300AAACACAGGT GCACAACACC CAGTTCATGC AACATCCCCA ATGGGAAAAA AGACCCCCCC 360AGCTCTCTTC TGCTGCAGTT TTTCTGCTCA CACCTGGATT TCCCCATGCA TTCCCACAAA 420AAGTAATTAA ATGGCATGCG TGCAGGCTGG ACACGCCAAC AACAGGTTTC CCACAATGCC 480CCACATGGGG CCAAGACCTG TGTGCATTAC TCATTGCATT TTTTTGCTTA TTCTCTGCTG 540TGTGGTATAA ATATATTGTT GAAAATGTCA AAAAGACCTA AAGATACCCC TGTGAATATC 600AGTGATAAGA AAAAGAGGAA GCATTTATGT TTATCTATAG CACAGAAAGT CAAGTTGTTG 660GAGAAACTGG ACAGTGGTGT AAGTGTGAAA CATCTTACAG AAGAGTATGG TGTTGGAATG 720ACCACCATAT ATGACCTGAA GAAACAGAAG GATAAACTGT TGAAGTTTTA TGCTGAAAGT 780GATGAGCAGA TATTAATGAA AAATAGAAAA ACACTTCATA AAGCTAAAAA TGAAGATCTT 840GATCGTGTAT TGAAAGAGTG GATCCGTCAG CGTCGCAGTG AACACATGCC ACTTAATGGT 900ATGCTGATCA TGAAACAAGC AAAGATATAT CACAATGAAC TAAAAATTGA GGGGAACTGT 960GAATATTCAA CAGGCTGGTT GCAGAAATTT AAGAAAAGAC ATGGCATTAA ATTTTTAAAG1020ACTTGTGGCA ATAAAGCATC TGCTGGTCAT GAAGCAACAG AGAAGTTTAC TGGCAATTTC1080AGTAATGATG ATGAACAAGA TGGTAACTTT GAAGGATTCA NTATGTCAAG TGAGAAAAAA1140ATAATGTCTG ACCTCCTTAC ATATACAAAA AATATACATC CAGAGACTGT CAGTAAGCTG1200GAAGAAGAGG ATATCTTTNA TGTTTTTAAC AGTAATAATG AGGCTCCAGT TGTTCATTCA1260TTGTCCAATG GTGAAGTAAC AAAAATGGTT CTGAATCAAG ATGATCATGA TGATAATGAT1320AATGAAGATG ATGTTAACAC TGCAGAAAAA GTGCCTATAG ACGACATGGT AAAAATGTGT1380GATGGGCTTA TTAAAGGACT AGAGCAGCAT GCATTCATAA CAGAGCAAGA AATCATGTCA1440GTTTATAAAA TCAAAGAGAG ACTTCTAAGA CAAAAAGCAT CATTAATGAG GCAGATGACT1500CTGAAAGAAA CATTTAAAAA AGCCATCCAG AGGAATGCTT CTTCCTCTCT ACAGGACCCA1560CTTCTTGGTC CCTCAACTGC TTCTGATGCT TCTTCTCACC TAAAAATAAA ATAAAATACA1620GTGTACAGTA ACCTTTTAGT CAAAACAGCA TCATACTTGG AAACTGAAAG CCTACTGTTA1680TTTGTTATTG TTGCTTAACA GCTGATACAG GTATTCTGGT GACACTACTG TGCTGGCTTA1740CTTAACCTGA ATACACTATT TTTTTCGTTG TAAAAAAAAA AAAAAAANAA NAAAAAAAAA1800AAAAAANANA 1810(2)SEQ ID No.20的信息(ⅰ)序列特征(A)長度70氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:20的序列描述Ala Arg Glu Gly Gly Lys Met Val Leu Glu Ser Thr Met Val Cys Val1 5 10 15Asp Asn Ser Glu Tyr Met Arg Asn Gly Asp Phe Leu Pro Thr Arg Leu20 25 30Gln Ala Gln Gln Asp Ala Val Asn Ile Xaa Cys His Ser Lys Thr Arg35 40 45Ser Asn Pro Glu Asn Asn Val Gly Leu Ile Thr Leu Ala Asn Asp Cys50 55 60Glu Val Leu Thr Thr Leu65 70(2)SEQ ID No.21的信息(ⅰ)序列特征(A)長度100氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:21的序列描述Ala Arg Glu Ser Thr Met Val Cys Val Asp Asn Ser Glu Tyr Met Arg1 5 10 15Asn Gly Asp Phe Leu Pro Thr Arg Leu Gln Ala Gln Gln Asp Ala Val20 25 30Asn Ile Val Cys His Ser Lys Thr Arg Ser Asn Pro Glu Asn Asn Val35 40 45Gly Leu Ile Thr Leu Ala Asn Asp Cys Glu Val Leu Thr Thr Leu Thr50 55 60Pro Asp Thr Gly Arg Ile Leu Ser Lys Leu His Thr Val Gln Pro Lys65 70 75 80Gly Lys Ile Thr Phe Cys Thr Gly