具有經非免疫原性肽連接在一起的干擾素α和免疫球蛋白Fc的雜合體的制作方法

專利名稱：具有經非免疫原性肽連接在一起的干擾素α和免疫球蛋白Fc的雜合體的制作方法
背景技術：
干擾素-α(“IFNα”)是以重組DNA技術所產生的第一種細胞因子，且已示出在如發炎，病毒及惡性疾病等狀況下具有治療價值。許多種IFNα制劑，包括純化自天然來源及由重組DNA技術所產生者已被應用，且于各種惡性及病毒疾病中被測試。IFNα可造成某些已發展腫瘤的消退，且在某些病毒感染中誘導陰性反應。目前為止，IFNα已于許多國家中被許可或試驗于以下適應癥如卡波西氏肉瘤發細胞白血病；惡性黑色素瘤；基礎細胞癌；多發性骨髓瘤；腎細胞癌；B型肝炎；C型肝炎；花柳疣；I／II皰疹，水痘／輸狀皰疹及蕈樣肉芽腫。
大多數的細胞因子，包括IFNα，由于于活體內產生以局部及暫時作用，因此有相當短的循環半衰期。IFNα的血清半衰期僅約2至8小時(Roche Labs．Refferon A，Schering Intron A，Physicians’DeskReference，47thedition，1993，pp．2006-2008，2194-2201)。為運用IFNα作為有效的全身性治療劑，其需以極大劑量且經常給藥。例如，對AIDS-相關的卡波西氏肉瘤的建議療程之一是始自每天3千6百萬IU的誘導劑量歷10至12周，以肌內或皮下注射方式給予，繼以3千6百萬IU的維持劑量，一周3次。(Roche Labs．Referon a，Physicians’Desk Reference，47th edition，1993，pp．2006-2008)。此種經常性腸外給藥是不方便且令人疼痛的。再者可能由高劑量引起的毒性作用，為某些患者的難處所在。據報道有皮膚，神經學，內分泌及免疫毒性。為克服這些缺點，可修飾分子以增加其循環半衰期或改變藥物的配方以延長其釋出時間。劑量及給藥頻率可減少而仍增加其效力。據報，低于9百萬單位的劑量，是可耐受的，而高于3千6百萬單位的劑量常會誘生嚴重的毒性及顯著地改變病人狀況。(Quesada，J．R．et al．，J．Clin，Oncol．，4234-43，1986)。經由產生新的IFNα也可能實質地減少毒性作用，該新的IFNα可在循環中更穩定且需更少劑量。目前已致力于制造滯留時間有所延長的重組IFNα-明膠綴合物(Tabata，Y．et al．，Cancer Res．515532-8，1991)。于動物中也已試驗以脂質為基礎的膠囊化IFNα配制物，并達到蛋白質在腹膜中延長的釋放(Bonetti，A．and Kim，S．Cancer ChemotherPharmacol．33258-261，1993)。
IgG及IgM類免疫球蛋白為人體血液中含量最豐富的一類。其循環半衰期由數天至21天。當用于形成重組雜合體時，發現IgG可增加許多配體結合蛋白質(受體)的半衰期，包括可溶性CD4分子，LHR及IFN-γ受體(Mordenti J．et al．，Nature，337525-31，1989；Capon，D．J．and Lasky，LA．，美國專利5，116，964；Kurschner，C．et al．，J．Immunol．1494096-4100，1992)。然而，此種雜合體出現難題，即在活性部份C-末端的肽，及在Fc部分N-末端的肽，在融合處會生成新的肽序列，其是一種新抗原，且具免疫原性。本發明涉及一種IFNα-Fc雜合體，其經過設計可克服此問題并延長IFNα的半衰期。
發明概述本發明涉及由二個亞基組成的雜合體重組蛋白質。每個亞基包括一個人類干擾素，較好是IFNα，由一個肽接頭連接，其主要由T細胞惰性序列所組成，連接至人類免疫球蛋白Fc片段上，較好是γ4鏈。γ4鏈優于γ1，因為前者的補體活化能力較少或無此能力。
IFNα的C-末端連接至Fc片段的N-末端。額外的IFNα(或其他細胞因子)可粘附至Fc片段其他任何未結合Fc鏈的N-末端上，產生γ4鏈的同二聚體。若所選擇的Fc片段是另一鏈，如μ鏈，則由于Fc片段可與10個可能的結合位點形成五聚體，此可生成有干擾素或其他細胞因子在10個結合位點中的每一個上連接的分子。
雜合體的二個部分經由T細胞免疫學上惰性的肽而連接，如GlyGly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ IDNO1)。此肽本身是免疫學上無活性的。在融合點處將此肽插入，可將由于二個肽部分連接所產生的新抗原性消除。接頭肽也可增加這些部分的撓性，且可保留生物活性。此相對較長的接頭肽有助于克服由雜合體Fc部分來的可能的立體位阻，后者可干擾雜合體的活性。
雜合體有較天然IFNα延長的半衰期。由于接頭，也可設計以將產生新的免疫原性表位(新抗原)的可能性減低，此點是IFNα及免疫球蛋白Fc片段的融合點。
細胞因子通常是有相當短半衰期的小蛋白質，其可在各種組織中，包括不希望位置，快速消失。據信少量的某些細胞因子可穿越血腦障壁，并進入中樞神經系，由是造成嚴重的神經毒性。IFNα連接至本發明的Fcγ，將尤其可適用于治療B或C型肝炎，因為這些產物在血管內(一旦經靜脈內給藥)有長的滯留時間，且不會穿透不希望的位置。
