用于基因治療的陽離子類脂的制作方法

專利名稱：：用于基因治療的陽離子類脂的制作方法
技術領域：
：本發明涉及胍的陽離子類脂衍生物，它們的制備及用途，以及利用這些衍生物制備的藥物組合物。有一些基于類脂的物質如脂質體已被有效地用作一些藥品和生物制品中的載體，用來將生物活性物質如藥物、放射治療劑、酶、病毒、核酸(例如質粒、DNA和RNA結構、轉錄因子及其它細胞載體)等引入培養細胞系和動物體內。例如，最近已有幾種類脂包囊的藥物如道諾霉素(DaunoXomeTM)和兩性霉素B(AbelcetTM，AmbisomeTM，AmphotecTM)獲得了食品和藥品管理局(FDA)的批準或被列入了目前FDA審查的NDA項目。在這種情況下人們作了更多的努力，希望研制出能有用并有效地將遺傳物質直接遞送到生物細胞的類脂介導的方法。例如，基因治療技術就是通過以所希望的治療方式用能影響基因復制、轉錄和翻譯過程的核酸結構轉染患者的靶細胞，從而減輕患者的病情。一般這些核酸結構是高分子量的、聚陰離子分子，因此若要在體內、來自體內或在體外有效地轉染細胞，則通常需要載體介導的遞送。參見，例如美國專利No.5,264,618，它描述了若干在臨床應用的利用類脂載體的技術和這樣的藥物組合物。這種轉染方法也可用于研制可生產有商業意義的蛋白質的新的細胞系和動物。最近已公開了幾種用于質粒遞送的類脂載體，參見Felgner等人的美國專利4,897,355，4,946,787，5,049,386，5,366,737，5,545,412；美國專利5,264,618，5,283,185(Epand等人，描述的DC-chol)，5,334,761；PCT申請WO95/14381，WO96/01840，WO96/1841，WO96/18372，以及Felgner等人，酶學方法，5，67-75(1993)。盡管在上述參考文獻中描述的化合物有助于生物活性物質進入細胞中，但人們仍希望能開發出更多的能提供更高攝取效力、更好的特異性和減少毒性的類脂載體。本發明即滿足了這些以及相關的需要。本發明的一個方面涉及式I的胍的陽離子類脂衍生物及其鹽、溶劑化物、拆分及未拆分的對映體、非對映體和它們的混合物R1R2N-C(O)-A-X式I其中R1和R2可以是相同的或不同的，為C10-C26烴基；A為亞烴基，其中一個或多個亞甲基可被基團Y任意取代(假如Y基團彼此不能鄰接)，而每個Y可獨立地為-O-，-OC(O)-，-C(O)O-，-NR5-，-NR5C(O)-，-C(O)NR5-，NR5C(O)NR5-，-NR5C(O)O-，-OC(O)NR5-，-S(O)n-(n為0、1或2)或-NZ-C(＝NZ)NZ-，其中每個Z獨立地為H或-(CH2)mNR5-C(＝NR5)NR5，m為1-10的整數，而每個R5獨立地為H或低級烷基；X是(1)三烴基銨基，其中烴基彼此相同或不同，或(2)-NH-C(＝NR3)NHR4，其中R3和R4各自獨立地為烴基、鹵代烷基、羥烷基、O-被護羥烷基、烷氧烷基、鹵代烷氧烷基、芳氧烷基、氨基烷基、單或二取代氨基烷基、N-保護的-氨基烷基、酰基、烷氧羰基、芳氧羰基、-C(O)NR6R7(其中R6和R7獨立地為H或烴基)、氮保護基，或R3和R4與它們連接的原子一起形成任意取代的單環或雙環；但條件是當R1和R2相同，均為C16烷基，而X為-NH-C(＝NH)NH2時，A不為亞丁基鏈。X優選為-NH-C(＝NR3)NHR4。在另一種優選的情況下，R1和R2相同，均為單不飽和鏈烯基。在另一種優選的情況下，R3和R4相同，均為H，氮保護基，氨基烷基或N-保護的氨基烷基，羥烷基或O-保護的羥烷基。R3和R4常常是由-(CH2)p-NH2表示的氨基烷基，其中p為2-10的整數。該氨基也可被保護，優選被叔丁氧羰基保護。應考慮到烷基氨基也可季銨化或以相應的N-氧化物存在。在相關方面，本發明提供了含有式I的陽離子類脂的聚陰離子-類脂配合物，它們的制備方法及它們在將生物活性物質遞送到細胞中的用途。另一方面，本發明涉及含治療有效量的核酸、式I的陽離子類脂和任選的藥學上可接受的賦形劑的藥物組合物。圖1所示為有代表性的本發明陽離子類脂化合物，表示為與首基X相連的具有所繪結構的脂酰胺尾基。圖2所示為本發明的陽離子類脂化合物的有代表性的首基X。圖3A和3B顯示了在無血清(圖3A)和含有血清(圖3B)的培養基中，商業上可獲得的化合物LipofectinTM(Lp)和LipofectAmineTM(Lf)與本發明化合物之間對人內皮細胞的DNA轉染效率的比較。圖4A和4B顯示了在無血清(圖4A)和含有血清(圖4B)的培養基中，商業上可獲得的化合物LipofectinTM(Lp)和LipofectAmineTM(Lf)與本發明化合物之間對人支氣管上皮細胞的DNA轉染效率的比較。圖5A和5B顯示了在無血清(圖5A)和含有血清(圖5B)的培養基中，商業上可獲得的化合物LipofectinTM(Lp)和LipofectAmineTM(Lf)與本發明化合物之間對鼠3T3成纖維細胞的DNA轉染效率的比較。圖6顯示了在含血清、無血清(圖6B)培養基中，共(CO-)類脂膽固醇和DOPE對新化合物2-胍基-N，N-二-十八碳-9-烯基-丙酰胺(2B)在人內皮細胞中在血清中的轉染效率的影響。括號中的比率為每次試驗中2B∶膽固醇∶DOPE的用量比。圖7A顯示了在上皮細胞中本發明化合物相對于其它類脂化合物LipofectinTM(Lp)，LipofectAmineTM(Lf)和GS-2888(11n，用作游離堿，11n/b或鹽酸鹽，11n/C1)的轉染效率。圖7B顯示了在培養血管內皮細胞中幾種試驗化合物的活性。圖8A所示為本發明化合物與DOTMATM通過導氣道裝置給予大鼠后的體內轉染效率的比較。定義及基本參數A、定義給出下面這些定義是為了解釋和定義用來描述本發明的各種術語的含義和范圍。術語“烴基”是指含有由連接有氫原子的最多26個碳原子的碳鏈或環的一價烴基。該術語包括烷基、環烷基、鏈烯基、炔基和芳基、有飽和和不飽和鍵的混合的基團、碳環，還包括這樣的基團的組合。它也包括直鏈、支鏈、環狀結構或它們的組合。術語“亞烴基”是指二價烴基。有代表性的實例包括亞烷基、亞苯基、亞環己基、二亞甲基環己基、2-丁烯-1，4-二基等等。優選該亞烴基鏈是完全飽和的和/或具有1-10個碳原子鏈長。術語“三烴基銨”是指基團(R)3N+-，每個R獨立地為烴基，優選低級烷基。脂族鏈包括下面定義的烷基、鏈烯基和炔基。脂族直鏈限定為無支碳鏈基。烷基是指完全飽和的具有特定碳原子數，或者若沒有詳細說明的話，最多26個碳原子的支鏈或無支碳鏈基團。例如，1-8個碳原子的烷基是指諸如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基等的基團，以及這些基團的位置異構體。低級烷基是指1-6個碳原子的烷基，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基和叔丁基。6-26個碳原子的烷基包括己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基和二十四烷基。