專利名稱：哺乳動物細胞表面抗原及相關試劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及與控制哺乳動物細胞如哺乳動物免疫系統細胞的活化和擴增的蛋白相關的組合物。具體而言，本發明提供了純化的基因，蛋白，抗體和相關試劑，用于例如控制各種細胞類型包括造血細胞的活化，發育，分化和功能。
背景技術：
靜止T細胞的活化對多數免疫應答是至關重要的，并允許這些細胞表現其調節或效應功能。參見Paul(編輯，1993)《基礎免疫學》第3版，Raven Press，N.Y.。T細胞和抗原呈遞細胞(APC)或其它形式的初級刺激，如固定化單克隆抗體(mAb)，的粘附增加，可增強T細胞受體信號。T細胞活化和T細胞擴增依賴于T細胞受體(TCR)和輔助細胞提供的共刺激的結合。參見，例如Jenkins和Johnson(1993)Curr.Opin.Immunol.5361-367；Bierer and Hahn(1993)Semin.Immunol.5249-261；June et al(1990)Immunol.Today 11211-216；Jenkins(1994)Immunity1443-446。T細胞的一種主要的研究得較為清楚的共刺激相互作用是T細胞上的CD28或CTLA-4與B7或B70的相互作用(Jenkins(1994)Immunity 1443-446)。最近對CD28缺陷小鼠(Shahinian et al(1993)Science 261609-612；Green et al(1994)Immunity 1501-508)和表達CTLA-4免疫球蛋白的轉基因小鼠(Ronchese et al(1994)J.Exp.Med.179808-817)的研究已經揭示出某些T細胞應答缺陷，盡管這些小鼠具有正常的初級免疫應答和對淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒及水泡性口炎病毒的正常CTL應答。因此，這兩項研究的結論是其它共刺激分子必需支持T細胞功能。然而，鑒定這些介導獨特共刺激信號的分子是困難的。
腫瘤壞死因子(TNF)是一個正在出現的細胞因子家族的原型成員，該細胞因子家族是免疫調節和炎癥應答的主要介導者。這些配體一般為II型膜蛋白，其羧基末端同源。通常產生蛋白水解加工的可溶性蛋白。參見，例如Smith et al(1994)Cell 76959-962；Amitage(1994)Curr.Opin.Immunol.6407-413；Gruss and Dower(1995)Blood 853378-3404；Wileyet al (1995)Immunity 3673-682；Baker and Reddy(1996)Oncogene 121-9。這些家族成員的關鍵作用已經由許多研究證實，它們與細胞凋亡、外周耐受、Ig突變和同種型轉換及普通B細胞和T細胞功能有關。參見，例如Thomson(編輯，1994)《細胞因子手冊》Academic Press，San Diego，CA。這些意味著在免疫和發育網絡中的基礎作用。
不能調節活化信號防止了對免疫系統中不適當的發育或生理應答的控制。本發明提供了至少一種替代共刺激分子，其激動劑和拮抗劑可用于調節免疫應答過多。
發明概述本發明部分基于發現了一種抗原，其具有與作為細胞凋亡誘導物的蛋白質的序列同源性。具體而言，本發明提供了編碼一種具有316個氨基酸的蛋白質的基因，該蛋白質被稱為499E9，表達于高度極化的Th1 T細胞。499E9的結合可能調節效應細胞的抗原特異性增殖和細胞因子產生。499E9是一種新的細胞表面分子，結合后可能會增強免疫細胞擴增或凋亡。介紹了小鼠的實施方案，使哺乳動物基因，蛋白，抗體和其用途成為現實。由其它哺乳動物如人和非哺乳動物種類獲得了具有顯著序列同源性的功能性等價物。而且，499E9受體可作為其結合配體刺激其它表達該受體的細胞。
更具體而言，本發明提供了以下物質的組合物，所述物質選自基本上純化的或重組的499E9蛋白或多肽，其中至少12個氨基酸與SEQ IDNO2具有至少約85％的序列同一性；SEQ ID NO2的天然序列的499E9；或含有499E9序列的融合蛋白。某些實施方案包括基本純化的或分離的蛋白，其含有一個與499E9相應部分具有序列同一性的區段，其中同源性為至少約90％的同一性，該部分為至少約9個氨基酸；同源性為至少約80％的同一性，該部分為至少約17個氨基酸；或同源性為至少約70％的同一性，該部分為至少約25個氨基酸。其它實施方案包括一種組合物，其中499E9包括表1的成熟序列，或一種蛋白或多肽，所述蛋白或多肽來自包括嚙齒類的哺乳動物等溫血動物；含有一個SEQ IDNO2的多肽區段；具有多個表現出同一性的部分；是499E9的天然等位變體；長度至少為約30個氨基酸；具有至少兩個對哺乳動物499E9特異的非重疊表位；至少約20個氨基酸與嚙齒類499E9具有至少約90％的序列同一性；是糖基化的；是合成多肽；粘附在固相底物上；與另一化學實體偶合；是天然序列的五重或更少的取代物；或者是天然序列的缺失或插入變體。還提供了各種組合物，例如包含無菌499E9蛋白或肽；或499E9蛋白或肽和載體，其中載體為水性化合物，包括水、鹽水和/或緩沖液；和/或配制供口服、直腸、鼻腔、局部或非腸道給藥。也提供了融合蛋白，例如包括表1的成熟蛋白序列；檢測或純化標志，包括FLAG，His6或Ig序列；或其它TNF-配體蛋白的序列。還提供了試劑盒實施方案，例如包括上述蛋白或多肽；和包含上述蛋白或多肽的分隔物；和/或使用或棄置試劑盒中試劑的說明。
抗體或結合化合物實施方案包括含有特異性與天然499E9蛋白結合的抗體的一個抗原結合區的抗體或化合物，其中所述蛋白是嚙齒類蛋白；結合化合物是Fv，Fab或Fab2片段；結合化合物偶合于另一化學實體上；或以下抗體針對成熟499E9產生的；針對純化499E9產生的；是免疫選擇的；是多克隆抗體；結合變性499E9；對抗原的Kd至少為30μM；偶合于固相載體上，包括珠或塑料膜；為無菌組合物；或可檢測地標記，包括放射性標記或熒光標記。其它實施方案包括含有結合化合物的試劑盒，和包含結合化合物的分隔物；和/或使用棄置試劑盒中試劑的說明。其它形式包括例如一種含以下組分的組合物一種無菌結合化合物；或結合化合物和一種載體，其中載體為水性化合物，包括水、鹽水和/或緩沖液；和/或配制供口服、直腸、鼻腔、局部或非腸道給藥的組合物。這也容許在混合物中將499E9蛋白或肽由其它物質中純化出來的方法，包括將混合物與上述抗體接觸，分離結合的499E9與其它物質。
核酸實施方案包括編碼一種蛋白或肽或融合蛋白的分離或重組核酸，其中499E9蛋白來自哺乳動物，包括嚙齒類；或者是以下核酸編碼表1的一個抗原肽序列；編碼表1的多個抗原肽序列；與編碼該區段的天然cDNA具有至少約80％的同一性；是一種表達載體；還包括復制起點；來自天然來源；含有可檢測的標記；含有合成核苷酸序列；小于6kb，優選小于3kb；來自哺乳動物，包括嚙齒類；含有天然的全長編碼序列；是一種編碼499E9蛋白的基因的雜交探針；是一種PCR引物，PCR產物或誘變引物。含有此重組核酸的細胞或組織也包含在本發明之內，如其中的細胞為原核細胞；真核細胞；細菌細胞；酵母細胞；昆蟲細胞；哺乳動物細胞；小鼠細胞；嚙齒類細胞或人細胞。包含上述物質的試劑盒形式包括核酸，或包含核酸的分隔物；包含499E9蛋白或多肽的分隔物；和/或使用或棄置試劑盒中試劑的說明。其它核酸實施方案包括以下核酸在以下洗滌條件下與SEQ ID NO1雜交30℃和低于2M鹽，45℃和/或500mM鹽，或55℃和/或150mM鹽；至少約30核苷酸的一個區段與嚙齒類499E9具有至少約85％的同一性，同一性至少為95％和/或該區段為至少55個核苷酸，或同一性至少為95％和/或該區段為至少75個核苷酸。
本發明還提供了調節細胞或組織培養細胞的生理或發育的方法，包括向細胞引入499E9的激動劑或拮抗劑。其它方法包括調節細胞的生理，包括使細胞與以下物質接觸基本純化的499E9或片段；特異結合499E9的抗體或結合配體；或編碼499E9或肽的核酸。優選該細胞是T細胞，該生理的調節是T細胞的凋亡；或T細胞的活化。
本發明還提供了治療免疫應答異常的患者的方法，即給予有效量的499E9特異性抗體或結合配體；499E9蛋白或多肽；或編碼499E9肽的核酸。免疫應答異常的特征在于T細胞免疫缺損；慢性炎癥；或組織排斥。優選實施方案詳述本文引用的所有參考文獻均全文引為參考，如同每一出版物或專利申請分別單獨引用一樣。I.概論本發明提供了編碼各種哺乳動物蛋白的氨基酸序列和DNA序列，所述蛋白是見于許多T細胞亞型如Th1，Th2，極化Th1細胞和極化Th2細胞的抗原。這些蛋白是具有調節作用的抗原，如誘導或防止相互作用細胞的增殖或分化，還具有其它生理效應。全長抗原和片段或拮抗劑可用于表達該抗原反受體的細胞的生理調節。該蛋白也可用作抗原，如免疫原，以針對該蛋白上的各種表位包括線性或構象表位產生抗體。該分子可用于限定功能性T細胞或NK細胞亞群。
編碼499E9的cDNA分離自極化Th1細胞cDNA文庫，見Openshawet al(1995)J.Exp.Med.1821357-1367。499E9 cDNA含有長度為219lbp的區段，包含一個編碼II型跨膜蛋白的大的開放讀框。轉錄子分析已經鑒定到多個轉錄子，最多的是2.1到2.3kb。結構特征包括約52氨基酸的細胞內區序列，約246氨基酸的細胞外區，和約20氨基酸的疏水的推測的跨膜區。見表1和SEQ ID NO2。499E9具有TNF配體家族成員的結構基元特征。例如可與CD40配體、OX40配體、TNF、NGF和FAS比較。表1列出了小鼠499E9的核酸和推測的氨基酸序列。表1小鼠499E9核苷酸和推測的氨基酸序列。推測的細胞內區序列大約自met1到met49；殘基8和11可能是酪氨酸磷酸化位點；跨膜序列可能大約自phe50到leu69；細胞外區可能大約自tyr70到asp316。見SEQ IDNO1和2。