專利名稱：從玉米麩粉中回收葉黃素的改良方法
技術領域：
本發明涉及從玉米麩粉中回收葉黃素(又名胡蘿卜醇)的改良法。使用本發明的方法，可明顯改善回收的葉黃素的得率、回收效率和質量。
背景技術：
葉黃素是綠色植物(如玉米、金盞花等)和一些動物制品(最有名的是蛋黃)中存在的氧化了的類胡蘿卜素化合物。葉黃素是黃色色素，可用于動物和人的食物及藥品。天然飼料源中的葉黃素往往被用于家禽(尤其是雞)及其蛋的著色。這些天然飼料源的例子包括黃玉米、玉米麩粉、金盞花粉和海藻粉。這些含葉黃素的材料在加入到雞飼料中后，會賦予烤仔雞以所需的健康的黃顏色或黃色調。
使用天然食物源來提供葉黃素可能導致結果的不一致，這種情況主要表現為烤仔雞的顏色深度有差異。在許多情況下，這些天然飼料源在葉黃素的生物利用率、葉黃素含量和葉黃素穩定性方面會有很大的差異。這些問題往往導致飼料材料的化學分析(即，葉黃素的存在量)與生物性能(即，燒烤食品的顯色)之間的相關性差。
已有從植物性物質(如玉米和金盞花粉)中提取葉黃素的嘗試。例如，蘇聯專利申請No.1,819,619提供了一種從金盞花花瓣中提取類黃酮和類胡蘿卜素的方法。將花瓣碾碎，然后用乙醇在70℃提取7次，每次40分鐘。蒸去乙醇之后，將提取物溶解在蓖麻油中。該物質通常含來自最初的金盞花花瓣的約30重量％的類黃酮(例如，藤菊黃素、patuletrin、六羥黃酮、萬壽菊甙、五羥黃酮)和約15重量％的類胡蘿卜素(例如，葉黃素、rubsanthin、堆心菊腦、胡蘿卜素和堇菜磺質)。該物質被用于醫學用途。目前使用的大多數葉黃素工業產品來自金盞花花瓣，其結果是，相對較貴。
最近，Cook等發明的美國專利No.5,254,673(1993年10月19日)提供了一種對玉米麩粉進行處理以純化玉米蛋白的方法。包括葉黃素在內的色素作為副產物而產生。將濕潤的或略干的玉米麩質進行酶性淀粉水解、堿處理和酒精洗滌，然后用酒精提取或者將去雜味和去色的麩質分離出來。已有報道，色素在酒精洗滌步驟中被回收，該酒精洗滌步驟由以“連續的逆流方式或在各步驟中用淡酒精分批洗滌的方式”進行的洗滌而組成。關于回收的副產物色素的數量和質量則沒有詳細說明。
我們現在已用玉米麩粉(含約12重量％的水分)重復了Cook等的方法。用Cook等所述的方法回收的葉黃素通常像橡膠或面糊一樣粘稠。而用本發明的方法回收的葉黃素則是黃顏色較強的結晶或粉狀物質。而且，用Cook等的方法回收的葉黃素的得率和效率明顯地比用本發明的方法回收的低。用Cook等的方法回收的葉黃素明顯地必須進一步純化(得率會由此降低)以使其能在食品中使用。而用本發明的方法制得的葉黃素不進一步純化也可在食品中使用。
從天然源(如玉米麩粉)中高得率和高效率地回收葉黃素將是人們所希望的。從天然源(如玉米麩粉)中得到呈晶體或粉狀的葉黃素將是理想的。從天然源(如玉米麩粉)中以適合在食品中使用的純度得到葉黃素將同樣是理想的。本發明的方法提供這樣的葉黃素。
發明概要本發明涉及從玉米麩粉中回收葉黃素的改良法。
在一個方面(“方法I”)中，本發明涉及這樣一種從玉米麩粉中回收葉黃素的方法，在該方法中，將較干的玉米麩粉用有機醇進行提取，然后進行皂化反應，將葉黃素酯轉換成葉黃素。使用本發明的此方法，可以比現有技術的方法高的得率、效率和純度從玉米麩粉中回收葉黃素。而且，用本發明的方法回收的葉黃素是結晶、粉狀固體，非常適合用于食品和藥品。
在第二方面(“方法II”)中，本發明涉及這樣一種從玉米麩粉中回收葉黃素的方法，在該方法中，將含小于約30重量％的水分的玉米麩粉用已加入了抗氧化劑的有機溶劑(或有機溶劑的混合液)進行提取，將所得到的存在于提取物中可溶性部分的粗葉黃素收集起來，可將其純化以提高最終的葉黃素產物的純度。與本發明的方法I不同的是，本發明的方法II不使用皂化反應。此外，與本發明的方法I相比，本發明的方法II在用來從玉米麩粉中提取葉黃素以制備粗葉黃素的溶劑(或溶劑混合液)中使用了抗氧化劑，較好的是，方法II中使用的溫度高于方法I中使用的溫度。使用本發明的方法II，也可以比其他從玉米麩粉中回收葉黃素的方法高的得率、效率和純度回收葉黃素。用本發明的方法II回收的葉黃素是桔黃色的或紅色的糊狀物，它可用于食品和藥品。本發明的方法II比方法I更佳，因為其純葉黃素的得率通常更高。
本發明的一個目的是，提供一種從玉米麩粉中回收葉黃素的方法，該方法包括(1)將玉米麩粉干燥至含水量小于約12重量％；(2)將干的玉米麩粉用第一種醇進行提取；(3)收集來自步驟(2)的含粗葉黃素的提取物，得到粗葉黃素；(4)用含堿的第二種醇對粗葉黃素進行處理；(5)從處理過的粗葉黃素中除去第二種醇，回收精制葉黃素；(6)收集精制葉黃素(方法I)。
較好的是，將精制葉黃素用吸附色譜法或離子交換色譜法等技術進一步純化。
本發明的另一個目的是，提供一種從玉米麩粉中回收葉黃素的方法，該方法包括(1)將含水量小于約12重量％的玉米麩粉用第一種醇進行提取；(2)收集來自步驟(1)的含粗葉黃素的提取物，得到粗葉黃素；(3)用含堿的第二種醇對粗葉黃素進行處理；(4)從處理過的粗葉黃素中除去第二種醇，回收精制葉黃素；(5)收集精制葉黃素(方法I)。
較好的是，將精制葉黃素用吸附色譜法或離子交換色譜法等技術進一步純化。
本發明的又一個目的是，提供一種從玉米麩粉中回收葉黃素的方法，該方法包括(1)將含水量小于約12重量％的玉米麩粉用第一種醇進行提取；(2)收集來自步驟(1)的含粗葉黃素的提取物，得到粗葉黃素；(3)用含堿的第二種醇對粗葉黃素進行處理，將所有葉黃素酯轉換成葉黃素；(4)從處理過的粗葉黃素中除去第二種醇，回收精制葉黃素；(5)用色譜法或離子交換技術將精制葉黃素純化；(6)收集純化過的精制葉黃素(方法I)。
本發明的再一個目的是，提供一種從玉米麩粉中回收葉黃素的方法，該方法包括(1)將含水量小于約30重量％的玉米麩粉用含抗氧化劑的有機溶劑或有機溶劑混合液進行提取，所含抗氧化劑的量小于玉米麩粉中的葉黃素總量的約0.5重量％，有機溶劑或有機溶劑混合液與玉米麩粉之比至少約為2∶1；
(2)收集所得提取物，得到葉黃素(方法II)。
較好的是，將所得葉黃素用正相吸附色譜法等技術進行純化。
本發明的還有一個目的是，提供一種從玉米麩粉中回收葉黃素的方法，該方法包括(1)將含水量小于約30重量％的玉米麩粉用含抗氧化劑的有機溶劑或有機溶劑混合液進行提取，所含抗氧化劑的量小于玉米麩粉中的葉黃素總量的約0.5重量％，有機溶劑或有機溶劑混合液與玉米麩粉之比至少約為2∶1；(2)收集所得提取物，得到粗葉黃素；(3)將粗葉黃素進行純化；(4)收集純葉黃素(方法II)。