鏈烯基是指任何具有特定碳原子數，或者若對碳原子數沒有特別限制的話，最多26個碳原子的支鏈或無支不飽和碳鏈基團；且在這些基團中有1個或多個雙鍵。6-26個碳原子的鏈烯基的實例為己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、十一碳烯基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、十八碳烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、二十一碳烯基、二十二碳烯基、二十三碳烯基和二十四碳烯基，在它們的各種異構型中，不飽和鍵可位于基團中的任意位置，并且該雙鍵可以是(Z)構型，也可以是(E)構型。炔基是指鏈烯基范圍的烴基，但在這些基團中有1個或多個三鍵。術語“低級烷氧基”是指基團-O-R′，其中R′為低級烷基。術語“聚亞甲基”是指基團-(CH2)n-，其中n為2-10的整數。術語“亞甲基”是指基團-CH2-。術語“亞丁基”是指基團-(CH2)4-。術語“亞烷基”是指二價飽和脂族基。術語“羰基”是指基團-C(O)-。術語“羥基羰基”或“羧基”是指基團-C(O)OH。術語“低級烷氧羰基”是指基團-C(O)OR′，其中R′為低級烷基。術語“酰基”是指基團-C(O)-R′，其中R′為氫或烴基，例如甲基羰基、乙基羰基、苯甲酰基、萘甲酰基等。術語“氨基甲酰基”是指基團-C(O)NR′R，其中R和R′獨立地為氫或低級烷基，例如當R為氫，R′為低級烷基時，該基團即低級烷基氨基甲酰基；當R和R′均為低級烷基時，該基團即二低級烷基氯基甲酰基。術語“單取代氨基”是指基團-NHR，其中R為烴基或酰基。術語“二取代氨基”是指基團NR′R″，其中R′和R″獨立地為烴基或酰基。術語“鹵代”是指氟代、溴代、氯代和碘代。術語“芳基”是指芳香一價單或多碳環基。術語“(低級烷基)-羥甲基”是指基團-CH(OH)-(低級烷基)。術語“芳甲基”是指基團芳基-CH2-。芳烷基是指從其中氫原子被芳基取代的烷基衍生的有機基團。有代表性的實例為芐基、苯乙基、3-苯丙基等。單環一般具有3-8個環原子。雙環一般具有7-14個環原子。碳環是指所有的環原子均為碳的環系統。雜環是指至少有一個環原子為雜原子的環系統，雜原子一般為O，N，或S(O)n(n為0、1或2)。術語“保護基”是指當一個基團的原子與分子中的反應基相連時可掩蔽、降低或阻止其反應性。保護基的實例可見于T.W.Greene等人，有機化學中的保護基，(Wiley，2nded.，1991)和Harrison等人，合成有機方法概要，1-8卷，(JohnWiley和Sons，1971-1996)。有代表性的胺保護基包括甲酰基，或2-6個碳原子的低級烷酰基，特別是乙酰或丙酰基，三苯甲游基或取代三苯甲游基如一甲氧三苯甲游基，二甲氧三苯甲游基如4，4′-二甲氧三苯甲游基或4，4′-二甲氧三苯基甲游基，三氟乙酰基，烯丙氧羰基，氨基甲酸叔丁酯(t-BOC)，氨基甲酸1-金鋼烷基酯，氨基甲酸芐基酯(Cbz)，氨基甲酸9-芴甲酯(FMOC)，硝基-藜蘆氧基氨基甲酸酯(NVOC)，鄰苯二甲酰基等。有代表性的羥基保護基是該羥基可以是酰化了的，也可以是烷基化的，包括芐基和三苯甲游基醚以及烷基醚，四氫吡喃醚，三烷基甲硅烷基醚和烯丙基醚。生物活性物質是指能在體外和/或體內發揮生物作用的任何分子或分子的混合物或復合體，包括藥劑、藥物、蛋白質、維生素、類固醇、聚陰離子、核苷、核苷酸、多核苷酸、核酸等。在本申請中所提到的緩沖劑包括“Tris”、“Hepes”和“PBS”。“Tris”是三(羥甲基)氨基甲烷，對本發明的優選實施方案來說，其在約pH7使用。“Hepes”是N-2羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸，本發明所用的該緩沖液的PH也約為7。磷酸鹽緩沖鹽水或“PBS”是10mM磷酸鈉和0.9wt.％NaCl，用作pH7.4的等滲生理緩沖劑。聚陰離子為生物活性聚合結構如多肽、多核苷酸、核酸、或其它大分子，其中有一個以上的聚合物單元帶有負電荷，且該聚合物的凈電荷為陰性。復合體(或脂質體復合體)定義為含有式I類脂的預制脂質體與聚陰離子混合制得的產物。這樣一種復合體的特點在于通過聚陰離子與類脂成分間的相互作用使得聚陰離子和脂質體一起作為一個基本整體通過凝膠過濾柱進行洗脫，從而根據斯托克斯半徑或通過一些其它的分離過程進行分離。電荷比率是指在復合體中由類脂提供的凈正電荷與聚陰離子提供的凈負電荷之間的數量關系。本文中的電荷比率表示為正電荷比負電荷，即5∶1意味著類脂上的凈正電荷為5，而聚陰離子上的凈負電荷為1。脂質體-聚陰離子復合體是通過聚陰離子溶液與由式I類脂(可適當帶有任意共類脂)制備的脂質體制劑接觸后所生成的物質的組合物。任意或任選的意思是其后所描述的事件或情形可以發生，也可不發生，這種表述包括所述事件或情形發生的情況，也包括它們不發生的情況。任選取代基包括烷基，環烷基，鏈烯基，炔基，芳基，鹵代烷基，羥基，氨基，鹵代，硝基，氰基，羧基，氨基甲酰基，烷氧基，鹵代烷氧基，單和二取代氨基，酰基，烷氧酰基，芳氧酰基等。任選的共類脂可理解為能產生穩定脂質體的結構，單獨或與包括本發明的陽離子胍基類脂在內的其它類脂成分結合在一起。它可以是中性的、帶正電荷的或帶負電荷的。雙層包覆復合體是從帶有凈正電荷的脂質體復合體制備的。而帶有凈正電荷的脂質體復合體是利用正電荷類脂的摩爾量比由聚陰離子提供的負電荷的摩爾量大而制得的。將這些帶正電荷的復合體與帶負電荷的類脂混合從而生成雙層包覆復合體。如果加入足夠的負電荷類脂，則最終的復合體將帶有凈負電荷。這一定義包括對表面進行了進一步改性的脂質體，如在其中摻入了抗體或抗原。DNA代表脫氧核糖核酸，它可任意含有人造核苷酸。DNA可以是單鏈、雙鏈或三鏈螺旋形式。RNA代表可任意含有人造核苷酸的核糖核酸。RNA可以是單鏈或雙鏈的。多核苷酸是含有一個以上核苷酸的DNA或RNA。多核苷酸可通過本領域普通技術人員熟知的化學合成方法，或利用重組DNA工藝，或通過上述兩種技術的結合來制備并包括摻入人造核苷酸的那些方法。反義是指與DNA或RNA中的核苷酸的特定序列互補的核苷酸序列。術語核酸是指DNA(例如基因組DNA，cDNA)，RNA(例如mRNA，核糖體RNA，tRNA，反義RNA)，核糖酶，寡聚核苷酸，多核苷酸，DNA和RNA的混合雙鏈體和三鏈體，質粒，表達載體等，包括含有人造核苷酸的那些序列。藥物是指所有治療或預防性的物質，而不是食物，藥物用于預防、診斷、緩解、治療或治愈人或動物的疾病。(治療上有用的多核苷酸、核酸和多肽均在該藥物定義的范圍內)。藥物制劑是包括藥物的物質組合物，用于人或動物的治療給藥。藥學上可接受的陰離子是其本身無毒性或在藥學上可接受的以及不會使得化合物變成藥學上不可接受的陰離子。這樣的陰離子的實例為鹵化物陰離子，氯化物，溴化物和碘化物。也可使用無機陰離子如硫酸根，磷酸根和硝酸根。有機陰離子可從單一有機酸衍生而得，如從乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、三氟乙酸等獲得。穩定轉染劑是其中引入了DNA且使該細胞的基因組DNA完整化的的活細胞。