GCCAGGACCT CTGTGAACCG GTCGGGGCGG GGGCCGCCTG GCCGGGAGTC TGCTCGGCGG60TGGGTGGCCG AGGAAGGGAG AGAACGATCG CGGAGCAGGG CGCCCGAACT CCGGGCGCCG120CGCC ATG CGC CGG GCC AGC CGA GAC TAC GGC AAG TAC CTG CGC AGC TCG169Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Gly Lys Tyr Leu Arg Ser Ser1 5 10 15GAG GAG ATG GGC AGC GGC CCC GGC GTC CCA CAC GAG GGT CCG CTG CAC217Glu Glu Met Gly Ser Gly Pro Gly Val Pro His Glu Gly Pro Leu His20 25 30CCC GCG CCT TCT GCA CCG GCT CCG GCG CCG CCA CCC GCC GCC TCC CGC265Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg35 40 45TCC ATG TTC CTG GCC CTC CTG GGG CTG GGA CTG GGC CAG GTG GTC TGC313Ser Met Phe Leu Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys50 55 60AGC ATC GCT CTG TTC CTG TAC TTT CGA GCG CAG ATG GAT CCT AAC AGA361Ser Ile Ala Leu Phe Leu Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg65 70 75ATA TCA GAA GAC AGC ACT CAC TGC TTT TAT AGA ATC CTG AGA CTC CAT409Ile Ser Glu Asp Ser Thr His Cys Phe Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His80 85 90 95GAA AAC GCA GGT TTG CAG TCG ACT CTG GAG AGT GAA GAA GAC ACA CTA457Glu Asn Ala Gly Leu Gln Asp Ser Thr Leu Glu Ser Glu Asp Thr Leu100 105 110CCT GAC TCC TGC AGG AGG ATG AAA CAA GCC TTT CAG GGG GCC GTG CAG505Pro Asp Ser Cys Arg Arg Met Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln115 120 125AAG GAA CTG CAA CAC ATT GTG GGG CCA CAG CGC TTC TCA GGA GCT CCA553Lys Glu Leu Gln His Ile Val Gly Pro Gln Arg Phe Ser Gly Ala Pro130 135 140GCT ATG ATG GAA GGC TCA TGG TTG GAT GTG GCC CAG CGA GGC AAG CCT601Ala Met Met Glu Gly Ser Trp Leu Asp Val Ala Gln Arg Gly Lys Pro145 150 155GAG GCC CAG CCA TTT GCA CAC CTC ACC ATC AAT GCT GCC AGC ATC CCA649Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro160 165 170 175TCG GGT TCC CAT AAA GTC ACT CTG TCC TCT TGG TAC CAC GAT CGA GGC697Ser Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly180 185 190TGG GCC AAG ATC TCT AAC ATG ACG TTA AGC AAC GGA AAA CTA AGG GTT745Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val195 200 205AAC CAA GAT GGC TTC TAT TAC CTG TAC GCC AAC ATT TGC TTT CGG CAT793Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His210 215 220CAT GAA ACA TCG GGA AGC GTA CCT ACA GAC TAT CTT CAG CTG ATG GTG841His Glu Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val225 230 235TAT GTC GTT AAA ACC AGC ATC AAA ATC CCA AGT TCT CAT AAC CTG ATG889Tyr Val Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met240 245 250 255AAA GGA GGG AGC ACG AAA AAC TGG TCG GGC AAT TCT GAA TTC CAC TTT937Lys Gly Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe260 265 270TAT TCC ATA AAT GTT GGG GGA TTT TTC AAG CTC CGA GCT GGT GAA GAA-985Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu275 280 285ATT AGC ATT CAG GTG TCC AAC CCT TCC CTG CTG GAT CCG GAT CAA GAT1033Ile Ser Ile Gln Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp290 295 300GCG ACG TAC TTT GGG GCT TTC AAA GTT CAG GAC ATA GAC TGAGACTCAT1082Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp Ile Asp305 310 315TTCGTGGAAC ATTAGCATGG ATGTCCTAGA TGTTTGGAAA CTTCTTAAAA AATGGATGAT1142GTCTATACAT GTGTAAGACT ACTAAGAGAC ATGGCCCACG GTGTATGAAA CTCACAGCCC1202TCTCTCTTGA GCCTGTACAG GTTGTGTATA TGTAAAGTCC ATAGGTGATG TTAGATTCAT1262GGTGATTACA CAACGGTTTT ACAATTTTGT AATGATTTCC TAAGAATTGA ACCAGATTGG1322GAGAGGTATT CCGATGCTTA TGAAAAACTT ACACGTGAGC TATGGAAGGG GGTCACAGTC1382TCTGGGTCTA ACCCCTGGAC ATGTGCCACT GAGAACCTTG AAATTAAGAA GATGCCATGT1442CATTGCAAAG AAATGATAGT GTGAAGGGTT AAGTTCTTTT GAATTGTTAC ATTGCGCTGG1502GACCTGCAAA TAAGTTCTTT TTTTCTAATG AGGAGAGAAA AATATATGTA TTTTTATATA1562ATGTCTAAAG TTATATTTCA GGTGTAATGT TTTCTGTGCA AAGTTTTGTA AATTATATTT1622GTGCTATAGT ATTTGATTCA AAATATTTAA AAATGTCTCA CTGTTGACAT ATTTAATGTT1682TTAAATGTAC AGATGTATTT AACTGGTGCA CTTTGTAATT CCCCTGAAGG TACTCGTAGC1742TAAGGGGGCA GAATACTGTT TCTGGTGACC ACATGTAGTT TATTTCTTTA TTCTTTTTAA1802CTTAATAGAG TCTTCAGACT TGTCAAAACT ATGCAAGCAA AATAAATAAA TAAAAATAAA1862ATGAATATCT TGAATAATAA GTAGGATGTT GGTCACCAGG TGCCTTTCAA ATTTAGAAGC1922TAATTGACTT TAGGAGCTGA CATAGCCAAA AAGGATACAT AATAGGCTAC TGAAAATCTG1982TCAGGAGTAT TTATGCAATT ATTGAACAGG TGTCTTTTTT TACAAGAGCT ACAAATTGTA2042AATTTTGTTT CTTTTTTTTC CCATAGAAAA TGTACTATAG TTTATCAGCC AAAAAACAAT2102CCACTTTTTA ATTTAGTGAA AGTTATTTTA TTATACTGTA CAATAAAAGC ATTGTTTCTG2162AATGGCATTT TTTGGTACTT AAAAATGGC2191TNF配體家族成員具有對應于殘基205的保守亮氨酸殘基；對應于殘基211的保守甘氨酸殘基；對應于殘基216的保守酪氨酸殘基；對應于殘基277的保守甘氨酸殘基；對應于殘基282的保守亮氨酸殘基；對應于殘基307的保守苯丙氨酸殘基；對應于殘基308的保守甘氨酸殘基。TNF配體區似乎自大約205(leu)延伸至316(asp)。糖基化位點可能是在197和262。這個克隆與小鼠TRAIL具有密切的同源性，后者可能誘導細胞凋亡。相關家族成員包括CD40和FAS配體，以及淋巴毒素β，腫瘤壞死因子等。
cDNA Southern雜交清楚地揭示，499E9表達于多種T細胞，包括Th1，Th2，3周極化的Th1或Th2細胞，前T細胞，也表達于Rag敲除胸腺cDNA文庫。可能已經在樹突細胞中檢測到一些弱的信號。表達499E9的細胞一般含一種約2.1到2.3kb的主要轉錄子，但也含其它轉錄子。組織分布分析表明在腦、心、腎、肝、肺、脾和睪丸中有陽性信號。499E9的轉錄子在成纖維細胞(L細胞)、單核細胞(RAW264)、幼稚T細胞(CD4+，MEL14+，Br細胞)、巨噬細胞、Nippo感染肺/肝/脾或Rag敲除器官(腦、心、腎、肝、肺、脾或睪丸)中已經檢測到。
499E9與TNF配體家族的結構同源性表明了該分子的功能。499E9作為T細胞表面分子，可能調節效應細胞的Ag特異性增殖應答，或誘導這些細胞的凋亡。499E9激動劑或拮抗劑可能也可作為共刺激分子調節T細胞介導的細胞活化，可能實際上引起T輔助細胞如Th1和Th2間的轉換。因此，499E9或拮抗劑應當可用于治療異常免疫紊亂，如T細胞免疫缺損，慢性炎癥或組織排斥。
