具有吡啶基取代的c13側鏈的紫杉烷衍生物、其制備方法及其作為抗腫瘤劑的用途的制作方法

專利名稱：具有吡啶基取代的c13側鏈的紫杉烷衍生物、其制備方法及其作為抗腫瘤劑的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及能夠影響微管蛋白聚合與解聚的藥物活性化合物。
一系列天然有絲分裂毒素被用作抗腫瘤劑，或者用于臨床實驗中。這些有絲分裂毒素分為不同的類別，它們或者通過抑制紡錘體中微管的聚合產生細胞毒性(例如長春花屬生物堿、秋水仙素)，或者通過GTP-非依賴性增加微管蛋白聚合并且通過防止微管解聚產生細胞毒性(例如紫杉酚(taxol)、taxoters)。由于其迄今尚未確定的理化性質，并且由于腫瘤細胞的特性，有絲分裂毒素對腫瘤細胞具有一定的選擇性，但是對于非轉移細胞它們仍然保留著并非是無足輕重的細胞毒性。在找尋更具選擇性、更易于制造，并且-象紫杉烷類物質一樣-能夠抑制微管解聚的化合物時，出人意料地發現了冰片酯類物質，如在P4416374.6和19513040.5中所述。對這類化合物進行結構改性顯示出使微管作用最佳化的相當大的可能性。尤其是，通過用Sk-H類型的酸將那些冰片在形式上酯化取得了顯著的結果。通過合成本文所述的紫杉酚衍生物(其中紫杉酚的異絲氨酸鏈被Sk置換)，將研究該類物質與紫杉酚相比是否還可以改善微管的穩定作用。
目前出人意料地發現，本發明的式Ⅰ化合物與紫杉酚相比，具有有利的變化的活性模式。除了明顯改善微管的穩定作用之外，還證明了式Ⅰ化合物可影響微管蛋白的聚合作用。
本發明的紫杉烷類(taxanes)化合物可用通式Ⅰ表征
其中Sk可以是
R1可以是氫或C1-C10酰基，R2可以是α-OH或β-OH，R3可以是C1-C10烷基、X-取代的苯基、C1-C10烷氧基，X可以是氫、鹵素、-N3或-CN，并且Ⅰ中的游離羥基可以進一步通過醚化或酯化進行官能改性，還包括其α-、β-和γ-環糊精籠形物，和用脂質體包封的通式Ⅰ化合物。
表示烷基的R3可以是具有1-10個碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、庚基、己基和癸基。優選具有1-4個碳原子的烷基。通式Ⅰ的R1和R3中分別包括的酰基和烷氧基含有1-10個碳原子，分別優選的是甲酰基、乙酰基、丙酰基和異丙酰基，以及甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基和叔丁氧基。
X定義中的鹵素是氟、氯、溴或碘。
優選的通式Ⅰ化合物是3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-紫杉酚，3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-7-表-紫杉酚，3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-2,3′-N-二去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-紫杉酚，以及3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-10-去乙酰基-紫杉酚。
本發明還涉及式Ⅰ冰片衍生物的制備方法，該方法的特征在于，將通式Ⅱ的醇與通式Ⅲa、Ⅲb或Ⅲc化合物反應，
其中R1和R2如上所定義，并且Ⅱ中所包括的羥基是任選地被保護的，
其中R3如上所定義，并且X′可以是羥基、O-烷基或鹵素，并且其中游離羥基通過醚化或酯化作用進行保護，以形成通式Ⅰ化合物，其中游離羥基可以通過醚化或酯化作用進行進一步的官能改性。
為了將Ⅱ中的醇官能團酯化，用堿例如金屬氫化物(如氫化鈉)、堿金屬醇鹽(如甲醇鈉、叔丁醇鉀)、堿金屬六甲基二硅氮烷(如六甲基二硅氮烷鈉)、1,5-二氮雜雙環[4.3.0]壬-5-烯(DBN)、1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯(DBU)、三乙胺、4-(二甲氨基)吡啶(DMAP)或1,4-二氮雜雙環[2.2.2]辛烷(DABCO)進行脫質子反應，并與通式Ⅲ的羧酸衍生物在惰性溶劑(例如二氯甲烷、乙醚或四氫呋喃)中、在-70℃至+50℃的溫度下反應。優選的反應是用氫化鈉作為堿，用環酰胺作羧酸衍生物，用四氫呋喃作溶劑，并且反應溫度為-10℃至+25℃。