局部給藥包括將藥物用于任何身體表面，包括眼部給藥和任何體腔表面的給藥。經皮給藥是通過皮膚產生系統作用而給藥。轉染是指為了本發明的目的而將DNA或RNA引入活細胞中。人造核苷酸包括商業上可獲得的那些或可由本領域普通技術人員熟知的方法方便地制得的那些。術語“藥學上可接受的鹽”是指從無機或有機酸或堿衍生的任何鹽。此處所用的術語-對哺乳動物的病情和/或疾病的“治療”，意思是(i)預防病情或疾病，即避免疾病的任何臨床癥狀；(ii)抑制病情或疾病，即抑制或減輕臨床癥狀的加重或發展；和/或(iii)解除病情或疾病，即導致臨床癥狀的消除。此處所用的術語“治療有效量”是指當需要時給予哺乳動物生物活性物質的量足以產生治療作用。構成“治療有效量”的劑量將根據物質、病情或疾病及其嚴重程度、以及被治療的哺乳動物的情況而變化，但可由本領域普通技術人員按照現代的知識和本發明來決定。所給的所有溫度均為攝氏溫度(即℃)。除非有相反的說明，否則本文所述的反應是在大氣壓下，在約-78℃到約150℃的溫度范圍內，更優選約10℃-約50℃，最優選約室溫，例如約20℃進行的。除非有相反的說明，本文所述的時間和溫度范圍均為近似值，例如“在10℃-100℃下，從8-24小時”意思是在約10℃-約100℃下，從約8-約24小時。如果需要的話，本文所述的化合物和中間體的分離和純化可利用任何適宜的分離或純化方法來進行，例如過濾、萃取、結晶、柱層析、制備高壓液相色譜(制備HPLC)、薄層色譜或厚層色譜、或者這些方法的結合。合適的分離和離析方法的特別說明可參考下文中的實施例。不過也可使用其它等效的分離或離析方法。在下面的例子中命名了一些有代表性的化合物。2N-C(O)CH2NHC(＝NH)NH22-胍基-N，N-二-十八碳-9-烯基-乙酰胺[CH3(CH2)7CH＝CH(CH2)8]2N-C(O)CH2CH2NHC(＝NH)NH23-胍基-N，N-二十八碳-9-烯基-丙酰胺[CH3(CH2)7CH＝CH(CH2)8]2N-C(O)CH2CH2NHC(＝NBOC)NHBOC3-[N′，N″-雙(叔丁氧羰基)胍基]-N，N-二-十八碳-9-烯基-丙酰胺[CH3(CH2)7CH＝CH(CH2)8]2N-C(O)CH2CH2NHC(＝NC2H4NHBOC)-NHC2H4NHBOC3-[N′，N″-雙(2-叔丁氧羰基氨基乙基)胍基]-N，N-二-十八碳-9-烯基-丙酰胺[CH3(CH2)7CH＝CH(CH2)8]2N-C(O)CH2CH2NHC(＝NC3H6NHBOC)-NHC3H6NHBOC3-[N′，N″-雙(2-叔丁氧羰基氨基丙基)胍基]-N，N-二-十八碳-9-烯基-丙酰胺[CH3(CH2)7CH＝CH(CH2)8]2N-C(O)CH2CH2NHC(＝NCH2CH2NH2)NHCH2CH2NH23-[N′，N″-雙(2-氨基乙基)胍基]-N，N-二-十八碳-9-烯基-丙酰胺[CH3(CH2)7CH＝CH(CH2)8][C18H35]N-C(O)CH2CH2NHC(＝NH)NH23-胍基-N-十八碳-9-烯基-N-十八烷基-丙酰胺化合物也可參照圖1和圖2中所示的結構來表示和定義。在這些表示圖中，化合物表示為與陽離子首基X相連的脂酰胺尾基。圖1顯示了有代表性的脂酰胺尾基1-14，圖2顯示了有代表性的陽離子首基的結構A-U。因此，定義為1B的化合物是指其中脂酰胺尾基1與陽離子首基B相連的化合物，即2-胍基-N，N-二-十八碳-9-烯基-乙酰胺。式I化合物的合成在反應流程中，R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7與本發明概述中所描述的相同。反應流程A說明了新的胍的陽離子類脂衍生物，即式I化合物的代表性制備流程。反應流程B說明了在反應流程A中用作原料的不對稱胺R1R2NH的代表性制備流程。反應流程A反應流程B原料對于反應流程A和B來說，原料可從AldrichChemicalCo.，Inc.，FlukaChemicalCorporation，K&amp;KChemicals，EastmanKodakChemicals，LancasterSynthesisLtd.，KarlIndustries，MaybridgeChemicalCo.Ltd.，或TokyoKasainternational獲得。長鏈酸優選從NuChekPrepLnc.，(Elysian，MN)得到。無法直接購得的那些化合物可由本領域普通技術人員按照參考文獻中記載的方法進行制備，如“用于有機合成的Fieser和Fieser′s試劑”，1-15卷，JohnWiley和Sons，1991；“碳化合物的Rodd′s化學”，1-5卷及附編，ElsevierSciencePublishers，1989；“有機反應”，1-40卷，JohnWiley和Sons，1991。胺R1R2NH的制備根據反應流程B，結構R1R2NH的中間體可通過下述過程進行合成首先式RNH2的胺與式R1COOH的羧酸在活性基如N-羥基琥珀酰亞胺、對硝基苯酚、五氯苯酚、五氟苯酚等和偶合劑如二環己基碳二亞胺(DCC)、二異丙基碳二亞胺(DIC)、N-羥基苯并三唑(HBOT)、N-羥基苯并三唑磷酰氯、氯甲酸異丁酯、N，N′-羰基二咪唑等存在的條件下進行偶合。該偶合反應一般在無水、非羥基有機溶劑中進行。然后用還原劑如金屬氫化物(例如氫化鋁鋰、乙硼烷等)將所得酰胺還原為預期的胺R1R2NH。胺RNH2和酸R1COOH一般可購得。胺RNH2也可通過前體羧酰胺(可從相應的酸經酰氯依次得到)的還原來制備。酸R1COOH可購得或通過易于得到的前體醇的氧化制得。式I化合物的制備一端帶有胺，另一端帶有羧酸的雙官能連接物HOC(O)-A-NH2(A如前所定義)既可從供應商如SigmaChemicalCompany(St.Louis，MO)處購得，也可利用本領域普通技術人員熟知的標準方法進行制備。根據反應流程A，在步驟1中，胺被保護，然后在與上述相似的條件下，所得N-保護連接物的羧基與式R1R2NH的胺偶合。在步驟2中，在適宜條件下(酸處理、氫解、光解等)去除氮保護基，然后在步驟3中，所得游離胺與硫脲或異硫脲鎓鹽縮合得到式I化合物。硫脲和異硫脲鎓鹽可從商業上獲得，也可利用下面的參考文獻中描述的合成方法進行制備Org.Syn.Coll.，卷II(S-甲基異硫脲硫酸鹽)，Org.Syn.Coll.，卷III(S-乙基硫脲)，化學評論，55，181(1955)。X為三烴基銨的式I化合物可通過將步驟2中得到的游離胺用所需要的烷基化劑如三烴基碘，對甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽等進行烷基化反應而得到，如果需要可連續進行。本發明化合物可方便地表示為與陽離子首基X相連的脂酰胺尾基。圖1中顯示了有代表性的脂酰胺尾基，其中X代表陽離子首基。有代表性的陽離子首基X顯示于圖2中。通常，陽離子首基為胍基部分。利用圖1和圖2的代表方式，表1中顯示了利用上述方法及在實施例中制備的本發明化合物的有代表性的實例。</tables>優選化合物R1和R2為CH3(CH2)7CH＝CH(CH2)8-的式I化合物是優選的。