TNF配體分子一般調節細胞增殖、存活和分化。例如，TNF和FAS可殺死表達其相應受體的細胞，包括成纖維細胞，肝細胞和淋巴細胞。這類配體的某些成員可影響表達其相應受體的細胞的增殖，所述細胞如表達CD40的B細胞。這些對增殖的效應可能也會影響隨后的分化步驟，可能直接或間接地導致細胞因子表達模式的改變。
TNF配體家族成員也具有共刺激作用，這也可調節細胞分化或細胞凋亡。受體表達細胞可能受到保護，免于活化誘導的細胞死亡(ACID)或細胞凋亡。例如，CD40配體可對T和B淋巴細胞具有作用。
該實施方案的特征在于來自小鼠，但也存在其它靈長類如人的變體。其它哺乳動物種類如靈長類和嚙齒類的蛋白的另一些序列也可獲得。見下述。以下敘述示例性涉及小鼠499E9，但同樣可用于其它種類的相關實施方案。小鼠499E9蛋白是具有細胞表面抗原如TNF配體家族成員的結構特征的蛋白。該蛋白在特定細胞類型上容易檢測到，其它細胞表達較少。499E9抗原應存在于鑒定的組織類型中，抗原與其結合配體的相互作用對介導細胞生理或發育的各個方面應是至關重要的，如本文所述。II.純化499E9小鼠499E9氨基酸序列見SEQ ID NO2。這些氨基酸序列(從氨基端到羧基端)的重要性在于提供抗原的序列信息，允許區分一種蛋白和其它蛋白，例舉多種變體。而且，肽序列允許制備肽，產生識別這種區段的抗體，核苷酸序列允許制備寡核苷酸探針，二者均為檢測或分離如克隆編碼這些序列的基因或cDNA的策略。
本文中，“小鼠499E9”用于說明蛋白質時包括具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白，或該蛋白的一個顯著的片段，或其它來源于小鼠的高度同源的蛋白。這些結合成分如抗體一般以高親和力結合499E9，如至少約100nM，通常優于約30nM，優選優于約10nM，更優選優于3nM。同源蛋白也見于非小鼠的哺乳動物種類如靈長類或嚙齒類。非哺乳動物種類應當也具有結構或功能相關的基因和蛋白，如禽類或兩棲類。
“多肽”在本文中包括一個顯著片段或區段，也包括一段至少約8個氨基酸的氨基酸殘基區段，通常至少約12個氨基酸，一般至少約16個氨基酸，優選至少約20個氨基酸，在具體實施方案中，為至少約30或更多個氨基酸。
“結合成分”指特異性與499E9結合的分子，如以細胞粘附對型方式或抗體-抗原相互作用方式結合。還包括以下化合物，如特異與499E9結合的蛋白，結合方式包括共價或非共價的天然生理相關蛋白-蛋白相互作用。該分子可以是聚合物或化學試劑。功能類似物可以是具有結構修飾的抗原或是一種具有與合適結合決定簇相互作用的分子形狀的分子。該化合物可作為結合相互作用的激動劑或拮抗劑，參見如Goodman etal(編輯，1990)《Goodman&Gilman′s治療的藥理學基礎》(第8版)，Pergamon Press。
基本純化一般指該蛋白沒有其它來源于原始來源生物的污染蛋白、核酸或其它生物分子。純度可通過標準方法分析，一般以重量表示，普通情況下至少約40％純度，一般至少約50％純度，通常至少約60％純度，典型地至少約80％純度，優選至少約90％純度，在最優選的實施方案中，至少約95％純度。通常加入載體或賦形劑。
多肽或片段的溶解性取決于環境和多肽。多種參數影響多肽的溶解性，包括溫度，電解質環境，多肽大小和分子特征，及溶劑性質。一般，多肽使用的溫度為約4℃到約65℃。通常使用的溫度高于約18℃。為診斷目的，溫度通常約為室溫或稍高，但低于分析成分的變性溫度。為治療目的，溫度通常為體溫，對小鼠和人一般為約37℃，但在某些條件下，該溫度在原位或體外可以提高或降低。
多肽的大小和結構一般是在基本穩定狀態，通常在非變性狀態。多肽可與其它多肽以四級結構結合，如賦予溶解性，或與脂質或去污劑結合，結合方式類似于天然脂雙層相互作用。
溶劑和電解質一般是生物相容的緩沖液，是用于保持生物活性的類型，通常接近生理水性溶劑。該溶劑通常具有中性pH，一般為約5-10，優選約7.5。在某些情況下，可以加入一種或多種去污劑，一般是溫和的非變性的去污劑，如CHS(半琥珀酸膽甾醇酯)或CHAPS(3-[3-膽胺基丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸)，或濃度足夠低，從而避免蛋白的結構或生理特性的顯著破壞。III.物理變體本發明也包括與499E9氨基酸序列具有基本氨基酸序列同一性的蛋白或肽。該變體包括種、多態或等位變體。
氨基酸序列同源性或序列同一性通過優化殘基匹配確定，如果需要，可引入所需的缺口。參見Needleham et al(1970)J.Mol.Biol.48443-453；Sankoff et al(1983)Time Warps，String Edits，andMacromoleculesThe Theory and Practice of Sequence Comparison第1章，Addison-Wesley，Reading，MA；和來自IntelliGenetics，Moutain View，CA和Wisconsin大學遺傳學計算機小組，Madison，WI的軟件包。當將保守性取代作為匹配時，序列同一性會發生改變。保守性取代一般包括以下組內的取代甘氨酸，丙氨酸；纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；絲氨酸，蘇氨酸；賴氨酸，精氨酸；以及苯丙氨酸，酪氨酸。同源氨基酸序列一般旨在包括各種相應蛋白序列的天然多態或等位和種間變體。通常，同源蛋白或肽與499E9的氨基酸序列具有25-100％(如果引入缺口)的同一性，到50-100％(如果包括保守取代)的同一性。同一性指標為至少約35％，一般為至少約40％，經常為至少約50％，典型地為約60％，通常為約70％，優選至少約80％，更優選至少約90％。
分離的499E9 DNA可通過以下方法方便地修飾核苷酸取代，核苷酸缺失，核苷酸插入，和核苷酸區段的倒轉。這些修飾產生新的DNA序列，其編碼這些抗原，它們的衍生物或具有類似生理，免疫原性，抗原性或其它功能活性的蛋白。這些修飾序列可用于產生突變抗原或增強表達。增強表達可能包括基因擴增，轉錄增加，翻譯增加和其它機制。“突變499E9”包括其與499E9的序列同一性在上述定義范圍之內，但具有不同于天然所見的499E9的氨基酸序列的多肽，這種差異可以由缺失、取代或插入產生。這通常包括與具有SEQ ID NO2序列的蛋白具有顯著同一性的蛋白，并與這些序列共有多種生物活性，如抗原性或免疫原性，在優選實施方案中，含有大多數公開的全長序列。全長序列一般是優選的，但截短變體如可溶性構建體和完整結構域也可使用，同樣，天然來源的基因或蛋白一般是最理想的。類似的構思可應用于不同的499E9蛋白，特別是各種溫血動物如哺乳動物和禽類中發現的蛋白。這些敘述通常意味著包括所有499E9蛋白，不限于具體討論的特定小鼠實施方案。
499E9誘變可通過氨基酸插入或缺失進行。可產生取代，缺失，插入或任意組合來獲得最終的構建體。插入包括氨基或羧基末端融合。隨機誘變可在靶密碼子進行，然后篩選表達的突變體的所需活性。在預定位點產生取代突變的方法是本領域已知的，如M13引物誘變或聚合酶鏈反應(PCR)。參見，例如Sambrook et al(1989)；Ausubel et al(1987 andsupplements)；Kunkel et al(1987)Methods in Enzymol.154367-382。
本發明也提供了重組蛋白，如使用來自這些蛋白的區段的異源融合蛋白。異源融合蛋白是天然狀態下一般不以同樣方式融合的蛋白或區段的融合體。類似的概念適用于異源核酸序列。融合蛋白可用作清除，分離和純化其部分的來源。
此外，新的構建體可通過合并其它蛋白的類似功能區產生。例如，靶位結合或其它區段可在不同的新融合多肽或片段之間“交換”。參見，例如Cunningham et al(1989)Science 2431330-1336；O′Dowd et al(1988)J.Biol.Chem.26315985-15992。
Beaucage和Carruthers(1981)Tetra.Letts.221859-1862所述的亞磷酰胺法可產生適當的合成DNA片段。雙鏈片段通常可通過以下方法獲得合成互補鏈，在合適的條件下退火，或使用DNA聚合酶以合適的引物序列加入互補鏈，如PCR技術。IV.功能變體對499E9生理應答的阻斷可能是由于抑制了抗原與其結合配體的集合，例如同種的另一分子，這可能是通過競爭性抑制實現的。因此，本發明的體外試驗通常使用分離的蛋白，來自表達膜相關499E9細胞的細胞膜，包括這些蛋白的抗原結合區段的可溶性片段，或偶聯于固相底物上的片段。這些試驗也允許診斷性確定結合區段突變和修飾或抗原突變和修飾，如499E9類似物，的效應。
本發明也包括競爭性藥物篩選試驗的用途，如其中抗原或結合片段的中和抗體與試驗化合物競爭結合該蛋白，如天然蛋白序列的試驗。
499E9抗原的“衍生物”包括天然形式的氨基酸序列突變，糖基化變體，和與其它化學實體的共價或聚集偶合物。共價衍生物可通過以下方法制備將官能團連接于499E9氨基酸側鏈中的基團，或N或C末端，如通過標準方法。參見，例如Lundblad and Noyes(1988)《蛋白修飾的化學試劑》卷1-2，CRC Press，Inc.，Boca Raton，FL；Hugli(ed.)(1989)《蛋白質化學技術》Academic Press，San Diego，CA；Wong(1991)《蛋白連接和共價交聯的化學》，CRC Press，Boca Raton，FL。
具體而言，糖基化改變包括例如通過合成和加工或進一步加工過程中改變多肽的糖基化特征。參見，例如Elbein(1987)Ann.Rev.Biochem.56497-534。也包括具有同樣的一級氨基酸序列，但具有小修飾的肽變體，所示修飾如臨時氨基酸殘基，如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸。
也提供499E9和其它同源或異源蛋白的融合多肽。多種細胞因子受體或其它表面蛋白是多聚體，如同源二聚體，重復構建體可能具有某些優點，包括對蛋白水解較不敏感。代表性實例是報告多肽如熒光素酶與蛋白的一個區段或結構域如受體結合區段融合，使得融合配體的存在或定位容易確定。參見，例如Dull et al美國專利4,859,609。其它基因融合配體包括細菌β半乳糖苷酶，trpE，蛋白A，β內酰胺酶，α淀粉酶，醇脫氫酶，酵母α交配因子，檢測或純化標志如His6序列的FLAG序列。參見，例如Gpdowski et al(1988)Science 241812-816。
