專利名稱：用于預防和治療過敏的肽免疫原的制作方法
1．領域本發明涉及肽免疫原，用于抑制相互作用，此相互作用通常導改由與過敏原相連的細胞結合的IgE誘導產生的肥大細胞和嗜堿性粒細胞的激發，導致藥理活性介體的釋放和控制過敏及炎癥發生中所涉及的細胞因子的從頭合成。本發明涉及包含BSW17模擬型肽(BSW17 mimotopepeptide)組分的免疫原分子和它們的用途。2．背景過敏癥狀由藥理活性介體，公認的有組胺、白細胞三烯和一些酶類，從細胞釋放到周邊組織和血管結構中引起。這些介體通常在稱為肥大細胞和嗜堿性粒細胞的特殊細胞中貯存或從頭合成。肥大細胞分布在整個動物組織中而嗜堿性粒細胞分布在血管系統內。這些細胞在細胞內合成并貯存介體，除非特定次序的事件發生激發其釋放。
免疫球蛋白(IgE)抗體在介導過敏反應中的作用已是眾所周知的。IgE是由一組多肽鏈復雜排列形成，象其他免疫球蛋白一樣，包含了兩條輕鏈和兩條重鏈，它們由二硫鍵連接形成“Y”形構型。每條輕鏈有兩個結構域，一個可變區(VL)連著一個氨基酸序列相對不變的恒定區(CL)。相對地，重鏈有一個可變區(VH)和IgE中有四個恒定區(CH1,CH2,CH3,CH4,也稱作Cε1,Cε2,Cε3,Cε4)。抗體的兩“臂”與抗原結合有關，其上有多肽結構變化的區域，稱為Fab’片段或者F(ab)2片段，F(ab’)2代表2個Fab’臂由二硫鍵連接。抗體的“尾部”或中軸包含一段固定或恒定的肽序列，稱為Fc片段。Fc片段含有相互作用的位點，使抗體能夠與其他免疫系統分子或細胞通過與它們的Fc受體結合相互聯系。
Fc受體是能夠特異地與免疫球蛋白Fc區域內活性分子位點結合的分子。Fc受體可以在一個細胞的細胞質外膜中以整合膜蛋白形式存在或者以在血漿或其他體液中自由循環的自由“可溶性”分子形式存在。在人體系統中，IgE與其受體FcεRI高親和性結合伴隨著一個復雜的蛋白-蛋白間相互作用，此相互作用有IgE的第三個重鏈恒定區結構域(Cε3)的不同部位和FcεRIα亞基的近膜免疫球蛋白樣的區域(α2)參與。
盡管IgE重鏈恒定區Cε3結構域中的一些氨基酸殘基和屬于FcεRIα受體的α2結構域的一些區域，已經被確定對結合是重要的，但是結合過程的詳細機理仍不清楚。熒光能量轉移測定、X-射線和中子散射實驗提供了實驗的證據表明，人類IgE有一個彎曲結構，推測其與IgE對FcεRI的獨特的高親和性(Kd～10-10M)有關，而且盡管IgE分子為受體結合提供兩個Cε3結構域上的相同抗原決定基，但推測這個彎曲保證了IgE與細胞結合的或可溶的FcεRI之間形成等摩爾復合物。這種單價性在功能上是保證在缺乏過敏原的情況下避免受體激發所必需的(
圖1)。相互作用位點根據它們的功能可能已經暴露從而能夠與細胞受體結合。或者，它們可能在抗體與抗原結合之前是隱藏的，在結合時抗體在結構上發生改變繼而暴露其他活性位點，然后該活性位點能夠激發特異的免疫活性。根據從圓二色譜分析得到的數據，有一種影響Cε3結合到受體上的構象重排可用來解釋細胞表面上Fcε/FcεRI復合物1∶1的化學比。
對生物體內組胺從肥大細胞和嗜堿性粒細胞中過敏性(免疫性)釋放來說，IgE分子必須以它的Fc部分鎖定或粘附在細胞的Fc受體位點上，導致IgE分子固定在肥大細胞和嗜堿性粒細胞上。與細胞結合的IgE分子的Fab部分必須與一個特定相容性抗原(過敏原)交叉連接。當上述相互作用發生時，肥大細胞或嗜堿性粒細胞被自動激發釋放組胺到周圍環境中，表面出熟悉的過敏癥狀。在后期反應中隨著其他生化反應的發生導致了細胞因子和其他介體的從頭合成和釋放[Ravetch,J.V.,and J.P.Kinet,Ann．免疫學年鑒9(1991)457-492].
傳統的治療過敏癥的方法包括用抗組胺劑或類固醇的系統治療或使病人脫敏的嘗試，這些方法不是針對基本的IgE與肥大細胞/嗜堿性粒細胞相互作用。其他的方法是關于多肽鏈的合成，合成的多肽鏈能夠阻斷IgE抗體與細胞表面的Fc受體結合和從已經結合了IgE的結合位點上轉移IgE。而且，為了確定IgE Fc區域內假定的“效應物”位點的性質已經進行了研究，推測此位點提供了一個激發肥大細胞和嗜堿性粒細胞釋放介體的免疫信號。
已經嘗試使用重組的IgE片段作為免疫原，產生保護性的抗IgE疫苗，并證明有效。反對這種疫苗的主要理由是擔心使用大的IgE片段來免疫接種不僅會引起抑制性抗體的產生，而且會在病人體中產生交叉連接從而產生過敏原的抗體(圖2)。
對這個問題的解決策略是以確定可能的最小的IgE片段為目標，這個小片段理想地僅包含受體結合位點，在結合后包埋在IgE/FcεRI復合物中，因此通過疫苗引起的免疫應答中不再產生交叉連接。但是考慮到在IgE/FcεRI相互作用中涉及的不同的Cε3區域的空間距離，重建這樣一種復雜的分子實體的嘗試可能未必會成功。3．發明概述現已發現，使用BSW17模擬型肽作自動免疫能解決與“經典”疫苗方法有關的本質問題，BSW17模擬型肽或者以與適當的載體偶聯的化學合成的肽形式，或者以重組融合構建體(例如和卵白蛋白、IgG等)的形式存在。
BSW17是一個單克隆抗體，能夠識別其至少一部分位于Cε3內部的Fcε上的構象抗原決定基。依據關于微生物保存的布達佩斯條約規定，產生單克隆抗體BSW17的雜交瘤細胞系已于1996年12月19日保藏在ECACC庫中，保藏號為96121916。如圖3中所示，這種抗體顯示生物活性的有趣分布。循環于血管系統內的BSW17或BSW17樣的抗體通過以下的方式防止過敏反應a)通過競爭性抑制IgE/IgERI相互作用來抑制肥大細胞和嗜堿性粒細胞的激發和b)通過B細胞水平的IgE合成的負調節來降低血清IgE水平。
BSW17“模擬型”肽目前已通過隨機肽噬菌體展示(Phagedisplay)文庫篩選得到鑒定，即模擬IgE分子上復雜構象的抗原決定基的至少一部分的肽。化學合成的模擬型肽與一種免疫原的載體蛋白偶聯可以用于，例如作為疫苗，使過敏的宿主中特異地產生抗體，通過阻斷IgE/FcεRIα結合和/或IgE合成來抑制肥大細胞和嗜堿性粒細胞激發。作為一種抗IgE抗體的模擬型肽，它們誘導一種免疫應答，使宿主內產生BSW17樣的抗體。既然已證明BSW17為非過敏原性，并對B細胞上IgE/FcεRI結合和IgE的合成有抑制作用，那么針對以BSW17模擬型肽為基礎的疫苗而產生的這些抗體具有相似的保護特性。與“經典的疫苗方法”相比，這種免疫應答是非常特異的，因為不存在IgE衍生的蛋白片段來導致免疫的病人體內產生交聯的抗體(圖4)。
因此本發明涉及免疫原分子包括(a)至少一種BSW17模擬型肽組分和(b)能夠針對此肽引起免疫應答的組分。在下文中簡稱為“本發明的免疫原”。
組分(a)優選地包含最多5個，優選1個或2個，尤其是一個BSW17模擬型肽組分，組分(b)正如下文所述，優選地是一種傳統的免疫原載體，尤其是BSA或者KLH。
組分(a)的BSW17模擬型肽優選總共最多15個氨基酸的，例如下文中序列(A)到(Q)(Seq.id.no.1 to no.17)之一。但是它們能適當地包括用于半抗原-載體結合的其他組分，例如促進與組分(b)偶聯或進一步加工的組分。因此，當BSW17模擬型肽是環狀時，兩端可以，例如通過兩個附加的半胱氨酸殘基形成二硫鍵而結合在一起或者末端被化學交聯，例如與賴氨酸；或者當BSW17模擬型肽是線型時，羧基端的氨基酸可以方便地通過酰胺化作用封閉，和/或氨基端的氨基酸可以容易地通過乙酰化作用封閉。此外，組分(a)的BSW17模擬型肽組分，例如下文中優選的組分(A)至(Q)，可以在本發明的免疫原中側接幾個，優選1或2個，附加的輔助基團，如乙酰基，半胱氨酸或賴氨酸和/或附加的偶聯基團，如DC或BSS，例如在下文提到的實施例8中所揭示的本發明的特定免疫原中作為偶聯物(2)到(4),(6)到(11),(13)和(14)。