本文所述的特異雜合體也可充作設計及構建其他細胞因子-Fc雜合體的模型。可使用相同或類似的接頭以減少產生新的免疫原性表位的可能性，同時保留生物活性。利用相同的技術可制成其中白介素-2是細胞因子的細胞因子-Fc雜合體，或包括有其他細胞因子的雜合體。
發明詳述本發明的雜合體分子包括一個干擾素部分，經由獨特的接頭連接至免疫球蛋白Fc部分。優選地，二個干擾素部分的C-末端分別地粘附至重鏈γ4Fc片段的二個N-末端上，而生成一個同二聚體結構。可生成獨特的接頭肽，Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly SerGly Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO1)，以連接二部分。較佳的γ4雜合體的完整核苷酸序列(包括接頭及Fc部分)示于SEQ ID NO7中，且接頭位于189至204號氨基酸殘基。
雜合體甚于天然細胞因子的優點在于活體內的半衰期更長。包括干擾素及γ4鏈Fc同二聚體的雜合體較天然干擾素還大。由于肝中血管的孔徑較大，此大分子更適用于治療肝炎，在此病毒主要是負責侵蝕肝臟。
接頭肽經過設計可增加二部分的撓性，且因此維持其生物活性。雖然干擾素及免疫球蛋白均源自人體，在二分子融合點處始終有產生新的免疫原性表位的可能性。因此，本發明接頭(其主要由T細胞惰性序列所組成)的其他優點在于可在融合點減低免疫原性。于SEQ ID NO7中可見，若接頭(189-204號殘基)不存在，可生成由第189號前的殘基及204號后的殘基所組成的新序列。此新序列對人體而言將是一個新抗原。
人類IFNα衍生自許多不同基因的一個家族。自基因及蛋白質序列資料中，目前已鑒定出24種以上。其到處有相異處，從幾個至最多35個氨基酸不同。大多數有一個23個氨基酸殘基的信號肽序列，及166個氨基酸殘基的成熟氨基酸序列(Goeddel，D．V．et al．，Nature，29020-261981Weissmann，C．and Weber，H．，Prog．Nuc．AcidRes．Mol．Biol．33；251-300，1986；Zoon，K．C．，Interferon，91-12，1987)。
IFNα2(也稱為IFNαA)為最被充分研究的干擾素之一。IFNα2的重組體型式已充作治療劑使用達數年。目前買得到的二種IFNα重組體產物為IFNα2a及IFNα2b，其相異處僅在第23位的一個氨基酸，且二者生物活性間并無顯著不同(von Gabain，A．，et al．，Eur．J．Biochem．190257-61，1990)。
IFNα2a被選為本發明干擾素雜合體的融合配對物，當然IFNα2b或其他的干擾素(包括IFNβ)也可使用。以其他細胞因子也可制備類似的構建體，如白介素-1或白介素-2。可使用相同的連接，不具有免疫原性且可保有構建體生物活性者也可替代的。
雜合體中以γ4鏈作為Fc部分的優點在于其在人循環中是穩定的。γ4(和γ1鏈不同)可避免廣譜的二級生物特性，如補體固定及抗體依賴性細胞介導的胞毒性(ADCC)，這些可能是不希望的特性。
IFNα2a的cDNA可由反轉錄作用及PCR獲得，利用從表達IFNα的白細胞提取的RNA而進行。此種細胞株之一，KG-1可得自美國典型培養物保藏中心(ATCC)，Rockville，Maryland，其編號為CCL246。在制備本發明雜合體的步驟中，于RNA提取的前，細胞以仙臺病毒攻擊以增加干擾素的轉錄作用(Cantell，K．et al．，Methodsin Enzymology，78A29-38，Adacemic Press，1981)。
如上所述，IFNα為IFN的集合，且每一細胞可在相同時間表達許多不同的IFNα亞型。在這些各型DNA序列的同源性如此高以致RT-PCR可能擴增一群而非特殊的一種。為特異地獲得IFNα2acDNA，要設計PCR引物，如此二個引物的最后一個核苷酸可在IFNα2a獨有的氨基酸密碼處結束。其分別是位置S22和161(見Zoon，K．C．Interferon，91-12，1987)。
利用重疊的PCR技術(Daugherty，B．L．et al．，Nucleic Acids Res，192471-6，1991)，可在所希望的任何位置處容易地連接二個基因片段。然而，PCR擴增作用的一個缺點是相當高的突變比例(Saiki，R．K．et al．，Science，239487，1988)。因此也進行DNA測序以檢查由PCR獲得的每一個DNA片段有否突變。當片段大小超過1kb時，測序是冗長且費時的，全長的IFNα-FccDNA也是如此。然而，可將限制酶BamHI位點引入接頭核苷酸序列中，而不改變其氨基酸序列。此位點位于SEQ ID NO1的核苷酸15及16之間。
來自PCR的二個基因片段可分別克隆至克隆載體內。此使DNA更易且更快被測序，因為二片段僅數百堿基對長。一旦鑒定出有正確DNA序列的克隆，二個基因片段可經由BamH I位置連接在一起。不需第二輪的重疊PCR及接下來全長片段的DNA測序工作。