Ile Arg Val Ala His Leu Ala Leu85 90 95Lys His Arg Gln100(2)SEQ ID No.22的信息(ⅰ)序列特征(A)長度214堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:22的序列描述CGGCACGAGA AGGTGGCAAG ATGGTGTTGG AAAGCACTAT GGTGTGTGTG GACAACAGTG60AGTATATGCG GAATGGAGAC TTCTTACCCA CCAGGCTGCA GGCCCAGCAG GATGCTGTCA 120ACATANTTTG TCATTCAAAG ACCCGCAGCA ACCCTGAGAA CAACGTGGGC CTTATCACAC 180TGGCTAATGA CTGTGAAGTG CTGACCACAC TCAC 214(2)SEQ ID No.23的信息(ⅰ)序列特征(A)長度375堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:23的序列描述TATGGACACA TTTGAGCCAG CCAAGGAGGA GGATGATTAC GACGTGATGC AGGACCCCGA60GTTCCTTCAG AGTGTCCTAG AGAACCTCCC AGGTGTGGAT CCCAACAATG AAGCCATTCG 120AAATGNTATG GGCTCCCTGG CCTCCCAGGC CACCAAGGAC GGCAAGAAGG ACAAGAAGGA 180GGAAGACAAG AAGTGAGACT GGAGGGAAAG GGTAGCTGAG TCTGCTTAGG GGACTGCATG 240GGAAGCACGG AATATAGGGT TAGATGTGTG TTATCTGTAA CCATTACAGC CTAAATAAAG 300CTTGGCAACT TTTTAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 360AAAAAAAAAC TCGAG375(2)SEQ ID No.24的信息(ⅰ)序列特征(A)長度304堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:24的序列描述CGGCACGAGA AAGCACTATG GTGTGTGTGG ACAACAGTGA GTATATGCGG AATGGAGACT60TCTTACCCAC CAGGCTGCAG GCCCAGCAGG ATGCTGTCAA CATAGTTTGT CATTCAAAGA 120CCCGCAGCAA CCCTGAGAAC AACGTGGGCC TTATCACACT GGCTAATGAC TGTGAAGTGC 180TGACCACACT CACCCCAGAC ACTGGCCGTA TCCTGTCCAA GCTACATACT GTCCAACCCA 240AGGGCAAGAT CACCTTCTGC ACGGGCATCC GCGTTGCCCA TCTGGCTCTG AAGCACCGAC 300AAGG304(2)SEQ ID No.25的信息(ⅰ)序列特征(A)長度22氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:25的序列描述Val Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro Gly Gly Gly Gly Val Gly Gly1 5 10 15Arg Cys Gly Gly Gly Gly20(2)SEQ ID No.26的信息(ⅰ)序列特征(A)長度78氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:26的序列描述Ala Arg Ala Ala Arg Ala Lys Ala Gln Ala Leu Ile Gln Asn Leu Ser1 5 10 15Leu Leu Leu Val Asp Ala Ser Val Gly Thr Ile Gln Cys Leu Glu Glu20 25 30Ile Leu Cys Glu Phe Val Gln Lys Asp Glu Leu Lys Pro Ala Val Thr35 40 45Xaa Leu Leu Trp Glu Arg Ala Thr Glu Lys Val Ala Cys Cys Pro Leu50 55 60Glu Arg Cys Ser Ser Val Met Leu Leu Gly Met Met Ala Arg65 70 75(2)SEQ ID No.27的信息(ⅰ)序列特征(A)長度384氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:27的序列描述Lys Met Val Leu Glu Ser Thr Met Val Cys Val Asp Asn Ser Glu Tyr1 5 10 15Met Arg Asn Gly Asp Phe Leu Pro Thr Arg Leu Gln Ala Gln Gln Asp20 25 30Ala Val Asn Ile Val Cys His Ser Lys Thr Arg Ser Asn Pro Glu Asn35 40 45Asn Val Gly Leu Ile Thr Leu Ala Asn Asp Cys Glu Val Leu Thr Thr50 55 60Leu Thr Pro Asp Thr Gly Arg Ile Leu Ser Lys Leu His Thr Val Gln65 70 75 80Pro Lys Gly Lys Ile Thr Phe Cys Thr Gly Ile Arg Val Ala His Leu85 90 95Ala Leu Lys His Arg Gln Gly Lys Asn His Lys Met Arg Ile Ile Ala100 105 110Phe Val Gly