式Ⅰ中的游離羥基可以按照本領域專業人員已知的方法進行進一步的官能改性，例如通過醚化或酯化。例如，游離羥基可以用生理耐受的酸轉化為吡啶鎓鹽，用生理耐受的堿轉化為磷酸酯或其鹽、或者轉化為其酯，用生理耐受的堿轉化為硫酸酯或其鹽、或者轉化為其酯，或者用水溶性聚合物轉化為酯和醚。還可以制備其本身具有腫瘤抑制作用的這些化合物的酯和醚。
新的紫杉酚衍生物的生物作用及應用領域
新的式Ⅰ化合物是有價值的藥物。它們通過影響微管蛋白的聚合作用并使所形成的微管穩定與微管蛋白相互作用，因而能夠以階段特異的方式影響細胞分裂。由此，特別是影響其生長基本不受細胞內調節機制影響的迅速生長的腫瘤細胞。此類活性成分主要適用于治療對細胞分裂的影響可以產生治療作用的疾病。
可以提及的是例如治療惡性腫瘤、瘧疾、治療格蘭氏陰性菌引起的疾病，以及治療以促毒性(excitotoxic)機制為基礎的中樞和外周神經系統疾病，例如治療急性神經變性癥狀如因中風和腦外傷引起的疾病，治療慢性神經變性癥狀包括阿爾茨海默癥，以及治療肌萎縮性側索硬化。對于惡性腫瘤而言，可以提及的是，例如治療卵巢癌、胃癌、結腸癌、腺癌、乳腺癌、肺癌、頭頸癌、惡性黑素瘤和急性淋巴細胞和髓細胞性白血病。本發明化合物通常可以單獨使用，或者與其他活性成分和可用于所述治療領域的各類物質聯合使用、以產生附加或協同作用。對于腫瘤治療來說，可以提及的是例如與下列物質聯合治療●鉑配合物，例如順鉑(cisplatin)和卡鉑(carboplatin)，●間介物質，例如蒽環類物質如阿霉素，或者蒽吡唑類物質例如C1-941。●與微管蛋白相互作用的物質，例如長春花屬生物堿如長春新堿和長春堿，或者在P4416374.6和19513040.5中所述的一類新的冰片酯，或者大環內酯類物質例如根霉素(rhizoxin)，或者其他物質例如秋水仙素、combretastatin A-4和epothilon A和B，●DNA局部異構酶(topoisomerase)抑制劑，例如喜樹堿、依托泊甙、topotecan和替尼泊甙，●葉酸(folate)或嘧啶抗代謝物質，例如lometrexol和gemcitubin,●DNA烷基化化合物，例如adozelesin和dystamycin A，●生長因子抑制劑(例如PDGF、EGF、TGFb、EGF抑制劑)，例如生長激素釋放抑制因子、蘇拉明、蛙皮素拮抗劑，●酪氨酸蛋白激酶或蛋白激酶A和C抑制劑，例如erbstatin、金雀異黃素、staurosporine、ilmofosin和8-Cl-cAMP，●抗促孕激素類抗激素物質例如mifepristone、onapristone，或者抗雌激素類物質例如三苯氧胺，或者抗雄激素類物質例如環丙氯地孕酮，●轉移抑制化合物，例如二十烷酸類物質(eicosanoids)，如PGI2、PGE1、6-氧代-PGE1及其穩定的衍生物(例如iloprost、cicaprost、beraprost)，●透膜Ca2+流入抑制劑，例如戊脈安、galopamil、氟苯桂嗪、硫氮卓酮、硝苯吡啶和硝苯吡酯，●精神抑制藥，例如氯丙嗪、三氟拉嗪、甲硫噠嗪和奮乃靜，●局部麻醉藥，例如苯胺基甲酸-Ca7、地布卡因、苯胺基甲酸-Ca3、articaine、苯胺基甲酸、利多卡因，●血管生成抑制物質，例如抗-VEGF抗體、endostatin B、干擾素a、AGM1470，以及●牛皮癬、卡波濟肉瘤和成神經細胞瘤中的細胞增殖抑制劑。
本發明還涉及以可藥用(即所用劑量的所述化合物是無毒的)通式Ⅰ化合物為基礎的藥物，任選地該藥物含有常規的賦形劑、載體和添加劑。
本發明化合物可以按照本身已知的蓋侖制藥方法制成腸道、經皮、非腸道或局部給藥的藥物制劑。它們可以以片劑、錠劑、明膠膠囊、顆粒劑、栓劑、植入物、可注射的無菌水溶液或油溶液、懸浮液或乳液、油膏、乳膏和凝膠形式給藥。因此，本發明還涉及本發明化合物在制備藥物中的應用。
可以將一種或多種活性成分與蓋侖制藥常用的賦形劑混合，這些賦形劑是例如阿拉伯膠、滑石、淀粉、甘露醇、甲基纖維素、乳糖、表面活性劑如吐溫或Myrj、硬脂酸鎂、水或非水載體、石蠟衍生物、潤濕劑、分散劑、乳化劑和防腐劑、以及調味用的矯味劑(例如精油)。
因此，本發明還涉及藥物組合物和藥物，其中含有至少一種本發明的化合物作為活性成分。一個單位劑量含有約0.1-100毫克一種或多種活性成分。本發明化合物的人用劑量約為0.1-1000毫克/天。