體外表達重組蛋白質的方式有許多種，包括于大腸桿菌，桿狀病毒，酵母，哺乳動物細胞或其他表達系統。原核細胞系統大腸桿菌無法進行轉譯后修飾作用，如糖基化作用。但此點對IFNα-Fc雜合體而言并非嚴重問題，因為天然的IFNα及免疫球蛋白γ4分子并未嚴重糖基化。再者已有報告指出，無任何糖基化作用的重組IFNα可保有其生物學活性(Baron，E．and Narula，S．，Bio／technology，10179-190，1990)。然而，自大腸桿菌溶胞產物中純化重組蛋白質是十分困難的。由大腸桿菌表達的外來蛋白質常會聚集且形成不溶的包涵體。因此常需要包涵體的溶解作用及接下來的再折疊(Schein，C．H．and Noteborn，H．M．，Bio／technology，6291-294，1988；Wilkinson，D．L．and Hamson，R．G．，Bio／technology，9443-448，1991)。
酵母表達系統巴斯德畢赤酵母(Invitrogen，San Diego，CA)可克服利用細菌系統時所遇到的某些問題，其通常可生成高產率，且有能力進行各種轉譯后處理修飾作用。所表達的外來蛋白質可分泌至培養物上清液中，其中并無其他許多蛋白質存留，而使得蛋白質的純化作用及過程的擴大更為容易。此系統先可表達IFNα-Fc雜合體或野生型IFNα2a。不幸地，IFNα-Fc分泌出后發現在SDS-PAGE上會部分降解，而單獨的IFNα2a則否。據信降解作用是由酵母表達系統中存在的蛋白酶活性所致，此由Scorer，C．A．et．Al．，Gene．136111-9，1993中所報告。在樞鈕區中相當弱的點可能是蛋白酶的靶。
也嘗試IFNα-Fc雜合體的哺乳動物細胞表達系統。采用了哺乳動物表達載體，pCDNA3(Invitrogen，San Diego，CA)，其含有一個CMV啟動子及一個NEO抗性基因。宿主細胞，NSO細胞，以pCDNA3／IFNα-Fc表達載體利用電穿孔法轉染。細胞以0．8毫克／毫升濃度的G418選擇。以ELISA鑒定表達IFNα-Fc的克隆。于此系統雜合體可成功地表達，且無降解現象。
在此哺乳動物表達系統中有許多優點。首先，重組蛋白質分泌至培養物上清液中，且在此無聚集作用，由是可簡化純化作用。利用蛋白質A管柱的一個層析步驟可得到經純化的IFNα-Fc蛋白質。同時以此系統產生的蛋白質，其糖基化作用型式和天然分子極相似，因其以哺乳動物細胞表達。再者，天然的IFNα2a信號肽序列包括于表達載體中。因此由細胞分泌的蛋白質具有真實的N-末端，然而，在大腸桿菌或酵母表達系統中，或是無信號肽或是使用非IFNα信號肽。不論何者，可在重組IFNα-Fc的N-末端帶來額外的人工氨基酸殘基。
如上所述，自培養物上清液中純化IFN-αFc重組蛋白質是相當直接的。經由蛋白質A管柱的單步驟親和層析，可容易地獲得純度在90％以上的蛋白質(經SDS-PAGE判斷)。
檢測IFNα生物活性有許多分析方法可應用。利用抗病毒分析法，已證明SEQ ID NO7的雜合體，具有約5至10倍高于相關IFNα-Fc雜合體的比活性，其中接頭分子具有Gly Gly Ser Gly Gly Ser序列(SEQ ID NO2)，且雜合體的Fc部分衍生自人類IgGl而非IgG4。然而，雖然示于SEQ ID NO7中的雜合體的生物活性有實質地改進，其仍較天然IFNα為低。然而可預期，此雜合體有更長的體內半衰期。此期望以下列證明結果為基礎，即在一個小鼠模型中，具有Gly Gly Ser Gly Gly Ser接頭序列及IgGl Fc部分的相關IFNα雜合體有較天然IFNα更長的半衰期。
因為SEQ ID NO7的雜合體預期有較天然IFNα更長的體內半衰期，因此即便其比活性較低，就臨床應用而言，此新的雜合體應優于天然的IFNα。這是因為較長的半衰期結果，使Cxt(濃度對時間曲線下的面積)可數百倍大于天然IFNα。此意味在天然IFNα及雜合體相同摩爾濃度劑量下，后者可提供數百倍增加的IFNα的曝露程度，造成在相同劑量下極為增加的效力，且給藥頻率可較低。
在檢測比活性時，摩爾濃度較佳可替代按每蛋白質質量下的單位計的表達活性。此乃因為干擾素經由與其特異受體結合而作用，此和存在的分子數目直接有關。同時，IFNα-Fcγ4的分子量(110Kd)約5倍多于野生型IFNα2a(20Kd)。考量此點，按單位／微摩爾計的檢測活性替代按單位／毫克計，可提供活性特異性更佳的比較。
