抗人gp39的人源化抗體,含有該抗體的組合物及其治療用途的制作方法

專利名稱：抗人gp39的人源化抗體,含有該抗體的組合物及其治療用途的制作方法
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本發(fā)明得到NIH授權(quán)號I期SBIR，項(xiàng)目號1R3926-01的部分基金支持。
本發(fā)明涉及特異于人gp39的人源化抗體，編碼該抗體的DNA，其制備方法，含有該抗體的藥物組合物，以及這種人源化抗體作為治療劑的用途。這些抗體在治療自身免疫疾病方面具有特殊的應(yīng)用，所述疾病包括例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化，糖尿病，和系統(tǒng)性紅斑狼瘡以及非自身免疫疾病，例如移植物抗宿主疾病和防止移植物排斥。發(fā)明背景免疫系統(tǒng)對外來抗原能產(chǎn)生兩種類型抗原特異性應(yīng)答。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性是用來指T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)的效應(yīng)子功能的術(shù)語。體液免疫性是用來指B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗原特異性抗體的術(shù)語。長期以來認(rèn)為抗大多數(shù)抗原的體液免疫性的進(jìn)程不僅需要產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞，而且涉及輔助T淋巴細(xì)胞(下文稱作Th)。(Mitchison，《歐洲免疫學(xué)雜志》(Eur.J.Immunol.)，118-25(1971)；Claman和Chaperon，《移植物評論》(Transplant Rev.)192-702624-2629(1973)；Raff等，《自然》(Nature)2261257-1260(1970))。在對依賴于胸腺抗原(下文稱TD)的刺激的應(yīng)答中Th提供某些信號，或“輔助”。一些B淋巴細(xì)胞輔助由Th細(xì)胞釋放的可溶性分子(例如淋巴因子例如IL-4和IL-5)介導(dǎo)的同時(shí)，B細(xì)胞的激活也需要B細(xì)胞和Th細(xì)胞之間依賴于接觸的相互作用。(Hirohata等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)1403736-3744(1988)；Bartlett等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，1431745-1765(1989))。這表明B細(xì)胞激活涉及B細(xì)胞和Th細(xì)胞上細(xì)胞表面分子之間的專性相互作用。對于激活的T細(xì)胞的分離的血漿膜能提供B細(xì)胞激活所必需的輔助功能這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步支持了這樣一種相互作用。(Brian，《美國國家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，85564-568(1988)；Hodgkin等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，1452025-2034(1990)；Noelle等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，1461118-1124(1991))。
進(jìn)一步得知在稱為“T細(xì)胞輔助功能”的依賴于接觸的過程中，CD4+T細(xì)胞指導(dǎo)B淋巴細(xì)胞的激活和分化，從而通過調(diào)節(jié)抗體分子的特異性，分泌和編碼同種型功能來調(diào)節(jié)體液免疫應(yīng)答。
(Mitchell et al.，J.Exp.Med.，128821(1968)；Mitchison，免疫學(xué)雜志.，168(1971)；Whiteetal.，J.Exp.Med.，14664(1978)；Reinherz et al.，雜志美國國家科學(xué)院院報(bào)，744061(1979)；Janeway et al.，Immunol.Rev.，10139(1988)；O′Brien et al.J.Immunol.，1413335(1988)；Rahemtulla et al.，自然，353180(1991)；and Grusby et al.，科學(xué)，2531417(1991)).
T細(xì)胞輔助B細(xì)胞分化的過程分為兩個(gè)不同的階段；誘導(dǎo)階段和效應(yīng)子階段(Vitetta等，《免疫學(xué)進(jìn)展》(Adv.Immunol.)，451(1989)；Noelle等，《今日免疫學(xué)》(Immunol.Today)，11361(1990))。在誘導(dǎo)階段，靜息T細(xì)胞接觸抗原至敏B細(xì)胞，這種關(guān)系使克隆型(clonotypic)T細(xì)胞受體(TCR)-CD4復(fù)合體與B細(xì)胞上的Ia/Ag復(fù)合體相互作用。(Janeway et al.，Immunol.Rev.，10139(1988)；Katz et al.，美國國立科學(xué)院院報(bào).，702624(1973)；Zinkernagel，Adv.Exp.Med.，66527(1976)；Sprent，J.Exp.Med.，1471159(1978)；Sprent，Immunol.Rev.，42158(1978)；Jones et al.，Nature，292547(1981)；Julius et al.，歐洲免疫學(xué)雜志.，18375(1982)；Chestnutet al.，免疫學(xué)雜志.，1261575(1981)；and Rogozinski et al.，免疫學(xué)雜志.，126735(1984)).TCR/CD4識別Ia/Ag導(dǎo)致生成穩(wěn)定的T-B關(guān)聯(lián)對和雙向T和B細(xì)胞激活(Sanders et al.，免疫學(xué)雜志.，1372395(1986)；Snow et al.，免疫學(xué)雜志，130614(1983)；Krusemeier et al.，免疫學(xué)雜志.，140367(1988)；Noelle et al.，免疫學(xué)雜志，1431807(1989)；Bartlettet al.，免疫學(xué)雜志，1431745(1989)；and Kupfer et al.，Annu.Rev.Immunol.，7309(1987)).在效應(yīng)子階段，激活的T細(xì)胞通過分泌淋巴因子(Thompson et al.，免疫學(xué)雜志.，134369(1985))and by contact-dependent stimuli(Noelle et al.，免疫學(xué)雜志，1431807(1989)；Clement et al.，免疫學(xué)雜志，1403736(1984)；Crow et al.，J.Exp.Med.，1641760(1986)；Brian，Proc.美國國立科學(xué)院院報(bào)，85564(1988)；Hirohataet al.，免疫學(xué)雜志1403736(1988)；Jover et al.，Clin.Immunol.Immun.，5390(1989)；Whalen et al.，免疫學(xué)雜志.，1412230(1988)；Pollok et al.，免疫學(xué)雜志，1461633(1991)；and Bartlett et al.，免疫學(xué)雜志，1431745(1990))，來驅(qū)動(dòng)B細(xì)胞分化，兩者都需要T細(xì)胞驅(qū)動(dòng)少量靜息B細(xì)胞終末分化到Ig分泌細(xì)胞(Clement et al.，免疫學(xué)雜志，132740(1984)；Martinez et al.，自然，29060(1981)；andAndersson et al.，美國國立科學(xué)院院報(bào)，USA，771612(1980)).
盡管T細(xì)胞輔助的誘導(dǎo)期是依賴Ag的和MHC限制的(Janeway等，《免疫學(xué)評論》(Immun.Rev.)，10134(1988)；Katz等，《美國國家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，102624(1973)；Zinkernagle，Adv.Exp.Med.Biol.，66527(1976))；但T細(xì)胞輔助的效應(yīng)子期是不依賴Ag的和MHC非限制的(Clement等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，132740(1984；Hirohata等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，1403736(1988)；Whalen等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，1431715(1988))。另外一個(gè)相反的性質(zhì)是T細(xì)胞輔助的誘導(dǎo)期通常需要CD4分子并且被抗CD4 mAb抑制(Rogozinski等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，126735(1984))，而輔助效應(yīng)子功能不需要CD4分子(Friedman等，《細(xì)胞免疫學(xué)》(CellImmunol.)，103105(1986))并且不被抗CD4 mAb抑制(Brian，《美國國家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，85564(1988)；Hirohata等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，1403736(1988)；Whalen等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，1431745(1988)；和Tohma等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，1462547(1991))。據(jù)信非特異性輔助效應(yīng)子功能通過定域T-B細(xì)胞與抗原特異性的關(guān)聯(lián)對相互作用的性質(zhì)而聚焦在特異性B細(xì)胞靶物上(Bartlett等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，1431745(1989)；Kupfer等，J.Exp.Med.，1651565(1987)和Poo等，《自然》(Nature)，332378(1988))。
盡管終末B細(xì)胞分化需要來自T細(xì)胞的接觸-和淋巴因子-介導(dǎo)的刺激，但是B細(xì)胞分化的中間階段可以在不存在分泌的因子情況下由激活的T細(xì)胞表面誘導(dǎo)(Crow et al.，J.Exp.Med.，1641760(1986)；Brian，美國國立科學(xué)院院報(bào)85564(1988)；Sekita et al.，Eur.J.Immunol.，181405(1988)；Hodgkin et al.，J.Immunol.，1452025(1990)；Noelle et al.，F(xiàn)ASEB J，52770(1991)).
這些對B細(xì)胞的中間作用包括表面CD23表達(dá)的誘導(dǎo)(Crow等，《細(xì)胞免疫學(xué)》(Cell Imunol.)12194(1989))，與細(xì)胞循環(huán)進(jìn)程相關(guān)的酶(Pollok等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，1461633(1991))和對淋巴因子的應(yīng)答(Noelle等，F(xiàn)ASEBJ.52770(1989)；Pollok等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，1461633(1991))。最近，已經(jīng)鑒定出了一些指導(dǎo)B細(xì)胞激活的誘導(dǎo)激活的T細(xì)胞表面分子。另外，功能研究也表征了一些指導(dǎo)B細(xì)胞激活的誘導(dǎo)激活的T細(xì)胞表面分子的性質(zhì)。第一，T細(xì)胞在激活4-8小時(shí)后獲得刺激B細(xì)胞的能力(Bartlett等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，1453956(1990)和Tohma等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，1462544(1991))。第二，與激活的T細(xì)胞表面相關(guān)的B細(xì)胞刺激活性保持在多聚甲醛固定的細(xì)胞(Noelle等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，1431807(1989)；Cros等，J.Exp.Med.，1641760(1986)；Pollok等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，1461633(1991)；Tohma等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，1462544(1991)和Kubota等，《免疫學(xué)》(Immunol.)，7240(1991))和在純化的膜片段上(Hodgkin等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，1452025(1990)和Martinez等，《自然》(Nature)，29060(1981))。第三，B細(xì)胞刺激活性對蛋白酶處理敏感(Noelle等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，1431807(1989)；Sekita等，《歐洲免疫學(xué)雜志》(Eur.J.Immunol.)，181405(1988)；和Hodgkin等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，1452025(1990))。第四，T細(xì)胞激活后獲得這些表面活性結(jié)構(gòu)的過程被放線菌酮抑制(Tohma等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，1962349(1991)和Hodgkin等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，1452025(1990))。
在當(dāng)與抗體交聯(lián)時(shí)，在未成熟和成熟B淋巴細(xì)胞上鑒定到一種細(xì)胞表面分子CD40，其誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖。Valle et al.，Eur.J.Immunol.，191463-1467(1989)；Gordon et al.，J.Immunol.，1401425-1430(1988)；Gruder et al.，J.Immunol.，1424144-4152(1989)已經(jīng)分子克隆了CD40并進(jìn)行了表征(Stamenkovic等，EMBO J.，81403-1410(1989))。
CD40在B細(xì)胞，交錯(cuò)對插樹突細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，濾泡樹突細(xì)胞，和胸腺上皮上被表達(dá)(Clark，《組織抗原》(Tissue Antigens)3633(1990)；Alderson等，J.Exp.Med.，178669(1993)；Galy等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，142772(1992))。人CD40是50kDa且屬于神經(jīng)生長因子受體族的I型膜蛋白(Hollenbaugh等，《免疫學(xué)評論》，(Immunol.Rev.)，13823(1994))。在IL-10存在下通過CD40發(fā)出信號誘導(dǎo)IgA，IgM，和IgG產(chǎn)生，表明通過這些相互作用調(diào)節(jié)同種型轉(zhuǎn)換。CD40和其配體之間的相互作用導(dǎo)致B細(xì)胞的致敏態(tài)，使其接受下面的信號。
一種CD40的配體，gp39(也稱作CD40配體或CD40L)最近已經(jīng)被分子克隆出來并被表征(Armitage等，《自然》(Nature)，35780-82(1992)；和Lederman等，J.Exp.Med.，1751091-1101(1992)；Hollenbaugh等，EMBO J.，114313-4319(1992))。gp39蛋白質(zhì)在激活的但不靜息的CD4+Th細(xì)胞上被表達(dá)。Spriggs等，J.Exp.Med.，1761543-1550(1992)；Lane等，《歐洲免疫學(xué)雜志》(Eur.J.Immunol.)，222573-2578(1992)；和Roy等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，1511-14(1993)。被gp39基因轉(zhuǎn)染并在其表面表達(dá)gp39的細(xì)胞能觸發(fā)B細(xì)胞增殖，并且與其它刺激信號一起能誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生。Armitage等，《自然》(Nature)，35780-82(1992；和Hollenbaugh等，EMBO J.，114313-4319(1992)。特別是對于小鼠(Noelle等，《美國國家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，896550(1992)；Armitage等，《自然》(Nature)，35780(1992))和對于人(Hollenbaugh等，EMBO.J.，114313(1992)；Spriggs等，J.Exp.Met.，1761543(1992))已經(jīng)鑒定出了CD40的配體，gp39。gp39是II型膜蛋白，并且是包括TNF-α，TNF-B和FAS，CD27，CD30和4-1BB的配體的新基因超家族的一部分。
使用抗-CD3抗體或者弗波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)加離子霉素可以在體外容易地誘導(dǎo)gp39的表達(dá)。表達(dá)快且是瞬時(shí)的，6-8小時(shí)達(dá)到高峰，24-48小時(shí)之間回到接近靜息水平(Roy等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，1512497(1993))。在體內(nèi)，據(jù)報(bào)道gp39在人體內(nèi)存在于淋巴樣濾泡的外層和中心帶和脾小動(dòng)脈周圍淋巴細(xì)胞鞘中的CD4+T細(xì)胞上，與CD40+B細(xì)胞相關(guān)(Lederman等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，)1493807(1992)。gp39+T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2，IL-4和IFN-γ(Van der Eetwegh等，J.Exp.Med.，1781555(1993))。
通過研究人疾病，伴X的IgM過度綜合癥(HIM)提供了對于gp39在調(diào)節(jié)體液免疫中的新作用的獨(dú)特的看法。HIM是特征在于喪失依賴胸腺的體液免疫，不能產(chǎn)生IgG，IgA，和IgE的意義深遠(yuǎn)的伴X免疫缺陷。gp39基因中的突變是無功能gp39蛋白質(zhì)表達(dá)和HIM患者輔助T細(xì)胞不能激活B細(xì)胞的原因(Allen等，《科學(xué)》(Science)，259990(1993)；Aruffo等，《細(xì)胞》(Cell)，72291(1993)；DiSanto等，《自然》(Nature)，361541(1993)；Korthauer等，《自然》(Nature)，361539(1993))。這些研究支持這樣的結(jié)論，即T細(xì)胞受體接合肽/MHC II類復(fù)合體之后早期，在關(guān)聯(lián)輔助T細(xì)胞上誘導(dǎo)gp39，而gp39與B細(xì)胞上CD40的結(jié)合誘導(dǎo)B細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)并分化，以進(jìn)行免疫球蛋白(Ig)分泌和同種型轉(zhuǎn)換。
功能研究表明，用抗-gp39處理小鼠完全破壞抗胸腺依賴性抗原(SRBC和TNP-KLH)的抗體反應(yīng)，但是對于胸腺非依賴性抗原(TNP-Ficoll)卻不是這樣(Foy等，J.Exp.Med.，1781567(1993))。另外，用抗-gp39處理防止用膠原蛋白注射的小鼠膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)的發(fā)展(Durie等，《自然》(Nature)，2611328(1993))。最后，抗-gp39防止小鼠脾內(nèi)記憶B細(xì)胞和胚中心的生成(Foy等，J.Exp.Med.，180157(1994))?？傊?，這些數(shù)據(jù)提供足夠的證據(jù)證明T細(xì)胞上的gp39與B細(xì)胞上的CD40之間的相互作用對于抗胸腺依賴性抗原的抗體反應(yīng)是必不可少的。
最近，已經(jīng)開發(fā)出一些自身免疫疾病的小鼠模型來評價(jià)給藥抗-gp39對病情發(fā)展的潛在的治療價(jià)值。下面提供對于模型研究結(jié)果的簡要討論膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎CIA是人自身免疫疾病類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的動(dòng)物模型(Trenthorn等，J.Exp.Med.，146857(1977))。通過給予異源II型膠原蛋白在很多物種中可以誘導(dǎo)該疾病(Courtenay等，《自然》(Nature)，283665(1980)；Cathcart等，Lab.Invest.，5426(1986))。