Ser Pro Val Glu Asp Asn Glu Lys Asp Leu Val Lys Leu115 120 125Ala Lys Arg Leu Lys Lys Glu Lys Val Asn Val Asp Ile Ile Asn Phe130 135 140Gly Glu Glu Glu Val Asn Thr Glu Lys Leu Thr Ala Phe Val Asn Thr145 150 155 160Leu Asn Gly Lys Asp Gly Thr Gly Ser His Leu Val Thr Val Pro Pro165 170 175Gly Pro Ser Leu Ala Asp Ala Leu Ile Ser Ser Pro Ile Leu Ala Gly180 185 190Glu Gly Gly Ala Met Leu Gly Leu Gly Ala Ser Asp Phe Glu Phe Gly195 200 205Val Asp Pro Ser Ala Asp Pro Glu Leu Ala Leu Ala Leu Arg Val Ser210 215 220Met Glu Glu Gln Arg Gln Arg Gln Glu Glu Glu Ala Arg Arg Ala Ala225 230 235 240Ala Ala Ser Ala Ala Glu Ala Gly Ile Ala Thr Thr Gly Thr Glu Asp245 250 255Ser Asp Asp Ala Leu Leu Lys Met Thr Ile Ser Gln Gln Glu Phe Gly260 265 270Arg Thr Gly Leu Pro Asp Leu Ser Ser Met Thr Glu Glu Glu Gln Ile275 280 285Ala Tyr Ala Met Gln Met Ser Leu Gln Gly Ala Glu Phe Gly Gln Ala290 295 300Glu Ser Ala Asp Ile Asp Ala Ser Ser Ala Met Asp Thr Ser Glu Pro305 310 315 320Ala Lys Glu Glu Asp Asp Tyr Asp Val Met Gln Asp Pro Glu Phe Leu325 330 335Gln Ser Val Leu Glu Asn Leu Pro Gly Val Asp Pro Asn Asn Glu Ala340 345 350Ile Arg Asn Ala Met Gly Ser Leu Pro Pro Arg Pro Pro Arg Thr Ala355 360 365Arg Arg Thr Arg Arg Arg Lys Thr Arg Ser Glu Thr Gly Gly Lys Gly370 375 380(2)SEQ ID No.28的信息(ⅰ)序列特征(A)長度68氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:28的序列描述Ala Arg Asp Ala Tyr Ser Phe Ser Arg Lys Ile Thr Glu Ala Ile Gly1 5 10 15Ile Ile Ser Lys Met Met Tyr Glu Asn Thr Thr Thr Val Val Gln Glu20 25 30Val Ile Glu Phe Phe Val Met Val Phe Gln Phe Gly Val Pro Gln Ala35 40 45Leu Phe Gly Val Arg Arg Met Leu Pro Leu Ile Trp Ser Lys Glu Pro50 55 60Gly Val Arg Glu65(2)SEQ ID No.29的信息(ⅰ)序列特征(A)長度97氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:29的序列描述Ala Arg Ala Gln Ala Leu Phe Gly Val Arg Arg Met Leu Pro Leu Ile1 5 10 15Trp Ser Lys Glu Pro Gly Val Arg Glu Ala Val Leu Asn Ala Tyr Arg20 25 30Gln Leu Tyr Leu Ash Pro Lys Gly Asp Ser Ala Arg Ala Lys Ala Gln35 40 45Ala Leu Ile Gln Asn Leu Ser Leu Leu Leu Val Asp Ala Ser Val Gly50 55 60Thr Ile Gln Cys Leu Glu Glu Ile Leu Cys Glu Phe Val Gln Lys Asp65 70 75 80Glu Leu Lys Pro Ala Val Thr Gln Leu Leu Trp Glu Pro Ala Thr Glu85 90 95Lys(2)SEQ ID No.30的信息
(ⅰ)序列特征(A)長度116氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:30的序列描述Ala Arg Ala Thr Thr Ala Phe Gly Cys Arg Ile Trp Asn Pro Cys Ala1 5 10 15Ala Leu Thr Met Lys Gln Ser Ser Asn Val Pro Ala Phe Leu Ser Lys20 25 30Leu Trp Thr Leu Val Glu Glu Thr His Thr Asn Glu Phe Ile Thr Trp35 40 45Ser Gln Asn Gly Gln Ser Phe Leu Val Leu Asp Glu Gln Arg Phe Ala50 55 60Lys Glu Ile Leu Pro Lys Tyr Phe Lys His Asn Asn Met Ala Ser Phe65 70 75 