特別優選的是R3和R4為烷基氨基(任意N-保護的)或叔丁氧羰基，且R1和R2為CH3(CH2)7CH＝CH(CH2)8-的式I化合物。應用本發明的陽離子類脂一般用作各種生物活性物質如藥物或核酸的載體。特別是該陽離子類脂可在用于制備類脂復合體的制劑中單獨使用，也可與其它類脂聯合應用，類脂復合體用于胞內遞送生物活性物質。本發明的陽離子胍基類脂的應用包括那些與目前實際使用商業上的陽離子類脂制品如LipofectinTM相應的轉染方法，以及其它公開的利用常規陽離子類脂的遞送技術。本發明的陽離子類脂可用于藥物制劑，通過各種體內或從自體內途徑遞送治療劑到哺乳動物的各個部位，從而達到預期的治療效果。它們也可在體外用來轉染和制備能表達有商業意義的蛋白質的細胞系。類脂復合體的制備含有本發明陽離子類脂的脂質體可用本領域普通技術人員熟知的方法進行制備。一般是將陽離子類脂(帶有一個或多個任意共類脂)的有機溶液干燥得到類脂膜，然后將其再水化得到脂質體的懸液。從所需類脂成分制備干燥類脂膜的適宜溶劑可理解為是能溶解所有成分并可在其后通過蒸發或冷凍干燥而方便去除的任何溶劑。這樣的溶劑的實例為氯仿、二氯甲烷、乙醚、環己烷、環戊烷、苯、甲苯、甲醇、或其它脂族醇如丙醇、異丙醇、丁醇、叔丁醇、異丁醇、戊醇和己醇。實施本發明時也可用兩種或多種溶劑的混合物。用于由干燥類脂膜形成脂質體的合適的水性介質可以是，例如水、緩沖水溶液、或組織培養基。例如，合適的緩沖液為磷酸鹽緩沖鹽水，即pH7.4的10mM磷酸鉀在0.9％NaCl中的溶液。介質的pH值應該在約2-約12的范圍內，但優選約5-約9，最優選約7。某些情況下，生物活性物質將包括在再水化介質中，而在其它情況下，如對于核酸，它們將在再水化/脂質體形成過程后再加入。任意共類脂的實例為與磷脂相關的物質如卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、鞘髓磷脂、腦磷脂、心肌磷脂、磷脂酸、糖脂、磷酸三十二烷酯、二油酰磷脂酰氯(DOPC)、二棕櫚酰磷脂酰氯(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕櫚酰油酰磷脂酰氯(POPC)、棕櫚酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰磷脂酰乙醇胺4-(N-馬來酰亞氨基-甲基)環己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)。此外不含磷的磷脂是，例如硬脂酰胺、十二烷胺、十六烷胺、乙酰十六酸酯、甘油蓖麻醇酸酯、硬脂酸十六烷酯、肉豆蔻酸異丙酯、兩性丙烯酸聚合物、三乙醇胺-十二烷基硫酸鹽、烷基-芳基硫酸酯聚乙氧化的脂肪酸酰胺、二十八烷基二甲基溴化銨、和類固醇如膽固醇，麥角甾醇，麥角甾醇B1、B2和B3，雄甾酮、膽酸、脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸、石膽酸等。優選的共類脂是膽固醇和/或DOPE。任意地，該懸液可經過聲處理、逆向蒸發、冷凍-熔化或擠壓方法以生成特定尺寸范圍的脂質體。優選制備直徑為約50-約200μM的單層脂質體。然后將被遞送的生物活性物質與脂質體的懸液混合生成生物物質的類脂復合體。復合體上的凈電荷可由脂質體上的電荷、生物物質上的電荷、和每種物質的相對用量來決定。由此即可制得陽離子類脂，也可制得陰離子類脂。一般優選避免所制得的復合體為中性，特別是當它們被制備成用于核酸的體內遞送時。一般這一點是通過將較小的組分(對于基本電荷)加入到較大組分中，并用力攪拌以避免局部濃度梯度來完成的。因此，當制備陰離子復合體時，將陽離子脂質體懸液加入到核酸中，而制備陽離子復合體時，添加順序要反過來。一般觀察認為陰離子復合體更適合核酸的呼吸道遞送，而靜脈內遞送可由陽離子復合體更有效地完成。藥物制劑本發明提供了包含上述陽離子類脂及一種或多種生物活性物質的藥物組合物。這樣的藥物組合物有助于細胞內生物活性分子進入組織和器官如呼吸道上皮細胞、肺、心臟、胃粘膜和固體腫瘤。另外，這些組合物有助于生物活性物質進入體外維持的細胞中。生物活性物質在本發明的藥物制劑中所包含的生物活性物質包括藥物和核酸。如本文所描述，核酸包括基因組DNA、cDNA、RNA、mRNA、核糖體RNA、反義RNA、核糖酶、RNA和DNA的混合雙鏈體與三鏈體以及質粒。核酸還包括(分子中)的天然堿基、糖殘基和/或磷酸二酯鍵經過修飾的那些以及肽核酸。這樣的修飾包括硫代磷酸、非天然堿基的取代等，包括但不限于PCT申請WO96/1840和WO96/1841中公開的那些。一般核酸將對治療或診斷意義上的蛋白質進行編碼。這樣的蛋白質包括組織相容性抗原、細胞粘著分子、生長因子(例如有關外周動脈疾病的血管內皮生長因子)、重組人類因子VIII、激素(胰島素、生長激素、生長激素釋放因子)、細胞因子(例如IL-12)、趨化因子、抗體、抗體片斷、細胞受體、胞內酶、轉錄因子(例如NF-κB、IκB)、毒肽(諸如蓖麻毒蛋白A鏈、白喉毒素等，它們可除去染病或有害的噁性細胞)或任何這些物質的片斷或修飾體。應理解為這樣的蛋白質包括野生型蛋白質的截斷和突變型蛋白，依據治療的需要可將它們用作野生型變異體的激動劑或拮抗劑。核酸還可包含表達控制序列，且一般將具有含轉錄啟動子、增強子、轉錄終止子、操縱基因或其它控制序列的轉錄單位。通常希望能有一種組織特異性啟動子，以確保蛋白質在靶組織中的特異性表達。一般核酸編碼的診斷上有意義的蛋白質常帶有另外對選擇性或診斷標記(例如lacZ、β-半乳糖苷酶、氯霉素轉移酶等)編碼的序列。本發明的陽離子類脂-核酸制劑還可含有能與細胞的成分結合的配體和/或受體。配體是任何能與另一個稱之為受體的分子特異性結合的化合物，配體和受體形成一個互補對。例如，配體可以是針對細胞表面受體的抗體，如主要組織相容性復合體HLA-A的抗原。這樣的制劑可使配體特異性地將核酸靶向在其表面表達受體的細胞亞單位(subset)。另外，配體可以是小分子，如象血管緊張肽轉化酶這樣的胞內酶的抑制劑。配體可以與陽離子類脂共價結合或非共價嵌入脂質體的膜中。轉染本發明的陽離子類脂-核酸復合體可在體外和體內用來轉染細胞。體外實驗是在有血清和無血清兩種情況下進行的。轉染效率相對于商業上的陽離子類脂制劑如LipofectinTM，DOTMATM，以及最近才公開的陽離子類脂如CytofectinGS-2888(J.G.Lewis等人，美國國家科學院院報，93卷，3176-3181(1996)等來確定。轉染效率利用帶有lacZ/β-半乳糖苷酶可檢測標記的PCMVβ質粒來測定。如實施例部分中的詳細描述所顯示，在血清存在的條件下，所測陽離子類脂的轉染效率一貫比LipofectinTM或GS-2888要高。盡管不希望受到任何特定理論的束縛，但仍相信本文所公開的由陽離子胍基類脂提供的這些令人驚奇的優越性應歸功于胍基首基可更牢固地與DNA結合，因此更少地與血清蛋白質結合。可利用本發明的陽離子類脂介導的遞送來轉染的細胞類型包括但不限于內皮細胞、上皮細胞(特別是肺上皮細胞)、肺泡、支氣管細胞、角質形成細胞和滑液細胞。