本發明的再有一個目的是，提供一種從玉米麩粉中回收葉黃素的方法，該方法包括(1)將玉米麩粉試樣干燥至含水量小于約30重量％；(2)往有機溶劑或有機溶劑混合液中加入抗氧化劑，加入的抗氧化劑的量小于玉米麩粉試樣中的葉黃素總量的約0.5重量％；(3)將玉米麩粉試樣用有機溶劑或有機溶劑混合液進行提取，提取方法為，將至少約2份的有機溶劑或有機溶劑混合液與1份玉米麩粉在約10℃至80℃混合約10分鐘至90分鐘；(4)收集所得提取物，得到粗葉黃素；(5)對粗葉黃素進行純化；(6)收集純葉黃素(方法II)。
通過下面的本發明的附圖和較佳實施方式的說明，本發明的這些和其他目的和優點將會變得明白。
圖面的簡單說明
圖1是本發明的方法I的較佳實施方式的方塊圖。
圖2是本發明方法I的從玉米麩粉中提取葉黃素的效率與提取所用的乙醇中的含水量的函數關系圖；圖3是本發明方法I的從玉米麩粉中提取葉黃素的效率與提取溫度的函數關系圖；圖4是本發明方法I的從玉米麩粉中提取葉黃素的效率與在25℃的提取時間的函數關系圖5和5A是本發明的方法II的二個較佳實施方式的方塊圖。
較佳實施方式的描述本發明通過從玉米麩粉中回收葉黃素的改良法。
本發明的方法I提供這樣一種從玉米麩粉中回收葉黃素的方法，在該方法中，將較干的玉米麩粉用有機醇進行提取，然后進行皂化反應，將葉黃素酯轉換成葉黃素。本發明的方法II提供這樣一種從玉米麩粉中回收葉黃素的方法，在該方法中，將較干的玉米麩粉用含抗氧化劑的有機溶劑進行提取，也可任選地將所得葉黃素產物純化以得到純的葉黃素產物。當使用正相吸附色譜法作為任選的純化步驟中的純化方法時，應將收集提取物而得到的“粗的葉黃素”產物中的蛋白質除去，使其轉換成“精制葉黃素”產物。然后，可將所得“精制葉黃素”產物純化，得到純的葉黃素產物。
使用本發明的方法I和方法II，可以比現有技術的方法高的得率、效率和純度從玉米麩粉中回收葉黃素。而且，用本發明的方法I回收的葉黃素是結晶、粉狀固體形式的，用本發明的方法II回收的葉黃素是桔黃色的或紅色的糊狀形式的，它們均非常適合用于食品和藥品。
實踐中，用于本發明的方法I和方法II的含葉黃素的來源物是玉米麩粉。玉米麩粉是工業玉米濕磨法的初級副產物。本發明的方法I和方法II中所用的玉米麩粉應較干。“較干”一詞是指在本發明的方法I中，玉米麩粉的含水量小于約12重量％，更好的是小于約10重量％，在本發明的方法II中，玉米麩粉的含水量小于約30重量％，較好的是小于約20重量％，更好的是小于12重量％。若在本發明的方法I和方法II中使用濕的玉米麩粉(即，在本發明的方法I中，玉米麩粉的含水量超過約12重量％，在本發明的方法II中，玉米麩粉的含水量超過約30重量％，或往玉米麩粉中加入顯著量的水)，則用這二個方法提取葉黃素的效率會明顯下降。而且，所得到的葉黃素會像橡膠一樣粘稠。可用本領域技術人員已知的常用方法將玉米麩粉干燥至所需的含水量。通常，干燥過的玉米麩粉每磅含約100-200mg葉黃素。
本發明的方法I和方法II中所用的試劑和設備均可從市場上購得。這些試劑和設備的供應商包括Aldrich Chemical公司(密執安州Milwaukee市)、FisherScientific公司(賓夕法尼亞州Pittsburgh市)、Glitsh公司(得克薩斯州Houston市)、Grown Iron Works公司(明尼蘇達州Minneapolis市)、Ace Glass公司(新澤西州Vineland市)、Millipore公司(麻薩諸塞州Bedford市)和PCI MembraneSystems公司(英國Hampshire郡Whitchurch市)。方法I在本發明方法I的第一個主要步驟中，將較干的玉米麩粉用葉黃素可微溶于其中的醇進行提取。合適的醇包括甲醇、乙醇、異丙醇和丁醇。較好的是，在溶劑提取法中使用乙醇(工業用或無水)和/或甲醇。較好的是，所用醇的含水量小于約20重量％，更好的是小于約10重量％；當乙醇溶劑的含水量超過約20重量％時，提取效率會下降(參見圖2)。通常，玉米麩粉與提取用醇溶劑之比約為1∶2。通常，所用溶劑的量必須足以形成料漿。通常，提取在環境溫度(即，約20-30℃)用常用的溶劑提取技術進行。應避免使溫度超過約40℃，否則，提取效率會急劇下降(參見圖3)。特別優選的提取技術包括連續提取法、逆流提取法、并流提取法、離心提取法等。先將含葉黃素的提取物(或合并的提取物)過濾以除去不溶物質，較好的是，接著除去溶劑。可使用常用的除溶劑的技術如蒸餾法、真空蒸餾法、噴霧法、旋轉蒸發法等。除溶劑(若進行的話)不必完全，因為在皂化步驟中也使用溶劑。實際上，在皂化步驟之前除去溶劑不是必需的(雖然是較佳的)。在方法I該階段的葉黃素提取物通常每磅含約800-1200mg葉黃素。這表明，與初始的玉米麩粉相比，濃縮系數約為7-8。
在本發明的方法I的第二個主要步驟中，將葉黃素提取物與醇堿在皂化反應中反應，以將葉黃素酯轉換成游離的葉黃素，從而提高葉黃素的回收率和回收效率。這步轉化是常規的皂化反應。雖然可使用各種醇堿，但通常優選乙醇堿。通常，在整個過程中最好使用與第一提取步驟中所用的相同的醇。合適的堿包括氫氧化堿金屬，如氫氧化鋰、氫氧化鈉和氫氧化鉀。氫氧化鉀乙醇溶液是最優選的皂化反應物。皂化最好通過將葉黃素提取物在醇堿中回流約1-2小時來進行。用另外的醇(較好的是乙醇)洗滌、過濾和除溶劑之后，回收精制葉黃素。
由本發明的方法I得到的精制葉黃素是金黃色的晶體粉末。通常每磅提取的粉末含約1600-2400mg葉黃素。這表明，與初始的玉米麩粉相比，濃縮系數約為10-15。精制葉黃素可用于各種食物原料、動物飼料和藥品，或者，可以且較好的是，將它們進一步純化。可使用常用的純化技術。特別優選的純化技術包括吸附色譜法和離子交換色譜法。使用溶劑混合液(較好的是己烷、丙酮、甲苯和乙醇)，可將葉黃素吸附在硅膠和/或硅藻土柱上。可將通過色譜柱的物質添加到合適的用作動物飼料的麩粉中去，也可將其舍棄；但最好將溶劑回收并重復利用。用另一種溶劑混合液(較好的是己烷、丙酮和甲醇)將純葉黃素從色譜柱上洗脫下來。合適的色譜吸附體包括硅膠、氧化鎂、氧化鋁、硅藻土等。或者，可用醇類溶劑將葉黃素吸附在離子交換柱上，然后用含乙酸的醇類溶劑進行洗脫。用常用技術(如蒸餾、真空蒸餾、旋轉蒸發等)除去溶劑之后，黃色晶體粉末通常每磅有望含約10,000-20,000mg葉黃素。這表明，與初始的玉米麩粉相比，濃縮系數約為50-150。可將該純化過的葉黃素作為著色劑或添加劑用于各種食品(如人造奶油)、動物飼料(如家禽飼料)和藥品。
現在看圖1，圖1所示的是實施本發明方法I的一個較佳方法。在提取單元14中用乙醇12提取玉米麩粉10，然后在單元16中進行過濾。玉米麩粉10必須較干(即，含水量小于約12重量％，較好的是小于約10重量％)。較好的是，提取14在或接近環境溫度(即，約25-35℃)的條件下進行。提取14和過濾16之后，收集含葉黃素的濾液24并合并。可收集來自過濾單元16的固體并在單元18中干燥，得到麩粉20。可將麩粉20用于動物飼料等。視需要，可將來自干燥單元18的乙醇循環至提取單元14或皂化單元32。