與雜交瘤BSW17產生的抗體相比，本發明的免疫原誘導產生的抗體是內源的；因此它們在病人中能起到預防治療的作用。
它們能夠通過適當地按上述解釋的方法偶聯組分(a)和(b)制備得到。4．詳細描述本發明的免疫原例如以一種多聚肽或一種重組融合蛋白的形式存在，靠多聚肽中的單體化合物成融合蛋白中的一個配偶體構成BSW17模擬型肽組分(a)，而多聚肽或融合蛋白的剩余部分構成引發免疫應答的組分(b)。
特別地，它們以至少一種BSW17模擬型肽組分(a)和免疫原的載體組分(b)形成的偶聯物的形式存在。
優選的BSW17模擬型肽組分，即本發明的免疫原的組分(a)，基本上包括或包含選自下面的氨基酸序列Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val (A) (Seq.id.no.1),Arg-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val (B) (Seq.id.no.2),Arg-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Tyr-Trp-Leu-Trp (C) (Seq.id.no.3),Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly (D) (Seq.id.no.4),Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly (E) (Seq.id.no.5),Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (F) (Seq.id.no.6),Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (G) (Seq.id.no.7),Val-Asn-Arg-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu (H) (Seq.id.no.8),Val-Lys-Leu-Pro-Trp-Arg-Phe-Tyr-Gln-Val (I) (Seq.id.no.9),Val-Trp-Thr-Ala-Cys-Gly-Tyr-Gly-Arg-Met (J) (Seq.id.no.10),Gly-Thr-Val-Ser-Thr-Leu-Ser (K) (Seq.id.no.11),Leu-Leu-Asp-Ser-Arg-Tyr-Trp (L) (Seq.id.no.12),Gln-Pro-Ala-His-Ser-Leu-Gly (M) (Seq.id.no.13),Leu-Trp-Gly-Met-Gln-Gly-Arg (N) (Seq.id.no.14),Leu-Thr-Leu-Ser-His-Pro-His-Trp-Val-Leu-Asn-His-Phe-Val-Ser (O) (Seq.id.no.15),Ser-Met-Gly-Pro-Asp-Gln-Thr-Leu-Arg (P) (Seq.id.no.16), orVal-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser (Q) (Seq.id.no.17).
更優選的是上述(A),(D)和(G)，尤其是(A)和(D)。
本發明也涉及藥物組合物，特別是疫苗，包含上面描述的免疫原分子和佐劑。
本發明也涉及配體，即在“被動免疫”中使用的針對BSW17模擬型肽的抗體或由抗體衍生的片段(見下面)，由此抗體或抗體片段也能識別對應于BSW17的人類IgE上的天然抗原決定基；也就是說，本發明涉及配體，如上面描述的包含了對BSW17模擬型肽組分特異的一個抗體結構或這個抗體結構域也能與IgE重鏈上的氨基酸序列反應，這部分氫基酸序列包含了被BSW17識別的天然抗原決定基，這些配體可作為多克隆或單克隆抗體在哺乳動物中產生；它們的優選形式為單克隆抗體，更優選的是它們的Fab片段或者F(ab’)2片段。
本發明進一步涉及本發明的免疫原的制備方法，包括共價偶聯a)至少一種BSW17模擬型肽組分與b)能對上述肽發生免疫應答的組分本發明也涉及上面描述的免疫原分子，用作一種藥物，例如用于治療IgE介導的疾病如過敏癥和遺傳過敏性皮炎。
本發明進一步涉及在藥物組合物，尤其是疫苗的制備中，上述免疫原分子抵抗IgE介導的疾病特別是過敏癥和遺傳過敏性皮炎的應用。
本發明更進一步涉及抵抗IgE介導的疾病如過敏癥和遺傳過敏性皮炎的預防或治療免疫的方法，包括當需要這種治療時，給病人施用治療有效量的上面所描述的免疫原分子。
本發明的免疫原，實質上不能介導非細胞溶解的組胺釋放，能夠誘導抗體產生，該抗體具有與IgE的Fc區域的靶氨基酸序列強血清學的交叉反應性。因此，它們在疫苗中或作為疫苗是有用的。
免疫原的初始用量(例如大約0.2mg到5mg，特別是1mg)例如是以肌內用藥，接著14到28天后，重復(加強劑量)同樣的劑量。劑量當然要在一定程度上視病人的年齡、體重和一般健康狀況而定。免疫可以是“自動的”或“被動的”。
在“自動”免疫中，病人接受了本發明的免疫原，并且通過它的抗hIgE應答是由病人的免疫系統自動產生的。
“被動”免疫是通過給患IgE介導的疾病的病人施用抗BSW17模擬型肽的抗體(或者是多克隆的或者是單克隆的抗體)來獲得的，給藥的方式優選注射。
多克隆抗BSW17模擬型肽的抗體制備可以通過給非人類哺乳動物施用本發明的免疫原，優選使用佐劑，并且收集生成的抗血清。通過在一段時間內重復注射可以得到更高的效價。用來制備抗體的哺乳動物品種沒有特別的限制；但一般傾向于使用兔或豚鼠，但馬、貓、狗、山羊、豬、大鼠、牛、綿羊等動物也可使用。生產抗體時，一定量的本發明的免疫原可用例如生理鹽水稀釋到一個合適的濃度，得到的稀釋液再與完全弗氏佐劑混合得到一種懸浮液。此懸浮液用于給哺乳動物用藥，例如腹腔內，例如給兔子用藥，每次用藥為從大約50μg到大約2500μg本發明的免疫原。此懸浮液用來實現免疫接種，優選大約每隔兩個星期用藥，時期為長達大約2-3個月，優選的是大約一個月。在最后一次用藥后經過1到2周傳代，從免疫的動物中收集血液，并將血液離心從血液中分離血清得到抗體。
單克隆抗BSW17模擬型肽的抗體可以是例如人或小鼠的。優選地，病人用從小鼠單克隆抗體或者人-鼠嵌合抗體(包含人的Fc區域和鼠的Fab’區域)制備得到的Fab’片段進行治療以減小對外來的動物免疫球蛋白的任何不良反應。小鼠單克隆抗體可用Khler和Milstein的方法制備(Kohler，G.and Milstein，C.，自然256495)，例如超免疫小鼠的脾細胞與適合的鼠骨髓瘤細胞系融合。很多方法可以用來得到人類單克隆抗體，包括用以下方法的生產(1)Epstein-Barr病毒(EB病毒，非洲淋巴細胞瘤病毒，EBV)轉化的B細胞(2)用于B淋巴細胞雜交的細胞系(3)人-鼠雜交瘤(4)人-人雜交瘤(5)人×人-鼠異源雜交瘤；和