融合肽一般通過重組核酸法或合成多肽法制備。核酸操作和表達的技術一般可參見，例如Sambrook et al (1989)《分子克隆實驗室指南》第2版，卷1-3，Cold Spring Harbor Laboratory；Ausubel et al(eds)(1993)《現代分子生物學方法》Greene and Wiley，NY。合成多肽的方法可參見，例如Merrifield(1 963)J.Amer.Chem.Soc.852149-2156；Merrifield(1986)Science 232341-347；Atherton et al(1989)《固相肽合成實用方法》IRLPress，Oxford；Grant(1992)《合成肽使用者指南》W.H.Freeman，NY。
本發明也包括499E9非氨基酸序列或糖基化變體的衍生物的用途。這種衍生物可包括與化學實體共價或聚集相連。共價或聚集衍生物可用作免疫原，免疫試驗中的試劑，或用于純化方法，如其它抗原等結合配體的親和層析。499E9可通過以下方法固定化采用本領域熟知的方法共價結合于溴化氰活化的SEPHAROSE等固相支持物上，或吸附于聚烯烴表面，采用或不采用戊二醛交聯，以用于抗499E9抗體的試驗或純化或用于另一種結合組合物。499E9可以用可檢測的基團標記，用于如診斷試驗。499E9的純化可通過固定化抗體或互補結合配體實現。
本發明的可溶性499E9或片段可用作免疫原，產生特異性結合抗原或其片段的抗血清或抗體。純化抗原可用來篩選單克隆抗體或抗原結合片段，包括天然抗體的抗原結合片段，如Fab，Fab′，F(ab)2等。純化的499E9也可用作檢測抗體的試劑，所述抗體是對增高水平的抗原或含抗原的細胞片段發生應答產生的，二者可用來診斷異常或特定生理或疾病狀態。本發明包括針對SEQ ID NO1的核苷酸序列編碼的氨基酸序列或包含其的蛋白片段產生的抗體。具體而言，本發明包括與以下特定片段具有結合親和力或針對其產生的抗體，所述片段推測位于脂雙層之外，為細胞外區或細胞內區。
本發明包括分離其它密切相關的種類的變體。Southern和Northern印跡分析應可確定，類似遺傳實體存在于其它哺乳動物中。有可能499E9具有廣泛的種類變體，如嚙齒類，兔形動物，食肉動物，偶蹄目，奇蹄目和靈長類。
本發明也提供了分離一組相關抗原的方法，所述抗原在結構，表達和功能方面具有獨特性和類似性。分離和鑒定其它獨特種類的變體將大大加速該分子的多種生理效應的闡明。具體而言，本發明提供了在不同種類中鑒定其它同源遺傳實體的探針。
分離的基因允許轉化缺乏相應499E9表達的細胞，如缺乏相應抗原并具有負背景活性的種類或細胞。這應允許相對于對照細胞分析499E9的功能。
通過這些抗原介導行使各種活化或分化功能的關鍵結構元件，可使用現代分子生物學的標準方法實現，特別是與相關類別成員比較。參見，例如Cunningham等(1989)所述的同系物篩選誘變，Science 2431339-1336；和O′Dowd et al(1988)J.Biol.Chem.26315985-15992；Lechleiter et al(1990)EMBO J 94381-4390中所用的方法。
細胞內功能可能與通常可接近細胞溶膠的抗原區段相關。然而，在某些情況下可能發生蛋白內化，也可能發生細胞內成分和“細胞外”區段的相互作用。499E9與其它細胞外成分相互作用的特定區段可通過誘變或直接生化手段如交聯或親和方法鑒定。晶體學或其它物理方法進行的結構分析也可使用。進一步的信號傳導機制的研究包括研究相關成分，其可能可通過親和方法或遺傳手段如突變的互補分析分離。
將進行499E9的表達和控制的進一步研究。與抗原相關的控制元件應具有不同的生理，發育，組織特異的或其它表達模式。欲研究的是上游或下游遺傳區，如控制元件。具體而言，已經發現了生理或發育變體，如抗原的多種可變加工形式。參見，例如SEQ ID NO1。因此，信使的不同剪接可能會導致抗原的膜結合形式，可溶形式和修飾變體的分配。
抗原的結構研究會導致新抗原的設計，特別是對該分子具有激動劑或拮抗劑特性的類似物。這可與前述篩選方法結合，分離具有所需活性范圍的抗原。V.抗體可針對各種499E9產生抗體，包括種類，多態或等位變體和其片段，以其天然形式或重組形式均可。此外，可針對499E9的活性或非活性形式包括天然或變性形式產生抗體。也包括抗獨特型抗體。
抗抗原的預定片段的抗體包括其結合片段和單鏈形式，可通過以片段與免疫原性蛋白的偶聯物免疫動物產生。單克隆抗體可由分泌所需抗體的細胞制備。可篩選這些抗體結合正常或缺陷499E9的活性或者其激動劑或拮抗劑活性，例如通過抗原或其結合配體介導的活性。抗體可以是激動劑或拮抗劑，如通過空間阻斷配體結合。這些單克隆抗體通常的結合KD是至少約1 mM，更通常的是至少約300μM，一般是至少約100μM，更一般的是至少約30μM，優選至少約10μM，更優選至少約3μM或更佳。
本發明的抗體可用于診斷應用。作為捕獲或非中和抗體，可以其沒有配體抑制結合時結合抗原的能力對其進行篩選。作為中和抗體，它們可用于競爭結合試驗。它們也可用于檢測499E9蛋白或其結合配體或對其進行定量。參見，例如Chan(ed)(1987)《免疫學實用指南》AcademicPress，Orlando，FLA；Price and Newman(ed)(1991)《免疫試驗原理和實踐》Stockton Press，N.Y.；Ngo(ed)(1988)《非同位素免疫試驗》PlenumPress，NY。交叉吸附或其它試驗可鑒定具有各種特異性范圍的抗體，例如獨特的或共有的種類特異性。
再者，本發明的抗體包括抗原結合片段可以作為強效拮抗劑，結合抗原，抑制功能性結合或抑制結合配體的能力，從而引發生物應答。它們也可用作非中和抗體，可偶聯于毒素或放射性核素，所以當抗體結合抗原時，例如在其表面表達抗原的細胞即被殺死。此外，這些抗體可通過接頭直接或間接偶聯于藥物或其它治療劑，可進行藥物打靶。
抗原片段可連接于其它物質，特別是多肽，作為融合或共價連接的多肽用作免疫原。抗原和其片段可與多種免疫原偶聯或共價連接，所述免疫原如匙孔血藍蛋白，牛血清白蛋白，破傷風類毒素等。有關制備單克隆抗血清的方法參見《微生物學》Hoeber Medical Division，Harper andRow，1969；Landsteiner(1962)《血清反應的特異性》Dover Publications，New York；Williams et al(1967)《免疫學和免疫化學方法》卷1，AcademicPress，New York；Harlow and Lane(1988)《抗體實驗室指南》CSH Press，NY。
在某些情況下，需要自各種哺乳動物宿主制備單克隆抗體，如小鼠，嚙齒類，靈長類，人等。制備這種單克隆抗體的技術見例如Stites et al(ed)《基礎和臨床免疫學》第4版，Lange Medical Publications，Los Altos，CA及其所引參考文獻；Harlow and Lane(1988)《抗體實驗室指南》CSH Press；Goding(1986)《單克隆抗體原理和實踐》第2版，Academic Press，NewYork；特別參見Kohler and Milstein(1975)Nature 256495-497，其中討論了產生單克隆抗體的一種方法。
其它合適的技術包括將淋巴細胞體外與抗原多肽接觸或者在噬菌體或類似載體中選擇適當的抗體文庫。參見，Huse et al(1989)“噬菌體λ中產生免疫球蛋白的大型組合文庫”Science 2461275-1281；Ward et al(1989)Nature 341544-546。本發明的多肽和抗體使用時可修飾或不修飾，包括嵌合或人源化抗體。多肽或抗體經常通過以下方法標記共價或非共價連接于提供檢測信號的物質。已知有多種標記或偶合技術，在科學文獻和專利文獻中有大量報導。合適的標記包括放射性核素，酶，底物，輔因子，抑制物，熒光物質，化學發光物質，磁性顆粒等。有這些標記的使用的教導的專利包括美國專利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241。也可產生重組免疫球蛋白，參見Cabilly，美國專利4,816,567；Moore et al，美國專利4,642,334；Queen et al (1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8610029-10033。
本發明的抗體也可用于分離蛋白的親和層析。使抗體與固相支持物連接制備層析柱。參見，例如Wilchek et al(1984)Meth.Enzymol 1043-55。
針對各種499E9產生的抗體可用于產生抗獨特型抗體。這些抗體可用來檢測或診斷各種與相應抗原表達有關的免疫疾病。VI.核酸所述肽序列和相關試劑可用于由天然來源檢測，分離或鑒定編碼499E9的DNA克隆。一般來說，其可用于分離哺乳動物基因，類似方法可用于分離其它種類的基因，如禽類和哺乳類等溫血動物。交叉雜交允許由其它種類分離499E9。已有多種不同的方法可用于成功地分離合適的核酸克隆。
純化蛋白或成分明確的肽可用于通過標準方法產生抗體，如上所述。合成肽或純化蛋白可呈遞給免疫系統，產生單克隆或多克隆抗體。參見，例如Coligan(1991)《現代免疫學方法》Wiley/Greene；Harlow andLane(1989)《抗體實驗室手冊》Cold Spring Harbor Press。或者，499E9可用作特異結合試劑，可利用其結合特異性的優點，正如使用抗體一樣。
例如，特異結合組合物可用于篩選表達文庫，該文庫由表達499E9的細胞系產生。所述篩選可以是標準表面表達抗原染色或淘篩。細胞內表達的篩選也可通過各種染色或免疫熒光方法進行。結合組合物可用于親和純化或表達該蛋白的細胞的分選。
肽區段也可用于推測合適的寡核苷酸以篩選文庫。遺傳密碼可用于選擇可用作篩選探針的寡核苷酸。參見，例如SEQ ID NO1。與聚合酶鏈反應(PCR)技術組合，合成寡核苷酸可用于由文庫中選擇正確的克隆。互補序列也可用作探針，引物或反義鏈。基于可能的細胞外區的鑒定，各種片段應特別適用于，例如與錨定載體或polyA互補PCR技術或其它肽的互補DNA偶聯。
本發明包括編碼生物活性的相應499E9多肽的分離DNA或片段的用途。此外，本發明包括編碼生物活性蛋白或多肽的分離或重組DNA，所述DNA在適當的條件下可與本文所述的DNA序列雜交。所述生物活性蛋白或多肽可以是完整的抗原或片段，具有如SEQ ID NO1所公開的氨基酸序列。再者，本發明包括分離或重組DNA或其片段的用途，所述DNA或片段編碼499E9的同源蛋白，或者是使用編碼499E9的cDNA作為探針分離的。該分離的DNA可在5′和3′側翼具有調控序列，如啟動子，增強子，polyA添加信號等。
“分離的”核酸是基本上與天然序列所具有的其它成分分離的核酸，如RNA，DNA或混合聚合物，所述其它成分如來自來源生物的核糖體，聚合酶和/或側翼基因組序列。該術語包括與其天然環境分離的核酸序列，也包括重組或克隆DNA分離物和化學合成類似物或異源系統生物合成的類似物。基本上純化的分子包括該分子的分離形式。通常，該核酸位于載體之內或者是小于約50kb的片段，通常小于約30kb，一般小于約10kb，優選小于約6kb。