然后在單元26中除去合并的濾液24中的乙醇28。除溶劑26可用常用的手段(如蒸餾法、真空蒸餾法、旋轉蒸發法、降膜蒸發法等)進行。視需要，可將除去的乙醇28循環至提取單元14或皂化單元32中。除去乙醇之后，得到粗葉黃素30。然后在皂化單元32中用醇堿34(較好的是KOH乙醇溶液)處理粗葉黃素30。皂化32將可能存在于粗葉黃素28中的葉黃素酯轉換成游離的葉黃素，從而可提高葉黃素的總回收率和回收效率。用乙醇洗滌和過濾36之后，回收精制葉黃素38。視需要，可將從洗滌和過濾步驟36中除去的乙醇40循環至提取單元14或皂化單元32。
精制葉黃素38可以此形式使用，也可進一步純化。通常，最好將精制葉黃素38進一步純化。因此，通常最好用例如含乙醇的溶劑將精制葉黃素38在色譜或陽離子交換柱42中進一步純化。葉黃素吸附在柱材料上，然后用第二溶劑洗脫。接著，除去洗脫下來的葉黃素中的溶劑，得到純的葉黃素46。可將其他通過色譜柱而未被吸附的物質48(例如蛋白質、淀粉和脂肪酸)添加到用作動物飼料的麩粉30中去，或者可舍棄。純的葉黃素產物46是金黃色的晶體粉末，可方便地摻入食品(尤其是禽類飼料產品)中。
下面給出本發明的方法I的實施例以舉例說明，但這些實施例不是對本發明的方法I的限定。在這些實施例中，葉黃素含量是用法定方法970.64(Associationof Official Analytical Chemists1990年第15版)測得的。實施例1本實施例舉例說明圖1所示的本發明的實施。將干燥過的玉米麩粉(100g，含水量小于12重量％)與變性乙醇(200g，含0.4重量％的水)在燒瓶中混合。溶劑/麩粉之比約為2∶1。玉米麩粉每磅含約160mg葉黃素。劇烈攪拌料漿混合物使其在約35℃保持懸浮狀態約30分鐘。然后將該混合物過濾，收集濾液。收集到約95g干麩粉，它可用作動物飼料。用旋轉蒸發器將濾液中的乙醇除去之后，作為提取物，收集到5g固體物質。該含葉黃素的固體物質(即，粗葉黃素)每磅含約1150mg葉黃素。這相當于從每磅初始的玉米麩粉中回收到約58mg葉黃素，回收率約為36％。
然后將粗葉黃素(5g)與約5gKOH乙醇溶液(約40gKOH在約100ml乙醇中)回流約1小時。接著用乙醇(50ml)洗滌反應混合物并過濾。用旋轉蒸發器除去濾液中的乙醇，得到約4g固體物質(即，精制葉黃素)，該固體提取物每磅約含2100mg葉黃素。這相當于從每磅初始的玉米麩粉中回收到約76mg葉黃素，回收率約為47％。
該精制葉黃素產物是金黃色的晶體粉末。它可方便地摻入到食品原料和動物飼料中。實施例2基本上重復實施例1的方法，所不同的是，對第一次提取中所用的乙醇中的含水量進行了變化；玉米麩粉起始物質的量約為100g。得到以下結果
該數據圖示在圖2中。如圖2所示，當含水量超過約20重量％時，提取效率下降。較好的是，應將溶劑的含水量保持在小于約10重量％。實施例3重復實施例1的方法，所不同的是，將干燥過的玉米麩粉的溫度在約20℃至50℃之間變化。結果見圖3。如圖3所示，當溫度在40℃以上時，提取效率明顯下降。較好的是，應將提取溫度保持在約20℃至30℃之間以得到最大的提取效率。實施例4重復實施例1的方法，所不同的是，將干燥過的玉米麩粉的提取時間在約0.25-3小時之間變化。結果見圖4。如圖4所示，當提取時間為30分鐘時，提取效率達到最大，而當提取時間超過約2小時，則提取效率呈下降趨勢。因此，雖然所用的提取時間可較長(即，在約2小時以上)但它們通常不能顯著提高總收率或效率。實施例5本實施例僅用于比較的目的，所舉例說明的是Cook等在美國專利No.5,254,673中所述的從玉米麩粉中回收葉黃素的方法。以Cook等的實施例1作為引導。用去離子水(510ml)和玉米麩粉(120g，與實施例1中所用的相同)制備料漿。將該料漿加熱至80℃并用3N氫氧化鈉將pH調節至約6.4。攪拌下往料漿中加入α-淀粉酶(0.5ml)。繼續消化1小時，將料漿冷卻至50℃。以1200×g將料漿離心10分鐘，除去上清液。將固體懸浮在等份的80℃水中，再以1200×g進行離心。用1M碳酸鈉和1M碳酸氫鈉將pH調節至9，在20℃對除去淀粉的固體進行處理。將所得的料漿在80℃加熱1小時，然后冷卻至50℃。以1200×g將料漿離心20分鐘，除去上清液。將固體懸浮在等份的水中，用3N鹽酸中和。再用等份的水以1200×g將固體離心二次。然后將該固體用2份量的乙醇(4重量％水)在室溫提取30分鐘并過濾。通過旋轉蒸發除去溶劑。回收的固體是黃色的糊狀或橡膠狀物質，每磅約含141mg葉黃素。由此，提取物中葉黃素的濃度與初始的玉米麩粉中的濃度基本相同(即，每磅玉米麩粉160mg葉黃素)；換言之，Cook等的麩粉并未產生使提取物中的葉黃素濃縮的效果。葉黃素的總回收率約為22％。對本實施例進行了重復，得到了基本相同的結果。由于提取物較粘稠和色素含量較低，因此，該含葉黃素的提取物不能方便地用于包括禽類飼料在內的食物組合物。方法II本發明的方法II使用以含抗氧化劑的有機溶劑(或有機溶劑的混合液)提取含水量小于約30重量％(較好的是小于約20重量％，更好的是小于約12重量％，最好小于10重量％)的玉米麩粉的一般步驟，得到“粗葉黃素”，然后，較好的是，將“粗葉黃素”純化，得到純的葉黃素。
當純化由提取物得到的“粗葉黃素”時和當所用的純化方法是正相吸附色譜法(它是優選的純化方法)時，應在該純化步驟之前進行從含“粗葉黃素”的提取物中除去蛋白質的附加步驟。該除去蛋白質的步驟可采用沉淀法、膜濾法或本領域技術人員已知的其他同類方法。然后可將“精制葉黃素”純化，并將純的葉黃素產物收集起來，所采用的收集方法可以與此處就使用其他純化法的方法II而所述的方式相同。該除去蛋白質的步驟應僅在采用正相吸附色譜法來純化提取物中所含的“粗葉黃素”時進行，而無需在用其他純化法來純化提取物中所含的“粗葉黃素”時進行。(1)提取制得玉米麩粉試樣，若玉米麩粉的含水量大于約30重量％，較好的是，以與前面就本發明的方法I所述的相同的方式將其干燥至小于20重量％，更好的是小于約12重量％，最好小于約10重量％。
然后往有機溶劑或有機溶劑的混合液中加入抗氧化劑，其添加量小于被提取的玉米麩粉中的總葉黃素的約0.5重量％，較好的是小于約0.1重量％。被提取的玉米麩粉中的總葉黃素可用前面所述的法定方法970.64或下述的改良方法測得。
抗氧化劑可減少葉黃素的氧化性降解并可使提取在較高的溫度(通常在約10-80℃之間，較好的是在約50-70℃之間，最好是約50℃)進行。添加抗氧化劑和提高提取溫度已被證明能將最終提取物中的葉黃素得率提高至86％。
較好的是，使用飼料級或食品級抗氧化劑，如乙氧喹(6-乙氧基-1，2-二氫-2，2，4-三甲基喹啉)、棓酸丙酯、丁基化羥基茴香醚、丁基化羥基甲苯、叔丁基對苯二酚、生育酚等。