80Val Arg Gln Leu Asn Met Tyr Gly Phe Arg Lys Val Ile His Ile Asp85 90 95Ser Gly Ile Val Lys Gln Glu Arg Asp Gly Pro Val Glu Phe Gln His100 105 110Pro Tyr Phe Gln115(2)SEQ ID No.31的信息(ⅰ)序列特征(A)長度124氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:31的序列描述Ala Arg Gly Ala Thr Cys Glu Arg Cys Lys Gly Gly Phe Ala Pro Ala1 5 10 15Glu Lys Ile Val Asn Ser Asn Gly Glu Leu Tyr His Glu Gln Cys Phe20 25 30Val Cys Ala Gln Cys Phe Gln Gln Phe Pro Glu Gly Leu Phe Tyr Glu35 40 45Phe Glu Gly Arg Lys Tyr Cys Glu His Asp Phe Gln Met Leu Phe Ala50 55 60Pro Cys Cys His Gln Cys Gty Glu Phe Ile Ile Gly Arg Val Ile Lys65 70 75 80Ala Met Asn Asn Ser Trp His Pro Glu Cys Phe Arg Cys Asp Leu Cys85 90 95Gln Glu Val Leu Ala Asp Ile Gly Phe Val Lys Asn Ala Gly Arg His100 105 110Leu Cys Arg Pro Cys His Asn Arg Glu Lys Ala Arg115 120(2)SEQ ID No.32的信息(ⅰ)序列特征(A)長度768堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:32的序列描述TACGAGGAGG AGGAGGAGGA GGCCCCGGAG GAGGAGGCGT TGGAGGTCGA TGCGGAGGCG60GAGGATGAGG AGGCCGAGGC GCCGGAGGAG GCCGAGGCGC CGGAGCAGGA GGAGGCCGGC 120CGGAGGCGGC ATGAGACGAG CGTGGCGGCC GCGGCTGCTC GGGGCCGCGC TGGTTGCCCA 180TTGACAGCGG CGTCTGCAGC TCGCTTCAAG ATGGCCGCTT GGCTCGCATT CATTTTCTGC 240TGAACGACTT TTAACTTTCA TTGTCTTTTC CGCCCGCTTC GATCGCCTCG CGCCGGCTGC 300TCTTTCCGGG ATTTTTTATC AAGCAGAAAT GCATCGAACA ACGAGAATCA AGATCACTGA 360GCTAAATCCC CACCTGATGT GTGTGCTTTG TGGAGGGTAC TTCATTGATG CCACAACCAT 420AATAGAATGT CTACATTCCT TCTGTAAAAC GTGTATTGTT CGTTACCTGG AGACCAGCAA 480GTATTGTCCT ATTTGTGATG TCCAAGTTCA CAAGACCAGA CCACTACTGA ATATAAGGTC 540AGATAAAACT CTCCAAGATA TTGTATACAA ATTAGTTCCA GGGCTTTTCA AAAATGAAAT 600GAAGAGAAGA AGGGATTTTT ATGCAGCTCA TCCTTCTGCT GATGCTGCCA ATGGCTCTAA 660TGAAGATNGA GGAGAGGTTG CAGATGAAGA TAAGAGAATT ATAACTGATG ATGAGATAAT 720AAGCTTATCC ATTGAATTCT TTGACCAGAA CAGATTGGAT CGGAAAGT768(2)SEQ ID No.33的信息(ⅰ)序列特征(A)長度642堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:33的序列描述TTTAAATAAA CCAGCAGGTT GCTAAAAGAA GGCATTTTAT CTAAAGTTAT TTTAATAGGT60GGTATAGCAG TAATTTTAAA TTTAAGAGTT GCTTTTACAG TTAACAATGG AATATGCCTT 120CTCTGCTATG TCTGAAAATA GAAGNTATTT ATTATGAGCT TNTACAGGTA TTTTTAAATA 180GAGCAAGCAT GTTGAATTTA AAATATGAAT AACCCCACCC AACAATTTTC AGTTTATTTT 240TTGCTTTGGT CGAACTTGGT GTGTGTTCAT CACCCATCAG TTATTTGTGA GGGTGTTTAT 300TCTATATGAA TATTGTTTCA TGTTTGTATG GGAAAATTGT AGCTAAACAT TTCATTGTCC 360CCAGTCTGCA AAAGAAGCAC AATTCTATTG CTTTGTCTTG CTTATAGTCA TTAAATCATT 420ACTTTTACAT ATATTGCTGT TACTTCTGCT TTCTTTAAAA ATATAGTAAA GGATGTTTTA 480TGAAGTCACA AGATACATAT ATTTTTATTT TGACCTAAAT TTGTACAGTC CCATTGTAAG 540TGTTGTTTCT AATTATAGAT GTAAAATGAA ATTTCATTTG TAATTGGAAA AAATCCAATA 600AAAAGGATAT TCATTTAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AA 