實施例1克隆人IFNαcDNA及構建IFNα-Fc表達載體6×106個KG-1細胞(ATCC246)與200單位的仙臺病毒在37℃下培育一夜。回收細胞，再以PBS充分洗滌。利用RNA-ZOL RNA分離試劑盒(BIOTEX，Houston，TX)依循廠商的操作指示提取總RNA。以逆轉錄作用，利用AMV反轉錄酶，并以寡(dT)為3’引物，于50mM Tris-HCl(pH 8．3)、60mMKCl及6mMMgCl2中，以42℃培育1小時合成第一鏈cDNA。反應混合物直接用作PCR的模板以擴增IFNαcDNA。用于PCR的5’引物含有一個HindIII位點，及來自IFNα2a前導肽前21個氨基酸的編碼序列(SEQ ID NO3)。3’引物含有編碼部分接頭(SEQ ID NO1)及IFNα2a后5個氨基酸，且整合在接頭序列中的一個BamHI位點的序列(SEQ IDNO4)。PCR緩沖溶液含有50mMKCl，10mMTris-Hcl(pH8．3)，1．5mMMgCl2，0．01％明膠，0．1毫摩爾每種dNTP，0．5微摩爾每種引物，5微升RT反應混合物，及1單位Taq DNA聚合酶，于共50微升體積中。PCR條件為94℃(1分鐘)，55℃(2分鐘)及72℃(2分鐘)，40個循環于GeneAmp PCR系統9600(Perkin Elmer，Norwalk，CT)。
以逆轉錄作用及PCR得到人類免疫球蛋白γ4Fc的cDNA，如上述方式進行。RNA提取自人類扁桃腺B細胞。5’引物具有SEQ IDNO5所示序列。3’引物具有SEQ ID NO6所示序列。
二個PCR擴增的DNA片段克隆至pUC18中，分別在HindIII／BamI位點或BamHI／EcoR I位點。其DNA序列以來自USB(Cleveland，Ohio)的DNA測序用試劑盒證實后，二個片段經由BamH I位點以第二輪克隆連接在一起。全長的IFNα-Fc cDNA再嵌入哺乳動物表達載體pCDNA3內(Invitrogen，San Diego，CA)，經由HindIII及EcoRI位點插入。
實施例2IFNα-Fc于哺乳動物細胞中的表達將107個NSO細胞與10微克線化的pcDNA3／IFNα-Fc質粒混合于0．8毫升PBS中，并置冰中5分鐘。在200v，960μF下利用GenePulser(BioRad，Hircules，CA)進行電穿孔。細胞再置回冰上20分鐘，并轉移至加有10毫升DMEM(并添加2％FCS)的100毫米組織培養皿內。經在37℃下培育2天后，洗滌細胞并再懸浮于相同培養基中。加入0．6毫克／毫升G418開始篩選。細胞涂布在8個96孔微板上，并在37℃下培育。一周后出現集落，其可在2周內容易地篩選。各孔的上清液，若有單一集落生長者則予以收集。在上清液中的IFNα-Fc經ELISA分析法定量決定，此中應用與辣根過氧化物酶綴合的山羊抗人類IgG及抗人Fc。選出具較高ELISA讀值及較小集落尺寸的克隆進一步亞克隆。這些集落轉移至24孔板內，并供應以含有G418的培養基。將具最高分泌水平的克隆擴大，并使其在旋轉器中生長。于大規模制備時，收集培養物上清液，并通過以PBS平衡的蛋白質A瓊脂糖柱。結合至蛋白質A的蛋白質以50mM檸檬酸鹽(pH3．0)洗脫，并以冷凍干燥法濃縮。
實施例3鑒定IFNα-Fc雜合體分離自NSO培養基的重組蛋白質，其純度以SDS-PAGE及Western印跡法檢查。在針對所有蛋白質以麗春紅S染色的吸印跡膜上可見僅一條蛋白質帶，顯示蛋白質制劑的同質性。此蛋白質的表觀分子量在還原條件下為約55kd，在非還原條件下為110kd，此確實是IFNα-Fc雜合體的預期大小。在非還原條件下，其表觀分子量的加倍提示了此雜合體呈二聚體型式。重組蛋白質可由抗-Fc及抗-IFNα抗體所確認，證實其由二個部份，IFNα及Fc片段所組成。
對IFNα-Fc的生物活性分析是一種抗病毒分析法。特言的，所使用的分析方法為Rodert M．Friedman et al所述策略的修飾(Measurement of antiviral activity induced by interferons α，β andγ，Current Protocols in Immunology，1994，pp．6．9．1-6．9．8)。簡言的，人類肺癌細胞(A549，ATCC#CCL185)以40，000細胞／孔的密度種入96孔板內，并在37℃下培育24小時。加入1∶2系列稀釋的IFNα-Fc雜合體或天然的IFNα(NIH#GXA01-901-535)，并在37℃下培育24小時。每一樣品進行三次。培養基以含有濃度約0．1MOI／細胞的腦心肌炎病毒(ATCC#VR 129B)的新鮮培養基替換，并在37℃下再培養48小時。死細胞吸出洗去，并以PBS充分洗滌。已粘附的細胞以2％甲醛固定，再以吉姆薩染料染色。板以自來水潤洗再令其干燥。經染色的細胞以甲醇溶解，樣品在595毫微米下分光光度地讀取。IFNα-Fc雜合體的抗病毒活性與IFNα標準品比較而評估，且發現是IFNα標準品活性的約30-60％。
應了解，此中所使用的術語及表示僅供示范但不予以限制，且本發明范圍僅由其后的權利要求書所定義，并包括這些權利要求主題中的所有同等事件。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人Yu Liming；Chang，Tse Wen(ⅱ)發明名稱具有經非免疫原性肽連接在一起的干擾素α和免疫球蛋白Fc的雜合體(ⅲ)序列數7(ⅳ)通信地址(A)收信人泰諾克斯生物系統公司(B)街道10301 Stella Link Rd．(C)城市休斯敦(D)州德克薩斯州(E)國家美國(F)郵編71025(ⅴ)計算機可讀形式(A)媒介類型3．5英寸軟盤(B)計算機Addonics C142SVGA(C)操作系統DOS3．30(D)軟件Wordperfect(ⅵ)本申請資料(A)申請號(B)申請日(C)分類(ⅶ)在先申請資料(A)申請號08／579，211(B)申請日1995．12．28