為了研究抗-gp39對CIA誘導(dǎo)的作用(Durie等，《科學(xué)》(Science)，2611328(1993))，對雄性DBA1/J小鼠在尾根部真皮內(nèi)注射在弗氏完全佐劑中乳化的小雞II型膠原蛋白。21天后進(jìn)行下面的攻擊。然后用相關(guān)的對照抗體或抗-gp39處理小鼠。與免疫的未處理對照小鼠相比，用抗-gp39處理的小鼠組顯示出沒有抗膠原蛋白抗體的效價(jià)。組織學(xué)分析表明用抗-gp39處理的小鼠顯示出沒有在免疫動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的炎性癥狀或疾病的任何典型的病理組織學(xué)表現(xiàn)。這些結(jié)果表明gp39-CD40的相互作用在CIA誘導(dǎo)中是絕對必不可少的。如果沒有獲得T細(xì)胞和B細(xì)胞之間初始的關(guān)聯(lián)相互作用，則不會(huì)發(fā)生下游的過程，例如自身抗體的生成和產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
最近發(fā)現(xiàn)gp39在激活單細(xì)胞產(chǎn)生沒有GM-CSF，IL-3和IFN-γ的TNF-α和IL-6中是重要的(Alderson等，J.Exp.Med.，178669(1993))。TNF-α涉及CIA疾病過程(Thorbecke等，《歐洲免疫學(xué)雜志》(Eur.J.Immunol.)，897375(1992)和RA(DiGiovane等，Ann.Rheum.Dis.，4768(1988)；Chu等，Arthrit.Rheum.，391125(1991)；Brennan等，《歐洲免疫學(xué)雜志》(Eur.J.Immunol.)，221907(1992)。因此抗-gp39對TNF-α的抑制作用在關(guān)節(jié)炎小鼠的關(guān)節(jié)中具有意義深遠(yuǎn)的抗炎作用?？?gp39對TNF-α的抑制作用和對T細(xì)胞-B細(xì)胞相互作用的抑制作用兩者有助于CIA的出現(xiàn)。
實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)EAE是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的實(shí)驗(yàn)性自身免疫疾病(Zamvil等，Ann.Rev.Immunol.，8579(1990))，并且是人自身免疫疾病，多發(fā)性硬化(MS)的疾病模型(Alvord等，“多發(fā)性硬化的實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性模型”(Experimental Allergic Model forMultiple Sclerosis)NY511(1984))。通過免疫接種從CNS純化的髓鞘堿性蛋白或致腦炎蛋白脂質(zhì)(PLP)容易在哺乳動(dòng)物物種中誘導(dǎo)該疾病。SJL/J小鼠是小鼠(H-2s)的敏感物種，通過誘導(dǎo)EAE，這些小鼠發(fā)生急性癱瘓病癥，并且在CNS中鑒定到急性細(xì)胞滲入。
Classen及其同事(未公開數(shù)據(jù))研究了抗-gp39對誘導(dǎo)SJL/J的EAE的作用。他們發(fā)現(xiàn)在抗-gp39處理的動(dòng)物體內(nèi)EAE進(jìn)展完全被抑制。另外，與對照動(dòng)物相比，抗-PLP抗體應(yīng)答延遲和減少。
EAE是通過T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞介導(dǎo)自身免疫疾病的一個(gè)例子，沒有直接的證據(jù)證明病情進(jìn)展中需要自身抗體。阻礙gp39與CD40之間的相互作用防止疾病誘發(fā)和疾病的繼承轉(zhuǎn)移。
慢性(c)和急性(a)移植物抗宿主疾病(GVHD)慢性和急性GVHD由對宿主異種MHC等位基因應(yīng)答的供者細(xì)胞產(chǎn)生。在c GVHD中，因?yàn)橥N異體輔助T細(xì)胞和宿主B細(xì)胞的相互作用而產(chǎn)生增加的多克隆免疫球蛋白。在體內(nèi)，抗-gp39抗體的施用阻斷c GVHD誘導(dǎo)的血清抗-DNA自身抗體，IgE的產(chǎn)生，體外自發(fā)性免疫球蛋白的產(chǎn)生，相關(guān)的脾腫大和轉(zhuǎn)移疾病的能力。Durie F.H.等，J.Clin.Invest.，94133(1994)。在給藥抗-gp39中止之后很長時(shí)間，抗體產(chǎn)生保持被抑制。a GVHD中誘導(dǎo)的抗-同種異體細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答通過體內(nèi)給予抗-gp39也被防止。這些數(shù)據(jù)表明CD40-gp39相互作用在產(chǎn)生兩種形式的GVHD中是關(guān)鍵的。CTL應(yīng)答被抑制以及用抗-gp39暫短處理引起疾病的長期抑制的事實(shí)證明通過共同給予同種異體細(xì)胞和抗-gp39抗體對于T細(xì)胞空間的永久性改變。
很多研究小組報(bào)道了特異于gp39的鼠抗體的生產(chǎn)，公開了該抗體具有作為免疫抑制劑的治療用途。例如，Columbia大學(xué)申請的，1993年5月27日公開的WO93/09812；1993年8月18日公開的EP0555880，和Noelle等人發(fā)明的Dartmouth College在1994年9月2日申請的PCT US/94/09872，描述了特異于gp39的鼠抗體及其作為治療劑的用途。
但是，在鼠抗體具有作為人體治療劑的應(yīng)用能力的同時(shí)，其在某些方面具有缺點(diǎn)。具體地說，因?yàn)樗鼈兪峭鈦矸N源的事實(shí)，鼠抗體在人體內(nèi)可能是免疫原性的。這經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致中和抗體反應(yīng)，如果期望重復(fù)施用該抗體，例如在治療慢性或復(fù)發(fā)疾病中期望復(fù)施用該抗體，則這是一個(gè)特殊的問題。也因?yàn)樗麄儼蠓€(wěn)定區(qū)，所以它們可能不具有人效應(yīng)子功能。
為了消滅或減少這些問題，公開了嵌合抗體。嵌合抗體包含兩種不同的抗體部分，一般是兩種不同物種的抗體。一般情況下，這種抗體包含人穩(wěn)定區(qū)和其它物種，一般是鼠可變區(qū)。例如，已經(jīng)有報(bào)道說一些鼠/人嵌合抗體具有親代小鼠抗體的結(jié)合特征和與人穩(wěn)定區(qū)相關(guān)的效應(yīng)子功能。參見，例如，Cabilly等，美國專利No.4816567；Shoemaker等，美國專利No.4978745；Beavers等，美國專利No.4975369；和Boss等，美國專利No.4816397，所有這些專利在此引作參考。一般來說，這些嵌合抗體通過從預(yù)先存在的鼠雜交瘤中提取的DNA中制備基因組基因庫而構(gòu)建(Nishimura等，《癌癥研究》(Cancer Research)，47999(1987))。然后在該基因庫中從具有正確抗體片段重排模式的重鏈和輕鏈兩者中篩選可變區(qū)基因?；蛘?，由從雜交瘤提取的RNA制備cDNA庫并篩選，或者通過聚合酶鏈反應(yīng)獲得可變區(qū)。然后，將克隆的可變區(qū)基因連接到包含合適的重鏈或輕鏈人穩(wěn)定區(qū)基因的克隆彈夾的表達(dá)載體中。然后在選擇的細(xì)胞系中表達(dá)嵌合基因，選擇的細(xì)胞系通常是鼠骨髓瘤細(xì)胞系。在人的治療中使用這樣的嵌合抗體。
在一個(gè)共同申請中，登記號是No.07/912292，公開了“靈長目化”的抗體，其包含人穩(wěn)定區(qū)和Old World猴可變區(qū)。這些靈長目化TM抗體在人體內(nèi)相容性很好，給出低或弱的免疫原性。
人源化抗體也是本領(lǐng)域公知的。理想的情況是，“人源化作用”產(chǎn)生一種抗體，其沒有免疫原性，并且完全保留源分子的抗原結(jié)合性質(zhì)。為了保留源分子的所有抗原結(jié)合性質(zhì)，其結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)必須在“人源化”變體中如實(shí)地再現(xiàn)。通過將非人抗體結(jié)合位點(diǎn)移植到人構(gòu)架有可能實(shí)現(xiàn)這一方案，或者(a)將整個(gè)非人可變區(qū)移植到人穩(wěn)定區(qū)來產(chǎn)生一種嵌合抗體(Morrison等，《美國國家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，816801(1984)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，4465(1988)(其保持配體結(jié)合性質(zhì)，但是，也保持了非人可變區(qū)的免疫原性))；(b)通過只將非人CDRs移植到人構(gòu)架和保留或沒有保留關(guān)鍵的構(gòu)架殘基的穩(wěn)定區(qū)(Jones等，《自然》(Nature)，321522(1986)；Verhoeyen等，《科學(xué)》(Science)，2391539(1988))；或(c)通過移植全部的非人可變區(qū)(以保持配體結(jié)合性質(zhì))，但是也通過暴露的殘基的毗鄰的置換用類人表面將其包埋(以減少免疫原性)(Padlan，《分子免疫學(xué)》(Molec.Immunol.，28489(1991))。
主要的是，通過CDR移植的人源化包括只將CDRs移植到人構(gòu)架和穩(wěn)定區(qū)。理論上講，這基本上消除了免疫原性(除了如果存在同種異型或獨(dú)特型)。但是據(jù)報(bào)道也需要保留一些源抗體的構(gòu)架殘基(Riechmann等，《自然》(Nature)，332323(1988)；Queen等，《美國國家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，86029(1989))。
需要保留的構(gòu)架殘基可以通過計(jì)算機(jī)模型鑒定。或者關(guān)鍵構(gòu)架殘基可以通過與已知抗體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)相比較而有效地確定(Padlan，《分子免疫學(xué)》(Molec.Immunol.，31(3)169-217(1994))。
有效力地影響抗原結(jié)合的這些殘基分成幾個(gè)組。第一組包括與結(jié)合位點(diǎn)表面接觸的殘基，因此其能直接接觸抗原。它們包括氨基酸末端殘基和那些與CDRs毗鄰的殘基。地二組包括或者通過接觸CDRs或者通過接觸相反鏈能改變CDRs結(jié)構(gòu)或相對順序的殘基。第三組包括包埋能影響可變區(qū)結(jié)構(gòu)整合性的側(cè)鏈的氨基酸。根據(jù)正式采用的編號體系(參見Kabat等，“免疫學(xué)蛋白質(zhì)的序列測定”(Sequences ofproteins of immunological interest)，第5版，出版號91-3242，U，S.Dept.Health & Human Services，NIH，Bethesda，MD，1991)通常在相同的位置發(fā)現(xiàn)這些組中的殘基(Padlan，1994，(Id.))。
但是，盡管人源化抗體是人所期望的，因?yàn)樗鼈兙哂性谌梭w內(nèi)的可能的低免疫原性，但是它們的生產(chǎn)是不可預(yù)測的。例如，抗體的序列改變可能會(huì)導(dǎo)致抗原結(jié)合功能基本上甚至全部喪失，或者喪失結(jié)合特異性?；蛘?，不考慮序列改變，“人源化抗體”在人體內(nèi)仍然具有免疫原性。
因此，本領(lǐng)域仍然非常需要對于所期抗原的新的人源化抗體。更具體地說，本領(lǐng)域存在對于特異于gp39的人源化抗體，因?yàn)樗鼈冇凶鳛槊庖咧委焺┑男堋０l(fā)明目的為此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供特異于人gp39的人源化抗體。
更具體地說，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供從一種抗gp39鼠抗體，特別是結(jié)合人gp39的特異性鼠抗體24-31的鼠抗體衍生的人源化抗體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有對人gp39是特異性的人源化抗體的藥物組合物。
本發(fā)明更具體的目的是提供含有從一種特異結(jié)合人gp39的鼠抗體24-31衍生的人源化抗體的藥物組合物。
本發(fā)明另一個(gè)具體的目的是使用抗人gp39人源化抗體治療人疾病的方法，通過調(diào)節(jié)gp39表達(dá)和/或抑制gp39/CD40結(jié)合相互作用可以治療的疾病包括例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化，特發(fā)性血小板減少紫癜(ITP)，糖尿病，和非自身免疫疾病，例如移植物抗宿主疾病和移植。
本發(fā)明再一個(gè)目的是提供編碼抗人gp39人源化抗體的核酸序列。
本發(fā)明更具體的目的是提供編碼從一種特異結(jié)合人gp39抗原的鼠抗體24-31衍生的人源化抗體的核酸序列。
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種載體，其用于抗人gp39人源化抗體的表達(dá)，特別是特異結(jié)合人gp39抗原的鼠抗體24-31衍生的人源化抗體的表達(dá)。發(fā)明概述在最主要的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及例如在測定T細(xì)胞依賴性抗體產(chǎn)生的B細(xì)胞測試中，保持不小于大約十分之一，更優(yōu)選不小于三分之一鼠24-31抗體的gp39抗原結(jié)合親和性和/或保持不小于大約十分之一，更優(yōu)選不小于三分之一鼠抗體24-31的體外功能活性的人源化抗體。更特別地，在以不大于24-31抗體濃度3倍濃度的B細(xì)胞測試中，本發(fā)明人源化抗體保持至少十分之一，更優(yōu)選至少大約三分之一體外功能活性的半數(shù)最大效能。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及人源化抗體，其結(jié)合與鼠24-31抗體相同的表位和/或其能與鼠24-31抗體競爭對于CD40對gp39結(jié)合的抑制和/或其包含24-31抗體CDR’s。
本發(fā)明更優(yōu)選地涉及由鼠24-31衍生的人源化抗體，其具有如下所示的人源化可變輕鏈序列和/或人源化可變重鏈序列(1)DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITC KASQNVITAVA WYQQKPGKSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLELK；(2)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KASQNVITAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(3)DIVMTQSPSFMSTSVGDRVTITC KASQNVITAVA WYQQKPGKSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQPEDFADYEC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(4)DIVMTQSPDSMATSLGERVTINC KASQNVITAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQAEDVADYFC QQYNSYPYT FGGGTXLEIK和選自下組的人源化可變重鏈序列(1)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSIT NGFWI WIRKPPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTLTVSS；(2)EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSIT NGFWI WIRKAPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(3)EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGDSIT NGFWI WIRKHPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSNNQFSLNLNSVTRADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(4)EVQLQESGPLVKPSETLSLTCAVYGDSIT NGFWI WIRKPPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFYLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS以及其變體或等價(jià)物。本發(fā)明中其變體或等價(jià)物是指包括其中上述鑒定的人源化可變重鏈和/或可變輕鏈序列中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸以基本上不影響gp39抗原結(jié)合親和性的方式通過取代，增加和/或缺失而被改變的人源化免疫球蛋白序列。特別是，本發(fā)明包括包含保守取代突變，即一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被類似氨基酸取代的變體和等價(jià)物。例如保守取代指相同大類中氨基酸的取代，例如一個(gè)酸性氨基酸，或一個(gè)堿性氨基酸，一個(gè)中性氨基酸被相同類中的另一個(gè)氨基酸取代。保守氨基酸取代要實(shí)現(xiàn)的目的是本領(lǐng)域公知的。優(yōu)選的是，這樣的變體和等價(jià)物要保持不小于大約十分之一，更優(yōu)選不小于三分之一親代鼠24-31抗體的gp39抗原結(jié)合親和性，更優(yōu)選不小于三分之一鼠24-31抗體的gp39抗原結(jié)合親和性。另外，這樣的變體和等價(jià)物優(yōu)選在例如在測定T細(xì)胞依賴性抗體產(chǎn)生的B細(xì)胞測試中，保持不小于十分之一，更優(yōu)選保持不小于大約三分之一鼠抗體24-31的體外功能活性。更優(yōu)選地，這樣的變體和等價(jià)物在例如在測定T細(xì)胞依賴性抗體產(chǎn)生的B細(xì)胞測試中，將保持至少大約三分之一鼠抗體24-31的體外功能活性。更特別地，在以不大于親代24-31抗體濃度大約3倍濃度的B細(xì)胞測試中，這些抗體將保持體外功能活性的半數(shù)最大效能。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼這樣的人源化抗體的表達(dá)的核酸序列，以及為在重組宿主細(xì)胞中產(chǎn)生人源化抗體而提供的表達(dá)載體。在最為優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些DNA序列將編碼下面的人源化可變重鏈序列和/或人源化可變輕鏈序列(1)DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITC KASQNVITAVA WYQQKPGKSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(2)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KASQNVITAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(3)DIVMTQSPSFMSTSVGDRVTITC KASQNVITAVA WYQQKPGKSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQPEDFADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(4)DIVMTQSPDSMATSLGERVTINC KASQNVITAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNKYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQAEDVADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK和選自下組的人源化可變重鏈序列(1)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSIT NGFWI WIRKPPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(2)EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSIT NGFWI WIRKHPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(3)EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGDSIT NGFWI WIRKHPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSNNQFSLNLNSVTRADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(4)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVYGDSIT NGFWI WIRKPPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFYLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS.