圖1示出了隨著時間和溫度的吸收變化過程(3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-紫杉酚，應用實施例2)。
圖2示出了隨著時間和溫度的吸收變化過程(3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-7-表-紫杉酚，應用實施例3)。
圖3示出了隨著時間和溫度的吸收變化過程(3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-2,3′-N-二去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-紫杉酚，應用實施例4)。
圖4示出了隨著時間和溫度的吸收變化過程(3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-10-去乙酰基-紫杉酚，應用實施例5)。
下列實施例用于進一步說明本發明化合物的制備，而非將本發明限制在實施例上。實施例13′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-紫杉酚在3℃和干燥的氬氣氛下，向3.1毫克(2.9微摩爾)實施例1a制備的化合物在0.5毫升無水四氫呋喃中的溶液中加入8.6微升1M氟化四丁銨的四氫呋喃溶液，并攪拌反應混合物30分鐘。將該混合物倒入飽和碳酸氫鈉溶液中，并用二氯甲烷萃取，將有機提取液濃縮，殘余物經半分析薄層板色譜純化。用乙酸乙酯作流動相，用二氯甲烷和甲醇的混合物作洗脫劑。分離得到0.4毫克(0.5微摩爾，17％)標題化合物。1H-NMR(CDCl3):d=1.16(3H),1.25(3H),1.70(3H),1.75(1H),1.84(3H),1.90(1H),2.26(3H),2.25-2.38(2H),2.38(3H),2.48(1H),2.56(1H),3.62(3H),3.81(1H),4.19(1H),4.31(1H),4.40(1H),4.71(1H),4.95(1H),5.37(1H),5.66(1H),5.69(1H),6.28(1H),6.31(1H),7.40(2H),7.51(2H),7.61(1H),8.11(2H),8.66(2H)ppm.實施例1a2′-三異丙基甲硅烷基-3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-7-三乙基甲硅烷基-紫杉酚在3℃和干燥的氬氣氛下，向4.2毫克(6.0微摩爾)和11.4毫克實施例1b和1c制備的化合物在0.1毫升無水四氫呋喃中的溶液中加入12毫克約60％氫化鈉分散液，并將該混合物加熱至30℃，并攪拌30分鐘。將該混合物再冷卻至3℃，加入30％乙酸水溶液，并用乙醚萃取數次。合并的有機提取液用飽和氯化鈉溶液洗滌，用硫酸鎂干燥。過濾并除去溶劑后，殘余物經2個分析薄層板色譜純化。用正己烷和乙酸乙酯的混合物作流動相，用二氯甲烷和甲醇的混合物作洗脫劑。分離得到3.7毫克(3.4微摩爾，57％)標題化合物。1H-NMR(CDCl3):d=0.60(6H),0.80-1.02(30H),1.25(6H),1.70(3H),1.91(1H),2.03(3H),2.14(1H),2.20(3H),2.36(1H),2.49(3H),2.53(1H),3.54(3H),3.84(1H),4.18(1H),4.30(1H),4.49(1H),4.85(1H),4.93(1H),5.30(1H),5.60(1H),5.70(1H),6.32(1H),6.47(1H),7.28(2H),7.49(2H),7.59(1H),8.13(2H),8.64(2H)ppm.實施例1b7-三乙基甲硅烷基-漿果赤霉素Ⅱ′在3℃和干燥的氬氣氛下，向3.7毫克(6.3微摩爾)色譜純化的漿果赤霉素Ⅲ(Calbiochem Corp.)在0.3毫升無水二甲基甲酰胺中的溶液中加入21微升三乙基氯硅烷和10.3毫克咪唑，并攪拌反應混合物1小時。將該混合物倒入飽和碳酸氫鈉溶液中，用乙醚萃取數次，然后用飽和氯化鈉溶液洗滌，濃縮合并的有機提取液。過濾并除去溶劑后得到的殘余物經半個分析薄層板色譜純化。用正己烷和乙酸乙酯的混合物作流動相，用二氯甲烷和甲醇的混合物作洗脫劑。分離得到3.0毫克(5.6微摩爾，88％)標題化合物。