(6)所有組成成分克隆(噬菌體展示)人×人-鼠異源雜交瘤是最優選的，包括組合人及鼠親本細胞型的有利特征。已使人-鼠異源雜交瘤細胞系適合于做B細胞融合(Teng,N.N.M.等，美國科學院院報807308)。
當用來進行免疫接種時，抗體可以通過最方便的肌肉注射的方法導入宿主體內。傳統的液體或固體載體也可運用，只要它們能被宿主接納，對宿主沒有不利的副作用且對疫苗沒有有害的影響。磷酸鹽緩沖液(PBS)可以單獨或與合適的佐劑如以氫氧化鋁為基礎的佐劑一起用來作為一種載體，PBS應在生理的PH值范圍內，例如大約PH6.8到7.2，優選大約PH7.0。免疫原性抗原的濃度可以在大約50μg到大約500μg的范圍內變動，優選每次注射大約20μg到300μg，溶劑的量一般從大約0.25ml到大約1ml，優選大約0.5ml。初次注射后需要多次注射，可以例如以一年的間隔。
就“自動”免疫來說，更適合人類使用，但其他哺乳動物品種例如狗也可以用與這些品種的IgE相對應的相似的模擬型肽同樣治療。“免疫原的載體”這個術語在此包括這樣一些物質，這些物質有獨立在宿主動物中引起免疫應答的性質并能與多肽共價偶聯，偶聯或者直接通過肽的形式或者在多肽的自由羧基、氨基或羥基與免疫原的載體物質的相應基團之間形成酯鍵，或者選擇性地通過常規的雙功能連接基團結合，或者作為融合蛋白。
這些載體的例子包括白蛋白，比如牛血清白蛋白(BSA)；球蛋白；甲狀腺球蛋白；血紅蛋白；血藍蛋白[特別是匙孔血藍蛋白(KLH)]；從蛔蟲中提取的蛋白，例如蛔蟲提取液，如免疫學雜志111260-268，免疫學雜志122302-308，免疫學雜志98893-900，和Am.J.Physiol.199575-578文章中所描述的或者從蛔蟲提取液中得到的純化產物；聚賴氨酸；聚谷氨酸；賴氨酸-谷氨酸共聚物，包含賴氨酸或者鳥氨酸的共聚物等。最近，疫苗的生產也采用白喉類毒素或破傷風類毒素作為免疫原的載體物質(Lepow M.L.等，傳染病雜志150402-406；Coen Beuvery,E.等，感染和免疫4039-45)而這些類毒素物質也可用于本發明。提純的結核菌素蛋白衍生物(PPD)尤其優選在“自動”免疫方案中應用，因為(1)它本身不誘導T細胞應答(即它實際上是T細胞半抗原)，然而表現為完全加工的抗原，并象一個完全加工的抗原被T細胞識別；(2)被認為是交聯識別模式中最有效的半抗原“載體”之一；和(3)它可以不經進一步測試而在人體中應用。
作為半抗原-載體結合劑，那些傳統上在制備抗原時使用的試劑都可以使用，例如上面所述，或以下實施例中提到的。
本發明共價偶聯組分(a)和組分(b)的方法可以用已知的方式實施。因此，舉例來說，對于直接共價偶聯，優選使用雙-N-琥珀酰亞胺衍生物，更優選雙磺基琥珀酰亞胺辛二酸(BSS)作為偶聯劑。戊二醛或碳二亞胺，更優選地二環己基碳二亞胺(DC)或者1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺，也可以用于肽(a)與免疫原的載體物質(b)的共價偶聯。
半抗原和半抗原-載體結合劑[即組分(a)]和載體[即組分(b)]的用量可以用常規的方法容易地得到確定。載體使用量優選為大約1到大約6倍，更優選為大約1到大約5倍于半抗原的重量，而半抗原-載體結合劑的使用量為半抗原摩爾當量的大約5到大約10倍。反應后，載體通過半抗原-載體結合劑結合到半抗原上，得到包括肽-載體復合物的所需抗原。所得到的本發明的免疫原可以容易地用常規的方法分離出來，例如通過透析，凝膠過濾，分級沉淀，等。
起始材料的制備也可用常規的方法實現。用來作為組分(a)的適當的肽可以例如通過隨機肽噬菌體展示文庫鑒定，和例如通過傳統的固相程序容易地合成，例如對環狀肽來說，可通過使用廣為所知的“F-moc”程序的固相程序，或者可以選擇性地使用通過隨機合成肽的篩選的擬肽策略來鑒定。圖解圖1:IgE與其高親和性受體IgERI之間的相互作用圖2 “經典的”抗IgE疫苗方法圖3:BSW17生物活性顯示4 以BSW17模擬型肽為基礎的免疫治療圖5 噬菌體展示的BSW17模擬型肽特異地識別BSW17圖6 噬菌體展示的BSW17模擬型肽抑制IgE/BSW17結合圖7 化學合成的BSW17模擬型肽與BSW17結合圖8a 環狀BSW17模擬型肽GEFCINHRGYWVCGDPA-KLH(BSS)偶聯物(SDS 236和Fcε(500-509)-KLH(BSS)偶聯物(SDS 237)被BSW17識別圖8b 不用BSW17模擬型肽偶聯物被BSW17識別圖9a: BSW17模擬型肽偶聯物[BSA(DC)]和Fcε(500-509)偶聯物[KLH(戊二醛]被BSW17特異識別圖9b: BSW17模擬型肽偶聯物[KLH(DC)；賴氨酸]被BSW17特異識別圖10a 用BSW17模擬型肽偶聯物(1)免疫接種后兔中誘導的抗人類IgE免疫應答圖10b 用BSW17模擬型肽偶聯物(2)免疫接種后兔中誘導的抗人類IgE免疫應答圖11 通過免疫接種在兔中產生的抗BSW17模擬型肽的抗體的血清效價圖12 在BSW17模擬型肽免疫的兔中抗人類IgE應答的同型特異性圖13 對于IgE結合抗BSW17模擬型肽的血清與BSW17的競爭圖14 親和純化的抗BSW17模擬型肽的抗體與hIgE結合圖15 免抗BSW17模擬型肽的血清和親和純化的抗BSW17模擬型肽的抗體對人類血細胞的過敏原性檢測-R2/0,R4/0在BSW17模擬型肽接種之前兔R2和R4的免疫前血清-R2/SDS214,R4/SDS213初次免疫接種65天后，兔R2和R4的血清-抗SDS213，抗SDS214親和純化的抗BSW17模擬型肽的抗體-R2/O PC,R4/O PC加了兔血清的陽性激發對照(PC)樣品濃度A=0.1μg抗BSW17模擬型肽的抗體(或者相當于兔全血清中的量)每毫升B=1.0μg抗BSW17模擬型肽的抗體(或者相當于兔全血清中的量)每毫升C=5.0μg抗BSW17模擬型肽的抗體(或者相當于兔全血清中的量)每毫升縮寫Ac 乙酰基AMS 硫酸銨BSA 牛血清白蛋白BSS 雙磺基琥珀酰亞胺辛二酸BSW17 抗天然IgE的CH3抗原決定基的IgG單克隆抗體(J.Knutti-mller et al.，過敏41457-465；S.Miescher et al.,Int.Arch.Allergy Immunol.10575)BSW17 mimotope peptide模仿人類IgE上天然抗原決定基的肽，能被單克隆的抗人類IgE抗體BSW17識別cfu 集落形成單位DC二環己基碳二亞胺EBV EB病毒，非洲淋巴細胞瘤病素ELISA 酶聯免疫吸附測定FcεRI IgE恒定區的高親和性受體ⅠFCS 胎牛血清gam 羊抗鼠gar 羊抗兔h 人類HEPES N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙基磺酸HRP 辣根過氧化物酶(=POX)HSA 人血清白蛋白IgE 免疫球蛋白EIPTG 異丙基-B-D-硫代半乳糖苷KLH 匙孔血藍蛋白Le27 單克隆的抗-人類IgE抗體(過敏,Supra；Int.Arch.Allergy Immunol.supra)LB-plates Luria-Bertani培養基平板mimotope peptide模仿抗體分子至少部分的構象抗原決定基的肽PBS 磷酸鹽緩沖液PEG 聚乙二醇POX 辣根過氧化酶(=HRP)PPD 純化的強結核菌素蛋白衍生物rhIL-3 重組的人類白細胞介素-3RIA plates 放射免疫分析平板RPMI1640標準細胞培養基(Sigma，圣路易斯，美國)SB-medium Na-Bacto培養基(Pharmacia,Uppsala,瑞典)sLt 可溶的白細胞三烯TBS Tris(三羥甲基氨基甲烷)緩沖鹽水VCS VCS M13輔助噬菌體(stratagene，美國)5．實施例在下列實施例中，闡明了本發明但在任何方面都不限制本發明的范圍，有關的溫度是指攝氏溫度。實施例1抗hIgE單克隆抗體BSW17的抗過敏潛力通過以BSW17模擬型肽進行自動免疫，在病人中建立了測試BSW17和BSW17樣抗體抗過敏能力的模型，BSW17對人類嗜堿性粒細胞樣細胞釋放組胺的影響，可從骨髓細胞與rhIL-3共培養中得到，說明如下。
