專利名稱：列玻汀拮抗劑在治療糖尿病中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及新的用途，并且具體涉及在治療糖尿病及其并發癥中的用途。
已知非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)是由于對胰島素的耐受性(特別是在骨骼肌、脂肪組織和肝臟中)以及胰腺內胰島β-細胞的胰島素分泌不充分而引起的。所以，盡管血胰島素增多，但仍然缺乏足夠的胰島素來補償胰島素耐受性，以將血糖維持在所需的范圍內。
Pelleymoumnter等人(科學，1995，269，540-543)報導稱，在遺傳性肥胖ob/ob小鼠中，ob多肽或“列玻汀”(leptin)可降低血漿內的胰島素和葡萄糖水平。
英國專利申請公開2292382涉及了多肽、OB多肽及其拮抗劑和它們在調控體重中的用途。GB 2292382公開文本在此引入作為參考。
如今我們已發現，重組列玻汀可直接抑制ob/ob小鼠的分離胰島和灌注胰腺分泌胰島素。所以，列玻汀拮抗劑被認為是具有提高胰島素分泌并有助于調制血糖水平的價值。我們還發現，列玻汀可抑制ob/ob小鼠離體比目魚肌中的基礎性和胰島素刺激性糖原合成。所以，列玻汀拮抗劑也可被認為是可在提高葡糖利用以及胰島素作用中具有提高葡糖利用的價值。所以，可將拮抗劑直接用于治療由胰島素分泌不足和高血糖作用導致的疾病。此外，血糖過多必定會導致多種慢性糖尿病并發癥，所以，那些可增加胰島素分泌并有助于血糖調控的拮抗劑能夠有效地治療糖尿病并發癥，例如視網膜病、腎病和血管病。
所以，本發明提供了列玻汀拮抗劑在治療由胰島素分泌不足和血糖過多導致的疾病如非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)中的應用。
另一方面，本發明提供了列玻汀拮抗劑在用于制造治療由胰島素分泌不足和高血糖引起的疾病(如非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM))的藥物中的應用。
GB 2292382中公開了適用的列玻汀拮抗劑，也可以通過公開了的方法制備這些拮抗劑。
具體的拮抗劑包括蛋白質拮抗劑。
具體的拮抗劑還包括非蛋白質拮抗劑，尤其是有機小分子拮抗劑。
本發明也涉及治療人或非人哺乳動物的因胰島素分泌不足和高血糖導致的疾病，如非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)的治療方法，該方法包括給需此治療的人或非人哺乳動物施用有效、可藥用且無毒量的列玻汀拮抗劑。
本發明還涉及一種藥物組合物，其中含有列玻汀拮抗劑或其可藥用衍生物以及可藥用載體。
具體的本發明藥物組合物是那些可有效治療由胰島素分泌不足和高血糖引起的疾病，如非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)的藥物組合物。
適用的可藥用載體是常規載體，例如公開在GB2292382或國際專利申請公開WO 94/01420中的那些。
按照常規方法，如上述專利申請所述的方法可以制備本發明的組合物。
按照常規方法，如公開在上述專利申請中的那些方法可以決定所述拮抗劑的劑量。
本申請附圖(
圖1-5和表1)簡述如下圖1和表1表示列玻汀(100nM)對ob小鼠灌注胰腺的基礎胰島素分泌的作用；圖2表示列玻汀(100nmol/l)對ob/ob胰島的糖刺激(16.7mmol/l)性胰島素分泌的影響；圖3表示重組列玻汀的劑量依賴性抑制作用對ob/ob小鼠離體胰島的糖刺激(16.7mmol/l)性胰島素分泌作用的影響；圖4表示列玻汀對ob/ob小鼠離體比目魚肌內的糖原合成的作用；圖5表示列玻汀對ob/ob小鼠離體比目魚肌內糖原合成的作用。