1H-NMR(CDCl3):d=0.59(6H),0.92(9H),1.06(3H),1.20(3H),1.62(1H),1.69(3H),1.88(1H),2.04(1H),2.19(6H),2.28(2H),2.29(3H),2.53(1H),3.88(1H),4.14(1H),4.31(1H),4.50(1H),4.83(1H),4.98(1H),5.63(1H),6.47(1H),7.49(2H),7.61(1H),8.11(2H)ppm.實施例1c(3R,4S)-1-(甲氧羰基)-3-三異丙基甲硅烷氧基-4-(4-吡啶基)-2-氮雜環丁酮在3℃和干燥的氬氣氛下，向250毫克(0.78毫摩爾)實施例1d制備的化合物在10毫升無水二氯甲烷中的溶液中加入573毫克4-二甲氨基吡啶和193微升氯甲酸甲酯，將反應混合物加熱至23℃，并攪拌16小時。將該混合物倒入飽和氯化銨溶液中，用乙醚萃取數次，然后用飽和氯化鈉溶液洗滌，濃縮合并的有機提取液。過濾并除去溶劑后得到的殘余物在約150毫升細硅膠上經色譜純化，用正己烷和乙酸乙酯的混合物作流動相。分離得到251毫克(0.66毫摩爾，85％)標題化合物。1H-NMR(CDCl3):d=0.82-1.07(21H),3.82(3H),5.11(1H),5.26(1H),7.23(2H),8.61(2H)ppm.實施例1d(3R,4S)-3-三異丙基甲硅烷氧基-4-(4-吡啶基)-2-氮雜環丁酮在3℃和氬氣氛下，向17.2克(40.3毫摩爾)實施例1e制備的化合物在384毫升乙腈中的溶液中加入67.3克硝酸高鈰銨在700毫升水中的溶液，攪拌反應混合物30分鐘。將該混合物倒入飽和碳酸氫鈉溶液中，用乙醚萃取數次，合并的有機提取液用1％氫氧化鈉溶液洗滌，并用硫酸鎂干燥。過濾并除去溶劑后得到的殘余物在約800毫升細硅膠上經色譜純化，用正己烷和乙酸乙酯的混合物作流動相。分離得到7.89克(24.6毫摩爾，61％)標題化合物。1H-NMR(CDCl3):d=0.78-1.07(21H),4.81(1H),5.23(1H),6.39(1H),7.28(2H),8.59(2H)ppm.實施例1e(3R,4S)-1-(4-甲氧基苯基)-3-三異丙基甲硅烷氧基-4-(4-吡啶基)-2-氮雜環丁酮在干燥氬氣氛下，將12.6毫升新蒸的二異丙基胺在70毫升無水四氫呋喃中的溶液冷卻至-30℃，加入37.6毫升2.4M正丁基鋰的正己烷溶液，并將該混合物加熱至0℃。30分鐘后，將該混合物冷卻至-78℃，向其中滴加按照四面體(Tetrahedron)第48期，No.34,6985-7012頁等(1992)所述類似的方法制備的22.1克(56.6毫摩爾)(1R,2S)-2-苯基-1-環己基-三異丙基甲硅烷氧基乙酸酯在70毫升無水四氫呋喃中的溶液，并攪拌該混合物3小時。然后加入15.6克(73.5毫摩爾)實施例1f制備的醛亞胺在150毫升無水四氫呋喃中的溶液，并用16小時將該混合物加熱至23℃。將該混合物倒入飽和氯化銨溶液中，用乙酸乙酯萃取數次，然后用飽和氯化鈉溶液洗滌，濃縮合并的有機提取液。過濾并除去溶劑后得到的殘余物在約1.8升細硅膠上經色譜純化，用正己烷和乙酸乙酯的混合物作流動相。分離得到17.2克(40.3毫摩爾，71％)標題化合物。1H-NMR(CDCl3):d=0.82-1.12(21H),3.76(3H),5.12(1H),5.29(1H),6.80(2H),7.19-7.30(4H),8.60(2H)ppm.實施例1fN-(4-甲氧基苯基)-(4-吡啶基)醛亞胺在干燥氬氣氛下，向10克(81.1毫摩爾)4-茴香胺在120毫升無水二氯甲烷中的溶液中加入7.8毫升吡啶-4-醛和8.4克硫酸鎂，并在23℃攪拌該混合物4小時。過濾并除去溶劑后得到的殘余物從正己烷中重結晶。分離得到15.9克(74.9毫摩爾，92％)標題化合物。1H-NMR(CDCl33):d=3.83(3H),6.95(2H),7.29(2H),7.73(2H),8.47(1H),8.73(2H)ppm.實施例23′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-7-表-紫杉酚(A)和3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-2,3′-N-二去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-紫杉酚(B)在3℃和干燥的氬氣氛下，向15毫克(13.9微摩爾)實施例1a制備的化合物在0.5毫升無水四氫呋喃中的溶液中加入42微升1M氟化四丁銨的四氫呋喃溶液，并在3℃攪拌該混合物30分鐘，加熱至23℃，并再攪拌30分鐘。