分離的核酸通常是分子的同質組合物，但在某些實施方案中含有少量異源物質。該異源物質通常見于聚合物末端或對所需生物功能或活性不重要的部分。
“重組”核酸由其制備方法或結構限定。關于其制備方法，如由一種方法制備的產物，該方法使用重組核酸技術，如在核苷酸序列中包括人工干預，通常是選擇或產生。或者，它可以是通過制備包括天然狀態下彼此互不相鄰的兩個片段的融合的序列產生的核酸，但必需排除天然產物，如天然存在的變體。因此，例如用任何非天然存在的載體轉化細胞制備的產物包括在內，包括使用任何合成寡核苷酸方法衍生的序列的核酸也包括在內。這通常是為了用編碼相同或保守氨基酸的豐余密碼子替代一個密碼子，而通常是引入或除去序列識別位點。
或者，重組是為了將具有所需功能的核酸區段連接在一起，產生不見于通常的天然形式的包括所需功能組合的單一遺傳實體。限制酶識別位點經常是這種人工操作的目標，但其它位點特異性目標，例如啟動子，DNA重組位點，調節序列，控制序列或其它有用特征，通常是設計時可考慮的。類似的概念可用于重組如融合多肽。具體而言，包括以下合成核酸，其通過遺傳密碼豐余性編碼類似于這些抗原片段的多肽和不同種類變體序列的融合體。
顯著的“片段”在用于核酸時是指至少約17個核苷酸的連續區段，通常至少約22個核苷酸，一般至少約29個核苷酸，更經常至少約35個核苷酸，典型地至少約41個核苷酸，普通至少約47個核苷酸，優選至少約55個核苷酸，在具體優選實施方案中是至少約60個核苷酸。
編碼499E9蛋白的DNA用于鑒定編碼相關或同源蛋白的基因，mRNA和cDNA種類，以及鑒定編碼不同種類同源蛋白的DNA時特別有用。在其它種類中可能存在同系物，包括靈長類，嚙齒類和禽類。各種499E9蛋白應當是同源的，并包括在本發明之內。然而，即使編碼與抗原的親緣關系較遠的蛋白的基因，在合適的條件下使用這些序列也可以方便地分離，只要它們同源性足夠。靈長類499E9蛋白尤其令人關注。
來自基因組序列的重組克隆如含有內含子的克隆可用于轉基因研究，包括如轉基因細胞和生物，和基因治療。參見，例如Goodnow(1992)“轉基因動物”，Roitt編輯，免疫學百科全書，Academic Press，San Diego，pp.1502-1504；Travis(1992)Science 2561392-1394；Kuhn et al(1991)Science 254707-710；Capecchi(1989)Science 2441288；Robertson(1987)編輯，《畸胎瘤和胚胎干細胞實用方法》，IRL Press，Oxford；Robertson(1992)J.Clinical Oncology 10180-199。
核酸序列比較中，基本序列同源性指所述區段或其互補鏈在進行比較時，優化排列后具有如下同一性(同時具有合適的核苷酸插入或缺失)至少約50％，一般至少約58％，普通情況下至少約65％，經常至少約71％，典型地至少約77％，通常至少約85％，優選至少約95-98％或更多，在具體實施方案中，為99％或更高。或者，當所述區段在選擇性雜交條件下與一條鏈或其互補鏈可雜交則具有基本序列同源性，所述鏈通常是499E9的序列，如SEQ ID NO1中的序列。一般，選擇性雜交在如下情況下會發生至少約30核苷酸的一個區段具有至少約55％的同源性，優選至少約25個核苷酸的一個區段具有至少約75％的同源性，最優選約20個核苷酸的一個區段具有至少約90％的同源性。參見，Kanehisa (1984)Nuc.Acids Res.12203-213。如本文所述，同源性比較的長度可以更長，在某些實施方案中，為至少約17個核苷酸的一個區段，通常至少約28個核苷酸，一般至少約40個核苷酸，優選至少約75-100或更多個核苷酸。
在涉及雜交中的同源性時，嚴緊條件是指鹽，溫度，有機溶劑和其它通常在雜交反應中要控制的參數的總的嚴緊條件。嚴緊溫度條件通常包括超過約30℃的溫度，通常超過約37℃，一般超過約55℃，優選超過約70℃。嚴緊鹽度條件普通情況下小于約1000mM，通常小于約400mM，一般小于約250mM，優選小于約150mM。但是，參數的組合較單一參數值更為重要，參見，例如Wetmur and Davidson(1968)J.Mol.Biol.31349-370。來自其它哺乳動物種類的499E9可通過密切相關的種的種間雜交克隆和分離。在親緣關系較遠的種類之間親緣性可能較低，因此相對來說親緣關系較近的種類之間雜交較為理想。或者，制備具有較低物種特異性的抗體制品可用于表達克隆法。
VII.制備499E9；模擬物編碼499E9或其片段的DNA可通過以下方法獲得化學合成，篩選cDNA文庫，或篩選制備自多種細胞系或組織樣品的基因組文庫。參見，例如Okayama and Berg(1982)Mol.Cell.Biol.2161-170；Gubler andHoffman (1983)Gene 25263-269；Glover編輯(1984)《DNA克隆實用方法》，IRL Press，Oxford。或者，本文提供的序列提供了有用的PCR引物，或允許合成或其它方法制備編碼499E9的合適基因，包括天然存在的499E9。
該DNA可在多種宿主細胞中表達，以合成全長499E9或其片段，它們又可用來例如產生多克隆或單克隆抗體；用于結合研究；用于修飾分子的構建和表達；和用于結構/功能研究。
本文所用的載體包括質粒，病毒，噬菌體，可整合DNA片段，和其它能將DNA片段整合進入宿主基因組的載體。參見，例如Pouwels et al(1985 and Supplements)《克隆載體實驗室指南》，Elsevier，NY；Rodriguezet al(1988)編輯《載體分子生物學克隆載體及其用途概述》，Battersworth，Boston，MA。
為本發明目的，當DNA序列功能上彼此相關時，它們被有效連接。例如，如果前序列或分泌先導序列被表達為前蛋白或參與指導多肽轉運至細胞膜或多肽的分泌，其被有效連接于多肽。如果啟動子控制多肽轉錄，其被有效連接于編碼序列；如果核糖體結合位點的定位可進行翻譯，則其被有效連接于編碼序列。一般，有效連接是指相鄰和符合讀框，但是，某些遺傳元件如抑制基因連接位置不相鄰但仍能結合操縱基因序列，從而控制表達。參見，例如Rodriguez et al第10章，p205-236；Balbasand Bolivar(1990)《酶學方法》18514-37；Ausubel et al(1993)《現代分子生物學方法》，Greene and Wiley，NY。
合適的表達載體代表性實例包括pCDNA1；pCD，參見Okayama et al(1985)Mol.Cell.Biol 51136-1142；pMClneo Poly-A，參見Thomas et al(1987)Cell 51503-512；和桿狀病毒載體，如pAC373或pAC610。參見，例如Miller(1988)Ann.Rev.Microbiol.42177-199。
在提供特定或限定糖基化特征的系統中表達499E9多肽通常較為理想。參見，例如Luckow and Summers (1988)Bio/Technology 647-55；Kaufman(1990)Meth.Enzymol.185487-511。
499E9或其片段可以工程改造以磷脂酰肌醇(PI)連接于細胞膜，但可通過磷脂酰肌醇裂解酶如磷脂酰肌醇磷脂酶C由細胞膜除去。這釋放了生物活性形式的抗原，允許通過標準蛋白質化學方法進行純化。參見，例如Low(1989)Biochim.Biophys.Acta 988427-454；Tse et al(1985)Science 2301003-1008；Brunner et al(1991)J.Cell Biol.1141275-1283。
既然499E9已經被鑒定，其片段或衍生物可通過常規合成肽的方法制備。這些包括如下文獻中所述的方法Stewart and Young(1984)《固相肽合成》，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL；Bodanszky and Bodanszky(1984)《肽合成的實踐》，Springer-Verlag，New York；Bodanszky(1984)《肽合成原理》，Springer-Verlag，New York；Villafranca編輯(1991)《蛋白質化學技術II》，Academic Press，San Diego，CA。
VIII.用途本發明提供的試劑可用于本文其它地方，如在概論中T細胞介導的疾病或以下有關診斷試劑盒的敘述中所述的診斷用途。
本發明也提供了具有明顯治療價值的試劑。499E9(天然存在或重組的)，其片段，其抗體，以及與499E9具有結合親和力的化合物，應可用于治療與異常生理或發育有關的疾病，包括異常增殖疾病如癌癥或退行性疾病。具體而言，淋巴細胞發育的調節可通過使用本文所提供的組合物進行適當治療來達到。例如，與499E9的異常表達或異常信號傳導有關的疾病或紊亂應該是該抗原的激動劑或拮抗劑的可能的靶。該抗原在造血細胞如淋巴細胞(其影響免疫應答，如自身免疫紊亂)的調節和發育中起作用。
尤其是，該抗原可能提供細胞活化的共刺激信號。因此，499E9可能調節T細胞介導的與其它細胞類型如具有其受體的細胞的相互作用。這些相互作用在某些情況下可導致細胞生長的調節，這些或其它細胞的細胞因子合成，或特定效應細胞的發育。
而且，499E9或其拮抗劑可以再指導T細胞應答，如Th1和Th2極化之間或與Th0細胞的應答。這些激動劑中應當有各種識別合適表位的抗體，所述表位如模擬499E9與其受體結合的表位。或者，它們可結合空間阻斷受體結合的表位。
499E9的拮抗劑如天然存在的499E9分泌型或封閉抗體也是有用的，它們可以提供調節異常狀況如自身免疫紊亂以及急性和慢性炎癥應答(其中T細胞活化，擴增和/或免疫T細胞記憶發揮重要作用)中的免疫應答的選擇性和強效途徑，上述自身免疫紊亂如類風濕性關節炎，系統性紅斑狼瘡(SLE)，橋本甲狀腺炎。參見Samter et al(編輯)《免疫疾病》卷1和2，Little，Brown and Co.。可以用天然存在的分泌型499E9或其拮抗劑實現T細胞活化，擴增和/或細胞因子釋放。
此外，某些與其它T細胞信號傳導調節劑結合的組合物也是有用的。這種其它信號傳導分子包括TcR試劑，CD40，CD40L，CTLA-8，CD28，SLAM，FAS及其相應拮抗劑。