而且本發(fā)明也包括如上所定義的其等價(jià)物和變體。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及上述鑒定的特異于gp39的人源化抗體作為藥物的用途。本發(fā)明也涉及本發(fā)明人源化抗gp39抗體治療通過調(diào)節(jié)gp39的表達(dá)或通過抑制gp39/CD40相互作用而可治療的疾病的用途。本發(fā)明更特別地涉及上述鑒定的特異于gp39的人源化抗體在治療自身免疫疾病中的人源化抗體的用途，所述疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化，糖尿病，和系統(tǒng)性紅斑狼瘡以及ITP。本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明人源化抗gp39抗體治療非自身免疫疾病包括移植物抗宿主疾病和抑制移植物排斥的用途。附圖的簡要說明

圖1是用來表達(dá)自24-31衍生的人源化和嵌合抗體的IDEC表達(dá)載體。
圖2a是B細(xì)胞增殖測試結(jié)果，人PBLs與可溶性gp39-CD8，重組人IL-4和鼠24-31抗體或?qū)φ帐驣gG1單克隆抗體接觸，證明24-31抗體抑制gp39誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖。
圖2B是B細(xì)胞分化測試結(jié)果，使用在IGD+B細(xì)胞存在下培養(yǎng)的固定的抗-CD3激活的絲裂霉素處理的T細(xì)胞，并使用24-31抗體的不同濃度，證明24-31抗體抑制由人B細(xì)胞引起的T細(xì)胞依賴性多克隆抗體的產(chǎn)生。
圖3是非轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞和一種gp39轉(zhuǎn)染物的FACS。
圖4是相應(yīng)于指定為VL#1或優(yōu)選的人源化可變輕鏈序列(1)的優(yōu)選的人源化可變輕鏈序列(包括互補(bǔ)決定區(qū))的氨基酸序列和DNA序列。
圖5是相應(yīng)于指定為VL#2或優(yōu)選的人源化可變輕鏈序列(2)的優(yōu)選的人源化可變輕鏈序列(包括互補(bǔ)決定區(qū))的氨基酸序列和DNA序列。
圖6是相應(yīng)于指定為VH#1或優(yōu)選的人源化可變重鏈序列(1)的優(yōu)選的人源化可變重鏈序列(包括互補(bǔ)決定區(qū))的氨基酸序列和DNA序列。
圖7是24-31可變輕鏈序列(非人源化)的氨基酸序列和DNA序列。
圖8是24-31可變重鏈序列(非人源化)的氨基酸序列和DNA序列。
圖9是鼠24-31，嵌合的24-31和人源化24-31抗體對CHO細(xì)胞中表達(dá)的gp39的結(jié)合的比較。
圖10是比較24-31(生物素)，和人源化的，嵌合的24-31對在CHO細(xì)胞中表達(dá)的gp39的結(jié)合的競爭測試的結(jié)果。
圖11是測定鼠24-31和本發(fā)明人源化24-31抗體對在絲裂霉素C處理的T細(xì)胞的存在下培養(yǎng)的B細(xì)胞引起的人IgM產(chǎn)生的作用的試驗(yàn)結(jié)果。
圖12是比較本發(fā)明兩種人源化抗體結(jié)合CHO細(xì)胞中表達(dá)的gp39的測試的結(jié)果。
圖13是鼠24-31Scatchard作圖。
圖14是人源化變體1的Scatchard作圖。
圖15是人源化變體2的Scatchard作圖。
圖16是表明gp39-CD8融合蛋白存在下H24-31.1的FcRI結(jié)合，并表明當(dāng)與抗原配合時(shí)H24-31.1只結(jié)合Fc受體I。
圖17是表明gp39-CD8融合蛋白存在下H24-31.1的FcRII結(jié)合，并表明當(dāng)與抗原配合時(shí)H24-31.1只結(jié)合Fc受體II。
圖18給出使用Alamar Blue的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性，并表明在大約0.5μg/ml H24-31.1抑制50％的細(xì)胞生長。
圖19是gp39+CHO結(jié)合H24-31.1(非人源化25-31變體1)的Clq結(jié)合的測定。具體地說，用各種H24-31.1濃度標(biāo)記的gp39+CHO細(xì)胞在過量人Clq(補(bǔ)體因子1)中培養(yǎng)，并接著與FITC標(biāo)記的山羊抗人Clq培養(yǎng)。樣品用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器測定來確定Clq對細(xì)胞的相對標(biāo)記。該圖也表明用Clq標(biāo)記細(xì)胞取決于抗體的濃度，H24-31.1Fab片段(沒有Clq結(jié)合)不結(jié)合Clq。
圖20表明H24-31.1對T細(xì)胞的作用應(yīng)答于T細(xì)胞依賴性recall抗原。該圖也表明，≥1μg/ml H24-31.1時(shí)，TT誘導(dǎo)的生長和IL-2的產(chǎn)生被最大抑制，大約40％左右。
圖21給出H24-31.1對T細(xì)胞依賴性B細(xì)胞分化的作用。該圖也表明，H24-31.1在1ng/ml時(shí)，抑制T細(xì)胞依賴性IgG產(chǎn)生大約85％。在較高濃度下可見的IgG產(chǎn)生的明顯增加是由于該試驗(yàn)不能從B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體中區(qū)分H24-31.1。
圖22給出H24-31.1Fab對T細(xì)胞依賴性B細(xì)胞分化的作用。也給出了抗gp39抗體抑制T細(xì)胞依賴性B細(xì)胞IgG產(chǎn)生的抑制作用。該圖還表明全H24-31.1抗體和其Fab片段在抑制IgG產(chǎn)生方面沒有區(qū)別。
圖23表明H24-31.1對抗原特異性B細(xì)胞的產(chǎn)生的作用應(yīng)答于T細(xì)胞依賴性recall抗原。用破傷風(fēng)類毒素體外致敏3天的人脾細(xì)胞以大約1×107個(gè)細(xì)胞/SCID的濃度轉(zhuǎn)移給SCID小鼠。6天后用PBS(第1組)或用300μg H24-31.1(第1和2組)對得到的hu-SPL-SCId小鼠注射。第3組小鼠再接受兩次300μg H24-31.1注射，每次間隔3天。在不同的時(shí)間點(diǎn)給小鼠抽血，并通過ELISA測定人IgG抗破傷風(fēng)類毒素滴度水平。該圖也表明注射H24-31.1抑制大約90％破傷風(fēng)類毒素特異性應(yīng)答的產(chǎn)生(第3組)。3個(gè)組之間總的人IgG水平是相似的。
圖24表明可溶性gp39-CD8對人B細(xì)胞的增殖作用。在4天增殖試驗(yàn)中，不同濃度的gp39-CD8與富集的人IL-4B細(xì)胞加一起培養(yǎng)。在B細(xì)胞加沒有g(shù)p39-CD8的IL-4的培養(yǎng)物中得到的CPM用作背景，并從用gp39-CD8刺激的試驗(yàn)培養(yǎng)物中的總的CPM中扣除。與PWM加IL-4培養(yǎng)的細(xì)胞作為B細(xì)胞增殖的正對照。CPM代表三聯(lián)試驗(yàn)的樣品的平均CPM。
圖25給出H24-31對B細(xì)胞增殖的抑制作用。在4天增殖試驗(yàn)中，不同濃度的H24-31.1抗體與用IL-4(1000U/ml)和10μg/ml的gp39-CD8培養(yǎng)的B細(xì)胞(1×105)一起溫育。與PWM加IL-4培養(yǎng)的細(xì)胞作為B細(xì)胞增殖的正對照。CPM代表三聯(lián)試驗(yàn)的樣品的平均CPM。
圖26表示人源化24-31變體對CD40-Ig結(jié)合gp39的阻斷。該圖也說明了鼠和人源化變體24-31阻斷CD40-Ig結(jié)合。發(fā)明的詳細(xì)說明在進(jìn)行本發(fā)明之前，說明書中使用的一些術(shù)語的定義在下面列出人源化抗體--這里指從非人抗體，一般是鼠抗體衍生的一種抗體，其保持或基本上保持親代抗體的抗原結(jié)合性質(zhì)但是在人體內(nèi)幾乎沒有免疫原性?？梢酝ㄟ^多種方法來實(shí)現(xiàn)，包括(a)將整個(gè)非人可變區(qū)移植到人穩(wěn)定區(qū)來產(chǎn)生一種嵌合抗體；(b)通過只將非人CDRs移植到人構(gòu)架和保留或沒有保留關(guān)鍵的構(gòu)架殘基的穩(wěn)定區(qū)；或(c)通過移植全部的非人可變區(qū)，但是通過表面殘基的置換用類人區(qū)將其包埋。這些方法公開在Jones等，Morrison等，《美國國家科學(xué)院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，816851-6855(1984)；Morrison和Oi，《免疫學(xué)進(jìn)展》(Adv.Immunol.)，4465-92(1988)；Verhoeyen等，《科學(xué)》(Science)，2391534-1536(1988))；Padlan，《分子免疫學(xué)》(Molec.Immunol.，28489-498(1991)；Padlan，《分子免疫學(xué)》(Molec.Immunol.，31(3)169-217(1994)。所有這些文獻(xiàn)在此引作參考。
互補(bǔ)決定區(qū)，或CDR--這里使用的術(shù)語CDR指根據(jù)Kabat等(1991)描述的共同確定結(jié)合親和性和天然免疫球蛋白結(jié)合位點(diǎn)的天然Fv區(qū)的特異性的氨基酸序列。
構(gòu)架區(qū)--這里使用的術(shù)語FR指插入到CDRs之間的氨基酸序列。抗體的這些部分用來保持CDRs的合適取向(使CDRs結(jié)合抗原)。
穩(wěn)定區(qū)--是指授予效應(yīng)子功能的抗體分子部分。在本發(fā)明中鼠穩(wěn)定區(qū)被人穩(wěn)定區(qū)取代。本發(fā)明嵌合的或人源化抗體的穩(wěn)定區(qū)從人的免疫球蛋白衍生。重鏈穩(wěn)定區(qū)選自下面的五種同種型的任何一個(gè)α，6，ε，γ，或ν。而且，不同亞類的重鏈(例如重鏈的IgG亞類)決定不同的效應(yīng)子功能，因此，通過選擇期望的重鏈穩(wěn)定區(qū)，可以產(chǎn)生具有期望效應(yīng)子功能的嵌合抗體。優(yōu)選的穩(wěn)定區(qū)是γ1(IgG1)，γ3(IgG3)，和γ4(IgG4)。更優(yōu)選的是γ1(IgG1)同種型的Fc區(qū)。輕鏈穩(wěn)定區(qū)可以是κ或λ型，優(yōu)選κ型。
嵌合抗體--這是一種包含由兩種不同抗體，一般是不同種的抗體衍生的序列的抗體。最典型的嵌合抗體包含人和鼠抗體片段，通常是人的穩(wěn)定區(qū)和鼠的可變區(qū)。
免疫原性--一種當(dāng)對受者施用時(shí)，瞄向蛋白質(zhì)或治療部分以減少免疫反應(yīng)(體液或細(xì)胞)的能力的尺度。本發(fā)明涉及本發(fā)明人源化抗體或其片段的免疫原性。
減少了免疫原性的人源化或嵌合抗體--這是指相對于親代抗體來說具有減少的免疫原性的一種抗體或人源化抗體，例如24-31抗體。
基本上保持親代抗體結(jié)合特性的人源化抗體--這是指一種人源化或嵌合抗體，其保留了特異性結(jié)合于被用來產(chǎn)生這種人源化或嵌合抗體的親代抗體識別的抗原的能力。基本上保持24-31結(jié)合特性的人源化或嵌合抗體將結(jié)合人gp39。優(yōu)選人源化或嵌合抗體將具有相同或基本上相同的抗原結(jié)合親和性和和親代抗體一樣的親合力。理想的情況是，抗體的親和性將不小于親代抗體親和性的10％，更優(yōu)選不小于大約30％，最優(yōu)選親和性將不小于親代抗體親和性的50％。測定抗原結(jié)合親和性的方法是本領(lǐng)域公知的，并且包括半數(shù)最大值結(jié)合測定，競爭試驗(yàn)，和Scatchard分析。本申請描述了合適的抗原結(jié)合測試。
本發(fā)明涉及新的人源化單克隆抗體，其結(jié)合人gp39，并且涉及其作為治療劑的用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼所述人源化抗體的核酸序列，并涉及它們在重組宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
更具體地說，本發(fā)明涉及從鼠抗體24-31衍生的特異性結(jié)合人gp39的人源化抗體。
鼠抗體24-31是抗人gp39，其體內(nèi)和體外功能滅活gp39。因此其具有使其有效價(jià)地用于治療其中期望gp39滅活和/或調(diào)節(jié)或抑制gp39/CD40相互作用的疾病的性質(zhì)。特別是，這些疾病包括自身免疫疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化，ITP，糖尿病，和系統(tǒng)性紅斑狼瘡以及非自身免疫疾病，例如移植物抗宿主疾病和移植物排斥。
但是在鼠抗體24-31具有使其有效價(jià)地適用于作為一種治療劑的功能特性的同時(shí)其也具有幾個(gè)潛在的缺點(diǎn)。也就是說因?yàn)槠涫鞘笤?，所以在人體中潛在地存在免疫原性。也因?yàn)槠浒蠓€(wěn)定區(qū)序列，因此其將可能不具有全部范圍的人效應(yīng)子功能，而且如果對人施用有可能更快地被清除。盡管這些缺點(diǎn)在治療某些疾病和人中可能是沒有問題的，但是如果要治療的疾病是慢性病或復(fù)發(fā)病，則它們會(huì)造成實(shí)質(zhì)性的憂慮。復(fù)發(fā)病和慢性病的例子包括例如自身免疫疾病，其中宿主連續(xù)地或慢性地具有一種抗自身抗原的自身免疫反應(yīng)。
因此為了緩和這些與鼠抗體24-31相關(guān)的缺點(diǎn)，即減輕在人體內(nèi)的潛在的免疫原性和降低人效應(yīng)子功能，本發(fā)明人產(chǎn)生改進(jìn)的人源化的鼠24-31抗體衍生物。這是本發(fā)明的目標(biāo)，期望的結(jié)果不是常規(guī)的性質(zhì)或者不是可預(yù)測的性質(zhì)。抗體的人源化作用需要要改變的氨基酸殘基的仔細(xì)選擇，和要取而代之的殘基的審慎選擇。因?yàn)榭贵w可變區(qū)的改變，甚至是只包括幾個(gè)氨基酸殘基的改變，都可能對抗原結(jié)合產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性的有害影響。例如，人源化抗體可以具有相對于親代抗體的極大地減小的抗原親和性和/或抗原特異性。
如上文所指出的，抗體，包括鼠抗體的人源化的不同方法已經(jīng)在文獻(xiàn)中公開。參見，例如，Padlan，《分子免疫學(xué)》(Molec.Immunol.)，28484-498(1991)；Padlan，《分子免疫學(xué)》(Molec.Immunol.)，31(3)169-217(1994)；Morrison和Oi，《免疫學(xué)進(jìn)展》(Adv.Immunol.)，4465-92(1988)，所有這些文獻(xiàn)在此全文引作參考。這些方法特別包括通過CDR移植的人源化作用(Jones等，《自然》(Nature)，321522-525(1986)；Verhoeyen等，《科學(xué)》(Science)，2391534-1539(1988)；和Padlan，《分子免疫學(xué)》(Molec.Immunol.)，28489(1991)和Padlan，《分子免疫學(xué)》(Molec.Immunol.)，31(3)169(1994)更特定的報(bào)道，其涉及非基本構(gòu)架氨基酸殘基的選擇以及其通過合適的取代突變而進(jìn)行的改變。這些文獻(xiàn)在此全文引作參考。
正如所指出的，CDR移植技術(shù)在成功地用于一些情況的同時(shí)，可能實(shí)質(zhì)性不利地影響得到的人源化抗體的親和性。據(jù)信因?yàn)槟承?gòu)架殘基影響或?qū)τ谟绊懣乖Y(jié)合是必需的和至少影響抗原結(jié)合而發(fā)生。我們的技術(shù)(Padlan(1994)(上文))更精確，因?yàn)槲覀冎槐Ａ粑覀冋J(rèn)為對在盡可能保持和人一樣的分子的表面特性的同時(shí)保持抗體結(jié)合位點(diǎn)是關(guān)鍵的那些鼠構(gòu)架殘基。因此該項(xiàng)技術(shù)具有產(chǎn)生保持親代抗體抗原結(jié)合特征的人源化抗體的可能性。因?yàn)槿绱?，本發(fā)明人選擇這項(xiàng)技術(shù)作為本發(fā)明方法，通過該方法可以有效地獲得從特異于人gp39的鼠抗體24-31衍生的人源化抗體。
24-31可變區(qū)的克隆(下面的實(shí)施例中有詳細(xì)描述)產(chǎn)生24-31抗體所利用的VL和VH序列的特征，分別在圖7和圖8中給出。序列測定后然后將可變區(qū)人源化。如所指出的，根據(jù)Padlan(1994)(上文)的方法，這實(shí)質(zhì)上是有效的，這篇文獻(xiàn)在此引作參考。
該方法一般包括用人構(gòu)架殘基置換非人構(gòu)架，同時(shí)只保留我們認(rèn)為對保持抗原結(jié)合特性是至關(guān)重要的那些構(gòu)架殘基。理想的情況是，該方法在外源基因抗體的表面上引入類人特征，從而使其在保留影響其抗原結(jié)合特性的內(nèi)部和接觸殘基的同時(shí)具有最小的免疫原性。
更具體地說，圖7和圖8中給出的24-31VK和VH序列通過與人抗體報(bào)道的序列的比較而人源化，其認(rèn)為是“模板”。
特別是使用下面的作為模板將24-31VK人源化(a)對于VL#1，人V-κ亞組I序列，例如DEN和類似物，以及012種系(參見Cox等，《歐洲免疫學(xué)雜志》(Eur.J.Immunol.)，24827-836(1994))，對于VL#2，人V-κ亞組IV序列，例如LEN。這些模板序列是已知的，并且在Kabat等(1991)(上文)或基因庫中有所報(bào)道。
使用下面的作為模板將24-31VH#1人源化(a)人VH亞組IV序列，58p2和(b)(基因庫登記號)Z18320和3d75d種系(S.Van der Maarel等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，1502858-2868(1993))。
這些模板可變重鏈抗體序列也是已知的，并且在Kabat等，“免疫學(xué)蛋白質(zhì)的序列測定”(Sequences of proteins of immunologicalinterest)，第5版，NIH(1991)和基因庫中有所報(bào)道。