同時還令人驚奇地觀察到將胍基首基與脂酰胺部分連結起來的連接鏈的長度在轉染效率中起到重要作用，即脂酰胺的酰氨官能團與胍基首基之間的2或3個碳原子鏈的間隔基，其轉染效率高于3或4個碳原子鏈的間隔基的轉染效率。表1顯示了在鼠成纖維(3T3)細胞、上皮細胞(HBE)和血管內皮細胞(IVEC)中，在油基尾基和胍基首基之間具有1-4個碳原子鏈長的連接鏈的陽離子類脂的轉染效率。轉染效率以相對于DOTMATM獲得的數據來表示。表1</tables>另外還驚奇地觀察到胍基首基的氨基上的取代基也提供了出乎意料的高轉染效率。表2顯示了在鼠成纖維(3T3)細胞、上皮細胞(HBE)和血管內皮細胞(IVEC)中，由油基尾、亞乙基連接鏈和胍基首基上的不同取代基組成的陽離子類脂的轉染效率。轉染效率是以相對于DOTMATM獲得數據來表示的。表2</tables>體內轉染過程可通過直接注射入動物體內細胞中來進行。另外，轉染也可通過體外從動物體內移植的細胞，然后將細胞重新再植入動物體內(從活體內方法)來完成。轉染的體內和從活體內的臨床試驗記錄可見于人類基因治療，7，1621-1642(1996)。可在體內轉染的組織包括呼吸道上皮和血管內皮。可經任何可接受的系統或局部途徑給藥，例如胃腸外的、口服(特別是嬰兒制劑)、靜脈內的、鼻的、支氣管吸入劑(即氣溶膠制劑)、經皮或局部途徑，可以是固體、半固體或液體劑型如片劑、栓劑、丸劑、膠囊、粉劑、溶液、懸浮液、氣霧劑、乳劑等，優選以適合精確劑量的簡便給藥的單位劑型。該組合物將包括慣用的藥物載體或賦形劑、生物活性物質、式I的陽離子類脂，此外還可包括其它藥物、藥劑、載體、輔劑等。載體可選自各種油，包括石油，動物、植物或合成油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。水、鹽水、含水右旋糖和乙二醇是優選的液體載體，特別是用于注射溶液。適宜的藥物載體包括淀粉、纖維素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、氯化鈉、干燥脫脂乳、甘油、丙二醇、水、乙醇等。其它適宜的藥物載體和它們的配方參見E.W.Martin的“Remington′s醫藥科學”。如果需要，所給予的藥物組合物也可含有少量無毒的輔助物質如濕潤劑或乳化劑、PH緩沖劑等，諸如乙酸鈉、脫水山梨糖醇一月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。本發明的類脂-聚陰離子復合體一般是以含與聚陰離子和式I的陽離子類脂結合的藥物賦形劑的藥物組合物形式給藥。如前所述，它對核酸編碼的治療上有意義的蛋白質的遞送特別有用。核酸和陽離子類脂在制劑中的濃度可由本領域技術人員在慣用范圍內進行變化。對于體外給藥來說，核酸的用量范圍是約0.5-100μM，優選約1.5-30μM，而陽離子類脂的用量范圍是約1-200μM，優選約5-120μM。對于體內給藥來說，核酸的用量可以是約0.1-10mM，優選約0.2-2mM，而陽離子類脂的用量可以是約0.1-20mM，優選約0.2-10mM。靜脈內給藥靜脈注射已被證明是治療劑給藥的重要途徑。含有本發明的陽離子類脂的藥物制劑可經這種途徑給藥，例如通過制備上述類脂復合體并將其分散于可接受的輸液中。一般本發明化合物的每日用量可通過一次性輸入，或通過均勻間隔一定時間的幾次輸入來給藥。美國專利4,016,100中描述了用于注射或口服給藥的控釋脂質體液體藥物制劑。已有建議將凍干的脂質體/肽藥物混合物填充到腸溶膠囊中作為口服的脂質體藥物，參見美國專利4,348,384。上述文獻均引入本文作為參考。氣霧劑給藥氣霧劑給藥是一種將治療劑直接遞送到呼吸道的有效方式。這一方法的優點是(1)它設法克服了酶降解、從胃腸道的不良吸收、或治療劑由于肝臟的首過作用而損失等的影響；(2)以這種方式給藥時，治療劑不會因為它們的分子大小、電荷或對肺外部位的親和力而無法到達它們在呼吸道上的靶部位；(3)它可使治療劑經肺泡快速吸收入體內；(4)它可避免其它器官系統接觸到治療劑，這在接觸可能導致不期望的副作用的情況下尤為重要。由于這些理由，氣霧劑給藥對于哮喘、肺的局部感染、以及肺和呼吸道的其它疾病或病況的治療來說特別有利。有三種類型的藥物吸入裝置噴霧式吸入器、定量吸入器(MDI)和干粉吸入器(DPI)。噴霧式裝置可產生高速氣流，將治療劑(已制備成液體型式)以霧狀噴射到患者的呼吸道。MDI一般帶有與壓縮氣體包裝在一起的制劑。一經開啟，該設備就通過壓縮氣體排放出定量的治療劑，由此提供了一種以一定劑量給藥的可靠方法。事實上，MDI已采用含氯氟烴(CFC)作為壓縮氣體來推進治療劑。在最近幾年里，CFC被認為與地球臭氧層的消耗有關。因此，其它沒有臭氧威脅的推進劑已被選作CFC的可能的替代品。DPI是以游離流動粉末的方式給予治療劑的，這些粉末可通過該裝置在呼吸過程中分散到患者的吸入氣流中。為了得到游離的流動粉末，用賦形劑如乳糖來配制治療劑。將定量的治療劑貯存于膠囊中，并隨著每次開啟而給出。所用的DPI的實例為Spinhaler(用于色甘酸二鈉的給藥)，Rotahaler_(用于羥甲叔丁腎上腺素的給藥)和Turbuhaler_(用于間羥叔丁腎上腺素的給藥)。所有上述方法都可用作本發明的給藥方式，特別適用于哮喘和其它類似或與呼吸道異常相關疾病的治療。栓劑對于通過栓劑的系統給藥來說，慣用的粘合劑和載體包括例如聚二醇或甘油三酸酯〔例如PEG1000(96％)和PEG4000(4％)〕。這樣的栓劑可由含有約0.5wt/wt％-約10wt/wt％，優選約1wt/wt％-約2wt/wt％的活性成分的混合物形成。液體可以液體給藥的藥物組合物的制備是通過溶解、分散等形式將上述活性化合物(約0.5％-約20％)和任選的載體中的藥物輔劑如水、鹽水、含水右旋糖、甘油、乙醇等一起制備成溶液或懸浮液。制備這種劑型的現行方法對于本領域技術人員來說是熟知的或將要知道的，例如參見Remington′s藥物科學，MackPublishingCompany，Easton，Pennsylvania，16thEd.，1980。按照本發明的教導，在任何情況下，所給藥的組合物都將含有用來緩解所治療的特定病情的有效治療量的活性化合物。實施例給出下面的實施例是為了使本領域技術人員更清楚地理解和實施本發明。它們對本發明范圍不起任何限制作用，僅僅是對本發明的解釋和說明。縮寫BOC-叔丁氧羰基CDI-羰基二咪唑硫代-CDI-硫代羰基二咪唑PYBOP-六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧)三吡咯烷磷鎓DIEA-二異丙基乙基胺實施例1式I化合物的制備A.3-[N′，N″-雙(2-叔丁氧羰基氨基乙基)胍基]-N，N-二-十八碳-9-烯基-丙酰胺(圖1和圖2所示的化合物2-0)的制備2B合成的特定反應順序見反應流程C和D。在實驗過程中描述的中間體在這些反應流程中給出了編號。反應流程C反應流程D化合物1向室溫下油酸(99+％，12.48gm.，44.2mmol)的二氯甲烷(200ml)溶液中加入1，1′-羰基二咪唑(8.24g，50.2mmol)。攪拌30分鐘后，加入濃縮氫氧化銨(50ml)和四丁基溴化銨(1.42g，4.42mmol)，所得混合物迅速攪拌2小時。