將該混合物倒入飽和碳酸氫鈉溶液中，用二氯甲烷萃取，將有機提取液濃縮，殘余物經2個分析薄層板色譜純化。用乙酸乙酯和甲醇的混合物作流動相，用二氯甲烷和甲醇的混合物作洗脫劑。分離得到3.8毫克(4.7微摩爾，34％)標題化合物A，2.4毫克(3.4微摩爾，25％)標題化合物B以及1.2毫克(1.5微摩爾，11％)實施例1所述的化合物。1H-NMR(CDCl3)of A:d=1.18(3H),1.23(3H),1.68(3H),1.71(1H),1.80(1H),1.83(3H),2.15-2.48(4H),2.21(3H),2.49(3H),3.56(3H),3.71(1H),3.92(1H),4.37(2H),4.63(1H),4.71(1H),4.91(1H),5.37(1H),5.67(1H),5.76(1H),6.34(1H),6.81(1H),7.33(2H),7.51(2H),7.61(1H),8.16(2H),8.63(2H)ppm.實施例33′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-10-去乙酰基-紫杉酚在氬氣氛下，向9.0毫克(10.2微摩爾)實施例3a制備的化合物A在0.8毫升乙醇和0.2毫升四氫呋喃中的溶液中加入20.4微升4N鹽酸，在23℃攪拌反應混合物1小時。重復兩次加入鹽酸，每次在攪拌1小時后添加，加入飽和碳酸氫鈉溶液，用二氯甲烷萃取，將有機提取液濃縮，殘余物經2個分析薄層板色譜純化。用乙酸乙酯和乙醇的混合物作流動相，用二氯甲烷和甲醇的混合物作洗脫劑。分離得到6.5毫克(8.5微摩爾，83％)標題化合物。1H-NMR(CDCl3):d=1.13(3H),1.24(3H),1.78(3H),1.83(3H),1.73-1.96(3H),2.25(2H),2.37(3H),2.60(1H),3.62(3H),3.92(1H),4.14-4.28(2H),4.20(1H),4.32(1H),4.69(1H),4.94(1H),5.21(1H),5.36(1H),5.68(1H),5.83(1H),6.30(1H),7.34(2H),7.50(2H),7.62(1H),8.10(2H),8.61(2H)ppm.實施例3a3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-7-三乙基甲硅烷基-10-去乙酰基-紫杉酚(A)和3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-2,3′-N-二去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-7-三乙基甲硅烷基-10-去乙酰基-紫杉酚(B)在-10℃，按照與實施例1所述類似的方法，將25毫克(23微摩爾)實施例3b制備的粗產物進行反應，經處理和純化后，分離得到9.0毫克(10.2微摩爾，44％)標題化合物A,2.5毫克(3.2微摩爾，14％)標題化合物B以及2.2毫克(2.9微摩爾，12％)實施例3的標題化合物。1H-NMR(CDCl3)of A:d=0.43-0.67(6H),0.94(9H),1.13(3H),1.24(3H),1.70(1H),1.76(3H),1.87(3H),1.93(1H),2.24(2H),2.36(3H),2.48(1H),3.62(3H),3.87(1H),4.18(1H),4.29(1H),4.34(1H),4.68(1H),4.91(1H),5.12(1H),5.36(1H), 5.63(1H),5.77(1H),6.29(1H), 7.33(2H),7.49(2H),7.60(1H),8.10(2H),8.60(2H)ppm.1H-NMR(CDCl3)of B:d=0.45-0.64(6H),0.94(9H),1.02(3H),1.25(4H),1.67(1H),1.72(3H),1.82(3H),1.88-2.12(2H),2.18(4H),2.47(1H),3.50(1H),3.67(1H),3.70(3H),3.90(lH),4.26(1H),4.30(1H),4.59(1H),4.61(1H),4.66(1H),4.91(1H),5.03(1H),5.27(1H),5.65(1H),6.25(1H),7.32(2H),8.62(2H)ppm.