模板人可變重鏈和輕鏈序列根據(jù)幾個(gè)不同的關(guān)鍵因素選擇，包括，特別是，總體上與24-31高度序列相似性，以及“重要”殘基的相似性，即據(jù)信包括在VL∶VH界面中的那些殘基；與互補(bǔ)決定區(qū)接觸的那些殘基，或者隱含指出的那些殘基。也這樣選擇模板，使保留據(jù)信影響抗原結(jié)合的甘氨酸，脯氨酸和其它特定氨基酸殘基。
該方法產(chǎn)生下面優(yōu)選的從24-31抗體衍生的人源化VL和VH重鏈序列，這在下面的表1和表2中給出。
如上所討論，本發(fā)明進(jìn)一步包括這些優(yōu)選的人源化序列的變體和等價(jià)物，例如，包含不實(shí)質(zhì)性影響gp39結(jié)合的一個(gè)或幾個(gè)保守的氨基酸取代的那些序列?；パa(bǔ)決定區(qū)在圖7和8中鑒定，其包含親代(非人源化)24-31抗體的全部可變重鏈和輕鏈CDR序列。
表1人源化24-31VL序列10204060708024-31 DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITC KASQNVITAVA WYQQKPGQSPKLLIY BASNRYT GVPDRFSGSGSGTDFTLTISNMQSEDLADYFC QQYNSYPYT100FGGGTKLEIK(1) DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITC KASQNVITAVA WYQQKPGKSPKLLIY SASNRYT GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFADYFC QQYNSYPYTFGGGTKLEIK(2) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KASQNVITAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYT GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVADYFC QQYNSYPYTFGGGTKLEIK(3) DIVMTQSPSFMSTSVGDRVTITC KASQNVITAVA WYQQKPGKSPKLLIY SASNRT GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQPEDFADYFC QQYNSYPYTFGGGTKLEIK(4) DIVMTQSPDSMATSLGERVTINC KASQNVITAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYT GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQAEDVADYFC QQYNSYPYTFGGGTKLEIK
表2人源化24-31VH序列1020 3040 70 82abc 9024-31 EVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSIT NGFWI WIRKFPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKS RISITRDTSQNQFYLQLNSVTTEDTGTYYCAC110RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS(1) EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSIT NGFWI WIRKPPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKS RISISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTGVYYCACRSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS(2) EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSIT NGFWI WIRKHPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKS RISISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTGVYYCACRSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS(3) EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGDSIT NGFWI WIRKHPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKS RISISRDTSNNQFSLNLNSVTRADTGVYYCACRSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS(4) EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVYGDSIT NGFWI WIRKPPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKS RISISRDTSKNQFYLKLSSVTAADTGVYYCACRSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS
從中可以看出，對于VH和VL鏈兩者設(shè)計(jì)了4個(gè)優(yōu)選的人源化構(gòu)架序列。因此使用上面鑒定的人源化VH和VL24-31序列可以合成16種不同的可能的人源化24-31抗體，不包括包含保守修飾的變體和等價(jià)物。
包含這些人源化可變重鏈和輕鏈序列的人源化24-31抗體可以通過重組方法獲得。期望包含上述優(yōu)選的人源化可變序列的任何結(jié)合的人源化序列都產(chǎn)生結(jié)合人gp39的人源化抗體。但是，以這些序列為基礎(chǔ)，使用表1和表2給出的編號的優(yōu)選順序期望如下(1) #1 VLwith #1 VH(變體1)(2) #2 VLwith #1 VH(變體2)(3) #1 VLwith #2 VH(變體3)(4) #2 VLwith #2 VH(變體4)上述鑒定的人源化VH和VL序列可以被進(jìn)一步改變，例如，通過引入一個(gè)或幾個(gè)另外的取代修飾，也可以通過加入其它氨基酸?？梢赃x擇附加的修飾，其不不利地影響抗原(gp39)結(jié)合。例如發(fā)明人期望通過取代殘基34，43，44和68中的一個(gè)或幾個(gè)進(jìn)一步修飾VH鏈(根據(jù)Kabat編號方案)，Kabat等(1991)(上文)。發(fā)明人還期望修飾VL鏈的殘基85。以抗體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)特征為基礎(chǔ)，相信這樣的殘基的修飾也不會(huì)對抗原結(jié)合有不利的影響。而且，期望引入一個(gè)或幾個(gè)保守氨基酸取代不會(huì)不利地影響gp39結(jié)合。
為了更好地描述本發(fā)明人源化24-31，VH和VL序列，在下面的表3中還給出了優(yōu)選的人源化構(gòu)架序列，將這些序列與模板人可變重鏈和輕鏈構(gòu)架序列相比較，即人DEN VK1，人012/V37種系，人DENVKIV，人58p2，人Z18320，和人3d75d，以及與非人源化鼠24-31 VH和VL構(gòu)架序列比較。
表3VK構(gòu)架區(qū)比較 -人源化 抗-gp39FR1 FR2人 012/V3b 種系 DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITC WYQQKPGKAPKLLIY人 DEN VKI ---------T------------- -------E---V---鼠 24-31--V----QK-M-T------S--- -------QS------VL#1 人源化 --V-------------------- --------S------Padlan
FR3 FR4人012/V3bGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC人DEN VKL-------------E---------SD-------FGQGTKLEIK鼠24-31 ---D----------------NM-SE-L-D-F---G-------Padlan VL#1 ---D------------------------D-F---G-------FR1 FR2人LEN VKIVDIVMTQSPDSLAVSLGERATINC WYQQKPGQPPKLLIY鼠24-31 -------QKFMST-V-D-VS-T- --------S------Padla VL#2人源化 ----------------------- --------S------FR3 FR4人 LEN VKIVGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCFGQGTKLEIK鼠 24-31 --------------------NM-S--L-D-F---G-------Padlan VL#2 ----------------------------D-F---G-------FR1人 S8p2 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIS鼠 24-31 E---------S----Q------S-T-D--TPadlan VH#1 人源化 E-------------------------D--T人 Z18320 基因庫 ---------------Q--------------表3(續(xù))人3d75d 種系 ---------------Q--------------Padlan VH#2 人源化E--------------Q----------D--TFR2 FR3人S8p2 WIRQPPGKGLEWIG RVTISVDTSKNQFSLELSSVTAADTAVYYCAR鼠24-31 ---KF--NK--YM- -IS-TR---Q---Y-Q-N---TE--GT----CPadlan VH#1 ---K---NK--YM- -IS--R-------------------G-----C人Z1S320 -----A-------- --------------------------------鼠3d75d ----E--------- --------------------------------Padlan VH#2 ---KH--NK--YM- -IS--R-------------------G-----C人58p2 WGQGTMVTVSS鼠24-31 -----TL----Padlan VH#1 -----TL----人Z18320 -----------Padlan VH#2 -----TL----
為了制備人源化抗體，合成了編碼上述鑒定的人源化VL和VH序列的DNA序列。如所指出的，考慮這4種人源化VL序列和4種人源化VH序列，有16種可以合成的可能的人源化抗原結(jié)合位點(diǎn)?？紤]到可能的人源化VH的殘基34，43，44和68以及人源化VL的殘基85被其它的氨基酸殘基的取代和/或保守取代突變的可能的插入，甚至還會(huì)有更多的可能的人源化抗原結(jié)合位點(diǎn)。在圖4，5和6中分別給出了兩個(gè)優(yōu)選的人源化可變輕鏈序列(1)和(2)和一個(gè)包括互補(bǔ)決定區(qū)的優(yōu)選的人源化可變重鏈序列(1)和相應(yīng)的DNA序列。
合成編碼已知序列蛋白質(zhì)的DNA的方法是本領(lǐng)域公知的。使用這樣的方法合成編碼本發(fā)明人源化VL和VH序列的DNA序列，然后在適于表達(dá)重組抗體的載體系統(tǒng)中表達(dá)。可以在提供使目的人源化VL和VH序列被表達(dá)為具有人穩(wěn)定區(qū)序列和產(chǎn)生功能(抗原結(jié)合)抗體相關(guān)的融合蛋白的任何載體系統(tǒng)中進(jìn)行。
適于表達(dá)重組抗體，特別是人源化抗體的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域公知的。
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已知能表達(dá)功能免疫球蛋白的宿主細(xì)胞舉例包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，COS細(xì)胞，骨髓瘤細(xì)胞，細(xì)菌例如大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)，酵母細(xì)胞，例如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)，連同其它宿主細(xì)胞。在這些宿主細(xì)胞中很多研究者使用CHO細(xì)胞，其具有有效表達(dá)和分泌免疫球蛋白的能力。
基本上是，人源化抗體的重組體表達(dá)通過兩種常規(guī)方法中的一種進(jìn)行。在第一種方法中，用為表達(dá)與選擇的穩(wěn)定區(qū)融合的重鏈和輕鏈可變序列兩者而提供的單一載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。在第二種方法中，用兩種載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，這兩種載體分別為了表達(dá)與選擇的穩(wěn)定區(qū)融合的可變重鏈或輕鏈序列。
人穩(wěn)定區(qū)序列是本領(lǐng)域公知的，并且在文獻(xiàn)中有所報(bào)道。優(yōu)選的人VL序列包括κ和λ穩(wěn)定輕鏈序列。優(yōu)選的人重鏈穩(wěn)定序列包括人γ1，人γ2，人γ3，人γ4，及其突變的變體，其為了改變作用或功能例如體內(nèi)增強(qiáng)的半衰期和降低的Fc受體結(jié)合而提供。
人γ4穩(wěn)定區(qū)優(yōu)選的修飾包括P和/或E修飾，分別指在236位由亮氨酸變?yōu)楣劝彼岷?或作29位由絲氨酸變?yōu)楦彼?Kabat編號)，這描述共同轉(zhuǎn)讓的在1995年9月6日登記的Attorney DocketNo.012712-165中，這里全文引作參考。
特別優(yōu)選的載體系統(tǒng)包括在下面的共同轉(zhuǎn)讓的1995年6月7日申請的U.S.登記號08/476237，1995年1月25日申請的登記號08/397072，1993年11月3日申請的08/147696，1992年11月13日申請的07/977691，1992年7月10日申請的07/912122，1992年3月23日申請的07/886281，和1991年7月25日申請的07/735064，專利全文引作參考。
特別是，這些申請描述了被稱為TCAE5.2和TCAE6的重組抗體的生產(chǎn)所用的載體系統(tǒng)，包括下面步驟1)串聯(lián)順序的4個(gè)轉(zhuǎn)錄彈夾(a)人免疫球蛋白輕鏈穩(wěn)定區(qū)。在TCAE5.2中有人免疫球蛋白κ輕鏈穩(wěn)定區(qū)(Kabat編號氨基酸108-214，同種異型Km3)且在TCAE6中有人免疫球蛋白輕鏈λ穩(wěn)定區(qū)(Kabat編號氨基酸108-215，基因型Oz-，Mcg-，Ke-同種異型)。
(b)人免疫球蛋白重鏈穩(wěn)定區(qū)；在兩個(gè)構(gòu)建中人免疫球蛋白重鏈?zhǔn)铅?、穩(wěn)定區(qū)(Kabat編號氨基酸114-478，同種異型Gmla，Gm12)。
(c)DHFR；包含其自身真核啟動(dòng)子和聚腺苷酸化區(qū)；和(d)NEO；也包含其自身真核啟動(dòng)子和聚腺苷酸化區(qū)。
2)人免疫球蛋白輕鏈和重鏈彈夾包含免疫球蛋白鏈分泌作用的合成信號序列；和3)人免疫球蛋白輕鏈和重鏈彈夾包含使輕鏈和重鏈免疫球蛋白可變區(qū)插入的特異性DNA接頭，其保持翻譯讀框并且不改變免疫球蛋白鏈中正常發(fā)現(xiàn)的氨基酸。
ANNEX2載體是TCAE載體的一種修飾，其包含在新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo)起始密碼子處兩個(gè)不同的修飾。第一處修飾是加入了一處讀框外上游翻譯起始位點(diǎn)。第二處修飾是修飾了新霉素基因的起始位點(diǎn)使其較小效率。NEOSPLA載體是ANNEX2載體的一種修飾。用合成供體/受體剪切位點(diǎn)將新霉素基因切割成兩部分，并將輕鏈，重鏈，和DHFR基因置于新霉素內(nèi)含子中。
這些載體優(yōu)選在CHO細(xì)胞中使用。本發(fā)明抗體優(yōu)選在上述載體系統(tǒng)中表達(dá)。
但是，從序號24-31抗體衍生的本發(fā)明人源化抗體序列也可以在任何為了功能抗體，即那些結(jié)合gp39抗原的抗體的表達(dá)而提供的載體系統(tǒng)中表達(dá)。
特別是發(fā)明人選擇了在CHO細(xì)胞中用包含人κ和人γ1穩(wěn)定區(qū)的N5KG1表達(dá)載體表達(dá)本發(fā)明人源化VL和VH序列，以及由24-31衍生的天然的(未修飾的)VL和VH序列。N5KG1表達(dá)載體在圖1中給出了圖示。正如所期望的，由24-31衍生的嵌合抗體，當(dāng)在CHO細(xì)胞中表達(dá)時(shí)結(jié)合gp39(通過結(jié)合CHO-gp39轉(zhuǎn)染物而證明)。由24-31衍生的幾種本發(fā)明人源化抗體當(dāng)使用該載體系統(tǒng)表達(dá)時(shí)產(chǎn)生功能(gp39結(jié)合)抗體。
下面將通過下面的實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。這些實(shí)施例是為了詳細(xì)說明的目的而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例1選擇人源化作用的24-31抗體動(dòng)物模型采集的證據(jù)證明施用抗-gp39防止多種自身免疫疾病并且阻滯同種異體移植排斥。這些結(jié)果提供了使人非信不可的證據(jù)，即這些抗人gp39抗體在處理自身免疫缺陷疾病和同種異體組織和器官移植中具有明顯的治療價(jià)值。已經(jīng)報(bào)道了一種特異于人gp39的單克隆抗體(mAb)(Lederman等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，1993817(1992))，并且評價(jià)了其體外阻斷gp39-CD40相互作用的功能活性。為了更深入研究抗-gp39抗體對人免疫系統(tǒng)的功能效果，制備了一系列抗-人gp39單克隆抗體。這一系列單克隆抗體中，一種mAb顯示優(yōu)異，并且體內(nèi)和體外對gp39的功能滅活進(jìn)行了廣泛試驗(yàn)。