已知在各種Northern印跡分析表明具有499E9 mRNA的細胞類型中的多種異常狀況。參見Berkow(編輯)《Merck診斷治療手冊》，Merck&Co.，Rahway，N.J.；Thorn et al《Harrison內科醫學原理》，McGraw-Hill，N.Y.；Weaterall et al(編輯)《牛津醫學教科書》，Oxford University Press，Oxford。許多其它醫學狀況和疾病與T細胞有關或是T細胞介導的，其中許多對本發明提供的激動劑或拮抗劑治療有反應。參見，例如Stites andTerr(編輯，1991)《基礎和臨床免疫學》Appleton and Lange，Norwalk，Connecticut；Samter et al(編輯)《免疫疾病》Little，Brown and Co.。這些問題對本發明提供的組合物的預防或治療應當是敏感的。
499E9抗體可以純化，然后給予患者(家畜或人)。這些試劑可以與其它活性或惰性成分合并用于治療，如在常規可藥用載劑或稀釋劑如免疫佐劑中與生理相容的穩定劑、賦形劑或防腐劑一起組合。這些組合可以是無菌過濾，然后在單位劑量容器中凍干或以水性制品穩定儲存形成單位劑型。本發明還包括抗體或其結合片段的應用，包括非互補結合的形式。
可使用499E9或其片段進行藥物篩選，以鑒定與499E9具有結合親和力或對499E9具有其它相關生物效應包括分離相關組分的化合物。隨后的生物分析可用來確定該化合物是否具有內在刺激活性或其作為阻斷劑或拮抗劑阻斷該抗原的活性，如突變蛋白拮抗劑。同樣，具有內在刺激活性的化合物可活化信號傳導途徑，因此其為刺激499E9活性的激動劑。本發明還包括499E9阻斷抗體作為拮抗劑和刺激分子如突變蛋白作為激動劑的治療用途。該方法對其它499E9種類變體應特別有用。
有效治療所需的試劑量取決于多種不同的因素，包括給藥方法，靶位點，患者生理狀況和給予的其它藥物。因此，對治療劑量應進行滴定以優化安全性和效果。一般，體外所用的劑量對這些試劑的原位給藥可提供有用的指導。治療特定疾病的有效劑量的動物試驗可提供人用劑量的預測信息。有關考慮見Gilman et al(編輯)(1990)Goodman and Gilman′sThe Pharmacological Bases of Therapeutics，第8版，Pergamon Press；《雷明頓制藥科學》第17版，1990，Mack Publishing Co.，Easton，Penn.。在其中及以下對各種給藥方法進行了討論，如口服，靜脈，腹膜內或肌肉給藥，經皮擴散等。可藥用佐劑將包括水，鹽水，緩沖液和其它所述化合物，如見Merck Index，Merck&Co.，Rahway，New Jersey。預計合適載劑中的劑量范圍通常小于約1 mM濃度，典型地小于約10μM，一般小于約100nM，優選小于約10pM(皮摩爾)，最優選小于約1 fM(飛摩爾)。緩釋制劑或緩釋裝置通常用于連續或長期給藥。參見，例如Langer(1990)Science 2491527-1533。
499E9或其片段，其抗體或片段，拮抗劑和激動劑可直接給予治療宿主，或根據化合物的大小，將其偶合于載體蛋白如卵清蛋白或血清白蛋白后再用藥。治療制劑可以許多常規劑型給藥。盡管可以將活性成分單獨給藥，優選將其作為藥物制劑給藥。制劑一般包括至少一種如上所述的活性成分以及一種或多種可接受的載體。每一種載體若與其它成分相容和對患者無害，就應是可藥用的和生理相容的。制劑包括適合口服，直腸，鼻腔，局部或非腸道(包括皮下，肌肉，靜脈和皮內)給藥的制劑。制劑可方便地以單位劑量形式存在，也可通過藥學領域已知的方法制備。見，例如Gilman et al(編輯)(1990) Goodman and Gilman′sThePharmacological Bases of Therapeutics，第8版，Pergamon Press；《雷明頓制藥科學》第17版，1990，Mack Publishing Co.，Easton，Penn.；Avis etal(編輯)(1993)《藥物劑型腸道藥物》，Dekker，New York；Liebermanet al(編輯)(1990)《藥物劑型片劑》，Dekker，New York；Lieberman etal(編輯)(1990)《藥物劑型分散系統》，Dekker，New York。本發明的該治療可與其它藥物合并或聯合使用，例如其它T細胞激活調節劑，如CD40，CD40配體，CD28，CTLA-4，B7，B70，SLAM，T細胞受體信號傳導分子或其相應拮抗劑。
天然存在和本發明的重組形式的499E9尤其可用于篩選對該蛋白具有結合活性的化合物的試劑盒和試驗方法中。近年已開發幾種自動分析方法，可以在短時間內篩選成千上萬種化合物。參見，例如Fodor et al(1991)Science 251767-773，其中敘述了通過多種在固相底物上合成的成分明確的聚合物測定結合親和力。由本發明提供的大量純化的可溶性499E9會大大促進合適分析方法的發展。
其它方法也可用于確定499E9-499E9受體相互作用中的關鍵殘基。可進行突變分析，例如參見Somoza et al(1993)J.Exptl.Med.，以確定在該相互作用和/或信號傳導中的具體關鍵殘基。參與同嗜性相互作用的細胞外區或細胞內區均提供細胞間信號傳導中重要的相互作用。
例如，如果抗原結構已經確定，通常可通過三級結構數據尋找拮抗劑。在發展出高度自動化的分析方法后使用純化的499E9可測定潛在相互作用類似物。具體而言，新的拮抗劑和拮抗劑可通過本文所述篩選技術發現。尤為重要的是對499E9分子譜具有合并的結合親和力的化合物，如可作為499E9種類變體的拮抗劑的化合物。已知藥物篩選方法利用已經用表達499E9的重組DNA分子穩定轉化的真核和原核宿主細胞。可分離表達與其它分子分離的499E9的細胞。這種細胞，無論是活的或固定的，均可用于標準結合配體結合試驗。參見，Parce et al(1989)Science246243-247；Owicki et al(1 990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 874007-4011，其中介紹了測定細胞應答的敏感方法。
藥物篩選的其它技術包括提供對499E9具有合適親和力的其它化合物的高流通量篩選，有關敘述見Geysen，歐洲專利申請84/03546，
公開日1984年9月13日。首先，在固體底物，如塑料針或某些其它合適表面，上合成大量不同小肽測試化合物，參見Fodor et al(1991)。然后所有的針與溶化的，未純化的或溶化的，純化的499E9反應并洗滌。下一步包括測定結合的499E9。
合理的藥物設計也基于499E9和其它效應物或類似物分子形狀的結構分析。效應物可以是介導對結合發生反應的其它功能的其它蛋白，或通常與499E9相互作用的其它蛋白。確定哪一個位點與特定其它蛋白相互作用的一種方法是物理結構分析法，如X射線晶體衍射或2維NMR技術。這些提供了哪一個氨基酸殘基形成分子接觸區的指導。蛋白結構分析的詳細介紹見例如Blendell and Johnson(1976)《蛋白質晶體衍射術》，Academic Press，New York。IX.試劑盒本發明也包括499E9蛋白，其片段，肽和其融合產物在多種檢測其它499E9或其結合配體的診斷試劑盒和方法中的用途。一般試劑盒包括一個分隔物，其中含有成分明確的499E9肽或基因區段或識別其中之一或另一個的試劑，如499E9片段或抗體。
確定試驗化合物與499E9的結合親和力的試劑盒一般包括試驗化合物；標記化合物，例如已知對499E9具有結合親和力的結合配體或抗體；499E9來源(天然存在的或重組的)；分離結合的和游離的標記化合物的裝置，如固定該分子的固相。篩選到化合物之后，對抗原具有合適結合親和力的化合物可在合適的生物試驗中評價，如本領域已知的試驗，以確定它們是否可作為499E9信號傳導途徑的激動劑或拮抗劑。可獲得重組499E9多肽也提供了校準該試驗的明確標準。
優選的確定例如在樣品中的499E9濃度的試劑盒一般包括已知對抗原具有結合親和力的標記化合物，如結合配體或抗體，抗原來源(天然存在的或重組的)和分離結合的和游離的標記化合物的裝置，如固定499E9的固相。通常也提供放置試劑的分隔物和說明書。
對499E9或其片段特異的抗體，包括抗原結合片段，可用于診斷應用中，測定較高水平的499E9和/或其片段的存在。這種診斷試驗可使用裂解物，活細胞，固定細胞，免疫熒光，細胞培養物，體液，并可進一步包括檢測與血清中抗原相關的抗原等。診斷試驗可以是同質的(沒有游離試劑和抗原-結合配體復合物的分離步驟)或異質的(有分離步驟)。有多種商用試驗，如放射免疫試驗(RIA)，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，酶免疫試驗(EIA)，多酶免疫試驗技術(EMIT)，底物標記熒光免疫試驗(SLFIA)等。參見，例如Van Vunakis et al(1980)Meth.Enzymol.701-525；Harlow and Lane(1980)《抗體實驗室手冊》，CSHPress，NY；Coligan et al(編輯)(1993)《現代分子生物學方法》，Greeneand Wiley，NY。
同樣，抗獨特型抗體也可用于診斷抗499E9抗體的存在，它們可能是某些異常狀態的診斷指標。例如，499E9的過量產生會導致各種免疫反應的產生，它們可能是異常生理狀況的診斷指標，特別是在增殖細胞性疾病如癌癥或異常活化或分化中。
診斷試驗的試劑經常以試劑盒提供，從而優化試驗的敏感性。對本發明而言，取決于試驗的性質，方法和標記，提供標記或未標記抗體或結合配體，或標記499E9。這通常與其它附加物一起，如緩沖液，穩定劑，產生信號所需的材料如酶底物等。優選，該試劑盒也包括使用和使用后棄置內含物的正確方法。一般試劑盒對每一有用試劑均具有分隔。理想的是，試劑以凍干粉末提供，進行試驗時，試劑可在提供合適濃度試劑的水性介質中重配。
前述的藥物篩選和診斷試驗中的許多成分可不經修飾即使用或以多種方式修飾后使用。例如，可通過將直接或間接提供檢測信號的實體共價或非共價連接進行標記。在任一試驗中，結合配體，試驗化合物，499E9或其抗體可直接或間接標記。直接標記的可能性包括標記基團放射標記如125I，酶(美國專利3,645,090)如過氧化物酶和堿性磷酸酶，和能監測熒光強度，波長偏移或熒光極化變化的熒光標記(美國專利3,940,475)。間接熒光標記的可能性包括一種成分的生物素化，然后與偶聯于上述標記基團之一的親和素結合。
有多種分離結合的和游離的499E9，或者結合的與游離的試驗化合物的方法。499E9可固定在多種基質上，然后進行洗滌。合適的基質包括塑料如ELISA板，濾膜和珠。參見，例如Coligan et al(編輯)(1993)《現代免疫學方法》卷1，第2章，Greene and Wiley，NY。其它合適的分離技術包括但不限于熒光素抗體磁化顆粒法，Rattle et al(1984)Clin.Chem.301457-1461，和雙抗體磁性顆粒分離，美國專利4,659,678。