用水(100ml)攪拌后，分離有機層，用水洗滌兩次，(硫酸鎂)干燥，并真空解吸。粗產物(12.88g)從己烷中重結晶得到12.35g化合物1，為白色固體。1HNMR(CDCL3)δ0.86(t，J＝6.6Hz，3H)，1.27-1.80(m，22H)，2.0(m，4H)，2.22(t，J＝8.0Hz，2H)，5.30(m，2H)；MSm/z281(M+)。化合物2在氬氣氛下，在1分鐘內用注射器向室溫下化合物1(10g，35.5mmol)的干燥四氫呋喃溶液(100ml)中逐滴加入氫化鋁鋰(39ml，39mmol1摩爾的THF液)。有輕微的放熱。該奶狀混合物在室溫下攪拌1小時后，再于50℃攪拌6小時。向迅速攪拌的冰冷卻的混合物中順序緩慢滴加水(1.5ml)，氫氧化鈉水溶液(15％，1.5ml)，水(3.5ml)。將所得白色顆粒狀固體過濾并用二氯甲烷(30ml)洗滌。用二氯甲烷溶液洗提后，所得無色液體(9.7g)經硅膠柱快速層析(用5％-7％-10％甲醇的二氯甲烷液進行洗脫)得到7.4g無色液體。1HNMR(CDCL3)δ0.88(t，J＝6.6Hz，3H)，1.27-1.64(m，36H)，2.00(m，4H)，2.68(t，J＝7.0Hz，2H)，5.36(m，2H)；MSm/z267(M+)。化合物3向室溫下油酸(99％，28.25g，100mmol)的二氯甲烷溶液(400ml)中一次加入1，1′-羰基二咪唑(17.84g，110mmol)并在氬氣氛下攪拌30分鐘。然后加入化合物2.(26.75g，100mmol)并在氬氣氛下攪拌2小時。加入水(200ml)后將該混合物攪拌幾分鐘。分離二氯甲烷層，(用硫酸鎂)干燥，并真空濃縮得到白色脂膏(57.5g)。1HNMR(CDCL3)δ0.88(t，J＝6.5Hz，6H)，1.27-1.73(m，54H)，2.01(m，8H)，2.15(t，J＝6.0Hz，2H)，3.26(q，J＝7.0Hz，2H)，5.35(m，2H)；MSm/z531(M+)。化合物4在氬氣氛下，在1分鐘內用注射器向室溫下化合物3(9.67g，18.25mmol)的干燥四氫呋喃溶液(100ml)中逐滴加入氫化鋁鋰(20ml，20mmol1摩爾的THF液)，然后在氬氣氛中60℃下攪拌過夜。向迅速攪拌的冰冷卻的混合物中順序緩慢滴加水(0.7ml)，氫氧化鈉水溶液(15％，0.7ml)，水(2.1ml)。將所得白色顆粒狀固體過濾并用乙醚(50ml)洗滌，(用無水硫酸鎂)干燥并真空濃縮。粗黃色油(9.45g)經硅膠閃式層析(用25％乙酸乙酯/己烷+1％三乙胺洗脫)得到4.2g淡黃色油和0.89g稍微不純的產物。1HNMR(CDCL3)δ0.88(t，J＝2.6Hz，6H)，1.25-1.98(m，46H)，2.02(m，8H)，2.58(t，J＝2.5Hz，4H)，5.34(m，4H)；MSm/z518(M+)。化合物5在氬氣氛中，向室溫下化合物4(10.36g，20mmol)、N-t-BOC-β-丙氨酸(3.78g，20mmol)和PyBOP(12.49g，24mmol)的混合物中加入二甲基甲酰胺(75ml)并攪拌5分鐘。向該溶液中加入二異丙基乙基胺(10.45ml，60mmol)，接著再攪拌45分鐘。向攪拌著的棕色溶液中加入水(500ml)和乙酸乙酯(250ml)。分離有機層，水層用乙酸乙酯(100ml)萃取兩次。合并后的有機部分用水(100ml)洗滌，(硫酸鎂)干燥并真空濃縮。粗棕色油狀固體經硅膠柱快速層析(5％-10％乙酸乙酯/己烷)得到13.45g無色油。1HNMR(CDCL3)δ0.88(t，J＝6.7Hz，6H)，1.26-1.42(m，45H)，1.42(s，9H)，1.43-1.75(m，6H)，2.00(m，8H)，2.50(t，J＝4.8Hz，2H)，3.16(brt，2H)，3.30(brt，2H)，3.41(brt，2H)，5.35(m，2H)；MSm/z688(M+)。化合物6在氬氣氛中，向化合物5(7.75g，11.2mmol)的干燥二噁烷溶液(20ml)中加入4NHCL的二噁烷液(25ml)并在室溫下攪拌過夜。該溶液洗提后加入乙腈(50ml)，洗提，重復2次以上。殘余物用乙酸乙酯(200ml)和10％氫氧化鈉水溶液(100ml)攪拌2小時。分離乙酸乙酯層，水層用乙酸乙酯(50ml)萃取，合并后的乙酸乙酯部分用(硫酸鎂)干燥并真空濃縮。粗油(6.6g)經硅膠閃式層析(依次用3％和10％甲醇/二氯甲烷洗脫)得到6.29g非常淡的黃色油。1HNMR(CDCL3)δ0.88(t，J＝7.0Hz，6H)，1.27-1.60(m，54H)，2.01(m，8H)，2.55(t，J＝5.9Hz，2H)，2.95(m，2H)，3.10(brt，2H)，3.35(brt，2H)，3.25(brt，2H)，5.34(m，4H)；MSm/z589(M+)。化合物7向65℃下化合物6(0.589g，1.0mmol)、硫脲(95mg，1.25mmol)、三乙胺(0.42ml，3.0mmol)和四氫呋喃(25ml)的溶液中加入氯化汞(0.34g，1.25mmol)并在氬氣氛中65℃下攪拌7天。白色懸液逐漸變為黑色。將該懸液冷卻至室溫，用硅藻土過濾并洗提該溶液。粗稠油用硅膠閃式層析(5％-8％-10％-15％甲醇/二氯甲烷+1％氫氧化銨)。回收起始物(425mg)并得到純產物(170mg)，為淡黃色油。將該油溶于10％甲醇/二氯甲烷并加入1NHCL的乙醚液(1ml)洗提得到混濁油脂。1HNMR(CDCL3)δ0.88(t，J＝6.5Hz，6H)，1.27-1.78(m，60H)，2.00(m，8H)，2.56(m，2H)，3.18(m，2H)，3.28(brt，2H)，3.54(brt，2H)，5.34(m，4H)，8.29(brt，1H)；MSm/z630(M+)。化合物8在3小時內，向室溫下1，2-乙二胺(21g，0.349moles)的干燥二噁烷溶液(120ml)中滴加二碳酸二叔丁酯(9.8g，26.6mmol)的二噁烷液(120ml)。混濁混合物逐漸澄清。該混合物在室溫下攪拌過夜。洗提后殘余物用水(200ml)攪拌并過濾白色沉淀。濾液用二氯甲烷(200ml)萃取3次，(用氯化鎂)干燥，洗提得到無色油(4.8g)。1HNMR(CDCL3)δ1.44(s，9H)，2.83(t，J＝6Hz，2H)，3.17(q，J＝6Hz)。化合物9向室溫下化合物8(0.8g，5mmol)和乙酸乙酯(35ml)的混合物中加入1，1′-硫代羰基二咪唑(1.07g，6mmol)并攪拌過夜。洗提后殘余物用硅膠閃式層析，以30％-50％乙酸乙酯/己烷進行洗脫得到0.66g固體。1HNMR(CDCL3)δ1.53(s，9H)，3.59(t，J＝8.4Hz，2H)，4.10(t，J＝7Hz，2H)。化合物10在氬氣氛中，將化合物8(0.275g，1.72mmol)、化合物9(0.347g，1.72mmol)和甲苯(4ml)的溶液在75℃下攪拌過夜。洗提后殘余物用硅膠閃式層析，以2％-3％甲醇/二氯甲烷洗脫得到油(0.37g)。1HNMR(CDCL3)δ1.45(s，9H)，3.34(t，J＝5.8Hz，2H)，3.54(m，2H)。