更具體地說，通過用人gp39(gp39-CD8)可溶性融合蛋白免疫接種，接著用激活的人外周血T細(xì)胞攻擊，得到6只鼠的一系列(都是IgG1)抗gp39抗體。人外周血T細(xì)胞的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)測定證明mAbs識別激活的(PMA/離子霉素)而不是靜息的CD3+T細(xì)胞上表達(dá)的細(xì)胞表面分子，而且反應(yīng)性模式類似于用重組CD40融合蛋白(CD40-Ig)所見到的(沒有給出數(shù)據(jù))[35S]代謝方法標(biāo)記的激活的人外周血T細(xì)胞的免疫沉淀證明6種mAbs的每一種沉淀出與用CD40-Ig沉淀的分子大小類似(33kDa)的分子。最后，在這些抗體存在下CD40-Ig對gp39的結(jié)合被阻斷，表明識別相同的分子，進(jìn)一步證明它們的特異性。
盡管所有6種mAbs能阻斷gp39功能，但是，選擇一種mAb，24-31進(jìn)行廣泛試驗(yàn)。
實(shí)施例2T細(xì)胞依賴性B細(xì)胞增殖和分化(Ig產(chǎn)生)被抗-gp39阻斷。
一系列研究提供證據(jù)證明通過CD40，通過其配體，gp39傳送的信號誘導(dǎo)B細(xì)胞激活，增殖，分化，和同種型轉(zhuǎn)換。為了測定抗-gp3924-31mAb是否阻斷gp39功能，B細(xì)胞在存在或不存在24-31下與gp39(gp39-CD8)可溶性融合蛋白一起培養(yǎng)，并通過3H-胸苷摻入測定B細(xì)胞增殖應(yīng)答。圖2A給出的結(jié)果證明gp39-CD8誘導(dǎo)B細(xì)胞的大量增殖。以2.5μg/ml這樣低的濃度存在的抗-gp39 24-31mAb完全阻滯了gp39-CD8誘導(dǎo)B細(xì)胞的增殖。為了測定24-31是否干擾T細(xì)胞誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖，B細(xì)胞在存在或不存在24-31下與抗-CD3激活的T細(xì)胞一起培養(yǎng)，12天后測定多克隆IgM，IgG，和IgA的產(chǎn)生。如圖2B所示，加入24-31，抑制多克隆IgM，IgG，和IgA的產(chǎn)生(90-99％)。這些結(jié)果證實(shí)了先前的報(bào)道，即在T細(xì)胞依賴性B細(xì)胞分化中需要gp39-CD40相互作用(Nishioka等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，1531027(1994))，并且進(jìn)一步證明新表征的抗-人gp3924-31mAb在阻斷gp39功能中的用途。
實(shí)施例3抗gp-39體內(nèi)阻斷scid小鼠體內(nèi)用人PBL重新構(gòu)建破傷風(fēng)類毒素特異性抗體的產(chǎn)生。進(jìn)行多種研究，可以在體內(nèi)在試驗(yàn)條件下通過使用用人外周血淋巴細(xì)胞移植的嚴(yán)重合并的免疫缺陷(scid)小鼠(PBL-scid小鼠)(Mosler等，《自然》(Nature)，335256(1988)McCune等，2411632(1988))。通過用人PBL注射在scid鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)長期的嵌合狀態(tài)，在體內(nèi)用可以攻擊的人-PBL-scid小鼠體內(nèi)測定抗原特異性第二抗體應(yīng)答(Carlsson等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，1481065(1992)；Duchosal等，《細(xì)胞免疫學(xué)》(Cell Immunol.)139468(1992))。利用該系統(tǒng)來測定體內(nèi)給予抗-gp39對人T細(xì)胞和B細(xì)胞引起的沒有反應(yīng)的免疫抑制作用。圖2B所示的試驗(yàn)結(jié)果證明24-31對gp39功能的阻斷體外抑制了由人B細(xì)胞引起的T細(xì)胞依賴性多克隆Ig產(chǎn)生。為了測定24-31是否體內(nèi)也抑制抗原特異性B細(xì)胞抗體的產(chǎn)生，腹膜內(nèi)(i.p.)注射人PBL(人-PBL-scid)并用破傷風(fēng)類毒素(TT)免疫接種的C.B-17scid/scid小鼠用24-31或PBS處理，并且測定第二(IgG)抗-TT抗體應(yīng)答。用TT對人-PBL-scid免疫接種在免疫接種14天內(nèi)在大多數(shù)動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生了可檢測水平的IgG抗-TT抗體(表4)。但是，測定到用抗-gp39(24-31；250μg/天，每周兩次)處理在9/10小鼠內(nèi)完全阻斷第二抗-TT抗體應(yīng)答，證明體內(nèi)阻斷gp39功能也導(dǎo)致抗原特異性體液應(yīng)答的抑制。受體品系 治療 抗破傷風(fēng)抗體(O.D.±SE)5含抗破傷風(fēng)抗體的小鼠之頻率免疫后的天數(shù)7d 14d 21d 28dC.B-17 PHS ＜0.02(0/10)2.30±.042.224±.040 .137+.007scid/scid (7/10)*(8/10)**(4/10)anti-gp39 .162 (1/10)＜0.02 (0/10) ＜0.02 (0/10) ＜0.02 (0/10)表4.用破傷風(fēng)類毒素免疫接種的C.B-17scid/scid小鼠體內(nèi)移植人PBL后第二抗-破傷風(fēng)類毒素抗體應(yīng)答的抑制*。用20×106人PBL和0.25ml破傷風(fēng)類毒素對4-6周大小的C.B-17scid/scid小鼠腹膜內(nèi)注射。
在整個(gè)試驗(yàn)中每周腹膜內(nèi)給予兩次抗-gp3924-31或PBS(250μg/注射)。
§每周通過ELISA測定血清中人抗破傷風(fēng)類毒素抗體的水平。所有小鼠水平在1∶10稀釋度時(shí)＞0.1000.D.，則認(rèn)為是陽性的。在計(jì)算表中包括的平均±SE值時(shí)只使用陽性小鼠。來自預(yù)先免疫的沒有接種破傷風(fēng)類毒素的小鼠的血清中人抗破傷風(fēng)類毒素抗體的水平＜0.02O.D.，數(shù)據(jù)以平均±SE表示。
*與抗-gp39處理的組明顯不同(p＝0.222)。
**與抗-gp39處理的組明顯不同(p＜0.001)。
實(shí)施例4抗-gp39處理不抑制人-PBL-scid脾細(xì)胞的抗原特異性T細(xì)胞增殖反應(yīng)。
為了測定用抗-gp39處理人-PBL-scid小鼠是否會(huì)改變體內(nèi)抗原特異性T細(xì)胞的應(yīng)答，并且體外測定來自用TT免疫接種并用24-31處理的人-PBL-scid小鼠的脾細(xì)胞的增殖應(yīng)答。來自對照或抗-gp39處理人-PBL-scid小鼠的脾細(xì)胞與TT培養(yǎng)或者培養(yǎng)基單獨(dú)培養(yǎng)，6天后通過3H-胸苷摻入來測定增殖應(yīng)答。表5總結(jié)了一項(xiàng)這樣的的試驗(yàn)的結(jié)果。用抗-gp39處理人-PBL-scid小鼠的體外用TT刺激的應(yīng)答類似于沒有處理的人-PBL-scid小鼠(5/10對3/10應(yīng)答小鼠)。使用NOD/LtSz-scid/scid小鼠作為受者得到了類似的結(jié)果，盡管抗-TT抗體在這些小鼠體內(nèi)是不可檢測的(沒有給出數(shù)據(jù))。這些數(shù)據(jù)證明用抗-gp39處理不導(dǎo)致人-PBL-scid小鼠抗原特異性T細(xì)胞的缺失或功能滅活，并且支持了這樣的結(jié)論，即抗-gp39對TT特異性抗體應(yīng)答的抑制歸因于gp39-CD40相互作用和接下來的B細(xì)胞應(yīng)答的阻斷，而不是T細(xì)胞滅活受體品系 *治療
應(yīng)答小鼠頻率C.B-17 scid/scid PBS 3/10anti-gp39 5/10NOD/LtSz-scid/scidPBS 5/10anti-gp39 6/10表5.抗-gp39處理不改變破傷風(fēng)類毒素接種的C.B.-17-scid/scid或NOD/LtSz-scid/scid小鼠中移植人PBL后抗破傷風(fēng)T細(xì)胞增殖反應(yīng)。
*用20×106人PBL和0.25ml破傷風(fēng)類毒素對4-6周大小的C.B-17scid/scid或NOD/LtSz-scid/scid小鼠腹膜內(nèi)注射。
在整個(gè)試驗(yàn)中每周腹膜內(nèi)給予兩次抗-gp3924-31或PBS(250μg/注射)。
§來自用人PBL注射并接種了破傷風(fēng)類毒素的小鼠的脾細(xì)胞以1×105細(xì)胞/ml濃度在單獨(dú)培養(yǎng)基或破傷風(fēng)類毒素存在下(2.5或5.0μg/ml)培養(yǎng)。6天后通過3H-胸苷摻入來測定增殖作用。通過下面的計(jì)算式計(jì)算刺激指數(shù)S.I.＝cpm破傷風(fēng)-cpm培養(yǎng)基/cpm培養(yǎng)基。S.I.＞2.0被認(rèn)為陽性。
實(shí)施例5gp39CHO轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的產(chǎn)生。
最近，產(chǎn)生了組成型表達(dá)細(xì)胞表面gp39的CHO轉(zhuǎn)染物來用作本申請建議的人源化抗-gp39 24-31結(jié)合研究的試劑。全長gp39基因(Hollenbaugh等，Immunol.Rev.，13823(1994))通過植物凝集素激活的人PBL的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，并在轉(zhuǎn)錄控制巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件下克隆到IDEC’s INPEP4載體。建立CHO轉(zhuǎn)染物并在50nM氨甲蝶呤中擴(kuò)增。通過ELISA(沒有給出數(shù)據(jù))和FACS分析表明，轉(zhuǎn)染物，50D4，表達(dá)細(xì)胞表面gp39(圖3)。該轉(zhuǎn)染物也指作mgp39 CHO(膜結(jié)合gp39轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞)。
實(shí)施例6使用CHO表達(dá)系統(tǒng)高水平表達(dá)抗體。
在CHO細(xì)胞中使用IDEC’s所有的N5KG1表達(dá)載體來表達(dá)人源化抗-gp39 24-31抗體。該載體在圖1中給出了圖示。使用該載體和類似載體在CHO中保持獲得重組抗體的高水平表達(dá)。使用這些載體，發(fā)現(xiàn)高百分比，5-10％的G418抗性克隆表達(dá)明顯量的重組體蛋白(1-10mg/l抗體)。這些通常是單一質(zhì)?？截愓象w，并且通過使用氨甲蝶呤可以容易地?cái)U(kuò)增，獲得30-100pg/細(xì)胞/天分泌的免疫球蛋白。表6列出了使用該系統(tǒng)在CHO細(xì)胞中表達(dá)的3種抗體的基因擴(kuò)增之前和之后獲得的抗體水平?？贵w 擴(kuò)增之前在搖瓶中擴(kuò)增之后在發(fā)酵罐中擴(kuò)增之后mg/lmg/lmg/lAnti-CD4γ11-2100-110 950Anti-CD4γ43-4125-150 N.D.Anti-CD20 5-10 200-300 650表6.使用IDEC’sCHO表達(dá)技術(shù)的抗體產(chǎn)生水平。
實(shí)施例7克隆24-31VK和VHDNA序列克隆抗-gp39 24-31VK和VHDNA基因片段并測定序列。測定其序列后，設(shè)計(jì)V區(qū)基因片段的人源化變體。合成相應(yīng)的DNA序列，并且克隆到包含人穩(wěn)定區(qū)基因的高水平表達(dá)載體中。然后建立產(chǎn)生人源化24-31抗體的CHO轉(zhuǎn)染物。為了證明抗-gp39抗體的人源化變體保持其gp39結(jié)合特性，在直接結(jié)合和競爭測試中比較鼠和人源化抗體的相對親和性。另外，評價(jià)了人源化24-31阻斷CD40結(jié)合gp39的能力和抑制T細(xì)胞依賴性抗體產(chǎn)生的能力。
1.克隆24-31VK和VH基因片段a.制備cDNA。根據(jù)廠商說明，利用Invitrogen CorporationMicroFast TrackTMmRNA分離試劑盒，從24-31雜交瘤和NS1細(xì)胞系，在產(chǎn)生24-31雜交瘤中使用的融合配對物(partner)各2×106個(gè)細(xì)胞中制備PloyA+mRNA，(Carroll等，《分子免疫學(xué)》(Mol.Immunol.)，10991(1988))。使用50pmol寡-dT和5單位M-MLV反相轉(zhuǎn)錄酶(Promega)(Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989))合成第一條cDNA鏈，接著進(jìn)行Sephadex G-25色譜。
b.VK和VHcDNA的PCR擴(kuò)增。使用一系列與3’穩(wěn)定區(qū)引物結(jié)合的特異于VK或VH前導(dǎo)序列的5’引物，通過PCR擴(kuò)增24-31和NS1cDNA。這一系列5’VH引物與Jones和Bending描述的那些引物相同(《生物/技術(shù)》(Bio/Technol.)，988(1991)；Errata，《生物/技術(shù)》(Bio/Technol.)，9579(1991))。修飾這一系列5’VK引物(Jones等，(上文))，將Sal I克隆位點(diǎn)識別序列(GTCGAC)轉(zhuǎn)變成Bgl II識別序列(AGATCT)，以利于擴(kuò)增的基因片段克隆到IDEC’sN5KG1表達(dá)載體中(見圖1)。3’VK和VH引物分別在氨基酸位置108-109包含一個(gè)Bsi WI克隆位點(diǎn)序列(根據(jù)Kabat等人的編號，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版，NIH(1991))和在114-115位置包含一個(gè)Nhe I克隆位點(diǎn)序列，具有下面的序列TGCAGCATCCGTACGTTTGATTCCAGCTT(Cκ)andGGGGGTGTCGTGCTAGCTG(A/C)(G/A)GAGAC(G/A)GTGA(Cγ1).
先前Assignee使用該引物擴(kuò)增和克隆C2B8抗-CD20抗體(Nishioka等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)，1531027(1994))和一些其它鼠VK和VH基因片段(沒有給出數(shù)據(jù))。
為了測定擴(kuò)增24-31VK和VH基因片段的正確引物對，在包含與CK引物結(jié)合的11個(gè)5’VK引物中的一個(gè)或者與Cγ1引物結(jié)合的12個(gè)5’VH引物中的一個(gè)的23個(gè)各個(gè)反應(yīng)中擴(kuò)增24-31cDNA。為了比較，使用相同序列的NS1 cDNA擴(kuò)增。在含有5單位Taq DNA聚合酶(PerkinElmer)，10mM Tris-HC1，pH8.3，50mM Kcl，1.5mM MgCl2，0.25mM各dCTB，dGTP，dATP，和TTP，50pmol3’穩(wěn)定區(qū)引物，和50pmol5’引物的100μl終體積中擴(kuò)增1μl cDNA(1/50 cDNA樣品)。擴(kuò)增周期由95℃變性1分鐘，50℃退火2分鐘，72℃延伸2分鐘組成，重復(fù)34次。擴(kuò)增的產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分析。重復(fù)對于VK和對于VH得到特定擴(kuò)增產(chǎn)物的24-31PCR反應(yīng)，并且克隆來自重復(fù)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是用瓊脂糖凝膠純化的(Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版(1989))，并用Bgl II和Bsi WI(對于VK)或Sal I和NheI(對于VH)消化。接著將這些產(chǎn)物(Ausabel等，《當(dāng)代分子生物學(xué)方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，Vol.2GreenePubl.Assoc.(1992))連接到IDEC’s載體，N5KG1。
轉(zhuǎn)化E.coli XL1-blue細(xì)胞(Stratagene)之后，制備質(zhì)粒DNA，從復(fù)制品構(gòu)建獲得VK和VH序列(通過Scripps Research InstituteCore Facility，La Jolla，CA，進(jìn)行序列測定)。NS1融合配對物的內(nèi)源輕鏈和重鏈的序列是已知的(Carroll等，《分子免疫學(xué)》，10991(1988)；Kabat等，(1991)(上文))，并且用來區(qū)分由24-31對NS1融合配對物V區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物。
實(shí)施例8合成編碼人源化24-31V區(qū)的基因片段。
合成包含在表1和2中鑒定為人源化VK和VH(1)的最優(yōu)選的人源化24-31VK和VH序列的人源化變體。具體地說，合成了編碼上面鑒定的人源化VK或VH區(qū)的4對重疊倒入，互補(bǔ)性寡核苷酸(oligos)(Midland Chemicals)，并且通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳純化(Ausabel等，《當(dāng)代分子生物學(xué)方法》(Current Protocolsin Molecular Biology)，Vol.2Greene Publ.Assoc.(1992))。每光光束的直徑D。
具有干涉能力的光子對主要來自屏幕上其相位為2π整數(shù)倍的那些地點(diǎn)，就是說彼此相距大約為
。這樣，由光子對形成的、來自平面y的光在干涉能力方面可以與一個(gè)光柵相比擬。但是它們將部分的通過散射體可能不均勻的、以后導(dǎo)至斑點(diǎn)的散射所抵消。