將蛋白或其片段連接于標記物的方法在文獻中有廣泛的報導，本文無需詳述。多種這樣的技術涉及使用活化羧基，通過使用碳二亞胺或活性酯形成肽鍵，通過巰基與活化鹵素如氯乙酰或活化烯烴如馬來酰亞胺反應形成硫醚，從而形成連鍵等。
本發明其它診斷方面包括來自499E9序列的寡核苷酸或多肽序列的使用。這些序列可用作探針檢測懷疑有異常狀況如癌癥或發育問題的患者樣品中的499E9信使水平。由于抗原是活化的標志，其可用于確定活化T細胞的數目，從而確定例如何時會需要額外的抑制。RNA和DNA核苷酸序列的制備，序列的標記和優選的序列大小在文獻中有充分的敘述和討論。參見，例如Langer-Safer et al(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.794381-4385；Caskey(1987)Science 236962-967；Wilchek et al(1988)Anal.Biochem.1711-32。
本發明也包括定性或定量測定其它標志的診斷試劑盒。診斷或預測可根據用作標志的多種指標的組合。因此，試劑盒可測定標志的組合。參見，例如Viallet et al (1989)Progress in Growth Factor Res.189-97。其它試劑盒可用來評價T細胞亞群。X.分離499E9特異結合配體的方法499E9蛋白基于例如其結構和功能與其它具有類似結構和表達細胞類型特異性的細胞表面抗原類似，應當與受體相互作用。可制備用于篩選的純化499E9使得分離受體的方法成為可行。使用本發明的499E9序列的可溶性或其它構建體允許篩選或分離499E9特異受體。有多種方法可進行表達克隆，淘篩，親和分離或以其它方式鑒定受體。
正如本領域技術人員所知，在不偏離本發明的精神和范圍的情況下，可對其進行多種改進和調整。本文所述的具體實施方案僅為舉例，本發明僅由所附權利要求書和其等效物限定。
實施例通用方法某些標準方法可參見例如Maniatis et al(1982)《分子克隆實驗室指南》，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Press；Sambrooket al(1989)《分子克隆實驗室指南》第2版，卷1-3，CSHPress，NY；Ausubel et al《生物學》，Greene Publishing Associates，Brooklyn，NY；Ausubel et al(1987 and Supplements)《現代分子生物學方法》，Greene andWiley，NY；Innis et al(編輯)(1990)《PCR方法和應用指南》，AcademicPress，NY。蛋白純化的方法包括例如硫酸銨沉淀，柱層析，電泳，離心，結晶等。參見，例如Ausubel et al(1987 and periodic supplements)；Deutscher(1990)“蛋白質純化指南”，《酶學方法》，卷182及其它卷；和蛋白質純化產品的使用說明，如Pharmacia，Piscataway，N.J.，或Bio-Rad，Richmond，CA。與重組技術組合允許與合適區段融合，如與FLAG序列或可通過蛋白酶可除去的序列融合的等效物。參見，例如Hochuli(1989)Chemische Industrie 1269-70；Hochuli(1990)“用金屬螯合吸附劑純化重組蛋白”，Setlow(編輯)《遺傳工程原理和方法》1287-98，PlenumPress，NY；Crowe et al(1992)《QIAexpress高水平表達和蛋白純化系統》，QUIAGEN，Inc.，Chatsworth，CA。細胞培養技術參見Doyle et al(編輯)(1994)《細胞和組織培養實驗室技術》，John Wiley and Sons，NY。
FACS分析參見Melamed et al(1990)《流式細胞術和分選》，Wiley-Liss，Inc.，New York，NY；Robinson et al(1993)《流式細胞術方法手冊》，Wiley-Liss，New York，NY。合適試劑的熒光標記按照標準方法進行。實施例1小鼠499E9的克隆3W Th1或Th2細胞的產生參見Openshaw et al(1995)J.Exp.Med.1821357-1367。簡而言之，Th1或Th1細胞群體來自IL12或IL14存在時抗原和抗原呈遞細胞刺激的CD4+細胞。每周刺激細胞1次，共3周，然后收獲細胞，重新用例如PMA和離子霉素刺激4小時。參見，Murphyet al(1996)J.Exp.Med.183901-913。
總RNA可使用例如硫氰酸胍/CsCl梯度法分離，該方法見Chirgwin，et al(1978)Biochem.185294-5299。Poly(A)+RNA使用例如OLIGOTEXmRNA分離試劑盒(QIAGEN)分離。來自這些細胞的這種RNA用來合成第1鏈cDNA，使用例如NotI/Oligo-dT引物(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)。合成雙鏈cDNA，與BstXI連接物連接，用NotI消化，大小分離大于0.5kb的片段，連接進入pCDSRα載體衍生物pJFE14的NotI/BstXI位點。參見Takebe et al(1985)Mol.Cell Biol.8466-472。電轉化感受態大腸桿菌DH10α細胞(Gibco-BRL)用于電轉化。
隨機挑取獨立的克隆，使用已知細胞因子cDNA混合物通過雜交篩選。從不與細胞因子探針雜交的克隆制備質粒DNA。這些克隆按照插入片段大小分組，進一步通過DNA測序鑒定。分離相應于499E9的克隆。實施例2小鼠499E9的細胞表達編碼小鼠499E9的cDNA的特異探針用來確定編碼該抗原的信使的組織分布。標準雜交探針可用于合適來源的RNA的Northern分析，所述來源可以是例如經刺激的細胞，處于各種生理狀態的細胞，各種組織如脾、肝、胸腺、肺等的細胞，或各種物種的細胞。cDNA文庫的Southern分析也可提供分布的有價值的信息。標準組織印跡或物種印跡可商購。類似技術也可用來評價可能與各種細胞類型的表達相關的診斷或醫學狀況。
使用合適引物的PCR分析也可使用。抗體分析包括免疫組織化學或FACS可用于確定細胞或組織分布。實施例3499E9蛋白的純化篩選多種轉染細胞系，獲得相對其它細胞以高水平表達抗原的膜結合形式或可溶形式的細胞系。篩選各種細胞系，選擇易于處理的有利特性。天然499E9可自天然來源分離或使用合適的表達載體在轉化細胞中表達分離。表達蛋白的純化可通過標準方法進行，或結合使用從細胞裂解物或上清中高效純化的工程化手段。FLAG或His6區段可用于這些純化。實施例4同源499E9基因的分離499E9 cDNA可用作雜交探針，篩選來自所需來源的文庫如靈長類細胞cDNA文庫。可對多種不同的物種篩選易于雜交的嚴緊性條件，并使用探針篩選其存在。合適的雜交條件可用來選擇具有雜交特異性的克隆。
使用基于肽序列的變性探針的雜交或PCR篩選允許分離合適的克隆。或者，使用PCR篩選的合適引物會獲得合適核酸克隆的富集。
類似方法可用于分離種類，多態或等位變體。種類變體使用種間雜交技術分離，基于作為探針的一個物種的全長分離物或片段的分離。
或者，針對小鼠499E9產生的抗體可用于篩選表達來自合適的如cDNA文庫的交叉反應性蛋白的細胞。純化蛋白或成分明確的肽可用于標準方法產生抗體，如上述。合成肽或純化蛋白呈遞給免疫系統，以產生單克隆或多克隆抗體。參見，例如Coligan(1991)《現代免疫學方法》，Wiley/Greene，Cold Spring Harbor Press。產生的抗體用于例如篩選，淘篩或分選。實施例5499E9特異性抗體的制備合成肽或純化蛋白呈遞給免疫系統，以產生單克隆或多克隆抗體。參見，例如Coligan(1991)《現代免疫學方法》，Wiley/Greene；Harlow andLane(1989)《抗體實驗室手冊》，Cold Spring Harbor Press。可制備多克隆血清或雜交瘤。在合適的情況下，結合試劑或如上所述進行熒光或其它標記或固定于底物上用于淘篩。實施例6499E9受體的分離499E9構建體表達產物可用作特異結合試劑，利用其結合特異性鑒定其結合配體如受體，正如抗體一樣。499E9試劑或如上所述進行熒光或其它標記或固定于底物上用于淘篩。
結合組合物用于篩選由表達結合配體即受體的細胞系制備的表達文庫。使用標準染色技術檢測或分選細胞內或表面表達的受體，或者表面表達的轉化細胞通過淘篩進行篩選。細胞內表達的篩選通過各種染色或免疫熒光方法進行。參見McMahan et al(1991)EMBO J.102821-2832。
或者，499E9試劑用于親和純化或分選表達受體的細胞。參見，例如Sambrook等或Ausubel等。
另一種策略是通過淘篩篩選膜結合受體。含受體cDNA的cDNA如上所述構建。配體可被固定并用于固定表達細胞。固定化可通過使用合適的抗體完成，所述抗體識別如499E9融合構建體的FLAG序列，或是針對第一抗體產生的抗體。選擇和擴增的重復循環導致合適克隆的富集和受體表達克隆的最終分離。
噬菌體表達文庫可通過499E9篩選。合適的標記技術如抗-FLAG抗體允許合適克隆的特異性標記。
本文引用作為參考的所有參考文獻均同樣被引用，如同每一篇文獻或專利申請分別和特別引用一樣。
本領域技術人員清楚，在不偏離本發明的精神和范圍的情況下，可對本發明進行多種改進和調整。本文所述的具體實施方案僅為示例，本發明由所附權利要求書和其等效物限定。
序列表SEQ ID NO1為小鼠499E9核酸序列。
SEQ ID NO2為小鼠499E9氨基酸序列。(1)一般資料(i)申請人Schering Corporation(ii)發明名稱哺乳動物細胞表面抗原及相關試劑(iii)序列數2(iv)通訊地址(A)收件人Schering-Plough Corporation(B)街道2000 Galloping Hill Road(C)城市Kenilworth(D)州New Jersey(E)國家美國(F)郵政編碼07033-0530(v)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機Apple Macintosh(C)操作系統Macintosh 7.5.3(D)軟件Microsoft Word 6.0(vi)當前申請資料(A)申請號(B)申請日1997年12月12日(C)分類號(vi)在先申請資料(A)申請號US 60/032,846(B)申請日1996年12月13日(viii)代理人/代理資料
(A)姓名Thampoe，Immac J..