642(2)SEQ ID No.34的信息(ⅰ)序列特征(A)長度236堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:34的序列描述CGGCACGAGC TGCCAGAGCC AAGGCCCAGG CTTTGATTCA GAATCTCTCT CTGCTGCTAG 60TGGATGCCTC GGTTGGGACC ATTCAGTGTC TTGAGGAAAT TCTCTGTGAG TTTGTGCAGA120AGGATGAGTT GAAACCAGCA GTGACCCANC TGCTGTGGGA GCGGGCCACC GAGAAAGTCG180CCTGCTGTCC TCTGGAACGC TGTTCCTCTG TCATGCTTCT TGGCATGATG GCACGA236(2)SEQ ID No.35的信息(ⅰ)序列特征(A)長度333堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:35的序列描述CCGGGCGTAT TGGCGTGCGC CTGTAATCCC AGCTAACTCA AGAGGCTGAG GCAGGAGAAT60CGCCTGAACC CAGAGGCGGA GGTTGTAGTG AGCCGAAATC ACACCATTGC ACTCCAGCTT 120GGGCAACAAT AGCGAACCTC CATCTCAAAT TAAAAAAAAA AATGCCTACA CGCTCTTTAA 180AATGCAAGGC TTTCTCTTAA ATTAGCCTAA CTGAACTGCG TTGAGCTGCT TCAACTTTGG 240AATATATGTT TGCCAATCTC CTTGTTTTCT AATGAATAAA TGTTTTTATA TACTTTTAGA 300AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAACTC GAG333(2)SEQ ID No.36的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1272堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:36的序列描述GCAAGATGGT GTTGGAAAGC ACTATGGTGT GTGTGGACAA CAGTGAGTAT ATGCGGAATG60GAGACTTCTT ACCCACCAGG CTGCAGGCCC AGCAGGATGC TGTCAACATA GTTTGTCATT 120CAAAGACCCG CAGCAACCCT GAGAACAACG TGGGCCTTAT CACACTGGCT AATGACTGTG 180AAGTGCTGAC CACACTCACC CCAGACACTG GCCGTATCCT GTCCAAGCTA CATACTGTCC 240AACCCAAGGG CAAGATCACC TTCTGCACGG GCATCCGCGT GGCCCATCTG GCTCTGAAGC 300ACCGACAAGG CAAGAATCAC AAGATGCGCA TCATTGCCTT TGTGGGAAGC CCAGTGGAGG 360ACAATGAGAA GGATCTGGTG AAACTGGCTA AACGCCTCAA GAAGGAGAAA GTAAATGTTG 420ACATTATCAA TTTTGGGGAA GAGGAGGTGA ACACAGAAAA GCTGACAGCC TTTGTAAACA 480CGTTGAATGG CAAAGATGGA ACCGGTTCTC ATCTGGTGAC AGTGCCTCCT GGGCCCAGTT 540TGGCTGATGC TCTCATCAGT TCTCCGATTT TGGCTGGTGA AGGTGGTGCC ATGCTGGGTC 600TTGGTGCCAG TGACTTTGAA TTTGGAGTAG ATCCCAGTGC TGATCCTGAG CTGGCCTTGG 660CCCTTCGTGT ATCTATGGAA GAGCAGCGGC AGCGGCAGGA GGAGGAGGCC CGGCGGGCAG 720CTGCAGCTTC TGCTGCTGAG GCCGGGATTG CTACGACTGG GACTGAAGAC TCAGACGATG 780CCCTGCTGAA GATGACCATC AGCCAGCAAG AGTTTGGCCG CACTGGGCTT CCTGACCTAA 840GCAGTATGAC TGAGGAAGAG CAGATTGCTT ATGCCATGCA GATGTCCCTG CAGGGAGCAG 900AGTTTGGCCA GGCGGAATCA GCAGACATTG ATGCCAGCTC AGCTATGGAC ACATCTGAGC 960CAGCCAAGGA GGAGGATGAT TACGACGTGA TGCAGGACCC CGAGTTCCTT CAGAGTGTCC 1020TAGAGAACCT CCCAGGTGTG GATCCCAACA ATGAAGCCAT TCGAAATGCT ATGGGCTCCC 1080TGCCTCCCAG GCCACCAAGG ACGGCAAGAA GGACAAGAAG GAGGAAGACA AGAAGTGAGA1140CTGGAGGGAA AGGGTAGCTG AGTCTGCTTA GGGGACTGCA TGGGAAGCAC GGAATATAGG1200GTTAGATGTG TGTTATCTGT AACCATTACA GCCTAAATAA AGCTTGGCAA CTTTTAAAAA1260AAAAAAAAAA AA1272(2)SEQ ID No.37的信息(ⅰ)序列特征(A)長度206堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:37的序列描述CGGCACGAGA TGCCTACAGC TTCTCCCGGA AGATTACAGA GGCCATTGGC