化合物11向65℃下化合物6(0.29g，0.494mmol)、化合物10(0.21g，0.596mmol)、三乙胺(0.27ml，1.98mmol)和四氫呋喃(25ml)的溶液中加入氯化汞(0.16g，0.596mmol)并在氬氣氛中65℃下攪拌1天。白色懸液逐漸變為黑色。將該懸液用硅藻土過濾并洗提該溶液。粗稠油用硅膠閃式層析(5％-10％甲醇/二氯甲烷+1％濃氫氧化銨)得到稠油(0.21g)。1HNMR(CDCL3)δ0.88(t，J＝6.8Hz，6H)，1.2-1.6(m，72H)，2.1(m，10H)，2.78(m，2H)，3.2-3.55(m，14H)，3.68(m，2H)，5.35(m，4H)；MSm/z916(M+)。B.其它式I化合物的制備利用上述方法，以合適的酸代替油酸，以合適的硫脲或異硫脲鎓鹽代替10，可制得下表中列出的化合物。這些化合物是根據圖1和圖2中顯示的脂酰胺尾基和陽離子首基來定義的。例如，化合物1A是指圖1中顯示的化合物1，其中X為圖2中顯示的首基A。基因治療中新的類脂</tables></tables>實施例2脂質體的制備在下面的實施例中將使用含有1∶1摩爾比的所示陽離子類脂和中性類脂二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE’)的陽離子脂質體囊。例如，將溶于二氯甲烷的9.19mg2-胍基-N，N-二-十八碳-9-烯基-丙酰胺(化合物2B)與10.81mgDOPE的氯仿液混合。通過旋轉式蒸發去除溶劑，類脂膜真空干燥。該膜用20ml無菌水再水化到濃度為1mg/ml，加熱至45℃，在高粉浴近距離聲波定位器中用聲波處理，或壓制成多層脂質體囊。利用CoulterSubmicronParticleSizer.N4M，(Coulter，HialeahFlorida)對顆粒尺寸進行激光掃描。新脂質體制劑的平均顆粒大小為296nm±40。實施例3類脂-核酸復合體的制備在下面的實施例中，將對lacZ/β-半乳糖苷酶基因編碼的PCMVβ質粒(Clontech，PaloAlto，CA)以1mg/ml的濃度儲存于-20℃下的水中。用與CMV啟動子連接的對CAT基因編碼的PCT0129質粒來制備用于體內遞送的復合體。用無血清的Optimem培養基(LifeTechnologies，Gathersburg，Md.)將質粒DNA稀釋到濃度為8μg/ml，然后將其加入到等體積的陽離子脂質體溶液中。復合體在用于轉染試驗前先形成30-45分鐘。以類脂/DNA為1∶1、1∶5和1∶25(重量)的比例來制備復合體。類脂/DNA復合體也可利用兩種商業上可獲得的類脂轉染劑LipofectamineTM和LipofectinTM(LifeTechnologies，Gathersburg，Md.)來制備。這些試劑將以慣用于轉染的商業上可獲得的類脂為準來評定其轉染效率。實施例4轉染效率的測定在含有血清或不含血清的培養基中比較利用本發明的含有胍基的脂質體得到的轉染效率與含有季銨的脂質體的轉染效率(圖3-5)。同時測定不同共類脂(DOPE或膽固醇)以及共類脂與陽離子胍基類脂的摩爾比對轉染效率的影響(圖6)。還要測定本發明類脂的轉染效率與DOTMATM和GS2888的轉染效率在體外(圖7)和體內(圖8)的對比數據。將新的類脂/DNA復合體置于96孔微量滴定板中進行常規篩選，以測定三個不同細胞系NIH3T3鼠成纖維細胞(ATCC#CTRL1658)、IVEC人內皮細胞(購自Dr.DenisePaulin，PasteurInstitute，Parise，France，細胞生理學雜志，457，41-51(1993)和16-HBE14o-人上皮細胞，美國生理學雜志，268，L347-L360(1995)的基因轉移效率。細胞在Costar微量滴定孔(Cambridge，MA)中覆以0.5％膠原(CollaborativeBiomedical，Bedford，MA)進行培養。轉染前48小時先將細胞以20,000細胞/孔的濃度接種于完全培養基中。在轉染當天，吸出基質，細胞用Optimem培養基洗滌3次，向每個微量滴定孔中加入50μL帶或不帶10％FBS的Optimem培養基(BioWhittaker，Walker)，并向合適的孔中加入50μL類脂/DNA復合體，以使終DNA濃度的細胞用類脂DNA復合體在37℃溫育5小時。然后將該培養基吸出，替之以100μL含有血清的完全培養基，之后再將細胞培養48小時。為了評定轉染效率，制備細胞溶解產物，并按照生產者的說明，利用熒光底物4-甲基傘形基(umbelliferyl)β-D半乳糖苷酶(MUG)(Sigma，St.Louis，MO)來測定β-半乳糖苷酶的活性。水解了的底物的量利用CytoFluorII熒光計(Millipore，BedfordMA)進行熒光測定。利用BCA試驗(Pierce，RockfordIL)測定溶胞產物中的總細胞蛋白質，結構表示為熒光單位/μg蛋白質，每個數據點代表3份樣品的平均測定值。A.人內皮細胞(IVEC)的轉染在無血清培養基(圖3A)或有血清的培養基(圖3B)中，用與0、2、10或50μg/ml陽離子脂質體復合的2μg/mlPCMV-β質粒來轉染IVEC細胞(2×104)。轉染48小時后，利用熒光底物(MUG)檢測β-半乳糖苷酶活性并將細胞溶解產物中的每μg蛋白質的活性歸一化。每個數據點代表一式三份樣品的平均值。圖3B顯示的有血清的情況下，幾種新化合物的轉染效率比商業上可獲得的化合物高2-10倍。B.人支氣管上皮細胞(16HBE)的轉染在無血清培養基(圖4A)或含有血清的培養基(圖4B)中，用與0、2、10或50μg/ml陽離子脂質體復合的2μg/mlPCMV-β質粒來轉染16HBE細胞(2×104)。轉染48小時后，利用熒光底物(MUG)檢測β-半乳糖苷酶活性并將細胞溶解產物中的每μg蛋白質的活性歸一化。每個數據點代表一式三份樣品的平均值。圖4A中的結果顯示，在人支氣管上皮細胞中，在無血清的情況下，幾種新化合物的轉染效率與商業上可獲得的化合物LipofectinTM的轉染效率相當，其中一種新化合物的轉染效率比其高出約30％。另一方面，圖4B顯示的有血清的情況下，幾種新化合物的轉染效率高于商業上可獲得的化合物的近數倍。C.鼠3T3成纖維細胞的轉染在無血清培養基(圖5A)或含有血清的培養基(圖5B)中，用與0、2、10或50μg/ml陽離子脂質體復合的2μg/mlPCMV-β質粒來轉染3T3成纖維細胞(2×104)。轉染48小時后，利用熒光底物(MUG)檢測β-半乳糖苷酶活性并將細胞溶解產物中的每μg蛋白質的活性歸一化。每個數據點代表一式三份樣品的平均值。圖5A中的結果顯示，在鼠3T3成纖維細胞中，在無血清的情況下，幾種新化合物的轉染效率比商業上可獲得的化合物Lipofectin的轉染效率高出約30-50％，顯示于圖的較右方。另一方面，圖5B顯示的有血清的情況下，幾種新化合物的轉染效率比商業上可獲得的化合物高4-10倍。D.人內皮細胞中共類脂對新化合物2-胍基-N，N-二-十八碳-9-烯基-丙酰胺(2B)的轉染效率的影響制備含2B∶膽固醇∶DOPE的摩爾比不同的陽離子脂質體。