Lee等人(自然，1995，379，632-635)認為存在多種形式的列玻汀受體。若胰島內的一種或多種列玻汀受體在性質或比例上不同于其它組織中的列玻汀受體，那么特效拮抗劑將成為一種拮抗胰島和/或骨骼肌內列玻汀受體的拮抗劑，但卻無法拮抗其它的列玻汀受體(例如，在下丘腦中)，由此加劇胰島素耐受性。
小鼠ob基因(J.Hered.41，317-318，(1950))和db基因(科學153，1127-1128(1966))中的突變導致肥胖癥和非胰島素依賴型糖尿病。ob基因的產物，列玻汀僅僅被表達在脂肪組織內(自然(倫敦)，372，425-432，(1994))，而且還證實，每天注射重組列玻汀可以在ob/ob小鼠中抑制對食物的攝取，減輕體重和脂肪質量(科學269，543-546(1995)；科學269，540-543(1995)；科學269，546-549(1995))。這種治療方式還可以降低高胰島素血癥(科學269，540-543(1995))。近期，已識別出ob基因受體的基因編碼(細胞學83，1263-1271(1995))。列玻汀受體存在數種不同的剪接變體。這些剪接變體之一在下丘腦中以高水平表達，并且被認為是調節能量平衡的功能受體。在C57B1/KSJ db/db小鼠(自然(倫敦)379，622-635，(1996)；細胞84，49l-495(1996)；科學27l，994-996(1996))，從而使胞質區消失，導致缺損信號轉導。如今報導，在ob/ob小鼠中，除了下丘腦以外，預知的列玻汀功能受體ob-Rb還在若干組織中表達，其中包括胰島。此外，重組列玻汀可直接抑制ob/ob小鼠離體胰島和灌注胰腺釋放出胰島素，并且抑制ob/ob小鼠離體比目魚肌中的基礎性和胰島素刺激性糖原合成，這證明列玻汀具有中樞及外周作用。
已確定小鼠中的糖尿病(db)基因產物是列玻汀受體。迄今至少已鑒別出六種不同剪接形式的列玻汀信息(自然(倫敦)379，622-635，(1996))。其中之一，Ob-Rb具有廣泛地胞內區，其中含有Box 2序列基元，它是JAK蛋白激酶結合所需要的，并且被認為是可編碼的功能受體。已設計出30-34元的短鏈反義寡脫氧核苷酸探針(Trayhurn等人，Biochem.Soc.Trans.23卷，4945頁，1995)與小鼠列玻汀受體的mRNA序列雜交，并且可用于檢測列玻汀受體所有轉錄物的表達，或只用于檢測列玻汀受體長形(long-form)，Ob-Rb。各個寡核苷酸探針的序列對于列玻汀受體來說均是單一的，并且與其它任何已知序列沒有明顯的同源性。
檢測瘦型+/+小鼠(lean+/+mice)的全部列玻汀受體mRNA在下丘腦、腎臟、肺、肝臟、全胰腺、腦、比目魚肌和脾中的表達，未對白色脂肪組織、腦垂體或心臟進行檢測。與瘦型的同窩動物(littermate)相比，相對于聚(A)mRNA水平標準化了的整列玻汀受體mRNA在ob/ob小鼠中過度表達。然而，在過度表達中存在組織特異性區別。所以，在瘦型小鼠中表達水平最高的下丘腦在ob/ob小鼠僅僅過度表達2倍。在腎臟內，整列玻汀mRNA過度表達4倍；但對于一些在瘦型小鼠中整列玻汀mRNA低表達的其它組織，其整列玻汀mRNA在ob/ob小鼠中過度表達至10倍。
用與堿基3329-3363相應的34元物探測的下丘腦諾慎印跡分析顯示出一個窄信號帶，所述的相應堿基3329-3363是僅僅存在于長形列玻汀受體Ob-Rb中的胞內環形結構。當用和堿基1877-1910相應的33元物探測時，該信號帶與復合帶(multiple band)形成反差，所述堿基1877-1910是列玻汀受體的所有已知剪接變體所共有的序列。分子量標記物顯示，34元物與一個mRNA片段雜交，該mRNA片段含有約3400個與推定功能列玻汀受體相一致的堿基對。在下丘腦中發現以高水平表達，這與Lee等人的近期研究(自然(倫敦)379，622-635，(1996))相吻合。