單核細胞是用親本股骨頭的骨髓通過Ficoll-Hypaque密度沉降(1.077g/ml；400g)置換制備得到。5×105細胞/ml在包含15％FCS和2ng/ml人rhIL-3的RPMI1640培養基中培養。在37℃和5％CO2中培養6天后，加入含rhIL-3的等量培養基。在第12天，收獲細胞用于被動敏化和組胺釋放測定。在1ml的總體積中，大約5×105個培養的骨髓細胞培養在HA緩沖液(20mM HEPES；PH7.4；0.3mg/ml HSA)中，緩沖液中含有500ng/ml人IgE，含有或缺失50倍過量的單克隆的抗IgE抗體。37°培養2小時后，細胞上清在被動敏化中用來測定組胺。細胞沉淀用來激發組胺釋放。為確定直接組胺釋放的程度，被動敏化的骨髓細胞懸浮于0.3ml HCM緩沖液中(HA緩沖液含有0.6M CaCl2和1mM MgCl2，并與0.1μg/ml過敏原的單克隆的抗IgE抗體Le27共培養)。在上清和細胞沉淀物中的組胺含量由Technicon自動分析儀Ⅱ(Technicon,Tarrytown,New York,USA)測量。計算組胺釋放的百分根據公式組胺釋放(％)=(上清中的組胺/上清中的組胺+細胞沉淀中的組胺)×100。計算在被動敏化過程中的組胺釋放的百分比根據公式組胺釋放(％)=〔上清中的組胺(被動敏化后)/上清中組胺(激發后)+上清中組胺(敏化后)+細胞沉淀中組胺〕×100。計算抗IgE抗體特異的組胺釋放根據公式特異的組胺釋放(％)=總組胺釋放(％)一自發組胺釋放(％)。
三個獨立實驗的結果總結在表1中表1抗IgE抗體對敏化的骨髓細胞組胺釋放的影響
*)與rhIL-3(2ng/ml)一起培養的人骨髓細胞由IgE(0.5μg/ml)或者IgE和抗IgE抗體(0.25μg/ml)一起被動敏化**)A敏化過程中組胺釋放B用單克隆抗IgE抗體Le27(0.1μg/ml)激發后組胺釋放表1的數據清楚地顯示，骨髓細胞與IgE和BSW17一起培養在敏化過程中不釋放組胺，但抑制隨后Le27的激發。骨髓細胞與IgE和Le27一起培養，在被動敏化過程中已經被激發到一定程度，這樣在與這種免疫原的單克隆抗體第二次培養時，不再釋放組胺。骨髓細胞在缺乏任何一種單克隆抗IgE抗體時被動地敏化，然而在隨后的Le27激發后有效地釋放組胺。
可以總結出a)BSW17本身是非免疫原的和b)BSW17保護人的嗜堿性粒細胞免于受誘導劑誘導導致組胺釋放。因此，通過用BSW17模擬型肽自動免疫，在過敏病人中產生BSW17樣抗體。可預期保護宿主免于過敏反應的發展。實施例2隨機肽噬菌體展示文庫篩選和選擇陽性克隆被BSW17特異識別的噬菌體顆粒通過展示線型或環狀隨機肽的噬菌體文庫生物篩選得到鑒定，隨機肽長度從6到15個氨基酸殘基并分別與噬菌體肽PⅢ和PⅧ融合。為擴增噬菌體文庫，2ml大腸桿菌XL-Ⅰblue在SB培養基中生長到OD600=1.0的液體培養物，與1010個噬菌體在室溫下培養15分鐘，再加入含10μg/ml四環素和20μg/ml羧芐青霉素的10mlSB培養基，分別取10μl,1μl和0.1μl涂在含100μg/ml羧芐青霉素的LB平板上。培養液在37°劇烈振蕩培養1小時，再加入含10μg/ml四環素和50μg/ml羧芐青霉素的100mlSB繼續培養1小時，再加入1012cfu的VCSM13輔助噬菌體。在37℃劇烈振蕩2小時后，加入卡那霉素到終濃度70μg/ml，培養過夜。在4°,4000g下離心20分鐘后，將上清與38ml 12％NaCl和16％PEG 8000的冰冷的無菌過濾溶液混合，冰上冷卻30分鐘，4°,10000g離心30分鐘。噬菌體沉淀溶于含15％酪蛋白的2ml TBS中，在4℃下保存。為生物篩選，用溶于0.1M碳酸鹽緩沖液(PH9.0)濃度為20μg/ml的BSW17在4°涂敷CostarRIA平板(Costar 3690)過夜，之后用含1.5％酪蛋白的TBS封閉。加入2×1011cfu噬菌體，37°培養2小時，用PBS/0.1％Tween 20洗10遍。用水洗加樣孔，結合的噬菌體用總共200μl0.1M HCl(PH2.2)洗脫10分鐘。洗脫的噬菌體用2M Tris堿中和并如上所描述的進行擴增。為篩選陽性克隆，在三輪篩選后，用50μl大腸桿菌XL-Ⅰblue在SD培養基中生長到OD600=1.0的液體培養物，與1μl 10-8稀釋度的擴增噬菌體一起在室溫下培養15分鐘，然后在含100μg/ml羧芐青霉素的LB平板上涂板生長過液，隨機挑選菌落在含100μg/ml羧芐青霉素的LB平板上劃板。37°4小時后，浸泡于10mM IPTG的硝酸纖維素濾膜置于其上，32℃接著過液培養。揭下濾膜，在CHCl3-大氣中37℃培養30分鐘。將濾膜放置于50mM Tris(PH8),150mM NaCl,5mM MgCl2,3％BSA，每100ml 100U DNA酶Ⅰ和40mg溶菌酶培養1小時，去除細菌碎片，用含1.5％酪蛋白的TBS封閉，與溶于含1.5％酪蛋白的TBS中的BSW17-POX(BSW17與POX偶聯)一起培養過液，用TBS,TBS/0.5％Tween 20,TBS各洗濾膜10分鐘。為顯色，將濾膜條于1ml含600μg 4-氯-1-萘酚和0.042％過氧化氫的TBS中。實施例3鑒定展示模仿天然BSW17抗原決定基的肽(BSW17模擬型肽)的噬菌體顆粒分別展示由7,8或9個氨基酸組成的環狀肽和由10和15個氨基酸殘基組成的線形肽的不同的噬菌體顆粒，已發現與BSW17結合。編碼這些肽的DNA核苷酸序列已經確定。根據它們之間的同源性和Fcε內的同源區域，展示被BSW17識別的肽的3組噬菌體可以從DNA序列推斷出來。在表2中顯示了一個總結表2由BSW17模擬型肽噬菌體展示的肽序列A組
=帶正電荷的p=不帶電有極性的o=非極性的n=表達相應序列的克隆數目+(++),+/-=被BSW17識別的強度(分別為Seq id.no.18,no.19,no.20和No.21)上述A組的第二個肽(Seq.id.no.19)是肽(A)(Seq.id.no.1)和二個附加的用來環化的Cys。其他三個肽，Seq.id.no.18,seq.id.no.20和seq.id.no.21分別是進一步相似制備的肽。B組
以上B組的三個肽分別為肽(G)(Seq.id.no.7),(H)(Seq.id.no.8)和(Ⅰ)(Seq.id.no.9)。C組
上述C組的7個肽分別為，肽(O)(seq.id.no.15),肽(J)(Seq.id.no.10),肽(P)和二個附加的Cys(Seq.id.no.22)，肽(L)和二個附加的Cys(Seq.id.no.23)，肽(M)和二個附加的Cys(seq.id.no.24)，肽(N)與二個附加的Cys(Seq.id.no.25)，和肽(K)和二個附加Cys(Seq.id.no.26)，包括側翼Cys的C組的肽是強BSW17結合物。整個C組不表達與Fcε同源的序列；這些肽是僅僅從結構上模仿BSW17抗原決定基的真正的模擬型肽。