實施例3b2′-三異丙基甲硅烷基-3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-7-三乙基甲硅烷基-10-去乙酰基-紫杉酚在氬氣氛下，向25毫克(23.2微摩爾)實施例1a制備的化合物在1.2毫升乙醇中的溶液中加入0.23毫升氫氧化，并在23℃攪拌該混合物24小時。將該混合物倒入飽和氯化鈉溶液中，用乙酸乙酯萃取數次，并用硫酸鎂干燥。過濾并除去溶劑后得到的殘余物無需純化即進行下一步反應。分離得到22毫克(最多21微摩爾，91％)標題化合物，其中仍然含有少量原料。
下列應用實施例用于證明本發明化合物的生物活性，而非將其應用限制在那些實施例上。應用實施例1分離和純化微管蛋白從新開顱的牛頭中分離牛腦(各330克)，并將其置于冰冷卻的PM4-M緩沖液中。除去每個腦的腦膜和血栓，并在冷室中用足量的PM4-M緩沖液打成均漿。將2個牛腦的均漿物質用總量500毫升的緩沖液配制成1.0升總體積，并進行首次離心(GSA轉子，15分鐘，4℃,6500g)。除去上清液表面的脂肪皮膚，經4層薄muslin過濾，轉入反向平衡的離心管(420毫升)中，并再次離心(Ti45轉子，96000g,75分鐘，4℃)。用移液管從沉淀中移去上清液，并經6層薄muslin過濾，加入在0.01M碳酸氫鹽/PBS中的50mM GTP溶液，使最終濃度達到1mM。在溫熱至37℃的水浴中、在反向平衡的離心管中進行首次聚合45分鐘。離心(Ti45轉子，27℃,96000g,60分鐘)除去所形成的微管，用移液管小心地除去上清液，并用刮鏟從管壁上分離非常軟的乳色沉淀。然后向沉淀中加入40毫升冷的PM緩沖液，用小的玻璃乳缽將其研磨成勻漿，并在冰上、在冷室中、在反向平衡的離心管中培養過夜(12-16小時)。在Ti60轉子(4℃；96000g,60分鐘)中離心除去解聚的產物，并用PM8-M緩沖液將上清液稀釋至1∶1，在37℃于計數器平衡的離心管中培養45分鐘，并再次離心(Ti45轉子，27℃,96000g,60分鐘)。用移液管小心地除去上清液，并將非常軟的乳色沉淀吸收在20毫升冷的PM緩沖液中，用小的玻璃乳缽將其小心地研磨成勻漿，并在冰上培養30分鐘。再次離心(Ti60轉子，4℃,96000g,60分鐘)得到微管蛋白，按照Pearce方法或者采用在280nm進行的光度測定法測量所述微管蛋白中的蛋白含量。在蛋白測定中，所用的分離物質與PM緩沖液的稀釋比例為1∶10、1∶20和1∶40。PM緩沖液本身是消光的，將該消光值作為零值從測定的蛋白含量中扣除。將分離的物質用PM緩沖液稀釋至所需的蛋白濃度(2毫克/毫升)。應用實施例23′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-紫杉酚對微管蛋白的生物作用采用光度測定法測量微管蛋白的聚合和微管的解聚。在測量之前，將按照應用實施例1制備的微管蛋白熔融，并脫氣15分鐘。將光度計設置在350nm。用移液管將3微升溶劑/樣品、6微升GTP(0-25微摩爾/升終濃度)和291微升微管蛋白移入干燥清潔的培養皿(10毫米)中。小心地攪拌樣品(不產生氣泡)，立即置于培養皿架上，并在37℃開始測量。一旦達到最大聚合值(20分鐘后，溶劑對照與紫杉酚1E-5摩爾/升)，則通過降溫至15℃開始解聚。解聚結束時停止測量操作，吸收的變化過程以對時間和溫度函數的圖表示(參見圖1)。
該圖清楚地表明，與對照相比，紫杉酚加速微管蛋白的聚合，并抑制解聚，而本發明化合物3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-紫杉酚抑制聚合并比紫杉酚明顯更好地使形成的微管穩定。應用實施例33′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-7-表-紫杉酚對微管蛋白的生物作用3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-7-表-紫杉酚更顯著地促進微管蛋白聚合以及與紫杉酚相比好得多地使微管穩定。結果示于圖2中。