ATCATCAGCA60AGATGATGTA TGAAAACACA ACTACAGTGG TGCAGGAGGT GATTGAATTC TTTGTGATGG 120TCTTCCAATT TGGGGTACCC CAGGCCCTGT TTGGGGTGCG CCGTATGCTG CCTCTCATCT 180GGTCTAAGGA GCCTGGTGTC CGGGAA206(2)SEQ ID No.38的信息(ⅰ)序列特征(A)長度341堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:38的序列描述TACTAAAAAT AAAAAATTAG CCGGGCGTAT TGGCGTGCGC CTGTAATCCC AGCTACTCAA60GAGGCTGAGG CAGGAGAATC GCCTGAACCC AGAGGCGGAG GTTGTAGTGA GCCGAAATCA 120CACCATTGCA CTCCAGCTTG GGCAACAATA GCGAACCTCC ATCTCAAATT AAAAAAAAAA 180TGCCTACACG CTCTTTAAAA TGCAAGGCTT TCTCTTAAAT TAGCCTAACT GAACTGCGTT 240GAGCTGCTTC AACTTTGGAA TATATGTTTG CCAATCTCCT TGTTTTCTAA TGAATAAATG 300TTTTTATATA CTTTTAANGA GAGAAAAAAA ANAAACTCGA G 341(2)SEQ ID No.39的信息(ⅰ)序列特征(A)長度293堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:39的序列描述CGGCACGAGC CCAGGCCCTG TTTGGGGTGC GCCGTATGCT GCCTCTCATC TGGTCTAAGG60AGCCTGGTGT CCGGGAAGCC GTGCTTAATG CCTACCGCCA ACTCTACCTC AACCCCAAAG 120GGGACTCTGC CAGAGCCAAG GCCCAGGCTT TGATTCAGAA TCTCTCTCTG CTGCTAGTGG 180ATGCCTCGGT TGGGACCATT CAGTGTCTTG AGGAAATTCT CTGTGAGTTT GTGCAGAAGG 240ATGAGTTGAA ACCAGCAGTG ACCCAGCTGC TGTGGGAACC GGCCACCGAG AAA 293(2)SEQ ID No.40的信息(ⅰ)序列特征(A)長度350堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:40的序列描述CGGCACGAGC TACCACCGCG TTCGGGTGTA GAATTTGGAA TCCCTGCGCC GCGTTAACAA60TGAAGCAGAG TTCGAACGTG CCGGCTTTCC TCAGCAAGCT GTGGACGCTT GTGGAGGAAA 120CCCACACTAA CGAGTTCATC ACCTGGAGCC AGAATGGCCA AAGTTTTCTG GTCTTGGATG 180AGCAACGATT TGCAAAAGAA ATTCTTCCCA AATATTTCAA GCACAATAAT ATGGCAAGCT 240TTGTGAGGCA ACTGAATATG TATGGTTTCC GTAAAGTAAT ACATATCGAC TCTGGAATTG 300TTAAGCAAGA AAGAGATGGT CCTGTAGAAT TTCAGCATCC TTACTTCCAA 350(2)SEQ ID No.41的信息(ⅰ)序列特征(A)長度377堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:41的序列描述TCCTAAAGCT TTCTCTGCTC CAGTTATTTT TATTAAATAT TTTTCACTTG GCTTATTTTT60AAAACTGGGA ACATAAAGTG CCTGTATCTT GTAAAACTTC ATTTGTTTCT TTTGGTTCAG 120AGAAGTTCAT TTATGTTCAA AGACGTTTAT TCATGTTCAA CAGGAAAGAC AAAGTGTACG 180TGAATGCTCG CTGTCTGATA GGGTTCCAGC TCCATATATA TAGAAAGATC GGGGGTGGGA 240TGGGATGGAG TGAGCCCCAT CCAGTTAGTT GGACTAGTTT TAAATAAAGG TTTTCCGGTT 300TGTGTTTTTT TGAACCATAC TGTTTAGTAA AATAAATACA ATGAATGTTG NAAAAAAAAA 360AAAAAAAAAA ACTCGAG 377(2)SEQ ID No.42的信息(ⅰ)序列特征(A)長度374堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:42的序列描述CGGCACGAGG CGCCACTTGC GAGCGCTGCA AGGGCGGCTT TGCGCCCGCT GAGAAGATCG60TGAACAGTAA TGGGGAGCTG TACCATGAGC AGTGTTTCGT GTGCGCTCAG TGCTTCCAGC 120AGTTCCCAGA AGGACTCTTC TATGAGTTTG AAGGAAGAAA GTACTGTGAA CATGACTTTC 180AGATGCTCTT TGCCCCTTGC TGTCATCAGT GTGGTGAATT CATCATTGGC CGAGTTATCA 240AAGCCATGAA TAACAGCTGG CATCCGGAGT GCTTCCGCTG TGACCTCTGC CAGGAAGTTC 300TGGCAGATAT CGGGTTTGTC AAGAATGCTG GGAGACACCT GTGTCGCCCC TGTCATAATC 360GTGAGAAAGC