如從表2中可以看到的，A組中肽的羧基端是高度保守的，而氨基端，盡管更加簡并，都包含了帶正電的，極性的氨基酸。這種電荷的分布似乎對BSW17識別是必須的，因為在氨基端的這個特性不同的一個克隆證明僅僅能與BSW17很弱地結合。在Fcε中沒有發現具有明顯序列同源性的連續的一段氨基酸。然而模式相似性排列，可以將這些肽定位到Cε4結構域內500到508位的一段氨基酸上。Stanworth等[Lancet336(1990)1279]推測Fcε500-509十肽參與了通過受體結合的IgE激發肥大細胞。
屬于B組的肽互相之間高度同源。而且，它們的氨基端幾乎與Fcε370-375位氨基酸相同。這個序列是Cε3的一部分，并包含或鄰近一個已顯示參與了IgE與它的高親和性受體結合的區域。這一發現解釋了BSW17對IgE/IgERI相互作用的抑制。
可以總結出，被BSW17識別的復雜的構象抗原決定基包含了IgE分子的500-508(Cε4內)和370-375(Cε3內)氨基酸片段提供的構象結構〔編號按照E.A.Padlan and D.R.Davies，分子免疫學23(1986)1063〕。上述A和B組中的模擬型肽與一個免疫原的載體分子偶聯，免疫個體產生的抗體因而將通過阻斷IgE結合到它的高親和性受體和/或引發靶細胞的脫粒來避免過敏反應。
表中的C組總結出的肽互相之間和與Fcε之間沒有表現出明顯的同源性。因此，它們代表模擬被BSW17識別的三維結構的“真正的模擬型肽”。用這些模擬型肽作為免疫原，因而將導致抗過敏性的BSW17樣的抗體在免疫的宿主中產生。
對選擇的模擬型肽，在以下實施例4到6中表明了BSW17樣免疫應答的產生，其特異性地針對人類IgE上的BSW17抗原決定基。實施例4展示BSW17模擬型肽的噬菌體被BSW17特異地識別噬菌體顆粒展示的模擬型肽(表2的A組第一個克隆=圖5中克隆1=Cys-Arg-Arg-His-Asn-Tyr-Gly-Phe-Trp-Val-Cys=Seq.id.no.18；第二個克隆=Cys-Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val-Cys=Seq.id.no.19)與BSW17的抗原特異的高變區域的結合通過ELISA證明。按照標準的ELISA程序，將10μgBSW17和不同的單克隆抗體涂敷到COSTAR板的加樣孔中，用BSA封閉后，在100μl包含噬菌體顆粒的ELISA溫育緩沖液中溫育，噬菌體顆粒從噬菌體侵染的細胞培養物上清中得到，噬菌體滴度為109cfu/ml。沖洗后，平板加入含5μg辣根過氧化物酶(HRP)偶聯的抗M13抗體的溫育緩沖液溫育。所有的溫育在室溫下持續1小時，最后沖洗后，噬菌體顆粒與涂敷的抗體結合由HRP結合的抗M13血清通過按標準ELISA程序中的生色底物顯色變為可見的，圖5表示了模擬型肽噬菌體非常特異地與BSW17結合并不與其他抗體如8E7,3G9和5H10結合，這些抗體也是單克隆的抗Cε3抗體并通過使用重組的Cε3作為免疫原產生的，不與5H5/F8結合，5H5/F8代表另一種針對人FcεRIα的胞外部分的單克隆抗體。作為陰性的非抗體對照的重組FcεRIα鏈和作為陽性對照的涂敷了多克隆抗M13抗血清的加樣孔也包括在實驗中。實施例5展示BSW17模擬型肽的噬菌體競爭性抑制BSW17結合到IgE上模擬型肽-BSW17相互作用的特異性已通過證明展示模擬型肽的噬菌體顆粒的吸附干擾了BSW17/IgE結合得到進一步證明。細菌細胞在含有100μg/ml四環素和50μg/ml羧芐青霉素的SB中生長到OD600=0.4，然后加入VCSM13輔助噬菌體，37°連續溫育2小時。然后加入卡那霉素到終濃度70μg/ml。連續溫育過夜，噬菌體顆粒用聚乙二醇沉淀。用溶于0.1M碳酸鹽緩沖液(PH9.6)的20μg/ml的BSW17涂敷柔軟的RIA平板，并用含1.5％酪蛋白的TBS封閉。人IgE用氯胺-T方法進行125Ⅰ-標記，分別地，在濃度不斷增加的非標記IgE(標準曲線)或噬菌體顆粒存在下，每孔用100000cpm Ⅰ125-標記的IgE與涂敷到RIA平板上的BSW17結合。所有的實驗在室溫下進行，平板用0.9％NaCl+0.05％ Tween20洗三遍，切成塊，每個加樣孔在γ-計數器中測量1分鐘。
模擬型肽噬菌體(圖6中的phBSW.6-9=圖5中的克隆1=CRRHNYGFWVC=Seq.id.no.18；圖6中的PHBSW.29-8=圖5中的克隆18=CINHRGYWVC=Seq.id.no.19)(見上述實施例4)抑制了BSW17結合到IgE上。圖6表示了在展示BSW17模擬型肽的噬菌體克隆存在時，125Ⅰ標記的IgE與BSW17結合。封閉的圓圈表示了未標記的IgE的標準抑制曲線，用來估計在1011cfu/ml噬菌體顆粒存在時標記的IgE結合的抑制。噬菌體克隆產生的抑制分別相當于濃度為1μg/ml和1.7μg/ml的非標記的IgE。實施例6用展示模擬型肽的噬菌體克隆免疫兔誘導抗原決定基特異的免疫反應為測試以BSW17模擬型肽為基礎的疫苗方法的實用性，用展示BSW17模擬型肽的噬菌體顆粒和作為參照的輔助噬菌體分別免疫接種兔。1012cfu新制備的噬菌體顆粒在4℃PBS中透析。取1mL用完全弗式佐劑乳化進行第一次免疫，或用1ml不完全弗式佐劑進行加強免疫，每隔14天重復皮下免疫。在第三次加強免疫后，取出12ml血，室溫下在玻璃瓶中凝結4小時，2000g離心10分鐘。上清用ELISA測定抗人體IgE抗體的存在。來自三個不同個體的人類IgE(SUS11-IgE；PS-IgE；WT-IgE)在PBS中稀釋到50μg/ml濃度，取1μl小份滴在硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜在含1.5％酪蛋白的TBS中封閉1小時。兔血清在含1.5％酪蛋白的TBS中1∶200稀釋，溫育過夜。用TBS,TBS-0.05％Tween20和TBS各洗10分鐘。顯色的羊抗免HRP在含1.5％酪蛋白的TBS中1∶1,000稀釋并溫育4小時。沖洗和顯色按上述的進行。正如表3中所示的，用VCSM13噬菌體免疫接種的對照兔和未免疫接種的兔在它們的血清中只表現很弱的對人類IgE的反應，假設反映的是天然存在的抗兔IgE自動抗體與人IgE發生交聯反應。然而，除了對噬菌體PⅧ外殼蛋白的大量的免疫應答外，用BSW17模擬型肽噬菌體免疫的兔血清中還包含了對人IgE特異識別的大量增加的抗體水平表3用展示BSW17模擬型肽的噬菌體免疫的兔中抗IgE應答
線這些抗血清中BSW17抗原決定基的特異性可用競爭性ELISA證明硝酸纖維素膜塊如上述制備，在兔血清與含1.5％酪蛋白的TBS 1∶50的稀釋液中溫育過夜。沖洗后，用含1.5％酪蛋白的TBS按1∶50000稀釋度稀釋辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體BSW17(BSW17-HRP)，加入此抗體稀釋液，放置4小時。隨后的沖洗和顯色如上述操作。正如從表4中可以看到的，BSW17-HRP與不同來源的IgE制備物的結合受到了用BSW17模擬型肽噬菌體免疫的兔血清的抑制，而同時用輔助噬菌體免疫的兔血清不顯示任何抑制效應表4用BSW17模擬型肽噬菌體免疫的兔血清對BSW17/IgE相互作用的抑制