此外，ob/ob小鼠下丘腦(hypothalami)的過度表達是+/+小鼠的2倍。Ob-Rb還存在于(并且比+/+小鼠過度表達)肝臟、腎臟和肺中，但不存在于全腦、心臟、比目魚肌或腦垂體中。對ob/ob小鼠中Ob-Rb的相對過度表達(與瘦型+/+小鼠相比)的發現與若干著作(科學269，540-543(1995)；美國國家科學院學報(Pro.Natl，Acad.Sci.)，USA 93，1726-1730(1996))中的發現一致，也就是說，重組列玻汀在ob/ob小鼠中可更有效地減少食物攝取和減輕體重。還可以提高列玻汀調控其受體表達的可能性。這將導致列玻汀耐受態，并且可以解釋為什么重組列玻汀在食物減肥中缺乏活性的原因(科學269，540-543(1995))。
利用狹線印跡技術，在瘦型+/+小鼠或ob/ob小鼠的全胰腺中皆為檢測數長形列玻汀受體的表達。但是，利用mRNA可以從ob/ob小鼠的全胰腺獲得強信號。
上述研究證實了，每天腹膜內注射重組列玻汀共28天后可以明顯降低ob/ob小鼠的血清胰島素和血糖，但不能降低瘦型小鼠的血清胰島素和血糖，這種降低作用是依賴于劑量的(科學269，540-543(1995))。得出ob/ob小鼠胰島中高度表達的長形列玻汀受體(推定功能受體)后，我們決定用ob/ob小鼠灌注胰腺測試對胰島素分泌的功能反應(圖1，表1)。
列玻汀(100nM)立刻使離體胰腺的胰島素釋放減少。
灌注胰腺標本中的列玻汀可直接對胰島產生作用，或通過脈管系統釋放出另外的介質來產生作用。為了澄清這點，測試列玻汀對ob/ob小鼠離體胰島釋放胰島素的作用。列玻汀(100nM)可徹底抑制16.7mM葡萄糖對胰島釋放胰島素的刺激作用，所述胰島分離自過夜禁食小鼠(圖2)。列玻汀的抑制作用在1-100nM內與劑量相關(圖3)。列玻汀(10nm)還可以抑制野生型小鼠胰島的糖刺激性胰島素分泌作用，但列玻汀(100nM)對ob/ob小鼠胰島的胰島素分泌作用沒有影響。
為了評估列玻汀直接抑制葡萄糖攝取和胰島素作用的可能性，利用Challiss等人所述的方法(生化藥理學，1988，37，947-950)，在由ob/ob小鼠分離出的完整比目魚肌(重4-5mg)中，對摻入到糖原中的〔14C〕葡萄糖進行測定。重組鼠列玻汀在100nM時可抑制比目魚肌中的糖原合成(圖4)，其中，在基礎處的抑制率為35％(P＜0.01)，在低濃度胰島素時抑制率為28％、30％和45％(分別為10、50和100uU/ml，P＜0.05)。列玻汀對胰島素的最大反應沒有顯著影響。在胰島素不存在和存在100uU/ml胰島素的條件下試驗較低濃度(1和10nM)列玻汀的作用。10uM列玻汀對基礎的和胰島素刺激的糖原合成產生顯著的抑制作用(分別為32％和35％；P＜0.05)。而1nM列玻汀不產生明顯的作用(圖5)。
肥胖在西方國家和許多發展中國家中是最常見的營養疾病。它與非胰島素依賴型糖尿病密切相關。這種關系的基礎很大程度被推測與進行性肥胖癥中出現的胰島素耐受性的提高有關。胰島素耐受性被認為可引起葡糖耐量，但普遍認為非胰島素依賴型糖尿病的惡化需要另外依賴于胰腺損害的惡化。
采用向ob/ob小鼠及其瘦型同窩動物輸注重組列玻汀的初期研究表明，列玻汀的初級作用是控制食欲，這可能是提高抑制中樞NPY的釋放來實現的(自然(倫敦)337，530-532，(1995))。然而，近期的研究采用了一組攝入等量食物的ob/ob小鼠作為列玻汀輸注對象，試驗證明列玻汀具有顯著的代謝作用(美國國家科學院院報(Proc.Natl，Acad.Sci.)，USA 93，1726-1730(1996))。對成對飼養的小鼠相比，向ob/ob小鼠輸注列玻汀將使體重和脂肪墊重量明顯降低。但是，輸注了列玻汀的小鼠與成對飼養動物之間最大的區別在于血清胰島素濃度。