與本發明的方法I相同，合適的溶劑包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和辛醇。優選乙醇或乙醇-己烷混合液。此外，與本發明的方法I相同，較好的是，溶劑(和本發明方法II中使用的所有其他試劑)的含水量小于約20重量％，更好的是小于約10重量％，因為當溶劑的含水量超過約20重量％時，提取效率會下降。通常，溶劑的量必須足以形成料漿。
然后，用含抗氧化劑的有機溶劑(或有機溶劑混合液)以溶劑與玉米麩粉之重量比至少約為2∶1(2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1等)提取干燥過的玉米麩粉，通常所采用的方法是，例如在劇烈攪拌下將玉米麩粉與含抗氧化劑的溶劑在10-80℃之間混合約10-90分鐘。通常，有機溶劑的量應足以形成料漿，因此，有機溶劑與玉米麩粉之比應不低于約2∶1。玉米麩粉可用逆流提取法、并流提取法、連續提取法、離心提取法和本領域技術人員已知的其他方法提取。在本發明的方法II中，最優選的提取方法是逆流提取法。
與本發明的方法中I應避免溫度超過約40℃不同的是，在本發明的方法II的提取步驟中，所用的溫度最好在約49℃以上。
在本發明方法II的該階段(未進行純化)的葉黃素提取物每磅通常含約500-2,000mg葉黃素。這表明，與初始的玉米麩粉相比，濃縮系數約為5-20。
如下面的實施例1所示，以3∶1的溶劑與玉米麩粉之比使用工業用乙醇在50℃進行提取，所得到的干燥過的提取物每磅含799mg葉黃素(未純化)。
如下面的實施例2所示，用20∶80的己烷/乙醇混合液得到的干燥過的提取物每磅含1140mg葉黃素(未純化)。
如下面的實施例4所示，用40∶60的己烷/乙醇混合液得到的純化和干燥過的提取物每磅含1410mg葉黃素(未純化)。
提取可用一個步驟進行，或者，可與下面的實施例5同樣，所采用的提取方法是，通過一系列單獨的、含抗氧化劑的有機溶劑(或有機溶劑混合液)被分成2份、3份、4份或多份的提取進行。在后一種情況下，玉米麩粉可用那些份溶劑中的每一份分別提取，其方式就如同僅一個這樣的提取在進行一樣。在這些單獨的提取均分別進行之后，合并含葉黃素的提取物。較好的提取方法是，通過一系列單獨的提取進行，因為該方法與逆流提取相似，能得到較高的粗葉黃素的得率。
混合完畢之后，收集含葉黃素的提取物(或由用分成多份的含抗氧化劑的溶劑或溶劑混合液進行的一系列單獨的提取得到的提取物的合并物)，所用的方法例如是，將提取物過濾，從提取物中除去不溶性物質，得到“粗葉黃素”。或者，可用離心法、水力旋流法或本領域技術人員已知的其他類似方法進行。所得到的提取物含“粗葉黃素”，它可以此形式用于各種食物原料、動物飼料和藥品，也可并較好的是將其純化。
如實施例6所示，可用例如旋轉蒸發的方法將提取物干燥，然后，在純化之前，將干燥過的提取物用相同的或不同的有機溶劑(或有機溶劑混合液)再提取一或多次。(2)純化(a)除去蛋白質從含“粗葉黃素”的提取物中除去蛋白質的操作應僅在使用正相吸附色譜法作為純化由提取得到的“粗葉黃素”產物的方法時進行。這是純化由提取得到的葉黃素產物的優選方法。可使用的其他純化方法〔如分配(反相)吸附色譜法、離子交換色譜法、體積排除色譜法和逆流色譜法〕則不需要此步驟。
蛋白質占含“粗葉黃素”玉米麩粉提取物的主要部分。在用正相色譜法進行純化之前，用本領域技術人員已知的采用技術(如蒸餾法、真空蒸餾法、噴霧法、旋轉蒸發法等)除去有機溶劑，將提取物溶解在非極性溶劑(如己烷)中。由于蛋白質不溶于己烷，它可能阻塞色譜柱，從而干擾葉黃素純化。
可使用包括沉淀法和膜濾法在內的多種除蛋白質的方法。
沉淀蛋白質的方法可以是，往提取物中加入硫酸銨等試劑，把蛋白質從溶液中逼出。例如，加入蛋白質不溶于其中的溶劑(如丙酮、乙酸乙酯等)可將蛋白質逼出使其沉淀。將提取物濃縮(即，在將蛋白質沉淀之前除去部分有機溶劑)不是必需的，但可以做。然后通過例如過濾或本領域技術人員已知的其他方法(如離心法或水力旋流法)將形成的主要由蛋白質組成的沉淀物除去。所得的可溶性部分的提取物含“精制葉黃素”。可使用本領域技術人員已知的常用技術(如蒸餾法、真空蒸餾法、噴霧法、旋轉蒸發法等)將濾液干燥。然而，在純化步驟之前將濾液干燥不是必需的。
也可用膜將蛋白質與提取物中的其他成分分離。用凝膠電泳測得的該蛋白質的分子量范圍在20,000-25,000道爾頓之間。可用來將葉黃素(分子量為568.85)等分子量較低的成分與蛋白質等分子量較大的成分分離的膜市場上有售。Millepore公司和PCI Membrane Systems公司等廠家生產分子量截止值為20,000以下的膜。在這樣的系統中，用泵將有機溶劑送過膜系統，蛋白質仍留在濃縮液中，而葉黃素及甘油三酯和脂肪酸則將進入滲透液中。然后用慣用的汽提法將有機溶劑從滲透液中除去，用正相吸附色譜法對滲透液進行分離。(b)純化然后，可將前述提取物中所含的“粗葉黃素”(當使用正相吸附色譜法以外的純化方法純化“粗葉黃素”產物時)或前述除去蛋白質步驟之后得到的“精制葉黃素”產物(當使用正相吸附色譜法純化提取物中所含的“粗葉黃素”產物時)純化。
“精制葉黃素”可用正相吸附色譜法純化，而“粗葉黃素”可用分配(反相)吸附色譜法、離子交換色譜法、體積排除色譜法、逆流色譜法等本領域技術人員已知的方法極性純化。
正相吸附色譜法在下列文獻中有描述K.Robards等，Principles and Practiceof Mordern Chromatographic Methods，Academic Press出版(1995)；R.P.W.Scott，Techniques and Practices of Chromatography，Marcel Dekker出版，New York(1995)；L.R.Snyder等，Introduction to Mordern LiquidChromatography(第2版)，John Wiley and Sons公司出版，New York(1979)；和K.K.Unger，Packing and Stationary Phases in Chromatographic Techniques，Marcel Dekker公司出版，New York(1990)。
分配(反相)色譜法在下列文獻中有描述El Rassi等，“Reversed Phase andHydrophobic Interaction Chromatography of Peptides and Proteins”，在SeparationProcesses in Biotechnology中，Marcel Dekker公司出版(1990)；和K.K.Unger，Packing and Stationary Phases in Chromatographic Techniques，Marcel Dekker公司出版，New York(1990)。