應用實施例43′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-2,3′-N-二去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-紫杉酚對微管蛋白的生物作用3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-2,3′-N-二去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-紫杉酚更顯著地促進微管蛋白聚合以及比紫杉酚更好地使所形成的微管穩定。結果示于圖3中。應用實施例53′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-10-去乙酰基-紫杉酚對微管蛋白的生物作用3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-10-去乙酰基-紫杉酚對于微管蛋白的聚合與紫杉酚沒有區別，但是它可以比紫杉酚明顯更好地使所形成的微管穩定。結果示于圖4中。應用實施例63′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-紫杉酚(1),3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-7-表-紫杉酚(2),3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-2,3′-N-二去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-紫杉酚(3)和3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-10-去乙酰基-紫杉酚(4)對腫瘤細胞系的抗增殖作用將MDA MB435乳房癌細胞置于微滴板中(5000細胞/孔)(第0天，RPMI培養基，1％非必需氨基酸、1％丙酮酸鹽，10％胎牛血清)。在第1天加入幾種不同濃度的添加物質。在第3天，采用MTT方法測定抗增殖作用。測定其IC50值。結果示于表1中。
表1

3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-紫杉酚與紫杉酚的活性相似，而3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-7-表-紫杉酚比紫杉酚具有顯著改善的抑制活性。
權利要求
1．通式Ⅰ的紫杉烷
其中Sk可以是
R1可以是氫或C1-C10酰基，R2可以是α-OH或β-OH，R3可以是C1-C10烷基、X-取代的苯基、C1-C10烷氧基，X可以是氫、鹵素、-N3或-CN，并且Ⅰ中的游離羥基可以進一步通過醚化或酯化進行官能改性，還包括其α-、β-和γ-環糊精籠形物，和用脂質體包封的通式Ⅰ化合物。
2．權利要求1的3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-紫杉酚。
3．權利要求1的3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-7-表-紫杉酚。
4．權利要求1的3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-2,3′-N-二去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-紫杉酚。
5．權利要求1的3′-去苯基-3′-(4-吡啶基)-3′-N-去苯甲酰基-3′-N-甲氧羰基-10-去乙酰基-紫杉酚。
6．權利要求1-5的通式Ⅰ紫杉烷衍生物的制備方法，其特征在于將通式Ⅱ的醇與通式Ⅲa、Ⅲb或Ⅲc化合物反應，
其中R1和R2如上所定義，并且Ⅱ中所包括的羥基是任選地被保護的，
其中R3如上所定義，并且X′可以是羥基、O-烷基或鹵素，其中游離羥基通過醚化或酯化作用進行保護，以形成通式Ⅰ化合物，其中游離羥基可以通過醚化或酯化作用進行官能改性。
7．含有權利要求1-5的一種或多種通式Ⅰ化合物的藥物。
8．權利要求7的藥物，其中含有常規的賦形劑、載體和添加劑。
9．權利要求1-5的通式Ⅰ化合物在制備藥物中的應用。
全文摘要
本發明描述了通式(Ⅰ)的紫杉烷,其中Sk可以是(i),R
文檔編號C07D405/12GK1210535SQ97192006
公開日1999年3月10日 申請日期1997年1月31日 優先權日1996年1月31日
發明者U·克拉爾, G·尼夫, H·格拉夫 申請人:舍林股份公司