成對飼養的小鼠的胰島素濃度從30.6±6.2mg/ml降低到14.2±4.2mg/ml。在被列玻汀輸注的小鼠中，胰島素濃度0.09±0.08mg/ml與瘦型小鼠的沒有明顯不同(美國國家科學院院報(Proc.Natl，Acad.Sci.)，USA 93，1726-1730(1996))。本試驗證明，編碼功能受體的列玻汀受體剪接變體存在于ob/ob小鼠的胰島內，并且列玻汀可直接抑制灌注胰腺內的基礎胰島素分泌和ob/ob小鼠離體胰島的葡糖刺激性胰島素釋放作用。這些數據首次顯示，過度肥胖后的列玻汀過量生產可直接改變胰島素的分泌作用，并且參與糖尿病綜合征的惡化。上述數據還表明，與肥胖有關的列玻汀過量生產是肥胖癥中眾多對誘發胰島素耐受性產生反應的因素中的一個。
所以，本發明的另一方面是提供列玻汀拮抗劑在胰島素耐受性，具體如與肥胖癥有關的胰島素耐受性治療中的應用。
本發明還提供列玻汀拮抗劑在用于制造治療胰島素耐受性，具體如與肥胖癥有關的胰島素耐受性的藥物中的應用。
本發明也提供一種在人或非人哺乳動物中治療胰島素耐受性，具體如與肥胖癥有關的胰島素耐受性的方法，該方法包括給需此治療的人體或非人體哺乳動物施用有效、可藥用、無毒量的列玻汀拮抗劑。
所以，本發明一種具體藥物組合物是用于治療胰島素耐受性，具體如與肥胖癥有關的胰島素耐受性的藥物組合物。
除胰島以外，我們還檢測了肝臟、腎臟和肺中的長形列玻汀受體。列玻汀在這些組織中的作用功能迄今未知。但是，Levin等人(美國國家科學院院報(Proc.Natl，Acad.Sci.)，USA 93，1726-1730(1996))注意到，肝臟內的肝糖原含量在列玻汀輸注的ob/ob小鼠中明顯降低，但在成對飼養的小鼠中則不然。結合現有的數據，上述發現表明，列玻汀可直接影響肝糖原代謝。
總之，本申請的結果為具有廣泛外周代謝活性和攝食中樞作用的列玻汀提供了生物學和功能的證據。
上述參考文獻的公開內容(包括GB2292382和WO 94/01420)在此引入作為參考。
下圖和下表說明本發明，但不是限定本發明。
0-15分鐘穩定化期16-30分鐘治療期(PBS或列玻汀)AUC曲線下面積變化率％16-30分鐘的平均值/0-15分鐘的平均值結果＝平均值±SEM(n＝4.5)，*P＜0.05(未成對試驗)
權利要求
1.列玻汀拮抗劑在用于制造治療由胰島素分泌不足和高血糖引起的疾病的藥物中的應用。
2.權利要求1的用途，其中所述藥物用于治療非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)。
3.列玻汀拮抗劑在用于制造治療由胰島素耐受性的藥物中的應用。
4.權利要求3的用途，其中所述藥物用于治療與肥胖癥有關的胰島素耐受性。
5.一種在人體或非人體哺乳動物中治療由胰島素分泌不足和高血糖引起的疾病的方法，該方法包括給需此治療的人或非人哺乳動物施用有效、可藥用、無毒量的列玻汀拮抗劑。
6.一種治療胰島素耐受性的方法，該方法包括該方法包括給需此治療的人或非人哺乳動物施用有效、可藥用、無毒量的列玻汀拮抗劑。
7.一種用于治療由胰島素分泌不足和高血糖引起的疾病的藥物組合物，其中含有列玻汀拮抗劑或其可藥用衍生物以及可藥用載體。
8.一種用于治療胰島素耐受性的藥物組合物，其中含有列玻汀拮抗劑或其可藥用衍生物以及可藥用載體。
9.權利要求1-8任一項的用途，其中所述列玻汀拮抗劑是有機小分子拮抗劑。
全文摘要
本發明涉及列玻汀拮抗劑在用于制造治療由胰島素分泌不足、高血糖和胰島素耐受性引起的疾病的藥物中的應用。
文檔編號C07K16/28GK1254291SQ97182228
公開日2000年5月24日 申請日期1997年6月6日 優先權日1997年6月6日
發明者M·A·考托尼, V·埃米爾森, Y－L劉 申請人:史密絲克萊恩比徹姆有限公司