離子交換色譜法在下列文獻中有描述Charles D.Shuey，“Ion ExchangeProcesses”，在Separation Processes in Biotechnology中，Marcel Dekker公司出版(1990)；H.Small，Ion Chromatography，Plenum Press出版(1989)；K.K.Unger，Packing and Siationary Phases in Chromatographic Techniques，Marcel Dekker公司出版，New York(1990)；和Phillip C.Wankat，“Large Scale Chromatography”，在Handbook of Separation Process Technology，John Wiley and Sons公司出版，NwYork(1987)。
體積排除色譜法在K.K.Unger，Packing and Stationary Phases inChromatographic Techniques，Marcel Dekker公司出版，New York(1990)中有描述。
逆流色譜法在Walter D.Conway等，Modern Countercurrent Chromatography，American Chemical Society出版，Wshington，D.C.(1995)中有描述。
上述關于色譜法的文獻的全部內容均在此處引作參考。
對于作為優選的純化方法的正相吸附色譜法而言，可使用的合適吸附劑(固定相)包括硅膠、氧化鎂、氧化鋁、纖維素、蔗糖、淀粉、氧化鈣、磷酸鈣、碳酸鈣、碳酸鉀、碳酸鈉等，也可使用這些吸附劑的混合物，如硅膠與氧化鋁的混合物即是一個較佳的吸附劑。
已成功地以低至2∶1和高至100∶1的吸附劑對“精制葉黃素”之干重比對“精制葉黃素”進行了純化。因此，這樣的吸附劑對“精制葉黃素”之干重比可在約2∶1至100∶1之間。較好的是，吸附劑對“精制葉黃素”之干重比為2∶1。
將“精制葉黃素”吸附在固定相上。視需要，可在吸附至柱床之前將它們加溶在小量的洗脫溶劑(移動相)中。然后用有機溶劑或二種或多種有機溶劑的混合液對色譜柱進行洗脫，以將純化過的葉黃素產物從柱上洗脫下來。
可以用等溶劑(即，在整個洗脫過程中，使用同一溶劑或溶劑混合液)洗脫色譜柱，也可以使用梯度洗脫液或階式梯度洗脫液(即，溶劑或溶劑混合液組分在洗脫過程中變化)。
在使用等溶劑系統時，用有機溶劑或有機溶劑混合液洗脫色譜柱。根據使用的溶劑，非極性溶劑或溶劑混合液(如己烷、環己烷、庚烷、石油醚等)可占溶劑或溶劑混合液的100％至50％。但可以用0-50％的極性較大的溶劑或溶劑混合液(如乙酸乙酯、丙酮、異丙醇、乙醇、甲醇、丁醇等)進行調整。可能需要5-200柱體積的移動相來洗脫色譜柱，合適的量可由本領域技術人員確定。
收集從色譜柱洗脫下來的流分。可將含甘油三酯和脂肪酸的流分加回到提取過的玉米麩粉中去。并可將葉黃素酯流分與游離葉黃素流分合并，或者皂化，然后與游離葉黃素流分合并。游離葉黃素流分可用作家禽飼料增補劑，或者可進一步純化。若收集蛋白質流分，則也可將其加回到提取過的玉米麩粉中去。
或者，可用梯度或階式梯度溶劑系統洗脫色譜柱。在“精制葉黃素”吸附在固定相之后，用有機溶劑或有機溶劑混合液洗脫色譜柱。移動相的組分會隨著時間而連續地或階式地變化，使移動相極性增大。例如，初始的移動相會是100％至50％的非極性溶劑或溶劑混合液(包括己烷、環己烷、庚烷、石油醚等溶劑)。然后用0-50％的極性較大的溶劑或溶劑混合液(包括乙酸乙酯、丙酮、異丙醇、乙醇、甲醇、丁醇等)進行調整。然后用本領域技術人員已知的方式以一給定的速率或以階式增加極性較大的溶劑或溶劑混合液的百分比。可將一種或多種極性較大的溶劑或溶劑混合液的百分比增加到占移動相的0％或100％，或者其間的任何數值。可能需要5-200倍的移動相來洗脫色譜柱，合適的量可由本領域技術人員確定。
例如，可用體積比為97/3的己烷/丙酮將“精制葉黃素”混合物吸附在硅膠柱上。用該溶劑混合液將甘油三酯、胡蘿卜素和葉黃素酯從色譜柱上洗脫下來，但游離的“精制葉黃素”仍吸附在色譜柱上。可用極性較大的溶劑混合液(如己烷/丙酮體積比在94/6至0/100之間的溶劑混合液)將純化過的葉黃素從色譜柱上洗脫下來。
然后可用前述的和/或本領域技術人員已知的任一種方法將純的游離葉黃素流分干燥，接著用前述法定方法970.64或下面所述的該方法的改進法算出干燥的流分中的純的葉黃素的濃度。
不管使用的是何種純化方法，可用色譜法作進一步的純化，以提高最終的純的葉黃素產物的純度。該附加的色譜法所使用的色譜柱可包括如前面所述的正相吸附劑，反相吸附劑，如鍵合吸附劑十八烷基硅烷(C18)、辛基硅烷(C8)、丁基硅烷(C4)、氰基丙基硅烷(CN)、氨基丙基硅烷(NH2)等。可與反相吸附劑一起使用的溶劑包括水、甲醇、乙腈、丙酮、乙醇、異丙醇、乙酸乙酯、己烷等。也可其他色譜法(如離子交換色譜法、體積排除色譜法、分配色譜法和逆流色譜法)以提高葉黃素產物的純度。
由本發明的方法II得到的純的葉黃素產物是桔黃色或紅色糊狀物。通常每磅純的產物有望含約5,000-60,000mg葉黃素。這表明，與初始的玉米麩粉中的葉黃素濃度(每磅麩粉約100-200mg葉黃素)相比，濃縮系數高達約600。可以前面就本發明的方法I所述的方式使用該純的葉黃素產物。
現在看圖5，圖5是本發明的方法II的一個較佳實施方式的方塊圖。
在提取單元214中，用含相當于玉米麩粉中的葉黃素總量的約0.1重量％的抗氧化劑乙氧喹的乙醇212提取玉米麩粉210。然后收集所得提取物，在濾器單元216中，從該提取物中濾去不溶物215，得到濾液224。玉米麩粉210應較干(即，含水量小于約30重量％，較好的是，小于約20重量％，更好的是，小于約12重量％，最好小于約10重量％)。較好的是，提取214在約50℃進行。
濾液224中的粗葉黃素可直接使用，或者可進一步純化。通常，宜將粗葉黃素進一步純化246。通常宜用例如含乙醇的溶劑將粗葉黃素在色譜柱中進一步純化，以得到純的葉黃素250。可使葉黃素吸附到吸附劑上，然后用第二溶劑進行洗脫，得到純的葉黃素250。可將其他通過色譜柱而未被吸附的物質248(如蛋白質、淀粉和脂肪酸)添加到用作動物飼料的麩粉中去，也可將其舍棄。純的葉黃素產物250是桔黃色或紅色的糊狀物，可方便地摻入食物產品(尤其是家禽飼料產品)中。例如，可將其溶解在固體或液體載體(如水)中，噴霧干燥成產品并用本領域技術人員已知的方法進行混合。
現在看圖5A，圖5A是是本發明的方法II的另一個較佳實施方式的方塊圖。