<p>在以下的實施例7和8中，表明了用化學合成的模擬型肽與載體蛋白偶聯作為免疫原來制備抗過敏疫苗的實用性。實施例7化學合成的BSW17模擬型肽高親和性地與BSW17結合為了確定BSW17模擬型肽噬菌體的由噬菌體衍生的部分可以省略且并不破壞模擬型肽序列的生物學活性，以下的肽由化學方法合成，包含了環狀BSW17模擬型十肽(A)[在表2,A組中表示為線型，即第二個克隆為肽(A)和2個附加的Cys(Seq.id.no.19)，這里包含7個附加的鄰近的噬菌體衍生的氨基酸殘基Gly-Glu-Phe-和-Gly-Asp-Pro-Ala作為側翼序線列，加入這些序列是為促進環狀模擬型肽的正確折疊]用標準技術合成后，此肽通過2個半胱氨酸環化并用R hodol綠熒光標記。在ELISA條件下，此肽與固定在微量滴定板的加樣孔上依次增加濃度的BSW17的結合用熒光測量的方法測定，表示在圖7中。實施例8與載體蛋白偶聯的化學合成的BSW17模擬型肽被BSW17特異識別不同的模擬型肽經化學合成，并與免疫原的載體蛋白偶聯。偶聯反應按肽與載體蛋白1∶1質量比，并按標準程序操作(Shans.Wong.蛋白質偶聯和交聯化學，CRC出版社)。偶聯物可以由以下偶聯劑制備得到-戊二醛偶聯-DC(二環己基碳二亞胺)偶聯-BSS(雙磺基琥珀酰亞胺辛二酸)偶聯-賴氨酸交聯得到的模擬型肽偶聯物是(1)P1=線型KTKGSGFFVF-BSA戊二醛(2)P4=線型AcINHRGYWVC-BSA(DC)(3)P5=線型AcRSRSGGYWLWC-BSA(DC)(4)SAF1-KLH=環狀GEFCINHRGYWVCGDPA-KLH(DC)(5)SAF2-KLH=線型KTKGSGFFVF-KLH(DC)(6)SAF3-KLH=線型VNLPWSFGLE-KLH(DC)(7)SAF3-Lys=線型VNLPWSFGLE-賴氨酸交聯(8)SAF4-KLH=線型VNLTWSRASG-KLH(DC)(9)SAF5-KLH=VNLTWS-KLH(DC)(10)SDS214=環狀GEFCRRHNYGFWVCGDPA-KLH(BSS)(11)SDS213,SDS227,SDS236,SDS252=環狀GEFCINHRGYWVCGDPA-KLH(BSS)(12)SDS237,SDS253=線型KTKGSGFFVF-KLH(BSS)(13)SDS242,SDS254=線型VNLPWSFGLE-KLH(BSS)(14)SDS243=線型VNLTWSRASG-KLH(BSS),由此(1),(5)和(12)是分別用戊二醛、DC和BSS偶聯制備的參考免疫原分子；因此(1)，即P1，其人類IgE的氨基酸500-509,Seq.id.no.28，見The LancetSupra，用戊二酸偶聯的方法與BSA偶聯(5)，即SAF2-KLH，是同樣的肽，Seq.id.no.28，用DC偶聯的方法與KLH偶聯；和(12)，即SDS237和SDS253，是同樣的肽，Seq.id.no.28，用BSS偶聯的方法與BSS偶聯。
其它的肽是本發明的免疫原，也就是說-(2)(P4)是N-乙酰化的肽(A)(Seq.id.no.1)，在C端的有一個附加的Cys(Seq.id.no.29)，通過DC偶聯的方法與BSA偶聯；-(3)(P5)是N-乙酰化的肽(C)(Seq.id.no.3)，在C端有一個的附加的Cys(Seq.id.no.30)，通過DC偶聯的方法與BSA偶聯；-(4)(SAF1-KLH)是實施例7的肽(Seq.id.no.31)通過由二個側翼Cys形成的二硫鍵環化，用DC偶聯的方法與KLH偶聯；-(6)(SAF3-KLH)是肽(G)(Seq.id.no.7)，與KLH通過DC偶聯的方法偶聯；-(7)(SAF3-Lys)是肽(G)(Seq.id.no.7)，通過賴氨酸交聯的方法偶聯；-(8)(SAF4-KLH)是肽(D)(Seq.id.no.4)，與KLH通過DC偶聯的方法偶聯；-(9)(SAF5-KLH)是肽(Q)(Seq.id.no.17)，與KLH通過DC偶聯的方法偶聯；-(10)(SDS214)是表2A組中第一個肽，具有與實施例7中肽(Seq.id.no.32)相同的7個相鄰的噬菌體衍生的氨基酸殘基；-(11)(SDS213,SDS227,SDS236,SDS252)是以上(4)中肽(Seq.id.no.31)相同的肽的環化，并用BSS偶聯的方法與KLH偶聯；-(13)(SDS242,SDS254)是肽(G)(Seq.id.no.7)用BSS偶聯的方法與KLH偶聯；和-(14)(SDS243)是肽(D)(Seq.id.no.4)用BSS偶聯的方法與KLH偶聯；圖8a表明，環狀BSW17模擬型肽-KLH(BSS)偶聯物(11)即SDS236，和Fcε衍生的“原始的”抗原決定基基元(12)，即SDS237，即Fcε(500-509)與KLH(BSS)偶聯為線型肽，都能以劑量依賴的方式被BSW17識別，而自由的KLH不表現任何結合。以各1μg SDS236,SDS237或自由的KLH涂敷微量滴定板的加樣孔，與不斷增加濃度的BSW17一起溫育。同羊抗鼠IgG-HRP(gamIgG-HRP)檢測結合的抗體，所示數據代表了減去在未涂敷抗體的(BSA封閉的)加樣孔中的背景結合的重復實驗的平均值。
圖8b總結了一些ELISA數據，這些數據來自用幾種化學偶聯方法偶聯在載體蛋白上的不同的BSW17模擬型肽偶聯物。微量滴定板的加樣孔以各5μg每種模擬型肽偶聯物，或自由的KLH涂敷，與10μg BSW17一起溫育。結合的抗體用gamIgG-HRP檢測。所示的數據代表了減去未吸附抗體的(BSA封閉的)加樣孔中的背景結合的重復實驗的平均值。與自由的KLH相比發現每一個BSW17模擬型肽偶聯物都被BSW17識別。然而，從幾個星期重復進行的實驗中，有一點發現變得更清楚，那就是通過DC偶聯的KLH偶聯物不太穩定并逐漸地失去了它們與BSW17結合的能力。相反，通過BSS偶聯得到的BSW17模擬型肽偶聯物被證明即使在+4°也是穩定的。
在圖9a和9b中表明，與KLH或BSA偶聯的BSW17模擬型肽被BSW17特異，并不被無關的單克隆抗體3G9(抗人體Cε3)和5H5/F8(抗人體RIα)識別。另外，微量滴定板加樣孔以各5μg的每個所示的模擬型肽偶聯物涂敷，并與10μg相應的單克隆抗體一起溫育。結合的抗體以gamIgG-HRP檢測，所示的數據代表了減去未加樣的(BSA封閉的)孔中的背景結合后，重復實驗的平均值。實施例9用BSW17模擬型肽偶聯物免疫兔導致體內抗人類IgE抗體的產生為確定BSW17模擬型肽偶聯物免疫原性的特異性，用如以下所列的一系列模擬型肽/載體制備物對兔進行免疫接種兔的編號 免疫原 偶聯物型R1 (10)SDS214R2 (10)SDS214Cε4模擬型肽R3 (11)SDS213R4 (11)SDS2131 KLH(Pierce)2 KLH-BSS接頭 KLH對照4 (12)SDS23711 (12)SDS237Cε4(500-509)7 (6)SAF3-KLH13 (7)SAF3-Lys14 (13)SDS242Cε3模擬型肽16 (13)SDS24217 (13)SDS25418 (7)SAF3-Lys5 (8)SAF4-KLHCε3(370-379)8 (8)SAF4-KLH19 (14)SDS24320 (14)SDS24312 (4)SAFI-KLH15 (4)SAFI-KLHCε4模擬型肽200μg相應的偶聯物制備物溶于總體積為500μl的磷酸鹽緩沖液(PBSdef)中，通過皮下注射對兔進行免疫接種。第一次免疫接種的樣品以1∶1的比例與完全弗氏佐劑(兔R1-R4)或TiterMax(sigma；兔1-20)混合。在起始免疫接種前，取出5ml血樣。加強免疫在第一次注射后第21和28天用不完全弗式佐劑進行。血樣在第28和49天提取，從所有血樣中制備血清。