與此相反，這一個(gè)鏡面上這種類型的干涉最大點(diǎn)在大的距離內(nèi)重新合成為一個(gè)總的光束，這樣，此探討表明為什么只有在散射的表面上才能觀察到斑點(diǎn)。
值得注意的是，在給定的公式1.0中對于相位差的余弦完全沒有路徑差y1-z和y2-z的貢獻(xiàn)。這表明，在屏幕上數(shù)量級為一個(gè)波長的相移在光子出射之前對此項(xiàng)只有可以忽略不計(jì)的貢獻(xiàn)。在多光子干涉基礎(chǔ)上的斑點(diǎn)通過數(shù)量級為一個(gè)波長的相移不能完全消除，這一點(diǎn)與所觀察的現(xiàn)象一致。
此外由此解釋中得出，一個(gè)不在受激輻射范圍內(nèi)運(yùn)行的激光器不再呈現(xiàn)出斑點(diǎn)在一個(gè)平面上的x1和x2的觀察只能用于發(fā)射激光的激光器，因?yàn)橹挥羞@樣才能單值確定在激光器出射面上的相位狀態(tài)。在一個(gè)光纖激光器的非發(fā)射激光的狀態(tài)下。與此相反，光子產(chǎn)生地點(diǎn)x1和x2在玻璃纖維方向相互移動(dòng)，這樣，x1和x2在激光光束的傳輸方向上相距甚遠(yuǎn)，所以對x1和x2的積分可以通過取平均值消除余弦項(xiàng)。
這種模型探討可以與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致的解釋斑點(diǎn)現(xiàn)象。通過這種解釋來解決斑點(diǎn)問題以前并沒有找到。
現(xiàn)在為了減少斑點(diǎn)建議以適當(dāng)?shù)南嘁谱饔玫皆诓煌窂缴系墓庾由稀榱苏f明起見。應(yīng)特別考慮在圖2中給出的地點(diǎn)區(qū)域50。假定在此地點(diǎn)、即在x1附近有一個(gè)量值為ΔA的路徑長度的變化，則由x1出射的光子與波數(shù)k1或k2的狀態(tài)無關(guān)而移行較大的路徑。則在公式10中會(huì)得到一個(gè)附加的相位(k1-k2)ΔA。就是說在一個(gè)波長譜中在分布為ΔA、即一定的寬度
時(shí)計(jì)算出干<p>2.生產(chǎn)和鑒定人源化24-31a).生產(chǎn)人源化24-31(變體1和變體2)的CHO轉(zhuǎn)染物的產(chǎn)生。
通過具有線性化h24-31DNA(變體1和變體2)的4×106個(gè)CHO細(xì)胞的電穿孔，接著在G418中選擇，來產(chǎn)生表達(dá)人源化24-31的CHO轉(zhuǎn)染物。通過應(yīng)用山羊抗-人κ來捕獲免疫球蛋白的三明治ELISA對來自G418抗性克隆的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液測定免疫球蛋白的產(chǎn)生。通過與辣根過氧化物酶(OPD)-綴合的特異于人IgG的山羊抗體一起培養(yǎng)，接著加入HRP底物，檸檬酸鹽緩沖液(9-34g/1 C6H8O7和14.2g/1 Na2HPO4)中0.4mg/ml鄰苯二胺(OPD)，pH5.0，含有0.0175％H2O2，測定免疫球蛋白結(jié)合。該平板在Molecular DeviCes“Vmax，動(dòng)力微板讀數(shù)器”分光光度計(jì)中在490nm處讀數(shù)。
實(shí)施例10人源化24-31阻斷CD40-Ig結(jié)合gp39。
建立人源化抗-gp39結(jié)合gp39試驗(yàn)后，試驗(yàn)有效地證明人源化抗-gp39保持其阻斷該配體結(jié)合其受體的能力。為此目的，在4℃，用一系列濃度的鼠24-31或用人源化變體1和變體224-31預(yù)處理激活的人外周血T細(xì)胞，或gp39轉(zhuǎn)染的CHO差別15分鐘。該預(yù)培養(yǎng)后，加入CD40-Ig-生物素，并且通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器用PE-親和素測定結(jié)合。圖26詳細(xì)說明了變體1在4μg/ml減少50％CD40-Ig結(jié)合，鼠24-31在大約12μg/ml減少50％結(jié)合，變體2在20μg/ml或以上減少50％結(jié)合。
實(shí)施例1124-31阻斷B細(xì)胞增殖和分化。
為了證實(shí)鼠24-31阻斷gp39功能，B細(xì)胞在存在或不存在一定劑量鼠24-31或人源化24-31下與可溶性gp39融合蛋白一起培養(yǎng)。如圖2A所示通過3H-胸苷摻入來測定B細(xì)胞增殖應(yīng)答。
T細(xì)胞依賴性B細(xì)胞分化被抗gp39單克隆抗體阻斷。為了證實(shí)鼠24-31抗體在阻斷在激活的人T細(xì)胞表面上表達(dá)的天然gp39的功能中是有效的，測定本發(fā)明人源化24-31抗體抑制T細(xì)胞誘導(dǎo)的B細(xì)胞分化的能力。B細(xì)胞在存在或不存在人源化24-31和鼠24-31下與抗-CD3激活的T細(xì)胞一起培養(yǎng)。12天后測定多克隆IgM，IgG，和IgA的產(chǎn)生(見圖2B)。這些結(jié)果證明抗-gp3924-31可以阻斷CD40結(jié)合并且通過CD40干擾T細(xì)胞依賴性B細(xì)胞激活。
實(shí)施例12結(jié)合能力該項(xiàng)試驗(yàn)有效測定鼠，嵌合的，和人源化(變體1)24-31抗體對gp39抗體相對于抗體濃度的反應(yīng)性。
方法平板制備1.向96孔平板中的每一孔中加入50聚-1-賴氨酸。室溫下培養(yǎng)30分鐘。彈動(dòng)平板去除聚-1-賴氨酸。
2.通過以1500rpm離心5分鐘，用HBSS將mgp39-CHO細(xì)胞(中國倉鼠卵巢細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞表面，實(shí)施例5中描述的膜gp39)沖洗3次。將細(xì)胞重新懸浮于HBSS，達(dá)到2×106個(gè)細(xì)胞/ml。
3.向每孔中加入50μl細(xì)胞懸浮液，以2000rpm離心平板5分鐘。
4.加入50μl/孔冰冷卻的0.5％戊二醛，并在室溫下培養(yǎng)15分鐘。
5.彈動(dòng)平板和印跡去除過量的戊二醛。加入150μl/孔100mM甘氨酸和0.1％BSA，并在室溫下培養(yǎng)30分鐘。可以馬上使用平板或者在-20℃下冷凍以備用。
結(jié)合測試1.解凍平板并去除甘氨酸緩沖液。
2.從1μg/ml開始在稀釋緩沖液中以1∶2系列稀釋試驗(yàn)抗體。重復(fù)轉(zhuǎn)移50μg/孔每種稀釋液。室溫下培養(yǎng)2小時(shí)。
3.用流動(dòng)的自來水將平板沖洗10次。
4.加入50μl/孔山羊抗-人IgG HRP或山羊抗-鼠IgG HRP的1∶2000稀釋液。室溫下培養(yǎng)1小時(shí)。
5.用流動(dòng)的自來水將平板沖洗10次。
6.加入50μl/孔ABTS底物，并使平板展開20-30分鐘。平板用490mn背景波長在波長405mn處讀數(shù)。
7.吸收度對抗體濃度作圖。
結(jié)果和結(jié)論3種抗-gp39抗體(鼠，嵌合的和人源化變體1的24-31)相對于抗體濃度的結(jié)合能力基本上是重疊的(見圖9)。這是一個(gè)好的指征，這些抗體具有類似的對于人gp39的結(jié)合能力，表明該人源化抗體保持了鼠24-31的gp39結(jié)合親和性。
實(shí)施例13生物素標(biāo)記的鼠24-31和嵌合的和人源化變體124-31之間的競爭為了測定24-31及其嵌合的和人源化變體之間結(jié)合的類似性，進(jìn)行了一項(xiàng)目的在于測定這些衍生物與源鼠抗體競爭結(jié)合gp39的能力。從先前的研究中，已經(jīng)證實(shí)大約200ng/ml 24-31達(dá)到2/3結(jié)合飽和。該量在競爭測試中使用。為了只測定24-31的直接結(jié)合，將H24-31生物素基化，測定減少的24-31結(jié)合來測定競爭。不同濃度的嵌合的和人源化的24-31變體與生物素基化的鼠24-31混合，終濃度是200ng/ml，并且分配到包被有g(shù)p39+CHO細(xì)胞的ELISA平板的孔中，平板上固定有戊二醛。使用下面描述的親和素-HRP測定24-31結(jié)合水平。
方法平板制備1.向96孔平板中的每一孔中加入50聚-1-賴氨酸。室溫下培養(yǎng)30分鐘。彈動(dòng)平板去除聚-1-賴氨酸。
2.通過以1500rpm離心5分鐘，用HBSS將mgp39-CHO細(xì)胞沖洗3次。將細(xì)胞重新懸浮于HBSS，達(dá)到2×106個(gè)細(xì)胞/ml。
3.向每孔中加入50μl細(xì)胞懸浮液，以2000rpm離心平板5分鐘。
4.加入50μl/孔冰冷卻的0.5％戊二醛，并在室溫下培養(yǎng)15分鐘。
5.彈動(dòng)平板和印跡去除過量的戊二醛。加入150μl/孔100mM甘氨酸和0.1％BSA，并在室溫下培養(yǎng)30分鐘。可以馬上使用平板或者在-20℃下冷凍以備用。
結(jié)合測試1.解凍平板并去除甘氨酸緩沖液。
2.在PBS中用1％BSA將鼠抗-gp39生物素稀釋到200ng/ml。
3.從10μg/ml開始在稀釋緩沖液中以1∶2系列稀釋試驗(yàn)抗體(鼠，嵌合的，和人源化24-31)。
4.重復(fù)將50μl稀釋的試驗(yàn)抗體和鼠抗-gp39生物素轉(zhuǎn)移到每孔中。幾個(gè)孔應(yīng)該含有含有鼠抗-gp39生物素的50μl稀釋緩沖液作為最大對照組。室溫下培養(yǎng)2小時(shí)。
5.用流動(dòng)的自來水將平板沖洗10次。
6.加入50μl/孔ABTS底物，并使平板展開20-30分鐘。平板用490mn背景波長在波長405mn處讀數(shù)。
7.用對照孔的平均值計(jì)算抑制百分率。
8.加入50μl/孔ABTS底物，并顯色平板20-30分鐘，以490nm波長為本底波長，于405nm讀板。
9.使用對照孔的平均值來計(jì)算百分抑制率結(jié)果和結(jié)論所有3種抗體與生物素標(biāo)記的24-31競爭完全相等(見圖10)。在測試限度內(nèi)所有濃度下的競爭曲線基本重疊。這證明所有試驗(yàn)的人源化抗體(變體1)保持其gp39結(jié)合親和性。
實(shí)施例14T細(xì)胞依賴性B細(xì)胞分化的調(diào)制為了證實(shí)人源化24-31保持鼠24-31的體外功能活性，在“Lipsky”測試中將人源化24-31與鼠24-31比較。將供者外周血單核細(xì)胞分離成兩個(gè)級分，T細(xì)胞級分和B細(xì)胞級分。首先用絲裂霉素C處理T細(xì)胞以防止有絲分裂，然后用抗-CD3抗體激活。與鼠或者人源化(變體1)24-31抗體一起加入B細(xì)胞。該項(xiàng)試驗(yàn)中包括沒有抗體的正對照，和沒有B細(xì)胞的負(fù)對照。培養(yǎng)10天后對上清液測定存在的人IgM。
方法1.在37℃下用50μl/孔無菌4μg/ml抗-CD3抗體(在50mMTris，pH9中稀釋)包被96孔平板2小時(shí)。
2.使用Lympho-Kwik試劑從淡黃色包被層中選擇性純化T和B細(xì)胞。在37℃下，每5×106個(gè)細(xì)胞用50μg/ml絲裂霉素C激活T細(xì)胞30分鐘。
3.用無菌HBSS或培養(yǎng)基將平板的孔沖洗幾次以去除沒有粘附的抗體。
4.向每孔中加入1×105個(gè)純化的T細(xì)胞(2×106/ml)。
5.向每孔中加入5×105個(gè)純化的B細(xì)胞(5×106/ml)。四次重復(fù)地向每孔中加入50μl抗-gp39抗體(10-0.1μg/ml)。對照孔應(yīng)該包括a)0抗體，b)0抗體，沒有T細(xì)胞，和c)0抗體，沒有B細(xì)胞。
6.平板在37℃/5％CO2培養(yǎng)12天。
7.7天后用3H胸苷或任何其它可接受方法在重復(fù)的孔上測定細(xì)胞生長。
8.12天后從重復(fù)的孔收集上清液并進(jìn)行ELISA測試來測定Ig產(chǎn)生(IgM)。
結(jié)果和結(jié)論結(jié)果表明人IgM的產(chǎn)生被低于0.01μg/ml濃度的人源化24-31抑制50％，類似于用鼠24-31獲得的抑制水平(見圖11)。在該項(xiàng)試驗(yàn)中人源化抗體保持其抑制T細(xì)胞依賴性B細(xì)胞增殖的能力(IgM產(chǎn)生)。
實(shí)施例15評價(jià)人源化24-31，變體2進(jìn)行該項(xiàng)試驗(yàn)測定人源化24-31變體2與變體1相比在直接結(jié)合測試中是否具有類似的gp39結(jié)合能力。
方法和上面的實(shí)施例13相同。
結(jié)果和結(jié)論結(jié)果表明兩種24-31變體的結(jié)合能力基本上重疊(見圖12)。這表明兩種變體具有類似的對gp39的結(jié)合活性。
實(shí)施例16
進(jìn)行該項(xiàng)試驗(yàn)測定24-31，和兩種人源化變體，1和2的Kd。
方法預(yù)先測定量的3種抗體的每一種使用IODO-BEADS(Pierce)用125I標(biāo)記。通過在Sephadex-G25/DEAE/Amberlite柱上大小分離來從游離的125I中分離抗體結(jié)合-125I。
為了測定計(jì)數(shù)/μg和合適的作用濃度(半數(shù)最大結(jié)合濃度)，在一系列稀釋物中進(jìn)行試驗(yàn)測定125I標(biāo)記的抗體對鼠gp39-CHO細(xì)胞的直接結(jié)合。
在一稀釋系列中125I標(biāo)記的抗體與未標(biāo)記的抗體混合并培養(yǎng)。以結(jié)合抗體的總量和游離抗體的量為基礎(chǔ)，結(jié)合對未結(jié)合作圖得到Scatchard作圖。對于一個(gè)活性位點(diǎn)的總的抗體濃度以75kD標(biāo)準(zhǔn)大小為基礎(chǔ)。
通過制備“最佳吻合”線來計(jì)算Kd。曲線斜率的倒數(shù)是Kd。也計(jì)算出校正系數(shù)r2。
結(jié)論分析Scatchard作圖。從該項(xiàng)分析得到的Kd是變體2，Kd＝14nM；鼠24-31，Kd＝8.51nM；變體1，Kd＝5.6。這些結(jié)果分別在圖13(鼠)，14(變體1)和15(變體2)中給出。這些抗體提供了進(jìn)一步的證據(jù)證明本發(fā)明人源化抗體類似于24-31結(jié)合gp39抗原。
實(shí)施例17H24-31.1的FcRI結(jié)合在用編碼人FcRI基因轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞系上進(jìn)行FcRI結(jié)合(圖16)。H24-31.1對Fc受體的結(jié)合用或不用由與人gp39胞外部分連接的CD8的胞外部分組成的融合蛋白形式的可溶性gp39測定。圖16詳細(xì)說明了H24-31.1當(dāng)與抗原配合時(shí)只結(jié)合FCRI。
實(shí)施例18
H24-31.1的FcRII結(jié)合在用編碼人FcRII基因轉(zhuǎn)染的鼠纖維細(xì)胞細(xì)胞系進(jìn)行FcRII結(jié)合(圖17)。H24-31.1對Fc受體的結(jié)合用或不用由與gp39胞外部分連接的CD8的胞外部分組成的融合蛋白形式的可溶性gp39測定。圖17詳細(xì)說明了H24-31.1當(dāng)與抗原配合時(shí)只結(jié)合Fc受體II。
實(shí)施例19H24-31.1在補(bǔ)體依賴性細(xì)胞細(xì)胞毒性中的作用在5％兔抗體存在下向gp39+CHO細(xì)胞中加入不同濃度的H24-31.1(圖18)。用警報(bào)藍(lán)(alamar blue)監(jiān)測CHO細(xì)胞的生長。圖18表明H24-31.1在大約0.5μg/ml抑制50％細(xì)胞生長。
實(shí)施例20測定gp39+CHO結(jié)合的H24-31.1的Clq結(jié)合用各種濃度H24-31.1標(biāo)記的gp39+CHO細(xì)胞在過量的人Clq(補(bǔ)體因子1)中培養(yǎng)，接著與FITC標(biāo)記的山羊抗-人Clq一起培養(yǎng)。用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器分析對樣品測定用Clq的細(xì)胞的相對標(biāo)記量(圖19)。圖19詳細(xì)說明Clq對細(xì)胞的標(biāo)記量取決于抗體濃度，并且Fab片段(沒有Clq結(jié)合)不結(jié)合Clq。
實(shí)施例21H24-31.1對T細(xì)胞應(yīng)答T細(xì)胞依賴性recall抗原的作用含有10％人AB血清，L-谷氨酸，丙酮酸鈉和非基本氨基酸的Iscoves Modified Dulbecco培養(yǎng)基中培養(yǎng)人外周血淋巴細(xì)胞(圖20)。除一個(gè)培養(yǎng)物外，所有的培養(yǎng)物還接受了10μg/ml破傷風(fēng)類毒素。用破傷風(fēng)類毒素致敏的培養(yǎng)物還接受了0-10μg/ml的H24-31.1。3天后取上清液測定IL-2含量。再2天后，所有的樣品都給予1μCi3H-胸苷/ml 16小時(shí)。收集細(xì)胞并測定摻入到染色體DNA中的胸苷作為測定生長的量度。沒有破傷風(fēng)類毒素的培養(yǎng)物的IL-2水平低于檢測限度，大約是2ng/ml。這些培養(yǎng)物摻入的3H-胸苷背景水平大約是300cpm，并且明顯不受用H24-31.1處理的影響(沒有顯示出)。圖20表明TT誘導(dǎo)的生長和IL-2的產(chǎn)生被≥1μg/ml的H24-31.1最大抑制，40％左右。
實(shí)施例22H24-31.1對T細(xì)胞依賴性B細(xì)胞增殖的作用用2μg/ml的抗-CD3抗體包被96孔平板過夜，并且在使用前用PBS充分洗滌。來自淡黃色包被物的外周血淋巴細(xì)胞被分離成T細(xì)胞級分和B細(xì)胞級分。在96孔平板的每一孔中平板培養(yǎng)之前使T細(xì)胞與絲裂霉素C一起培養(yǎng)1小時(shí)。接著在補(bǔ)加有10％小牛血清，L-谷氨酸，丙酮酸鈉和非基本氨基酸的Iscoves Modified Dulbecco培養(yǎng)基中加入B細(xì)胞。在0-10μg/ml各種濃度的H24-31.1存在下培養(yǎng)細(xì)胞。12天后取上清液測定人IgG的存在(圖21)。該圖詳細(xì)說明了人源化H24-31.1在1ng/ml抑制大約85％T細(xì)胞依賴性IgG的產(chǎn)生。