(ⅷ)律師／代理人信息(A)姓名Mirabel，Eric D．(B)注冊號31，211(C)卷號／文檔號95-2-PCT(ⅸ)電迅信息(A)電話(713)664-2288(B)傳真(713)664-8914
(2)SEQIDNO1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度48個核苷酸(B)類型核苷酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲學線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1(2)SEQ ID NO2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度6個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學未知(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2Gly Gly Ser Gly Gly Ser1 5(2)SEQ ID NO3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度81個核苷酸(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3CATAAGCTTC ATCTACAATG GCCTTGACCT TTGCTTTACT 40GGTGGCCCTC CTGGTGCTCA GCTTGCAAGTC AAGCTGCTCT G 81
(2)SEQ ID NO4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度40個核苷酸(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ IDNO4CTCTCCGGAT CCACCTGAGC CACCTTCCTT ACTTCTTAAA 40(2)SEQ ID NO5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度58個核苷酸(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ IDNO5AATGGATCCG GTGGAGGCGG AAGCGGCGGT GGAGGATCAG 40AGTCCAAATA TGGTCCCC 5a(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度42個核苷酸(B)類型核苷酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲學線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ IDNO6ATCGAATTCT ATTTACCCAG AGACAGGGAG AGGCTCTTCT GT 42(2)SEQ ID NO7的信息(ⅰ)序列特征
(A)長度1302個核苷酸(B)類型核苷酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲學線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO7ATG GCC TTG ACC TTT GCT TTA CTG GTG GCC CTC CTG GTG 39Mec Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Lau Leu Val1 5 10CTC AGC TGC AAG TCA AGC TGC TCT CTG GGC TGT GAT CTG 78Leu Ser Cya Lya Ser Ser Cya Ser Leu Gly Cya Aap Leu15 20 25CCT CAA ACC CAC AGC CTG GGT AGC AGG AGG ACC TTG ATG 117Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met30 35CTC CTG GCA CAG ATG AGG AAA ATC TCT CTT TTC TCC TGC 156Leu Leu Ala Gln Met Arg Lya Ile Ser Leu Phe Ser Cya40 45 50TTG AAG GAC AGA CAT GAC TTT GGA TTT CCC CAG GAG GAG 195Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu55 