在提取單元114中，用含相當于玉米麩粉中的葉黃素總量的約0.1重量％的抗氧化劑乙氧喹的乙醇112提取玉米麩粉110。然后收集所得提取物，在濾器單元116中，從該提取物中濾去不溶物115。如前面就圖5所述，玉米麩粉110應較干。較好的是，提取114在約50℃進行。
在上述提取和過濾之后，較好的是，接著，在單元126中將濾液124中的乙醇128除去。除溶劑可以前面就本發明方法I所述的方式進行。除去乙醇128之后，得到含“粗葉黃素”的提取物130。
粗葉黃素可直接使用，或者可進一步純化。通常，宜將粗葉黃素130進一步純化。因此，通常宜用例如含乙醇的溶劑將粗葉黃素在色譜柱中進一步純化。可使葉黃素吸附到吸附劑上，然后用第二溶劑進行洗脫。然后除去洗脫下來的葉黃素中的溶劑，得到純的葉黃素。可將其他通過色譜柱而未被吸附的物質(如蛋白質、淀粉和脂肪酸)添加到用作動物飼料的麩粉中去，也可將其舍棄。
接著，較好的是，在減容單元132中用旋轉蒸發器或其他類似的裝置將含“粗葉黃素”的提取物減少至總固體濃度在約10-40重量％之間。
然后，宜以溶劑/提取物為1/1的重量比將第二有機溶劑(它最好是乙酸乙酯134)加入到含“粗葉黃素”的提取物中。較好的是，在劇烈攪拌下，將提取物在25℃與溶劑混合30秒鐘。
然后在濾器單元136中除去在上面的步驟中形成的主要由蛋白質組成的沉淀物140。殘留的提取物的可溶性部分含“精制葉黃素”138。
然后，宜在旋轉蒸發單元142中從含精制葉黃素138的提取物的可溶性部分中除去溶劑乙酸乙酯144。
用1/1的硅膠/氧化鎂作為吸附劑，用己烷作為有機溶劑，使精制葉黃素138吸附在色譜柱上，以乙醇作為第二溶劑，將純的精制葉黃素150從色譜柱上洗脫下來，由此通過正相吸附色譜法將精制葉黃素138進一步純化。可將其他通過色譜柱而未被吸附的物質148(如蛋白質、淀粉、脂肪酸和甘油三酯)添加到動物飼料中，也可將其舍棄。純的精制葉黃素產物150是桔黃色或紅色的糊狀物，可以前面就圖5所述的方式方便地摻入食物產品(尤其是家禽飼料產品)中。
給出下面的實施例是為了舉例說明而不是限定本發明的方法II。與前面就本發明的方法I給出的實施例一樣，在本發明方法II的實施例中所述的不同步驟中的葉黃素含量均是用前述法定方法970.64測得的。然而，在本發明的方法II的實施例中，用VWR變性酒精(Fisher Scientific公司產品目錄第VW0475-3號)代替提取劑中的無水乙醇。該配方(下面將描述)系通過比較研究進行確定，以提供同等的結果。
配方SDI酒精100體積甲基·異丁基酮 1體積乙酸乙酯 1體積烴類溶劑 1體積此外，用97/3的己烷/丙酮代替96/4的己烷/丙酮作為胡蘿卜素的洗脫液，因為發現97/3的己烷/丙酮可使最前面的葉黃素條帶(單羥基色素)更好的分離。最后，在讀取所產生的葉黃素溶液的等分試樣的吸收度之前，將該等分試樣進行離心。業已發現，凈化溶液可提高分析的精度。實施例1攪拌下，在50℃用300g含抗氧化劑乙氧喹的乙醇提取含小于12重量％的水和含170mg葉黃素的玉米麩粉(100g)30分鐘。通過真空過濾回收玉米麩粉，然后用相同方式再提取2次。所用乙氧喹的總量相當于用前述法定方法970.64測得的玉米麩粉中的葉黃素量的0.1％。將三份提取物合并，通過旋轉蒸發進行干燥。用前述法定方法970.64測得的干提取物中的葉黃素濃度為799mg/磅(未進一步純化)，與初始(起始)的玉米麩粉中的葉黃素的量相比，濃度提高了約5倍。實施例2攪拌下，在60℃用200g含抗氧化劑乙氧喹的20/80的己烷/乙醇提取含小于12重量％的水和含170mg葉黃素的玉米麩粉(100g)30分鐘。通過真空過濾回收玉米麩粉，然后用相同方式再提取2次。所用乙氧喹的總量相當于用前述法定方法970.64測得的玉米麩粉中的葉黃素量的0.1％。將三份提取物合并，通過旋轉蒸發進行干燥。用前述法定方法970.64測得的干提取物中的葉黃素濃度為1140mg/磅(未進一步純化)，與初始(起始)的玉米麩粉中的葉黃素的量相比，濃度提高了約7倍。實施例3攪拌下，在60℃用300g含抗氧化劑乙氧喹的乙醇提取含20重量％的水和含170mg葉黃素的玉米麩粉(100g)30分鐘。通過真空過濾回收玉米麩粉，然后用相同方式再提取2次。所用乙氧喹的總量相當于用前述法定方法970.64測得的玉米麩粉中的葉黃素量的0.1％。將三份提取物合并，通過旋轉蒸發進行干燥。用前述法定方法970.64測得的干提取物中的葉黃素濃度為549mg/磅(未進一步純化)，與初始(起始)的玉米麩粉中的葉黃素的量相比，濃度提高了約3倍。實施例4攪拌下，在60℃用200g含抗氧化劑乙氧喹的40/60的己烷/乙醇提取含小于12重量％的水和含170mg葉黃素的玉米麩粉(100g)30分鐘。通過真空過濾回收玉米麩粉，然后用相同方式再提取2次。所用乙氧喹的總量相當于用前述法定方法970.64測得的玉米麩粉中的葉黃素量的0.1％。將三份提取物合并，通過旋轉蒸發進行干燥。用前述法定方法970.64測得的干提取物中的葉黃素濃度為1410mg/磅(未進一步純化)，與初始(起始)的玉米麩粉中的葉黃素的量相比，濃度提高了約8倍。實施例5提取將100g干玉米麩粉(含小于12重量％水的玉米麩粉)稱取到提取容器中去。
然后用前述法定方法970.64算出干玉米麩粉(以g計)中的葉黃素總量。由于玉米麩粉的葉黃素濃度為每磅170mg，因此，100g玉米麩粉含37.4mg葉黃素。加入到所用溶劑(乙醇)中的抗氧化劑乙氧喹的量為37.4mg的0.1％，即37.4μg。
在溶劑/玉米麩粉為3/1的分批提取中，將抗氧化劑在3份300g 96％乙醇(0.4重量％水)中進行分配。
將第一份300g乙醇傾入到內有干玉米麩粉的提取容器中，劇烈攪拌下在50℃提取30分鐘。通過真空過濾回收提取物。
將玉米麩粉返回到提取容器中。將第二份乙醇傾倒在玉米麩粉上面，在50℃進行第二次類似的30分鐘提取。通過真空過濾將提取物再一次回收。
將玉米麩粉返回到提取容器中去，以類似的方式用第三和最后一份乙醇進行提取。提取在攪拌下于50℃進行30分鐘。通過真空過濾回收最后的提取物。
將上述三份提取物合并。合并后的提取物重713.4g，含16.81g總固體(固含量為2.36重量％)。(將10.0g合并的提取物試樣通過旋轉蒸發進行干燥，測得重0.236g。根據該值，測得合并的提取物中的總固體)。用前述法定方法970.64測得所得干重“粗葉黃素”濃度為每磅提取物含799mg(純化之前)。除蛋白質通過旋轉蒸發除去部分乙醇，這樣，提取物的重量從713.74g減至156.23g。此時，濃縮物的固含量為10.8重量％。
以溶劑與濃縮物之重量比為2/1的比率往濃縮物中加入含0.004％水的乙酸乙酯，即，將312.5g的乙酸乙酯加入到濃縮物中。于是，有主要由蛋白質組成的淡黃色沉淀物形成。接著，通過真空過濾除去沉淀物。