實(shí)施例23H24-31.1Fab對T細(xì)胞依賴性B細(xì)胞分化的作用用2μg/ml的抗-CD3抗體包被96孔平板過夜，并且在使用前用PBS充分洗滌。來自淡黃色包被物的外周血淋巴細(xì)胞被分離成T細(xì)胞級分和B細(xì)胞級分。在96孔平板的每一孔中平板培養(yǎng)之前使T細(xì)胞與絲裂霉素C一起培養(yǎng)1小時(shí)。接著在補(bǔ)加有10％小牛血清，L-谷氨酸，丙酮酸鈉和非基本氨基酸的Iscoves Modified Dulbecco培養(yǎng)基中混入B細(xì)胞。在0-10μg/ml各種濃度的H24-31.1和H24-31.1Fab存在下培養(yǎng)細(xì)胞。12天后取上清液測定人IgG的存在(圖22)。該圖表明全H24-31.1抗體和其Fab片段之間在抑制IgG產(chǎn)生方面沒有區(qū)別。
實(shí)施例24H24-31.1對抗原特異性B細(xì)胞的產(chǎn)生對T細(xì)胞依賴性recall抗原應(yīng)答的作用體外用破傷風(fēng)類毒素致敏3天的人脾細(xì)胞以大約1×107個(gè)細(xì)胞/SCID的濃度轉(zhuǎn)移給SCID小鼠。6天后給得到的hu-SPL-SCID小鼠注射PBS(第1組)或300μg H24-31.1(第1組和第2組)。第二天所有的hu-SPL-SCID小鼠都用破傷風(fēng)類毒素加強(qiáng)免疫。第3組的小鼠還接受了兩次300μg H24-31.1注射，每次間隔3天。在不同時(shí)間點(diǎn)喂養(yǎng)小鼠，并通過ELISA測定人IgG抗-破傷風(fēng)類毒素滴度的水平(圖23)。圖23表明注射H24-31.1抑制大約90％破傷風(fēng)類毒素特異性應(yīng)答的產(chǎn)生。
實(shí)施例25H24-31.1抗體對人B細(xì)胞增殖的作用這些試驗(yàn)的目的是證明H24-31.1抗體抑制B細(xì)胞增殖的可溶性gp39-CD8誘導(dǎo)作用。
根據(jù)廠商提供的說明用Lympho-Kwik試劑(Cat#LK-25-B，LK-50-B，One Lambda，Inc.，CA91303)從來自淡黃色包被物的淋巴細(xì)胞制劑中富集B細(xì)胞(＞90％)。富集的人B細(xì)胞以96孔每個(gè)孔中有1×105個(gè)細(xì)胞與1000U/ml IL-4(Genzyme，Corp.)培養(yǎng)，與不同濃度H24-31.1抗體加10μg/ml gp39-CD8溫育4天。在溫育的最后16小時(shí)期間對培養(yǎng)物用1μCi/孔的3H-胸苷發(fā)生脈沖，并測定增殖的B細(xì)胞放射性的摻入。圖24表明gp39-CD8以劑量依賴性方式引起B(yǎng)細(xì)胞增殖。圖25證明H24-31.1抑制gp39-CD8依賴性B細(xì)胞增殖。
用途本發(fā)明人源化抗-gp39抗體在治療其中g(shù)p39調(diào)制和/或gp39-CD40相互作用的抑制是治療有益的任何疾病中具有效能。而且，本發(fā)明人源化抗-gp39抗體可以用于治療其中期望抗體應(yīng)答抗原被抑制的疾病。這樣的疾病包括自身免疫疾病和非自身免疫疾病。
抗-gp39抗體防止CD40在B細(xì)胞中產(chǎn)生信號的能力在體內(nèi)被功能翻譯成T細(xì)胞依賴性抗體應(yīng)答的明顯抑制。因此，自身抗體產(chǎn)生所介導(dǎo)的自身免疫疾病期望從抗-gp39抗體治療中得到益處。這樣的疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡，特發(fā)性血小板減少紫癜，肌無力gravis和具有抗-胰島素和抗-胰島素受體抗體的糖尿病患者亞群。另外，CD40在B細(xì)胞和樹突細(xì)胞中產(chǎn)生信號對于上游調(diào)控共同產(chǎn)生信號受體例如B7.1和B7.2分子是基本的?？?gp39抗體對CD40信號的阻斷干擾抗原呈遞給T細(xì)胞，導(dǎo)致T細(xì)胞激活和T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答的抑制。抗-gp39抗體在例如CIA，EAE，NOD小鼠，GVHD和移植物排斥疾病模型中的治療效力進(jìn)一步證實(shí)抗體對T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答的抑制作用。以動(dòng)物模型藥效所支持的作用機(jī)理為基礎(chǔ)，本發(fā)明人源化抗-gp39抗體的治療效能延伸到這樣的疾病，例如RA，MS，糖尿病，牛皮癬，GVHD和移植物排斥。
通過施用本發(fā)明人源化抗體可以有效地治療的具體疾病包括下列疾病變應(yīng)性支氣管曲菌病，自身免疫溶血性貧血；微黑棘皮癥變應(yīng)性接觸皮炎；阿狄森氏病；特應(yīng)性皮炎；簇狀脫發(fā)；一般脫發(fā)；淀粉樣變性；過敏樣紫癜；過敏樣反應(yīng)，發(fā)育不良性貧血；遺傳性血管水腫；特發(fā)性血管水腫；關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎；顳動(dòng)脈炎，巨大細(xì)胞動(dòng)脈炎；Takayasu’s動(dòng)脈炎，暫時(shí)的動(dòng)脈炎；哮喘；運(yùn)動(dòng)失調(diào)毛細(xì)管擴(kuò)張；自身免疫卵巢炎；自身免疫睪丸炎；自身免疫多種內(nèi)分泌腺衰竭；貝切特綜合征?。回惛駹栒鞑?；血栓閉塞性脈管炎；大皰天皰瘡；念珠菌??；慢性粘膜與皮膚??；Caplan綜合癥；心肌梗塞后的綜合癥；心包造口術(shù)后的綜合癥；心炎；腹腔口炎性腹瀉；Chagas疾??；Chediak-Higashi綜合癥；Churg-Strauss疾??；Cogan綜合癥；冷凝集素疾病；CREST綜合癥；冷球蛋白血癥；隱原性纖維化肺泡炎；皰疹樣皮炎；皮膚肌炎；糖尿?。籇iamond-Blackfan綜合癥；DiGeorge綜合癥；盤狀紅斑狼瘡；嗜曙紅細(xì)胞筋膜炎；鞏膜外層炎；Drythemaelevatum diutinum；有邊緣紅斑；多態(tài)紅斑；結(jié)節(jié)紅斑；家族性地中海熱；Felty綜合癥；肺纖維化；過敏性腎小球腎炎；自身免疫腎小球腎炎；鏈球菌型腎小球腎炎；移植后腎小球腎炎；膜腎小球??；古德帕斯綜合癥；移植物抗宿主疾病；免疫介導(dǎo)的粒細(xì)胞減少；環(huán)形肉芽腫，變應(yīng)性肉芽腫??；肉芽腫肌炎；Grave疾病；Hashimoto甲狀腺炎；新生兒溶血病；特發(fā)性血色??；Henoch-Schoenlein紫癜；慢性活性和慢性進(jìn)展肝炎；組織細(xì)胞增多病X；嗜曙紅細(xì)胞過多綜合癥；特發(fā)性血小板減少紫癜；Job綜合癥；青少年皮膚肌炎；青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(青少年慢性關(guān)節(jié)炎)；Kawasaki疾病；角膜炎；干性角膜結(jié)膜炎；Landry-Guillain-Barre-Strohl綜合癥；麻風(fēng)結(jié)節(jié)麻風(fēng)；Loeffler綜合癥；中毒性表皮融解壞死；感染色關(guān)節(jié)炎；淋巴瘤樣肉芽腫??；系統(tǒng)性肥大細(xì)胞??；混合的締結(jié)組織疾?。欢鄶?shù)性單神經(jīng)炎；Muckle-Wells綜合癥；粘膜皮膚淋巴結(jié)綜合癥；多中心性網(wǎng)狀組織細(xì)胞瘤??；多發(fā)性硬化；肌無力grayis；蕈樣真菌病；系統(tǒng)性多動(dòng)脈炎；腎病綜合癥；交錯(cuò)綜合癥；脂膜炎；陣發(fā)性寒冷性血紅蛋白尿；陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿；類天皰瘡天皰瘡；紅斑天皰瘡；葉狀天皰瘡；尋常天皰瘡；Pigeon breeder疾??；超敏性肺炎；多關(guān)節(jié)炎結(jié)節(jié)；多肌痛風(fēng)濕病；多肌炎；特發(fā)性多神經(jīng)炎；葡萄牙家族性多神經(jīng)??；前期驚厥/驚厥；原發(fā)性膽汁性肝硬變；進(jìn)程性系統(tǒng)性硬化(硬皮病)；牛皮癬；牛皮癬性關(guān)節(jié)炎；肺泡蛋白沉積；肺纖維化，Raynaud現(xiàn)象/綜合癥；Reidel甲狀腺炎；Reiter綜合癥；再發(fā)性polychrondritis；風(fēng)濕性發(fā)燒；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；肉樣瘤病；鞏膜炎；硬化的膽管炎；血清病；白細(xì)胞增多并發(fā)異型單核細(xì)胞綜合癥；Sjogren綜合癥；Stevens-Johnson綜合癥；Still疾??；亞急性硬化全腦炎；交感性眼炎；系統(tǒng)性紅斑狼瘡；移植物排斥；潰瘍性結(jié)腸炎；未分化締結(jié)組織疾??；慢性蕁麻疹；寒冷性蕁麻疹；葡萄膜炎；白斑；Weber-Christian疾?。籛egener肉芽腫病；Wiskott-Aldrich綜合癥。
其中，通過施用抗-gp39抗體可以治療或適宜的病癥包括自身免疫溶血性貧血；再生障礙性貧血；暫時(shí)的關(guān)節(jié)炎；糖尿病；費(fèi)爾提綜合癥；古德帕斯綜合癥；移植物抗宿主疾?。惶匕l(fā)性血小板減少紫癜，肌無力gravis；多發(fā)性硬化；多關(guān)節(jié)炎結(jié)節(jié)；牛皮癬；牛皮癬性關(guān)節(jié)炎；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡；哮喘；過敏病癥；和移植物排斥。
用來產(chǎn)生治療效果的抗體的量可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定?？贵w一般通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在藥學(xué)可接受緩沖液中提供，并且可以通過任何期望途徑給藥。因?yàn)楸景l(fā)明要求的抗體的效力及其人的耐受性，有可能重復(fù)施用這些抗體以根除人體內(nèi)各種各樣的疾病或病癥。
本發(fā)明抗-gp39人源化抗體(或者其片段)也用來誘導(dǎo)沒有調(diào)制，例如誘導(dǎo)人的或動(dòng)物的免疫系統(tǒng)的抑制。因此本發(fā)明涉及通過對這樣的人或其它動(dòng)物施用有效的無毒性量的本發(fā)明這樣一種抗體在需要治療的人或其它動(dòng)物體內(nèi)預(yù)防性或治療性誘導(dǎo)免疫調(diào)控的方法。
本發(fā)明抗體在誘導(dǎo)免疫抑制中有用途的事實(shí)意味著它們用于治療或防止移植器官或組織(例如腎，心臟，肺，骨髓，皮膚，角膜等)的抗性或排斥；治療或防止自身免疫疾病，炎癥，增生或超增生疾病，和皮膚出現(xiàn)免疫學(xué)介導(dǎo)的疾病(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，紅斑狼瘡，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，慢性甲狀腺病，多發(fā)性硬化，EAE，肌無力gravis，I型糖尿病，葡萄膜炎，腎病變綜合癥，牛皮癬特應(yīng)性皮炎，接觸性皮炎和濕疹皮炎，皮脂溢皮炎，Lichen planus，Pemplugus，大皰天皰瘡，表皮大皰，蕁麻疹，血管水腫，脈管炎，紅斑，皮膚嗜曙紅細(xì)胞增多，簇狀脫發(fā)等)；治療可逆性防礙呼吸道疾病，腸炎和變應(yīng)性反應(yīng)(例如腹腔疾病，直腸炎，嗜曙紅細(xì)胞增多胃腸炎，肥大細(xì)胞病，節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎)和與食物相關(guān)的過敏(例如偏頭疼，鼻炎和濕疹)。本發(fā)明抗體還具有用于治療其中期望沒有調(diào)制的非自身免疫疾病的效能，所述疾病例如移植物抗宿主疾病(GVHD)，移植物排斥，哮喘，白血病，HIV，淋巴組織瘤，等等。
本發(fā)明抗體還可以在給予一種載體或重組病毒(例如，包含一種治療DNA)之前，同時(shí)，或之后施用，來防止或減少對所述載體的宿主免疫(體液)應(yīng)答。
本領(lǐng)域技術(shù)人員通過常規(guī)試驗(yàn)應(yīng)該能夠確定為誘導(dǎo)免疫抑制目的而使用的抗體的有效的，非毒性量。一般情況下，有效劑量在大約每千克體重每天0.05-100毫克范圍內(nèi)。
根據(jù)上述治療方法，本發(fā)明抗體可以以足以產(chǎn)生治療或預(yù)防程度這樣的效果的量對人或其它動(dòng)物施用。本發(fā)明這些抗體可以以通過根據(jù)已知技術(shù)將本發(fā)明抗體與常規(guī)藥學(xué)可接受載體或稀釋劑混合而制備的常規(guī)劑量形式對人或其它動(dòng)物施用。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解藥學(xué)可接受載體或稀釋劑的形式和特征取決于其要混合的活性成分的量，給藥途徑和其它公知的可變因素。
本發(fā)明抗體(或其片段)的給藥途徑可以是口服，腸胃外，吸入或局部。這里使用的術(shù)語腸胃外包括靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，皮下，直腸，陰道或腹膜內(nèi)給藥。一般優(yōu)選的是腸胃外給藥的皮下和肌內(nèi)形式。
使用本發(fā)明化合物預(yù)防性或治療性誘導(dǎo)免疫抑制的每天腸胃外和口服劑量用藥法一般是在每千克體重每天大約0.05-100，優(yōu)選大約0.5-10毫克范圍內(nèi)。
本發(fā)明抗體也可以通過吸入給藥。“吸入”是指鼻內(nèi)和口吸入給藥。這種給藥的合適的劑量形式，例如氣霧劑制劑或計(jì)量的劑量吸入劑，可以通過常規(guī)技術(shù)制備。要施用的本發(fā)明化合物的優(yōu)選劑量一般在大約10-100毫克范圍內(nèi)。
本發(fā)明抗體也可以局部給藥。通過局部給藥是指不是全身給藥，并且包括本發(fā)明抗體(或其片段)的外部給藥到表皮，口腔前庭和將這樣一種抗體滴注到耳，眼和鼻，在那里其不明顯進(jìn)入血液。全身給藥是指口服，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)和肌內(nèi)給藥。達(dá)到治療或預(yù)防效果所需要的抗體的量當(dāng)然隨著所選擇的抗體，要治療的疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度以及接受治療的動(dòng)物而變化，并且由醫(yī)生謹(jǐn)慎判斷最佳方案。本發(fā)明抗體合適的局部給藥劑量一般在每千克體重每天大約1-100毫克范圍內(nèi)。
制劑盡管可以單獨(dú)施用抗體或片段，但是優(yōu)選其以一種藥物制劑存在。對于局部給藥，活性成分含量可以是制劑重量的0.001％-10％w/w，例如1％-2％，盡管可以含有制劑的10％w/w這樣多，但是優(yōu)選不超過5％w/w，更優(yōu)選0.1％-1％w/w。
本發(fā)明局部給藥制劑含有一種活性成分和其一種或幾種可接受載體和任選的任何其它治療成分。載體從與制劑的其它成分相容的意義上說必須是“可接受的”，并且對其受者無害。
適于局部給藥的制劑包括適于穿透皮膚到達(dá)要治療的位點(diǎn)的液體或半液體制劑，例如涂抹劑，洗劑，霜?jiǎng)?，軟膏或糊劑，和適合對眼，耳或鼻給藥的滴劑。
本發(fā)明滴劑可以含有無菌水溶液或油溶液，并且可以通過將活性成分溶解于合適的殺細(xì)菌和/或殺真菌劑和/或任何其它合適的防腐劑，優(yōu)選包括表面活性劑的水溶液中來制備。所得溶液然后可以通過過濾而澄清，轉(zhuǎn)移到合適的容器中，然后密封，并通過壓熱器處理或在90℃-100℃保持半小時(shí)來滅菌?；蛘咴撊芤嚎梢酝ㄟ^過濾而滅菌并通過無菌技術(shù)轉(zhuǎn)移到容器中。適用于滴劑中的殺細(xì)菌和殺真菌劑的例子是硝酸苯汞或乙酸苯汞(0.002％)，氯芐烷銨(0.01％)和醋酸洗必太(0.01％)。用于制備油溶液的合適的溶劑包括甘油，稀醇和丙二醇。
根據(jù)本發(fā)明的洗劑包括適合于對皮膚或眼施用的那些洗劑。眼洗劑可以包括任選地含有殺細(xì)菌劑的無菌水溶液，并且可以通過類似于制備滴劑的方法制備。施用于皮膚的洗劑或涂抹劑也可以包括一種催干和使皮膚涼下來的試劑，例如一種醇或酮，和/或一種增加水分劑，例如甘油或一種象蓖麻油或花生油。
根據(jù)本發(fā)明的霜?jiǎng)?，軟膏或糊劑是外部給藥的半固體制劑。其可以通過借助于合適的機(jī)器，將活性成分只混合在研細(xì)的或粉化的形式中，或與油脂性或非油脂性基質(zhì)混合在在含水或無水液體溶液或懸浮液中。這樣的基質(zhì)可以包括烴類，例如硬的，軟的或液體石蠟，甘油，蜂蠟，金屬皂；膠漿；天然來源的油，例如杏仁油，玉米油，花生油，蓖麻油或橄欖油；羊毛脂或其衍生物，或脂肪酸，例如硬脂酸或油酸，和一種醇一起，例如丙二醇或聚乙二醇。該制劑可以混入任何合適的表面活性劑，例如一種陰離子，陽離子或非離子表面活性劑，例如山梨糖醇酐酯或其聚氧乙烯衍生物。也可以含有懸浮劑例如天然樹膠，纖維素衍生物或無機(jī)材料，例如硅藻土(silicaceous)，硅石，和其它成分例如含水羊毛脂。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識到本發(fā)明抗體或其片段的最佳量和各個(gè)劑量間隔可以根據(jù)要治療的疾病的性質(zhì)和程度，給藥的形式，途徑和位置，和要治療的具體動(dòng)物來確定，而最佳方案可以通過常規(guī)技術(shù)確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)該認(rèn)識到最佳治療方案，即給定天數(shù)每天所給予的本發(fā)明抗體或其片段的劑量次數(shù)可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)的治療測試試驗(yàn)方法確定。
不用進(jìn)一步詳盡闡述，相信本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用前面描述的方法，利用本發(fā)明達(dá)到最完善程度。因此下面的實(shí)施例只是作為詳細(xì)說明的實(shí)施例，而不是在任何方面限制本發(fā)明范圍。
膠囊組合物膠囊形式的本發(fā)明藥物組合物通過用50mg粉末形式的本發(fā)明抗體或其片段，100mg乳糖，32mg滑石粉和8mg硬脂酸鎂裝填到標(biāo)準(zhǔn)的兩片硬明膠膠囊中而制備。
可腸胃外注射的組合物適合于注射給藥的形式的本發(fā)明藥物組合物通過在10k體積丙二醇和水中攪拌1.5k本發(fā)明抗體或其片段而制備。該溶液通過過濾滅菌。
乳膏劑組合物1.0g本發(fā)明抗體或其片段。
100.0g白色軟石蠟。
本發(fā)明抗體或其片段分散在小體積的賦形劑中，產(chǎn)生光滑的，均勻的產(chǎn)物。然后將分散物裝入軟金屬管中。
局部霜?jiǎng)┙M合物1.0g本發(fā)明抗體或其片段。
20.0g Polawax GP200.