60 65TTT GGC AAC CAG TTC CAA AAG GCT GAA ACC ATC CCT GTC 234Phe Gly Asp Gln Phe Gln Lya Ala Glu Thr Ile Phe Val70 75CTC CAT GAG ATG ATC CAG CAG ATC TTC AAT CTC TTC AGC 273Leu His Glu Met Ile Glu Glu Ile Phe Asp Leu Phe Ser80 85 90ACA AAG GAC TCA TCT GCT GCT TGG GAT GAG ACC CTC CTA 312Thr Lya Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Gln Thr Leu Leu95 100GAC AAA TTC TAC ACT GAA CTC TAC CAG CAG CTG AAT GAC 351Asp Lya Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asp Asp105 110 115CTG GAA GCC TGT GTG ATA CAG GGG GTG GGG GTG ACA GAG 390Leu Glu Ala Cya Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu120 125 130ACT CCC CTG ATG AAG GAG GAC TCC ATT CTG GCT GTG AGG 429Thr Pro Leu Met Lya Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg135 140AAA TAC TTC CAA AGA ATC ACT CTC TAT CTG AAA GAG AAG 468Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys145 150 155AAA TAC AGC CCT TGT GCC TGG GAG GTT GTC AGA GCA GAA 507Lya Tyr Ser Phe Cya Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu160 165ATC ATG AGA TCT TTT TCT TTG TCA ACA AAC TTG CAA GAA 546Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asp Leu Gln Glu170 175 180AGT TTA AGA AGT AAG GAA GGT GGC TCA GGT GGA TCC GGT 585Ser Leu Arg Ser Lya Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly185 190 195GGA GGC GGA AGC GGC GGT GGA GGA TCA GAG TCC AAA TAT 624Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lya Tyr200 205GGT CCC CCG TGC CCA TCA TGC CCA GCA CCT GAG TTC CTG 663Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu210 215 220GGG GGA CCA TCA GTC TTC CTG TTC CCC CCA AAA CCC AAG 702Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys225 230GAC ACT CTC ATG ATC TCC CGC ACC CCT GAG GTC ACG TGC 741Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys235 240 245GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAG GAA GAC CCC GAG GTC CAG 780Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln250 255 260TTC AAC TGG TAC GTG GAT GGC GTG GAG GTG CAT AAT GCC 819Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala265 270AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TTC AAC AGC ACC TAC 858Lya Thr Lya Pro Arg Glu Glu Glu Phe Asn