通過旋轉蒸發從濾液中除去溶劑。用前述法定方法970.64測得干燥后的濾出物每磅所含“精制葉黃素”的濃度為2150mg。正相吸附色譜法在小的玻璃色譜柱(30mm內徑×60mm)中裝入12g 1∶1的硅膠60(Devisil633級60A型)∶氧化鎂(Fisher Scientific公司生產的hyflo super cel)。
將精制葉黃素(即，干燥后的濾出物)溶解在175g己烷(不含水)中，然后吸附在色譜柱上。
用79g己烷/丙酮(97∶3v/v，含0.02重量％水)進行洗脫，然后用100g丙酮(含0.5重量％水)進行洗脫。
將從色譜柱洗脫下來的3份流分收集起來(1)己烷流分；(2)97∶3己烷/丙酮流分；和(3)丙酮流分。
將各流分通過旋轉蒸發進行干燥。測得己烷流分的干重為3.53g，用前述法定方法970.64測得的每磅固體流分的葉黃素濃度為205mg。測得97∶3己烷/丙酮流分的干重為0.85g，用前述法定方法970.64測得的每磅固體流分的葉黃素濃度為820mg。這二個流分主要含油、脂肪酸、胡蘿卜素和葉黃素酯，可加回到回收的用作動物飼料的麩粉中去，也可將其舍棄。最后一個流分(即，丙酮流分)的干重為1.32g，用前述法定方法970.64測得的每磅固體流分的純葉黃素濃度為7430mg，固體流分呈桔黃色/紅色糊狀。
由此，在前述過程完成之后，玉米麩粉中的葉黃素濃度從初始玉米麩粉的每磅170mg提高到純化過的干提取物的每磅7430mg，提高了約44倍。實施例6攪拌下，在60℃用900g含抗氧化劑乙氧喹的乙醇提取含小于12重量％的水和含170mg葉黃素的玉米麩粉(300g)30分鐘。通過真空過濾回收玉米麩粉，然后用相同方式再提取3次。所用乙氧喹的總量相當于用前述法定方法970.64測得的玉米麩粉中的葉黃素量的0.3％。將三份提取物合并，通過旋轉蒸發進行干燥。用前述法定方法970.64測得的干提取物中的葉黃素濃度為596mg/磅(純化之前)。
將一份干提取物(55.7g)溶解在100ml乙醇中。往提取物中加入己烷(500ml)和丙酮(100ml)，將溶液在1L分離漏斗中與300ml的10％硫酸鈉水溶液進行分配。取出己烷層，用500ml己烷再提取水層2次。將三份己烷相合并并通過旋轉蒸發進行干燥。用前述法定方法970.64測得葉黃素濃度為1716mg/磅。
將78g 1∶1的硅膠(Devisil633級60A型)∶氧化鎂(Fisher Scientific公司生產的hyflo super cel)裝入1″(內徑)×25″的色譜柱中。將進樣料(干重7.33g，葉黃素濃度為1716mg/磅，由上述合并的己烷相組成)溶解在246g己烷中，然后吸附到色譜柱上。接著用己烷(69g)、97∶3己烷/丙酮(515g)、70∶15∶15己烷/丙酮/甲醇(384g)和甲醇(212g)進行洗脫。稱得葉黃素流分的干重為0.2g，用前述法定方法970.64測得的葉黃素濃度為30,760mg/磅，即，與初始(起始)的玉米麩粉中的葉黃素的量相比，葉黃素濃度提高了約180倍。實施例7攪拌下，在60℃用300g含抗氧化劑乙氧喹的乙醇提取含15重量％的水和含170mg葉黃素的玉米麩粉(100g)30分鐘。通過真空過濾回收玉米麩粉，然后用相同方式再提取2次。所用乙氧喹的總量相當于用前述法定方法970.64測得的玉米麩粉中的葉黃素量的0.1％。將三份提取物合并，并從提取物中取出試樣，通過旋轉蒸發進行干燥。用前述法定方法970.64測得的干提取物中的葉黃素濃度為600mg/磅(純化之前)。
通過旋轉蒸發除去合并的提取物中的溶劑，使總固體濃度為41％(通過將10.0ml試樣進行干燥而測得)。往提取物中加入乙酸乙酯(132g)，將混合物用刮勺攪拌1或2分鐘。將混合物真空過濾，除去沉淀物。通過旋轉蒸發將濾液干燥，用前述法定方法970.64測得其葉黃素濃度為1835mg/磅。
將9.4g 1∶1的硅膠(Devisil633級60A型)∶氧化鎂(Fisher Scientific公司生產的hyflo super cel)裝入32mm(內徑)×30mm的色譜柱中。將進樣料(干重4.7g，葉黃素濃度為1835mg/磅，由上述玉米麩粉乙醇提取物中可溶于乙酸乙酯的部分組成)溶解在5g 97∶3己烷/乙酸乙酯中，然后吸附到色譜柱上。接著用己烷(40g)、乙酸乙酯(55g)進行洗脫。稱得葉黃素流分的干重為0.9g，用前述法定方法970.64測得的葉黃素濃度為8,320mg/磅，即，與初始(起始)的玉米麩粉中的葉黃素的量相比，葉黃素濃度提高了約49倍。實施例8攪拌下，在60℃用900g含抗氧化劑乙氧喹的乙醇提取含小于12重量％的水和含170mg葉黃素的玉米麩粉(300g)30分鐘。通過真空過濾回收玉米麩粉，然后用相同方式再提取2次。所用乙氧喹的總量相當于用前述法定方法970.64測得的玉米麩粉中的葉黃素量的0.1％。將三份提取物合并，并從提取物中取出試樣，通過旋轉蒸發進行干燥。用前述法定方法970.64測得的干提取物中的葉黃素濃度為470mg/磅(純化之前)。
通過旋轉蒸發除去合并的提取物中的溶劑，使其濃度為54％(通過將10.0ml試樣進行干燥而測得)。往提取物(100g)中加入乙酸乙酯(400g)，將混合物用刮勺攪拌15分鐘。將混合物真空過濾，除去沉淀物。通過旋轉蒸發將濾液干燥，用前述法定方法970.64測得其葉黃素濃度為1518mg/磅。
將16.5g 1∶1的硅膠(Devisil633級60A型)∶氧化鎂(Fisher Scientific公司生產的hyflo super cel)裝入30mm(內徑)×60mm的色譜柱中。將一部分干重為8.35g的干濾出物溶解在70g己烷中，然后吸附到色譜柱上。接著用己烷(90g)、97∶3己烷/乙酸乙酯(98g)、乙酸乙酯(142g)和乙醇(118g)進行洗脫。稱得葉黃素流分的干重為2.32g，用前述法定方法970.64測得的葉黃素濃度為5150mg/磅。
將80.0g 1∶1的硅膠(Devisil633級60A型)∶氧化鎂(Fisher Scientific公司生產的hyflo super cel)裝入1″(內徑)×26″的色譜柱中。將進樣料(主要由一部分來自前述色譜柱的葉黃素流分組成，干重1.57g，用前述法定方法970.64測得的葉黃素濃度為5,150mg/磅)溶解在15g 96∶4己烷/異丙醇中，然后吸附到色譜柱上。接著用96∶4己烷/異丙醇(518g)、90∶10己烷/異丙醇(174g)和異丙醇(174g)進行洗脫。稱得葉黃素流分的干重為0.35g，用前述法定方法970.64測得的葉黃素濃度為9,307mg/磅，即，與初始(起始)的玉米麩粉中的葉黃素的量相比，葉黃素濃度提高了約55倍。