CAGA 374(2)SEQ ID No.43的信息(ⅰ)序列特征(A)長度492堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:43的序列描述CTTTGCATTT TACAGTAAGA ATCAAAGTCC CTTCAGTGTG CCTTTGTCAG CTAATATGTG60ACCAGCAATG ACAACCTTGG GAGTATTTAT TAAATATTAT GCTATGAATA TAGGCAACAC 120AGAACAGGGT TTGCAGTATA GCGTCTTGAT GCTAAATTCT CATATACCTC TACACGAGAA 180ATATGGAGGA GAAAAACAAG CATTTACATA TATTCTTCGT CACTTTGAAG ATGCATGACC 240TGAACTCGAC TGCTTGTGTT TGTTTACATA TCAGGCATAC CCAGGCATCT CCTGCAGCCA 300GAGGTTCCAT TGCTGTCTTT GCTCAGTCCT CTTTTAAAAT ATGAATTAGT GGACAGGCAC 360GGTGCCTCAC ACCTGTAATC CCAGCACTTT GGGAGGTCGA GGCAGGTGGA TCACGAGGTC 420AGGAGATCAA GACCATCCTG GCTACCACTG AAACCCCATC TCTACTACAA AAAAAAAAAA 480AAAAAACTCG AG 492(2)SEQ ID No.44的信息(ⅰ)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:44的序列描述Ser Gln Ile Cys Glu Leu Val Ala His Glu Thr Ile Ser Phe Leu1 5 10 15(2)SEQ ID No.45的信息(ⅰ)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:45的序列描述Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Ile Leu Asp Glu Val Ile Arg Gly Thr1 5 10 15(2)SEQ ID No.46的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:46的序列描述Val Val Lys Thr Tyr Leu Ile Ser Ser Ile Pro Gln Gly Ala Phe Asn1 5 10 15Tyr Lys Tyr Thr Ala20(2)SEQ ID No.47的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:47的序列描述Val Val Lys Thr Tyr Leu Ile Ser Ser Ile Pro Leu Gln Ala Phe Asn1 5 10 15Tyr Lys Tyr Thr Ala20(2)SEQ ID No.48的信息(ⅰ)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:48的序列描述Xaa Ala Lys Lys Phe Leu Asp Ala Glu His Lys Leu Asn Phe Ala1 5 10 15(2)SEQ ID No.49的信息(ⅰ)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:49的序列描述Xaa Xaa Xaa Lys Ile Lys Lys Phe Ile Gln Glu Asn Ile Phe Gly1 5 10 15(2)SEQ ID No.50的信息(ⅰ)序列特征(A)長度18氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:50的序列描述Xaa Lys Val Lys Val Gly Val Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly Arg Leu1 5 10 15Val Thr(2)SEQ ID No.51的信息(ⅰ)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:51的序列描述Xaa Tyr Gln Tyr Pro Ala Leu Thr Xaa Glu Gln Lys Lys Glu Leu1 5 10 15(2)SEQ ID No.52的信息(ⅰ)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:52的序列描述Xaa Pro Ala Val Tyr Phe Lys Xaa Xaa Phe Leu Asp Xaa Asp1 5 10(2)SEQ ID No.53的信息(ⅰ)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:53的序列描述Xaa Pro Ala Val Tyr Phe Lys Glu Gln Phe Leu Asp Gly Asp Gly1 5 10 15(2)SEQ ID No.54的信息(ⅰ)序列特征(A)長度18氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:54的序列描述Xaa Xaa Val Ala Val Leu Xaa Ala Ser Xaa Xaa Ile Gly Gln Pro Leu1 5 10 15Ser Leu(2)SEQ ID No.55的信息(ⅰ)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:55的序列描述Val Val Lys Thr Tyr Leu Ile Ser Xaa Ile Pro Leu Gln Gly Ala1 5 10 15(2)SEQ ID No.56的信息(ⅰ)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:56的序列描述Xaa Xaa Lys Thr Tyr Leu Ile Ser Ser Ile Pro Leu Gln Gly Ala1 5 10 15(2)SEQ ID No.57的信息(ⅰ)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲類型線性(ⅹⅰ)SEQ ID NO:57的序列描述Met Asp Ile Pro Gln Thr Lys Gln Asp Leu Glu Leu Pro Lys Leu1 5 10 1權利要求