Ser Thr Tyr275 280 285CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG 897Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp290 295CTG AAC GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA 936Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys300 305 310GGC CTC CCG TCC TCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC 975Gly Leu Pro Ssr Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lya Ala315 320 325AAA GGG CAG CCC CGA GAG CCA CAG GTG TAC ACC CTG CCC 1014Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro330 335CCA TCC CAG GAG GAG ATG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG 1053Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu340 345 350ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC TAC CCC AGC GAC ATC GCC 1092Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala355 360GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC 1131Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr365 370 375AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC 1170Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe380 385 390TTC CTC TAC AGC AGG CTA ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG 1209Phe Lya Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp395 400CAG GAG GGG AAT GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG 1248Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cya Ser Val Met His Glu405 410 415CCT CTG CAC AAC CAC TAC ACA CAG AAG AGC CTC TCC CTG 1287Ala Leu His Asp His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu420 425TCT CTG GGT AAA TAG 1302Ser Leu Gly Lya430
權利要求
1.一種雜合體分子，其中含有一個干擾素分子并在其C-末端經由一個肽接頭連接至免疫球蛋白Fc片段的N-末端，其中的肽接頭具有序列Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser(SEQID NO1)。
2.根據權利要求1的雜合體分子，其中另一個干擾素分子在其C-末端經由肽接頭連接至免疫球蛋白Fc片段鏈的N-末端，由此形成一個同二聚體。
3.根據權利要求2的雜合體分子，其中干擾素分子是IFNα2a或IFNα2b。
4.根據權利要求2的雜合體分子，其中的Fc片段是γ4鏈Fc片段。
5.一種治療肝炎，發細胞白血病，多發性骨髓瘤，或其他癌癥或病毒疾病的方法，此方法包括給予權利要求1至4中任一項的雜合體分子。
全文摘要
本發明涉及一種雜合的重組蛋白,其含有人類干擾素,優選是干擾素－α(IFNα),及人類免疫球蛋白Fc片段,優選是γ4鏈,經由肽接頭連接,肽接頭序列為Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO:1)。
文檔編號C07K16/00GK1206350SQ96199422
公開日1999年1月27日 申請日期1996年12月13日 優先權日1995年12月28日
發明者張子文, 於利敏 申請人:泰諾克斯生物系統公司