2.0g干燥的含水羊毛脂。
2.5g白蜂蠟。
0.1g羥基苯甲酸甲酯。
加蒸餾水到100.0g。
將Polawax，蜂蠟和含水羊毛脂一起在60℃加熱。加入羥基苯甲酸甲酯，并用高速攪拌實(shí)現(xiàn)均勻化。然后將溫度降到SOOC。然后加入本發(fā)明抗體或其片段，分散均勻，慢速攪拌下使組合物冷卻。
局部洗液組合物1.0g本發(fā)明抗體或其片段。
0.6g單月桂酸山梨糖醇酐酯。0.6g Polysorbate 20。
1.2g鯨蠟硬脂醇。6.0g甘油。
0.2g羥基苯甲酸甲酯。
純化的水B.P.到100.00ml(B.P.＝Britis Pharmacopeia)。
75℃下將羥基苯甲酸甲酯和甘油溶解于70ml水中。單月桂酸山梨糖醇酐酯，Polysorbate 20和鯨蠟硬脂醇一起在75℃下融化，并加到水溶液中。將得到的乳液均勻化，連續(xù)攪拌下使其冷卻，并加入作為保留的水中的懸浮劑的本發(fā)明抗體或其片段。攪拌全部的懸浮液直到均勻。
眼滴劑組合物0.5g本發(fā)明抗體或其片段。
0.01g羥基苯甲酸甲酯。
0.04g羥基苯甲酸丙酯。
純化的水B.P.到100.00ml。
75℃下，將羥基苯甲酸甲酯和羥基苯甲酸丙酯溶解于70ml純化水中，并將所得溶液冷卻。然后加入本發(fā)明抗體或其片段，該溶液通過膜過濾器(0.022Am孔大小)過濾滅菌，并無菌包裝到合適的無菌容器中。
吸入給藥的組合物對于15-20ml容量的氣霧劑容器混合10mg本發(fā)明抗體或其片段和0.2-0.5k潤滑劑，例如吐溫85或油酸，，并將該化混合物分散到拋射劑中，例如氟利昂，優(yōu)選是(1，2-二氯四氟乙烷)和二氟氯甲烷的混合物，并裝入適于鼻內(nèi)或口吸入給藥的合適的氣霧劑容器中。
對于15-20ml容量的氣霧劑容器的吸入給藥的組合物將10mg本發(fā)明抗體或其片段溶解于乙醇(6-8ml)，加入0.2-0.5k潤滑劑，例如吐溫85或油酸，，并將該化混合物分散到拋射劑中，例如氟利昂，優(yōu)選是(1，2-二氯四氟乙烷)和二氟氯甲烷的混合物，并裝入適于鼻內(nèi)或口吸入給藥的合適的氣霧劑容器中。
本發(fā)明抗體和藥物組合物對于腸胃外給藥特別有用，即皮下，肌內(nèi)或靜脈內(nèi)。腸胃外給藥的組合物通常包括本發(fā)明抗體或其片段的溶液或溶解于可接受載體，優(yōu)選含水載體中的其雞尾酒合劑?？梢允褂枚喾N含水載體，例如水，緩沖的水，0.4k鹽水，0.3％甘油等。這些溶液是滅菌的并且通常沒有顆粒物質(zhì)。這些溶液可以通過常規(guī)的公知的技術(shù)滅菌。因?yàn)樾枰咏項(xiàng)l件，所以組合物可以含有藥學(xué)可接受助劑，例如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑等。本發(fā)明抗體或其片段在這樣的藥物制劑中的濃度可以寬范圍變化，即從小于大約0.5k，通常是或至少是大約1％至15或20％重量這樣多，并且主要以液體體積，粘度等為基礎(chǔ)，根據(jù)選擇的具體的給藥方式來選擇。
因此，制備用于肌內(nèi)注射的本發(fā)明藥物組合物，其含有1ml無菌緩沖水和50mg本發(fā)明抗體或其片段。類似地，用于靜脈內(nèi)輸液的本發(fā)明藥物組合物含有250ml無菌Ringer’s溶液和150mg本發(fā)明抗體或其片段。制備腸胃外給藥組合物實(shí)際的方法是公知的或者對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，更具體地公開于例如Remington’sPharmaceutical Science，第15版，Mack PublishingCompany，Easton，Pennsylvania，這里引作參考。
本發(fā)明抗體(或其片段)可以凍干儲(chǔ)存并且在使用前在合適的載體中重新配制。已經(jīng)證明這項(xiàng)技術(shù)對于常規(guī)免疫球蛋白是有效的，并且可以使用本領(lǐng)域公知的凍干和重新配制技術(shù)。
根據(jù)要取得的結(jié)果，可以為了預(yù)防性和/或治療性處理而施用本發(fā)明藥物組合物。在治療應(yīng)用中，以足以治愈或至少部分治愈疾病及其并發(fā)癥的量對已經(jīng)患病的患者施用組合物。在預(yù)防性應(yīng)用中，對還沒有進(jìn)入疾病癥狀的患者施用含有本發(fā)明抗體的組合物或其雞尾酒合劑，以提高患者的抵抗力。
根據(jù)主治醫(yī)生選擇的劑量水平和方式進(jìn)行藥物組合物的一次或多次給藥。在任何情況下，本發(fā)明藥物組合物應(yīng)該提供足以有效治療患者的本發(fā)明改變的抗體(或其片段)的量。
還應(yīng)該注意到，本發(fā)明抗體可以用來設(shè)計(jì)和合成在相同治療中和該抗體一樣有用的肽或非肽化合物(擬肽藥)。參見，例如Saragovi等，《科學(xué)》(Science)，253792-795(1991)。
由上所述可以理解，盡管為了詳細(xì)說明的目的描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但是，在不脫離本發(fā)明范圍下可以進(jìn)行多種變化。因此，本發(fā)明不受后面的權(quán)利要求書的限制。
權(quán)利要求
1.一種人源化抗體，其能與鼠24-31抗體競爭抑制CD40結(jié)合gp39。
2.權(quán)利要求1的抗體，其包含圖4-8給出的24-31抗體的互補(bǔ)決定區(qū)或包含一個(gè)或幾個(gè)保守氨基酸取代的變體和等價(jià)物。
3.一種由鼠單克隆抗體24-31衍生的人源化抗體。
4.一種由鼠單克隆抗體24-31衍生的人源化抗體，其保持至少三分之一鼠24-31抗體的gp39抗原結(jié)合親和性。
5.一種由鼠單克隆抗體24-31衍生的人源化抗體，其在B細(xì)胞測試中，在不大于親代鼠24-31抗體濃度的3倍的濃度下，體外功能活性保持半數(shù)最大效能(half-maximal potency)。
6.權(quán)利要求5的方法，其中B細(xì)胞測試測定T細(xì)胞依賴性抗體產(chǎn)生。
7.權(quán)利要求1的人源化抗體，其中所述的抗體包含選自下組的人源化可變輕鏈序列(1)DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITC KASQNVITAVA WYQQKPGKSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(2)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KASQNVITAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(3)DIVMTQSPSFMSTSVGDRVTITC KASQNVITAVA WYQQKPGKSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQPEDFADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(4)DIVMTQSPDSMATSLGERVTINC KASQNVITAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQAEDVADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK，和包含不實(shí)質(zhì)性影響所得人源化抗體結(jié)合gp39抗原能力的一個(gè)或幾個(gè)保守氨基酸取代的其變體和等價(jià)物。
8.權(quán)利要求1的人源化抗體，其中所述的抗體包含選自下組的人源化可變重鏈序列(1)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSIT NGFWI WIRKPPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSPISISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(2)EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSIT NGFWI WIRKHPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(3)EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGDSIT NGFWI WIRKHPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSNNQFSLNLNSVTRADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(4)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVYGDSIT NGFWI WIRKPPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFYLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS.和包含不實(shí)質(zhì)性影響所得人源化抗體結(jié)合gp39抗原能力的一個(gè)或幾個(gè)保守氨基酸取代的其變體和等價(jià)物。
9.權(quán)利要求1的人源化抗體，其包含選自下組的人源化可變輕鏈序列(1)DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITC KASQNVITAVA WYQQKPGKSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(2)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KASQNVITAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(3)DIVMTQSPSFMSTSVGDRVTITC KASQNVITAVA WYQQKPGKSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQPEDFADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(4)DIVMTQSPDSMATSLGERVTINC KASQNVITAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQAEDVADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK和選自下組的人源化可變重鏈序列(1)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSIT NGFWI WIRKPPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(2)EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSIT NGFWI WIRKHPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(3)EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGDSIT NGFWI WIRKHPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSNNQFSLNLNSVIRADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(4)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVYGDSIT NGFWI WIRKPPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFYLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS，and和包含不實(shí)質(zhì)性影響所得人源化抗體結(jié)合gp39抗原能力的一個(gè)或幾個(gè)保守氨基酸取代的其變體和等價(jià)物。
10.權(quán)利要求5的人源化抗體，其包含人源化可變輕鏈序列(1)和人源化可變重鏈序列(1)。
11.權(quán)利要求5的人源化抗體，其包含人源化可變輕鏈序列(2)和人源化可變重鏈序列(1)。
12.權(quán)利要求5的人源化抗體，其包含人源化可變輕鏈序列(1)和人源化可變重鏈序列(2)。
13.權(quán)利要求5的人源化抗體，其包含人源化可變輕鏈序列(2)和人源化可變重鏈序列(2)。
14.任一項(xiàng)權(quán)利要求1-9的人源化抗體，其包含人κ或λ輕鏈穩(wěn)定區(qū)和或者人γ1或人γ4重鏈穩(wěn)定區(qū)。
15.編碼任一項(xiàng)權(quán)利要求1-13的人源化抗體的DNA序列。
16.包含權(quán)利要求10的DNA序列的表達(dá)載體。
17.含有從鼠單克隆抗體24-31衍生的人源化抗體的藥物組合物。
18.權(quán)利要求17的藥物組合物，其中所述人源化抗體包含選自下組的人源化可變輕鏈序列(1)DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITC KASQNVITAVA WYQQKPGKSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(2)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KASQNVITAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(3)DIVMTQSPSEMSTSVGDRVTITC KASQNVITAVA WYQQKPGKSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQPEDFADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(4)DIVMTQSPDSMATSLGERVTINC KASQNVITAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQAEDVADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK.和包含不實(shí)質(zhì)性影響所得人源化抗體結(jié)合gp39抗原能力的一個(gè)或幾個(gè)保守氨基酸取代的其變體和等價(jià)物。
19.權(quán)利要求18的藥物組合物，其中所述的人源化抗體包含選自下組的人源化可變重鏈序列(1)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSIT NGFWI WIRKPPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(2)EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSIT NGFWI WTRKHPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(3)EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGDSIT NGFWI WIRKHPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSNNQFSLNLNSVTRADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(4)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVYGDSIT NGFWI WIRKPPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFYLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS，和包含不實(shí)質(zhì)性影響所得人源化抗體結(jié)合gp39抗原能力的一個(gè)或幾個(gè)保守氨基酸取代的其變體和等價(jià)物。
20.權(quán)利要求17的藥物組合物，其中所述人源化抗體包含選自下組的人源化可變輕鏈序列(1)DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITC KASQNVITAVA WYQQKPGXSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(2)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KASQNVITAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLETK；(3)DIVMTQSPSFMSTSVGDRVTITC KASQNVITAVA WYQQKPGKSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQPEDFADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(4)DIVMTQSPDSMATSLGERVTINC KASQNVITAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQAEDVADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK和選自下組的人源化可變重鏈序列(1)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSIT NGFWI WIRKPPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(2)EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSIT NGFWI WIRKHPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(3)EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGDSIT NGFWI WIRKHPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSNNQFSLNLNSVTRADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(4)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVYGDSIT NGFWI WIRKPPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFYLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS，和包含不實(shí)質(zhì)性影響所得人源化抗體結(jié)合gp39抗原能力的一個(gè)或幾個(gè)保守氨基酸取代的其變體和等價(jià)物。
21.權(quán)利要求20的藥物組合物，其中人源化抗體包含人源化可變輕鏈序列(1)和人源化可變重鏈序列(1)。
22.權(quán)利要求20的藥物組合物，其中人源化抗體包含人源化可變輕鏈序列(2)和人源化可變重鏈序列(1)。
23.權(quán)利要求20的藥物組合物，其中人源化抗體包含人源化可變輕鏈序列(1)和人源化可變重鏈序列(2)。
24.權(quán)利要求20的藥物組合物，其中人源化抗體包含人源化可變輕鏈序列(2)和人源化可變重鏈序列(2)。
25.一種通過調(diào)制gp39表達(dá)或抑制gp39/CD40相互作用而可以治療疾病的方法，其包括施用治療有效量的任一項(xiàng)權(quán)利要求1-13的人源化抗體。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述疾病是一種自身免疫疾病。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述自身免疫疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，牛皮癬，多發(fā)性硬化，糖尿病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡和ITP。
28.權(quán)利要求25的方法，其中所述疾病是一種非自身免疫疾病。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所述疾病是移植物抗宿主疾病或移植物排斥。
30.權(quán)利要求25的方法，其中所述疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，紅斑狼瘡，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，慢性甲狀腺病，多發(fā)性硬化，EAE，重癥肌無力，I型糖尿病，葡萄膜炎，腎病變綜合癥，牛皮癬特應(yīng)性皮炎，接觸性皮炎和濕疹皮炎，皮脂溢皮炎，Lichen planus，Pemplugus，大皰天皰瘡，表皮大皰，蕁麻疹，血管水腫，脈管炎，紅斑，皮膚嗜曙紅細(xì)胞增多，簇狀脫發(fā)等；可逆性防礙呼吸道疾病，腸炎和變應(yīng)性反應(yīng)(例如腹腔疾病，直腸炎，嗜曙紅細(xì)胞增多胃腸炎，肥大細(xì)胞病，節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎)和與食物相關(guān)的過敏。
31.權(quán)利要求25的方法，其中所述疾病選自哮喘，白血病，HIV，和淋巴組織瘤。
全文摘要
本發(fā)明涉及結(jié)合人gp39的人源化抗體和其作為治療劑的用途。這些人源化抗體對于治療自身免疫疾病特別有用。
文檔編號C07K16/18GK1207127SQ96199547
公開日1999年2月3日 申請日期1996年11月7日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月7日
發(fā)明者A·布拉克, N·漢納, E·A·帕德蘭, R·A·紐曼 申請人:艾德藥品公司