抗人類IgE免疫應答在免疫的兔子中的產生用ELISA監測微量滴定板的加樣孔以5μg人體IgE(SUS-11；JW8)涂敷，與100μl血清樣品(1∶50用ELISA溫育緩沖液稀釋)一起溫育。與固定的人類IgE結合的兔抗體通過與羊抗免IgG-HRP(garIgG-HRP)一起溫育來檢測。測量的OD405值由每一個對應的兔子的免疫前的血清得到的讀出值來校正，血清稀釋度也為1∶50。圖10a和10b給出的數據代表重復測量的平均值。圖10a和圖10b清楚地證明了用不同的BSW17模擬型肽偶聯物免疫的兔子中針對人類IgE的抗體的誘導產生。
通過ELISA，分別與KLH載體，用作免疫原的肽和人類IgE相關的新產生的抗體的血清滴度得到確定。使用一系列的血清稀釋度分別與固定的KLH，模擬型肽-BSA偶聯物和人類IgE一起溫育。這樣的血清滴度鑒定的兩個例子表示在圖11中，分別為(11)，即SDS213，和(10)，即SDS214。
上述的例子證明了BSW17模擬型肽偶聯物作為免疫原來誘導抗人類IgE反應的實用性。實施例10用BSW17模擬型肽偶聯物免疫的兔中誘導的抗hIgE應答是同型特異的，在與IgE結合中與BSW17競爭免疫的兔中的抗人類IgE免疫應答的同型特異性通過ELISA監測微量滴定板的每個加一樣孔分別以3μg的人類IgE(SUS-11),IgA,IgG和IgM涂敷，再加100μl血清樣品(在ELISA溫育緩沖液中1∶50稀釋)溫育。由固定的人類抗體結合的兔抗體通過與羊garIgG-HRP一起溫育來測定。測出的OD405值通過從每一只相應的兔子的1∶50稀釋的免疫前血清得到的讀出值來校正。圖12中所給出的數據代表了重復實驗的平均值。如可見的，用BSW17模擬型肽偶聯物免疫的兔中產生的免疫應答對IgE特異，除了用(10)，即SDS214，免疫的兔血清對人類IgM的部分識別。
在競爭性ELISA中可更進一步表明，兔抗SDS214抗血清能夠不完全地與BSW17競爭和IgE的結合。每個微量滴定板加樣孔以1μg人類IgE(SUS-11)涂敷，并與含5μg BSW17或無BSW17的溫育緩沖液一起溫育。沖洗后，以1∶50用ELISA溫育緩沖液稀釋抗SDS213抗血清，加入100μl進行第二次溫育，由未處理的固定的人類IgE和預先與BSW17溫育的IgE結合的兔抗體通過加羊garIgG-HRP溫育來測定。在圖13中給出的數據代表了重復實驗的平均值。實施例11用BSW17模擬型肽偶聯物免疫的兔中產生的抗hIgE抗體可以通過用與Sepharose偶聯的模擬型肽作為親和劑的親和層析純化這個實施例證明，用BSW17模擬型肽偶聯物免疫在兔中誘導的抗hIgE應答與特異的抗模擬型肽的應答相同。
兔多克隆抗BSW17模擬型肽的抗體的免疫親和純化a)硫酸銨沉淀在22ml兔抗血清(根據Bradford,60mg/ml總蛋白，BSA標準，BIO-RAD)中加入5.5g固體AMS(25％W/V)，混合物攪拌3小時，并在室溫下放置過夜。沉淀通過18000rpm(Sorvall)離心45分鐘分離，用25ml25％AMS水溶液(W/V)洗。洗了的沉淀在同樣條件下再次離心，并在10mlPBS(含0.05％NaN3,PH7.2)中溶解，在5l同樣的緩沖液中+4°透析過夜。b)免疫親和層析被透析物在0.2μm Millex-GV濾膜器(Millipore)上過濾，并上樣到Pharmacia XK 16/30柱上，此柱中已充入了與5mg BSW17模擬型肽SDS227共價偶聯的CH-Sepharose 4B，以PBS,0.05％NaN3為層析緩沖液，流速為1ml/min。上樣和洗去未結合的蛋白組分后，特異結合的抗體用0.1M甘氨酸/鹽酸緩沖液(PH2.8)洗脫。洗脫液(組分第12-20在9ml溶液中)邊收集邊攪拌用3.3M Tris/HAc,0.8％NaN3,PH8.0溶液(50μl/ml)立即中和到PH7.4，最后在3lPBS,0.05％NaN3,PH7.2溶液中4°透析過夜。根據Bradford,BIgG標準(BIO-RAD)，總蛋白量大約為1mg/ml。從上樣的總蛋白中的回收率為0.7％。
親和純化的IgG組分與hIgE的結合用ELISA檢測。
以逐步增加濃度的人體IgE(JW8)涂敷微量滴定板的加樣孔，并分別與5μg純化的抗SDS-213抗血清和抗SDS214抗血清一起溫育。用garIgG-HRP檢測結合的抗體。圖14所示的數據代表重復實驗的平均值。如從圖中可見到的，在抗BSW17模擬型肽親和柱上純化的IgG抗體被人類IgE劑量依賴性地識別。用親和柱的流出液樣品，只觀察到較低背景結合活性。這些數據證明在兔中誘導的抗hIgE活性與針對模擬型肽的抗體相同。實施例12用BSW17模擬型肽偶聯物免疫后，兔中產生的抗人類IgE抗體對人血細胞是非過敏原的此例證明通過用BSW17模擬型肽偶聯物免疫在兔中產生的抗IgE抗體對人血中嗜堿性粒細胞是非過敏原的。作為檢測系統，可使用商業上有售的CAST sLt ELISA試劑盒(Bühlmann AG,Allshwil，瑞士)。在這個實驗中，從人嗜堿性粒細胞中可溶的白細胞三烯(sLt)的釋放作為細胞受過敏原試劑激發的結果，可用供應商提供的實驗方法來測定。在將細胞與檢測樣品共培養后，實驗的讀出值給出了每ml人白血細胞上清中存在的sLt的pg量，讀出值通過與標準曲線比較確定。標準曲線是用一系列稀釋度的標準sLt在競爭ELISA中得到。在每一次檢測中都包括了正、負對照，正和負對照分別是從所給的血細胞制備物(PC=“病人對照”；用交聯的抗IgERIα抗體激發細胞樣品后得到樣器)所能釋放的最多sLt和從血細胞制備物(PB=“病人空白”)自發sLt釋放的sLt背景水平。
從用實施例11中所述的BSW17模擬型肽偶聯物和親和純化的抗BSW17模擬型肽的抗體免疫的兔中得到完全血清，來檢測嗜堿性粒細胞激發的存在，因而檢測了非過敏原的抗hIgE抗體。從一個健康的供體新取出的人全血用來作為嗜堿性粒細胞的來源并嚴格地按CAST ELISA試劑盒的方法加工。圖15中總結的結果表明無論是包含了用BSW17模擬型偶聯物免疫產生的抗hIgE抗體的非純化血清，還是親和純化的抗BSW17模擬型肽的抗體，都沒有激發人體血細胞釋放白細胞三烯的能力；因此他們是非過敏原的。這是BSW17模擬型肽在人的抗過敏疫苗中應用的絕對前提。
序列表(1)基本信息(ⅰ)申請人(A)名稱Novartis AG(B)街名Schwarzwaldallee 21 5(C)城市巴塞爾(D)國家瑞士(E)郵政編碼(ZIP):CH-4058(F)電話61-3245269(G)傳真61-3227532(ⅱ)發明名稱肽免疫原(ⅲ)序列數目32(ⅳ)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.25(EPO)(ⅴ)目前申請資料申請號WO PCT/EP97/...