(B)登記號36,322(C)資料/文檔號DX0686 PCT(ix)通訊資料(A)電話(908)298-506 1(B)傳真(908)298-5388(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度2191個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ii)分子類型cDNA(ix)特性(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置125..1072(xi)序列描述SEQ ID NO1GCCAGGACCT CTGTGAACCG GTCGGGGCGG GGGCCGCCTG GCCGGGAGTC TGCTCGGCGG60TGGGTGGCCG AGGAAGGGAG AGAACGATCG CGGAGCAGGG CGCCCGAACT CCGGGCGCCG120CGCC ATG CGC CGG GCC AGC CGA GAC TAC GGC AAG TAC CTG CGC AGC TCG169Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Gly Lys Tyr Leu Arg Ser Ser1 5 10 15GAG GAG ATG GGC AGC GGC CCC GGC GTC CCA CAC GAG GGT CCG CTG CAC217Glu Glu Met Gly Ser Gly Pro Gly Val Pro His Glu Gly Pro Leu His20 25 30CCC GCG CCT TCT GCA CCG GCT CCG GCG CCG CCA CCC GCC GCC TCC CGC265Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg35 40 45TCC ATG TTC CTG GCC CTC CTG GGG CTG GGA CTG GGC CAG GTG GTC TGC313Ser Met Phe Leu Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys50 55 60AGC ATC GCT CTG TTC CTG TAC TTT CGA GCG CAG ATG GAT CCT AAC AGA361Ser Ile Ala Leu Phe Leu Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg65 70 75ATA TCA GAA GAC AGC ACT CAC TGC TTT TAT AGA ATC CTG AGA CTC CAT409Ile Ser Glu Asp Ser Thr His Cys Phe Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His80 85 90 95GAA AAC GCA GGT TTG CAG GAC TCG ACT CTG GAG AGT GAA GAC ACA CTA457Glu Asn Ala Gly Leu Gln Asp Ser Thr Leu Glu Ser Glu Asp Thr Leu100 105 110CCT GAC TCC TGC AGG AGG ATG AAA CAA GCC TTT CAG GGG GCC GTG CAG505Pro Asp Ser Cys Arg Arg Met Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln115 120 125AAG GAA CTG CAA CAC ATT GTG GGG CCA CAG CGC TTC TCA GGA GCT CCA553Lys Glu Leu Gln His Ile Val Gly Pro Gln Arg Phe Ser Gly Ala Pro130 135 140GCT ATG ATG GAA GGC TCA TGG TTG GAT GTG GCC CAG CGA GGC AAG CCT601Ala Met Met Glu Gly Ser Trp Leu Asp Val Ala Gln Arg Gly Lys Pro145 150 155GAG GCC CAG CCA TTT GCA CAC CTC ACC ATC AAT GCT GCC AGC ATC CCA649Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro160 165 170 175TCG GGT TCC CAT AAA GTC ACT CTG TCC TCT TGG TAC CAC GAT CGA GGC697Ser Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly180 185 190TGG GCC AAG ATC TCT AAC ATG ACG TTA AGC AAC GGA AAA CTA AGG GTT745Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val195 200 205AAC CAA GAT GGC TTC TAT TAC CTG TAC GCC AAC ATT TGC TTT CGG CAT793Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His210 215 220CAT GAA ACA TCG GGA AGC GTA CCT ACA GAC TAT CTT CAG CTG ATG GTG841His Glu Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val225 230 235TAT GTC GTT AAA ACC AGC ATC AAA ATC CCA AGT TCT CAT AAC CTG ATG889Tyr Val Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met240 245 250 255AAA GGA GGG AGC ACG AAA AAC TGG TCG GGC AAT TCT GAA TTC CAC TTT937Lys Gly Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe260 265 270TAT TCC ATA AAT GTT GGG GGA TTT TTC AAG CTC CGA GCT GGT GAA GAA985Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu275 280 285ATT AGC ATT CAG GTG TCC AAC CCT TCC CTG CTG GAT CCG GAT CAA GAT1033Ile Ser Ile Gln Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp290 295 300GCG ACG TAC TTT GGG GCT TTC AAA GTT CAG GAC ATA GAC TGAGACTCAT1082Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp Ile Asp305 310 315TTCGTGGAAC ATTAGCATGG ATGTCCTAGA TGTTTGGAAA CTTCTTAAAA AATGGATGAT1142GTCTATACAT GTGTAAGACT ACTAAGAGAC ATGGCCCACG GTGTATGAAA CTCACAGCCC1202TCTCTCTTGA GCCTGTACAG GTTGTGTATA TGTAAAGTCC ATAGGTGATG TTAGATTCAT1262GGTGATTACA CAACGGTTTT ACAATTTTGT AATGATTTCC TAAGAATTGA ACCAGATTGG1322GAGAGGTATT CCGATGCTTA TGAAAAACTT ACACGTGAGC TATGGAAGGG GGTCACAGTC1382TCTGGGTCTA ACCCCTGGAC ATGTGCCACT GAGAACCTTG AAATTAAGAA GATGCCATGT1442CATTGCAAAG AAATGATAGT GTGAAGGGTT AAGTTCTTTT GAATTGTTAC ATTGCGCTGG1502GACCTGCAAA TAAGTTCTTT TTTTCTAATG AGGAGAGAAA AATATATGTA TTTTTATATA1562ATGTCTAAAG TTATATTTCA GGTGTAATGT TTTCTGTGCA AAGTTTTGTA AATTATATTT1622GTGCTATAGT ATTTGATTCA AAATATTTAA AAATGTCTCA CTGTTGACAT ATTTAATGTT1682TTAAATGTAC AGATGTATTT AACTGGTGCA CTTTGTAATT CCCCTGAAGG TACTCGTAGC1742TAAGGGGGCA GAATACTGTT TCTGGTGACC ACATGTAGTT TATTTCTTTA TTCTTTTTAA1802CTTAATAGAG TCTTCAGACT TGTCAAAACT ATGCAAGCAA AATAAATAAA TAAAAATAAA1862ATGAATATCT TGAATAATAA GTAGGATGTT GGTCACCAGG TGCCTTTCAA ATTTAGAAGC1922TAATTGACTT TAGGAGCTGA CATAGCCAAA AAGGATACAT AATAGGCTAC TGAAAATCTG1982TCAGGAGTAT TTATGCAATT ATTGAACAGG TGTCTTTTTT TACAAGAGCT ACAAATTGTA2042AATTTTGTTT CTTTTTTTTC CCATAGAAAA TGTACTATAG TTTATCAGCC AAAAAACAAT2102CCACTTTTTA ATTTAGTGAA AGTTATTTTA TTATACTGTA CAATAAAAGC ATTGTTTCTG2162AATGGCATTT TTTGGTACTT AAAAATGGC2191(3)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度316個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線型(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Gly Lys Tyr Leu Arg Ser Ser Glu1 5 10 15Glu Met Gly Ser Gly Pro Gly Val Pro His Glu Gly Pro Leu His Pro20 25 30Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser35 40 45Met Phe Leu Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys Ser
50 55 60Ile Ala Leu Phe Leu Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg Ile65 70 75 80Ser Glu Asp Ser Thr His Cys Phe Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His Glu85 90 95Asn Ala Gly Leu Gln Asp Ser Thr Leu Glu Ser Glu Asp Thr Leu Pro100 105 110Asp Ser Cys Arg Arg Met Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln Lys115 120 125Glu Leu Gln His Ile Val Gly Pro Gln Arg Phe Ser Gly Ala Pro Ala130 135 140Met Met Glu Gly Ser Trp Leu Asp Val Ala Gln Arg Gly Lys Pro Glu145 150 155 160Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro Ser165 170 175Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp180 185 190Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val Asn195 200 205Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His His210 215 220Glu Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val Tyr225 230 235 240Val Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met Lys245 250 255Gly Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe Tyr260 265 270Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu Ile275 280 285Ser Ile Gln Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp Ala290 295 300Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp Ile Asp305 310 31權利要求
1.至少12個氨基酸與SEQ ID NO2具有至少約85％的序列同一性的基本上純化的或重組的多肽。
2.包括權利要求1的多肽的融合蛋白。
3.編碼權利要求1的多肽或權利要求2的融合蛋白的分離核酸。
4.具有SEQ ID NO1的核苷酸序列的分離核酸。
5.一種以下核酸a)其在30℃的洗滌條件和小于2M鹽時與SEQ ID NO1雜交；或b)其中至少約30個核苷酸的區段與編碼499E9多肽的核酸具有至少約85％的同一性。
6.包括權利要求4或5的核酸的重組載體。
7.包括權利要求4-6任一項的核酸或載體的宿主細胞。
8.制備多肽或融合蛋白的方法，包括在表達核酸的條件下培養權利要求7的宿主細胞。
9.包括特異性結合權利要求1的多肽的抗體或抗原結合片段的結合化合物。
10.包括權利要求1的多肽或權利要求2的融合蛋白的組合物。
11.包括以下組分的試劑盒a)權利要求1的多肽或權利要求2的融合蛋白；b)特異性結合權利要求1的多肽的抗體；或c)權利要求4或5的核酸。
全文摘要
本發明提供了編碼哺乳動物T細胞表面抗原的純化基因,與其相關的試劑,包括純化蛋白,特異抗體和編碼該抗原的核酸。還提供了使用該試劑和診斷試劑盒的方法。
文檔編號C07K16/28GK1245534SQ97181715
公開日2000年2月23日 申請日期1997年12月12日 優先權日1996年12月13日
發明者D·M·戈爾曼, J·D·馬特森 申請人:先靈公司