在有血清或無血清的培養基中，用與0、2、10或50μg/ml陽離子脂質體復合的2μg/mlPCMV-β質粒來轉染IVEC細胞(2×104)(圖6)。轉染48小時后，利用熒光底物(MUG)檢測β-半乳糖苷酶活性并將細胞溶解產物中的每μg蛋白質的活性歸一化。每個數據點代表一式三份樣品的平均值。圖6中的結果顯示，在人內皮細胞中，在有血清的情況下，新化合物2B與膽固醇和DOPE以1∶0∶1和0.5∶0.25∶0.25的比例結合時的轉染效率比商業上可獲得的化合物LipofectinTM和LipofectAmineTM的轉染效率高出約10-20倍，顯示于圖的較左方。圖6中顯示的無血清的情況下，新化合物2B與DOPE以1∶1的比例結合時的轉染效率比商業上可獲得的化合物LipofectAmineTM的轉染效率高出約40％。E.新的RS-化合物相對于CytofectinGS2888的轉染活性以兩種方式將BOC保護的GS-2888分別制備成鹽酸鹽和游離堿。陽離子類脂與中性類脂的比例為1∶1。圖7B作為對照，顯示GS-2888是有活性的。在圖7A和7B中所用的化合物是用同一批料，在同一天，利用不同細胞上的相同DNA制備的。在含有血清的培養基中(圖4B)，用與0、2、10或50μg/ml陽離子脂質體復合的2μg/mlPCMV-β質粒來轉染2×104細胞。GS-2888與中性類脂的配比為1∶1和2∶1摩爾比。轉染48小時后，利用熒光底物(MUG)檢測β-半乳糖苷酶活性并將細胞溶解產物中的每μg蛋白質的活性歸一化。每個數據點代表一式三份樣品的平均值。圖7A顯示了IVEC內皮細胞中的轉染效力。圖7B顯示了16-HBE上皮細胞中的轉染效力。圖7A表明在HBE細胞中，幾種新的胍基類脂的轉染效率比GS2888高出10倍。F.本發明的新化合物的體內轉染效率確立一種以適于體內遞送的濃度和體積制備DNA/類脂復合體的可重復的方法。該方法是用含有陽離子類脂DOTMATM或本發明的陽離子類脂配以中性類脂DOPE的脂質體來進行的。DNA采用聚陰離子環狀質粒的形式。成功的復合是通過將較少的成分緩慢注入迅速攪拌的主要成分的溶液中來完成的。這一方法是在無菌環境中操作的，可根據復合體大小在較寬的濃度范圍(DNA0.15-1.5mM；類脂0.2-8.5mM)內和電荷比例下重復進行。體內試驗是用麻醉鼠，通過類脂/DNA復合體的氣管內裝置來進行的。用與CMV啟動子相連的對氯霉素乙酰轉移酶基因(CAT)編碼的質粒(PCT0129)來進行轉染效率的所有體內評估。轉染復合體一般含有與0.8-3.5mM脂質體和5％右旋糖復合物200μgDNA。利用上述裝置，通過與30測量針連結的P10導管將250μL復合體輸送到鼠的肺部。40小時后將動物處死，摘除肺并利用CATElisa試驗(BoehringerMannheim)分析酶活性。不同組的陽離子類脂與DOTMATM對比的結果顯示于圖8A中。數據表示為平均微微克CAT蛋白質/mg肺蛋白質(n＝8)，結果顯示在接受了與本發明類脂復合的DNA的動物體中檢測到的CAT蛋白質水平比接受了與DOTMATM復合的DNA的動物體中檢測到的CAT濃度高50倍。出于清晰和便于理解的目的，上述發明已通過圖表和實施例進行了詳細描述。對于本領域技術人員來說，顯然可在本權利要求書記載的范圍內進行改變和改動。因此，應理解為上面的描述是解釋性的，而不是限制性的。所以本發明的范圍不應依據上面的描述來確定，而應當根據下面的權利要求以及該權利要求所定義的等效物的整個范圍來確定。在本說明書中引用的所有專利、專利申請書和出版物均作為一整體而完全結合在此作為參考，就象每一單個專利、專利申請書或出版物均在此單獨地公開了一樣。權利要求1.式I化合物及其鹽、溶劑化物、拆分了及未拆分的對映體、非對映體和它們的混合物R1R2N-C(O)-A-X式I其中R1和R2可以是相同的或不同的，為C10-C26烴基；A為亞烴基，其中一個或多個亞甲基可被基團Y任意取代(假如Y基團彼此不能鄰接)，而每個Y可獨立地為-O-，-OC(O)-，-C(O)O-，-NR5-，-NR5C(O)-，-C(O)NR5-，NR5C(O)NR5-，-NR5C(O)O-，-OC(O)NR5-，-S(O)n-(n為0、1或2)或-NZ-C(＝NZ)NZ-，其中每個Z獨立地為H或-(CH2)mNR5-C(＝NR5)NR5，m為1-10的整數，而每個R5獨立地為H或低級烷基；X是(1)三烴基銨基，其中烴基彼此相同或不同，或(2)-NH-C(＝NR3)NHR4，其中R3和R4各自獨立地為烴基、鹵代烷基、羥烷基、O-保護的羥烷基、烷氧烷基、鹵代烷氧烷基、芳氧烷基、氨基烷基、單或二取代氨基烷基、N-保護的-氨基烷基、酰基、烷氧羰基、芳氧羰基、-C(O)NR6R7(其中R6和R7獨立地為H或烴基)、氮保護基，或R3和R4與它們連接的原子一起形成任意取代的單環或雙環化合物；但條件是當R1和R2相同，均為C16烷基，而X為-NH-C(＝NH)NH2時，A不為亞丁基鏈。2.按照權利要求1的化合物，其中X為-NH-C(＝NR3)NHR4。3.按照權利要求1或2的化合物，其中R1和R2為烷基或單不飽和鏈烯基。4.按照權利要求1-3任一項所述的化合物，其中R1和R2是相同的。5.按照權利要求1-4任一項所述的化合物，其中R1和R2為CH3(CH2)7CH＝CH(CH2)8-。6.按照權利要求1-5任一項所述的化合物，其中A為亞烷基。7.按照權利要求1-6任一項所述的化合物，其中A為亞甲基或亞乙基，而R3和R4均為H或N-保護的-氨基烷基。8.按照權利要求1-7任一項所述的化合物，其中R3和R4為選自下列基團的N-保護的-氨基烷基，選自2-(叔丁氧羰基氨基)乙基和3-(叔丁氧羰基)丙基。9.聚陰離子-類脂復合體，含有權利要求1-8中任一項所述的化合物和聚陰離子。10.權利要求9的聚陰離子類脂復合體，其中聚陰離子為核酸。11.按照權利要求9或10的聚陰離子類脂復合體，進一步含有靶向配體。12.按照權利要求9-11任一項所述的聚陰離子類脂復合體，其中核酸為表達質粒。13.權利要求12的聚陰離子-類脂復合體，其中所述表達質粒編碼IL-12或IκB。14.一種聚陰離子-類脂復合體的制備方法，所述方法包括下列步驟形成含權利要求1-8中任一項所述的化合物和任意共類脂的脂質體；和該脂質體與聚陰離子接觸形成權利要求9-13中任一項所述的聚陰離子-類脂復合體。15.一種將聚陰離子遞送到細胞中的方法，所述方法包括形成權利要求14的復合體并使該復合體與細胞接觸。16.一種藥物制劑，含有權利要求9-13中任一項所述的聚陰離子-類脂復合體和藥學上可接受的賦形劑。全文摘要本發明提供了新的陽離子類脂,特別是胍基類脂,以及它們的制備方法。還提供了含有本發明類脂的聚陰離子－類脂復合體,它們的制法以及將生物活性物質特別是核酸遞送到細胞的用途。文檔編號C07C279/14GK1180697SQ9712151公開日1998年5月6日申請日期1997年10月21日優先權日1996年10月22日發明者P·N·比龍爾,D·R·海斯非德,J·O·林克,J·J·內斯特,G·A·佩爾茨申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司