(ⅵ)在先申請資料(A)申請號GB9604412.8(B)遞交日1996年3月1日(ⅶ)在先申請資料(A)申請號GB 9617702.7(B)遞交日1996年8月22日(2)關于SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:1Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val1 5(3)關于SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:2Arg Asn His Arg Gly Tyr Trp Val1 5(4)關于SEQ ID NO:3的信息
(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:3Arg Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Trp Leu Trp1 5 10(5)關于SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:4Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly1 5 10(6)關于SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征
(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:5Val Asn Leu Pro Trp Ser Arg Ala Ser Glyl 5 10(7)關于SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:6Val Asn Leu Thr Trp Ser Phe Gly Leu Glu1 5 10(8)關于SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:7Val Asn Leu Pro Trp Ser Phe Gly Leu Glu1 5 10(2)關于SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:8Val Asn Arg Pro Trp Ser Phe Gly Leu Glu1 5 10(10)關于SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:9Val Lys Leu Pro Trp Arg Phe Tyr Gln Val1 5 10(11)關于SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:10Val Trp Thr Ala Cys Gly Tyr Gly Arg Met1 5 10(12)關于SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:11Gly Thr Val Ser Thr Leu Ser1 5(13)關于SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:12Leu Leu Asp Ser Arg Tyr Trp1 5(14)關于SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型
(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:13Gln Pro Ala His Ser Leu Gly1 5(15)關于SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:14Leu Trp Gly Met Gln Gly Arg1 5(16)關于SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型肽
(ⅲ)假擬是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO15Leu Thr Leu Set His Pro His Trp Val Leu Asn His Phe1 5 10Val Ser15(17)關于SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:16Ser Met Gly Pro Asp Gin Thr Leu Arg1 5(18)關于SEQ ID NO:17的信息(ⅰ)序列特征(A)長度6個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬是
(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:17Val Asn Leu Thr Trp Ser1 5(19)關于SEQ ID NO:18的信息(ⅰ)序列特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:18Cys Arg Arg His Asn Tyr Gly Phe Trp Val Cys1 5 10(20)關于SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬是(ⅳ)反義否
(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:19Cys Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val Cys1 5 10(21)關于SEQ ID NO:20的信息(ⅰ)序列特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:20Cys Thr Arg Leu His Thr Gly Tyr Trp Val Cys1 5 10(22)關于SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)序列特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的
(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:21Cys Thr Leu Ser Val Phe Gly Tyr Trp Val Cys1 5 10(23)關于SEQ ID NO:22的信息(ⅰ)序列特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:22Cys Ser Met Gly Pro Asp Gln Thr Leu Arg Cys1 5 10(24)關于SEQ ID NO:23的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:23
Cys Leu Leu Asp Ser Arg Tyr Trp Cys1 5(25)關于SEQ ID NO:24的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:24Cys Gln Pro Ala His Ser Leu Gly Cys1 5(26)關于SEQ ID NO:25的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:25
Cys Leu Trp Gly Met Gln Gly Arg Cys1 5(27)關于SEQ ID NO:26的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:26Cys Gly Thr Val Ser Thr Leu Ser Cysl 5(28)關于SEQ ID NO:27的信息(ⅰ)序列特征(A)長度17個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:27Gly Glu Phe Cys Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val Cys1 5 10Gly Asp Pro Ala15(28)關于SEQ ID NO:28的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬否(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:28Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe1 5 10(30)關于SEQ ID NO:29的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:29Ile Asn His Arg Gly Tyr Tro Val Cys1 5(31)關于SEQ ID NO:30的信息(ⅰ)序列特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:30Arg Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Trp Leu Trp Cys1 5 10(32)關于SEQ ID NO:31的信息(ⅰ)序列特征(A)長度17個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構兩種(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:31Gly Glu Phe Cys Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val Cys1 5 10Gly Asp Pro Ala15(33)關于SEQ ID NO:32的信息(ⅰ)序列特征(A)長度18個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構兩種(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假擬是(ⅳ)反義否(ⅴ)片段類型內部的(ⅵ)序列描述SEQ ID NO:32Gly Glu Phe Cys Arg Arg His Asn Tyr Gly Phe Trp Val1 5 10Cys Gly Asp Pro Ala1
權利要求
1．一種免疫原分子包括a)至少一種BSW17模擬型肽組分和b)能引發對上述肽的免疫應答的組分
2．根據權利要求1所述的免疫原分子，其中的BSW17模擬型肽是環狀的，由此其末端通過兩個附加的半胱氨酸殘基形成二硫鍵而結合在一起或者其末端用化學方法交聯；或者其中BSW17模擬型肽是線型的，由此其羧基端氨基酸可以通過酰胺化作用方便地封閉和/或其氨基端氨基酸可以通過乙酰化方便地封閉。
3．根據權利要求1所述的免疫原分子，所說的分子以一種多聚肽或一種重組融合蛋白的形式存在，靠多聚肽中的單體化合物或融合蛋白中的一個配偶體構成BSW17模擬型肽組分，而多聚肽或融合蛋白的剩余部分構成引發免疫應答的組分。
4．根據權利要求1所述的免疫原分子，所說的分子以BSW17模擬型肽和免疫原載體的偶聯物的形式存在。
5．根據權利要求1所述的免疫原分子，其中BSW17模擬型肽組分基本上包括選自以下的氨基酸序列Ile-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val(A),Arg-Asn-His-Arg-Gly-Tyr-Trp-Val(B),Arg-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Tyr-Trp-Leu-Trp(C),Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly(D),Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Arg-Ala-Ser-Gly(E),Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu(F),Val-Asn-Leu-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu(G),Val-Asn-Arg-Pro-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Glu(H),Val-Lys-Leu-Pro-Trp-Arg-Phe-Tyr-Gln-Val (I),Val-Trp-Thr-Ala-Cys-Gly-Tyr-Gly-Arg-Met (J),Gly-Thr-Val-Ser-Thr-Leu-Ser (K),Leu-Leu-Asp-Ser-Arg-Tyr-Trp (L),Gln-Pro-Ala-His-Ser-Leu-Gly (M),Leu-Trp-Gly-Met-Gln-Gly-Arg (N),Leu-Thr-Leu-Ser-His-Pro-His-Trp-Val-Leu-Asn-His-Phe-Val-Ser (O),Ser-Met-Gly-Pro-Asp-Gln-Thr-Leu-Arg (P),Val-Asn-Leu-Thr-Trp-Ser (Q).
6．一種藥物組合物，該組合物包括了據權利要求1-5的任何一項所述的免疫原分子和佐劑。
7．一種配體，該配體包括對如權利要求1-5的任何一項所述的BSW17模擬型肽組分特異的抗體結構域，因此此抗體結構域也與IgE重鏈上的氨基酸序列反應，IgE包含了被BSW17識別的天然抗原決定基。
8．根據權利要求7所述的配體，該配體以單克隆的抗體或其Fab’或F(ab)2片段形式存在。
9．根據權利要求1所述的免疫原分子的制備方法，該方法包括適當偶聯(a)BSW17模擬型肽組分和(b)能引發對此肽的免疫應答的組分。
10．如權利要求1-5中任何一項所述的免疫原分子，用作一種藥物來治療IgE介導的疾病。
11．如權利要求1-5中任何一項所述的免疫原分子在制備一種抗過敏疫苗中的應用。
全文摘要
免疫原分子包含(a)至少一種模擬被單克隆的抗人類IgE抗體BSW17識別的人類IgE上天然抗原決定基的肽組分,和(b)能夠針對此肽引發免疫應答的組分。它們在,或對藥物組合物的制備,特別是對IgE介導的疾病如過敏癥和遺傳過敏性皮炎的治療有用,例如抵抗過敏的疫苗。
文檔編號C07K16/44GK1213380SQ97192671
公開日1999年4月7日 申請日期1997年2月28日 優先權日1996年3月1日
發明者F·克里克, B·斯塔德勒 申請人:諾瓦提斯公司