雖然前面用一些特征并結合其某些優選實施方式對本發明進行了描述，但本領域技術人員會明白，已描述的這些特征和實施方式可有許多不超出本發明的范圍和實質的變化、改進和替換。因此，所有這些改進和變化應認為是在本文所描述和要求保護的本發明的范圍之內，本發明僅受下面的權利要求書的范圍的限定，對這樣的權利要求書應給予合理寬的解釋。
權利要求
1.一種從玉米麩粉中回收葉黃素的方法，該方法包括(a)將含水量小于30重量％的玉米麩粉用含抗氧化劑的有機溶劑或有機溶劑混合液進行提取，所含抗氧化劑的量小于玉米麩粉中的葉黃素總量的0.5重量％，有機溶劑或有機溶劑混合液與玉米麩粉之比至少為2∶1；(b)收集所得提取物，得到葉黃素。
2.如權利要求1所述的方法，其中，玉米麩粉的含水量小于20重量％，將該玉米麩粉與有機溶劑或有機溶劑混合液在10-80℃混合10-90分鐘。
3.如權利要求2所述的方法，其中，玉米麩粉的含水量小于12重量％。
4.如權利要求3所述的方法，其中，有機溶劑的含水量小于20重量％。
5.如權利要求4所述的方法，其中，有機溶劑是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、辛醇或乙醇-己烷混合液。
6.如權利要求1所述的方法，其中，抗氧化劑是乙氧喹、棓酸丙酯、丁基化羥基茴香醚、丁基化羥基甲苯、叔丁基對苯二酚或生育酚。
7.如權利要求6所述的方法，其中，有機溶劑是乙醇或乙醇-己烷混合液。
8.如權利要求7所述的方法，其中，乙醇或乙醇-己烷混合液含小于10重量％的水和相當于玉米麩粉中的葉黃素的總量的0.3重量％以下的抗氧化劑。
9.如權利要求8所述的方法，其中，抗氧化劑是乙氧喹。
10.如權利要求9所述的方法，其中，將玉米麩粉與乙醇或乙醇-己烷混合液在50-70℃混合。
11.如權利要求4所述的方法，其中，提取通過一連串的二個或多個單獨的提取或逆流提取進行。
12.如權利要求6所述的方法，其中，提取通過一連串的二個或多個單獨的提取或逆流提取進行。
13.一種從玉米麩粉中回收葉黃素的方法，該方法包括(a)將含水量小于30重量％的玉米麩粉用含抗氧化劑的有機溶劑或有機溶劑混合液進行提取，所含抗氧化劑的量小于玉米麩粉中的葉黃素總量的0.5重量％，有機溶劑或有機溶劑混合液與玉米麩粉之比至少為2∶1；(b)收集所得提取物，得到粗葉黃素；(c)將粗葉黃素進行純化；(d)收集純化過的葉黃素。
14.如權利要求13所述的方法，其中，玉米麩粉的含水量小于20重量％，將該玉米麩粉與有機溶劑或有機溶劑混合液在10-80℃混合10-90分鐘。
15.如權利要求14所述的方法，其中，玉米麩粉的含水量小于12重量％。
16.如權利要求15所述的方法，其中，有機溶劑的含水量小于20重量％。
17.如權利要求16所述的方法，其中，從含粗葉黃素的提取物中除去蛋白質，得到精制葉黃素，將該精制葉黃素通過正相吸附色譜法進行純化。
18.如權利要求17所述的方法，其中，通過沉淀或膜濾除去蛋白質，色譜法中所用的吸附劑是硅膠與氧化鎂的混合物，在該色譜法中，用己烷、己烷/異丙醇或異丙醇使精制葉黃素吸附在吸附劑上，用乙醇、甲醇、己烷、己烷/丙酮、丙酮、己烷/丙酮/甲醇、己烷/乙酸乙酯、乙酸乙酯或己烷/異丙醇將純化過的葉黃素從色譜柱上洗脫下來。
19.如權利要求16所述的方法，其中，通過分配(反相)吸附色譜法、離子交換色譜法、體積排除色譜法或逆流色譜法對粗葉黃素進行純化。
20.如權利要求17所述的方法，其中，有機溶劑是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、辛醇或乙醇-己烷混合液，抗氧化劑是乙氧喹、棓酸丙酯、丁基化羥基茴香醚、丁基化羥基甲苯、叔丁基對苯二酚或生育酚。
21.如權利要求19所述的方法，其中，所述有機溶劑是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、辛醇或乙醇-己烷混合液，抗氧化劑是乙氧喹、棓酸丙酯、丁基化羥基茴香醚、丁基化羥基甲苯、叔丁基對苯二酚或生育酚。
22.如權利要求20所述的方法，其中，有機溶劑是含小于10重量％的水和含相當于玉米麩粉中的葉黃素的總量的0.3重量％以下的乙氧喹的乙醇或乙醇-己烷混合液。
23.如權利要求21所述的方法，其中，有機溶劑是含小于10重量％的水和含相當于玉米麩粉中的葉黃素的總量的0.3重量％以下的乙氧喹的乙醇或乙醇-己烷混合液。
24.如權利要求22所述的方法，其中，將玉米麩粉與乙醇或乙醇-己烷混合液在50-70℃混合。
25.如權利要求23所述的方法，其中，將玉米麩粉與乙醇或乙醇-己烷混合液在50-70℃混合。
26.如權利要求24所述的方法，其中，提取通過一連串的二個或多個單獨的提取或逆流提取進行。
27.如權利要求25所述的方法，其中，提取通過一連串的二個或多個單獨的提取或逆流提取進行。
28.如權利要求26所述的方法，其中，將玉米麩粉與乙醇或乙醇-己烷混合液在50℃混合，通過沉淀或膜濾除去蛋白質，色譜法中所用的吸附劑是硅膠與氧化鎂的混合物，在該色譜法中，用己烷、己烷/異丙醇或異丙醇使精制葉黃素吸附在所述吸附劑上，用乙醇、甲醇、己烷、己烷/丙酮、丙酮、己烷/丙酮/甲醇、己烷/乙酸乙酯、乙酸乙酯或己烷/異丙醇將純化過的葉黃素從色譜柱上洗脫下來。
29.如權利要求27所述的方法，其中，將玉米麩粉與乙醇或乙醇-己烷混合液在50℃混合。
30.如權利要求28所述的方法，其中，用己烷使精制葉黃素吸附吸附在吸附劑上，用乙醇將純化過的葉黃素從色譜柱上洗脫下來。
31.一種從玉米麩粉中回收葉黃素的方法，該方法包括(a)將玉米麩粉試樣干燥至含水量小于30重量％；(b)往有機溶劑或有機溶劑混合液中加入抗氧化劑，加入的抗氧化劑的量小于玉米麩粉試樣中的葉黃素總量的0.5重量％；(c)將玉米麩粉試樣用有機溶劑或有機溶劑混合液進行提取，提取方法為，將至少約2份的有機溶劑或有機溶劑混合液與1份玉米麩粉在10-80℃混合10-90分鐘；(d)收集所得提取物，得到粗葉黃素；(e)對粗葉黃素進行純化；(f)收集純化過的葉黃素。
全文摘要
提供改進的從玉米麩粉中回收葉黃素的方法。更具體地說,描述了通過以下步驟從玉米麩粉中回收葉黃素的方法:將較干的玉米麩粉用有機醇進行提取,然后進行皂化反應,將葉黃素酯轉換成葉黃素。還描述了通過以下步驟從玉米麩粉中回收葉黃素的方法:用含抗氧化劑的第一溶劑對較干的玉米麩粉進行提取,然后可任選地將所得提取物純化。使用這些方法,可以比現有技術的方法高的得率、效率和純度從玉米麩粉中回收葉黃素。而且,在這些方法中回收的葉黃素產物非常適合用于食品和藥品。這些物質尤其適合用于家禽飼料,會賦予烤仔雞和卵黃以所需的健康的黃顏色或黃色調。
文檔編號C07C35/00GK1242761SQ97181210
公開日2000年1月26日 申請日期1997年11月24日 優先權日1997年11月24日
發明者H·S·穆拉利達拉, T·L·科爾尼埃勒 申請人:嘉吉有限公司