1．一種多肽，其包含具有選自SEQ ID No.2,4,5,6,7和8的部分序列的一種前列腺蛋白質或是與該蛋白質僅在保守性替換和/或修飾上有差別的變體的免疫原性部分。
2．一種多肽，其包含有一種前列腺蛋白質或者與該蛋白質僅在保守性替換和/或修飾上有差別的變體的一個免疫原性部分，其中該蛋白質包含有選自SEQ ID No.11和13-19中列出的序列、這些序列的互補序列以及在中度嚴格條件下與SEQ ID No.11和13-19列出的序列或其互補序列雜交的DNA序列的DNA序列編碼的氨基酸序列或其部分。
3．一種含有編碼權利要求1或2的多肽的核苷酸序列的DNA分子。
4．一種含有權利要求3的DNA分子的表達載體。
5．一種用權利要求4的表達載體轉化的宿主細胞。
6．權利要求5的宿主細胞，其中該宿主細胞選自大腸桿菌、酵母和哺乳動物細胞。
7．一種包含有權利要求1或2的多肽及生理上可接受的載體的藥物組合物。
8．一種包含有權利要求1或2的多肽及一種非特異性免疫反應增強劑的疫苗。
9．權利要求8的疫苗，其中非特異性免疫反應增強劑是一種佐劑。
10．一種含有一種DNA分子和一種非特異性免疫反應增強劑的疫苗，該DNA分子包含有編碼權利要求1或2的多肽的核苷酸序列。
11．權利要求10的疫苗，其中非特異性免疫反應增強劑是一種佐劑。
12．一種用于前列腺癌治療的藥物組合物，其包含一種多肽和一種生理上可接受的載體，該多肽含有一種前列腺蛋白的具有選自SEQ ID No.1,3,20,21,25-31和44-57的部分序列的免疫原性部分。
13．一種用于前列腺癌治療的疫苗，其包含有一種多肽和一種非特異性免疫反應增強劑，該多肽包含有一種前列腺蛋白的具有選自SEQ IDNo.1,3,20,21,25-31和44-57的部分序列的免疫原性部分。
14．權利要求13的疫苗，其中非特異性免疫反應增強劑是一種佐劑。
15．一種根據權利要求7的藥物組合物，其用于抑制前列腺癌發展的藥物的制造。
16．一種根據權利要求8的疫苗，其用于抑制前列腺癌的發展的藥物的制造。
17．一種檢測病人中前列腺癌的方法，包括(a)獲自病人的生物學樣品與能結合權利要求1或2的多肽的結合試劑接觸；且(b)檢測樣品中結合到結合試劑上的蛋白質或多肽從而檢測病人中的前列腺癌。
18．權利要求17的方法，其中結合試劑是一種單克隆抗體。
19．權利要求17的方法，其中結合試劑是一種多克隆抗體。
20．一種監視病人中前列腺癌發展的方法，包括(a)獲自病人的生物學樣品與能結合權利要求1或2的多肽的結合試劑接觸；(b)檢測樣品中結合到結合試劑上的蛋白質或多肽的量；(c)重復步驟(a)和(b)；且(d)比較步驟(b)和(c)中檢測到的多肽的量以監視病人中前列腺癌的發展。
21．一種檢測病人中前列腺癌的方法，包括(a)獲自病人的生物學樣品與能結合一種多肽的結合試劑接觸，該多肽含有一種前列腺蛋白質的具有選自SEQ ID No.1,3,20,21,25-31和44-57的部分序列的免疫原性部分；且(b)檢測樣品中結合到結合試劑上的蛋白質或多肽從而檢測病人中的前列腺癌。
22．權利要求21的方法，其中結合試劑是一種單克隆抗體。
23．權利要求21的方法，其中結合試劑是一種多克隆抗體。
24．一種監視病人中前列腺癌發展的方法，包括(a)獲自病人的生物學樣品與能結合一種多肽的結合試劑接觸，該多肽含有一種前列腺蛋白質的具有選自SEQ ID No.1,3,20,21,25-31和44-57的部分序列的免疫原性部分；(b)檢測樣品中結合到結合試劑上的蛋白質或多肽的量；(c)重復步驟(a)和(b)；且(d)比較步驟(b)和(c)中檢測到的多肽的量以監視病人中前列腺癌的發展。
25．一種與權利要求1或2的多肽結合的單克隆抗體。
26．一種根據權利要求25的單克隆抗體，其用于抑制前列腺癌的發展的藥物的制造。
27．權利要求26的單克隆抗體，其中的單克隆抗體與一種治療劑相偶聯。
28．一種檢測病人中前列腺癌的方法，包括(a)獲自病人的生物學樣品與聚合酶鏈式反應中的至少兩條寡核苷酸引物接觸，其中至少一條寡聚核苷酸引物特異于選自SEQ ID No.9-19,22-24和32-43的一種DNA分子；且(b)檢測樣品中在該寡核苷酸引物存在時擴增的DNA序列從而檢測前列腺癌。
29．權利要求28的方法，其中至少一個寡核苷酸引物包含選自SEQID No.9-19,22-24和32-43的一種DNA分子的至少約10個連續核苷酸。
30．一種檢測病人中前列腺癌的方法，包括(a)獲自病人的生物學樣品與至少一個特異于選自SEQ ID No.9-19,22-24和32-43的一種DNA分子的寡核苷酸探針接觸；且(b)檢測樣品中與寡核苷酸探針雜交的DNA序列從而檢測前列腺癌。
31．權利要求30的方法，其中的探針包含選自SEQ ID No.9-19,22-24和32-43的一種DNA分子的至少約15個連續核苷酸。
全文摘要
提供了用于治療和診斷前列腺癌的化合物和方法。發明的化合物包括含有一種前列腺蛋白質的至少一部分的多肽。也提供了用于前列腺癌的免疫治療的包含這種多肽或編碼這種多肽的DNA分子的疫苗和藥物組合物。發明的多肽也可以用來產生用于前列腺癌的診斷和監視的抗體。也提供了用于制備探針、引物和多肽的核苷酸序列。
文檔編號C07K14/47GK1222935SQ97194019
公開日1999年7月14日 申請日期1997年3月14日 優先權日1997年3月14日
發明者S·G·里德, D·C·狄爾頓, D·R·特瓦德茲 申請人:科里克薩有限公司