專利名稱：寡糖氨基糖醇及測定方法
技術領域：
本發明涉及對化合物如酶，例如催化糖苷鍵水解的糖基水解酶、催化轉糖苷作用的轉糖基酶和催化糖苷鍵的斷裂除去的裂合酶的活性進行定位和測定的方法。
活的有機體中有各種糖基水解酶和轉糖基酶，它們通過與糖類底物(包括木聚糖(xyloglucan)、其它半纖維素、纖維素、淀粉、糖原、殼多糖和果膠聚糖)的作用在有機體的生命中起各種不同的作用。檢測和測定這些酶的實驗方法通常是的將合適底物的水性溶液放在容器內(如試管)，用如比色法、放射化學法、色譜法或粘度法來檢測它們的酶催化變化。
然而，這些方法是耗時的，且不宜篩選大量的酶樣品。而且，這些方法并未提供酶在試樣如凝膠電泳圖試樣或部分有機體中的分布或定位的空間信息。
本發明一方面提供可檢測感興趣化合物的存在，或感興趣化合物樣品的空間分布的方法，方法包括步驟將可與感興趣化合物反應或相互作用的標記物浸透或涂覆合適的基底材料，標記物以可被檢測的方式如熒光、放射性或上色來作標記，它對基底材料的親和力和它與感興趣化合物反應或相互作用的產生產物的親和力有相當不同，方法還包下列括步驟，使浸透過的基底材料與測試的樣品接觸，使標記過的標記物得以與存在于樣品中的任何靶化合物反應或相互作用，用合適的溶劑除去未反應的標記過的標記物或標記過的反應產物，檢測留在所述基底材料上的標記過的標記物或檢測從所述基底材料上釋出的標記過的反應產物，以指示感興趣化合物的存在或不存在。
本發明利用了某些糖類而不是其它糖類在選出的溶劑中有與基底材料結合的能力。
較佳的，感興趣化合物是酶，而標記物是酶的底物。所述酶的底物可以是蛋白質、肽、多糖或寡糖。在一個特別佳的方法中，底物是寡糖基-1-氨基-1-脫氧-糖醇。這些化合物由申請人開發，并認為它們是新的。在本說明書中它們被稱作“OAD”類，該術語包括正-糖基-1-氨基-1-脫氧-糖醇、正-寡糖基-1-氨基-1-脫氧-糖醇、正-糖基-6-氨基-6-脫氧-醛糖酸、正-寡糖基-6-氨基-6-脫氧醛糖酸和/或它們的內酯，以及還原性氨基化反應的相關產物。
在一些情況下，還原糖不僅有一個還原性位點，而且有兩個或多個還原性位點隨機地處于其中，這是有利的。這些額外的還原性位點可通過氧化劑如高碘酸鈉獲得。
本發明也提供了制備OAD的方法，是還原糖與銨鹽和還原劑反應。較佳的，銨鹽為碳酸氫銨，還原劑為氰基硼氫化鈉(sodium cyanoborohydride)。本發明更好的特征在附加權利要求中敘述。
如上所述，本發明的方法可用于檢測酶活和/或檢測樣品中酶的空間分布。特別是(但不是唯一的)，本發明的方法可用于下列酶轉糖基酶如葡聚糖蔗糖酶、淀粉蔗糖酶、菊糖蔗糖酶(inulosucrase)、糖原磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、木聚糖合成酶、葡聚糖合成酶、果膠合成酶、糖原合成酶、淀粉合成酶、愈傷葡聚糖合成酶、殼多糖合成酶；糖基水解酶(內作用(endoacting))，如木聚糖酶、內切葡聚糖酶、殼多糖酶、甘露聚糖酶、聚半乳糖醛酸酶、β-淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、鼠李半乳糖醛酸酶；裂合酶如果膠/果膠酸鹽裂合酶、藻酸鹽裂合酶；糖基水解酶(外作用(exoacting))如α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶、α-D-半乳糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、β-D-葡糖苷酶、α-L-巖藻糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、外-聚半乳糖醛酸酶、N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷酶、α-D-木糖苷酶。
現在通過實施例來描述本發明的一個具體例子。在該實施例中待測定的酶是木聚糖內切轉糖基酶(XET)(參考文獻1)。
1.標記過的寡糖的制備將還原寡糖4-正-[4-正-[4-正-[6-正-α-D-吡喃木糖基-β-D-吡喃葡糖基]-6-正-(2-正-β-D-吡喃半乳糖基)-α-D-吡喃木糖基-β-D-吡喃葡糖基]-6-正-(2-正-β-D-吡喃半乳糖基)-α-D-吡喃木糖基-β-D-吡喃葡糖基]-D-葡萄糖(“XLLG”，用參考文獻2中的縮寫命名法)(1克)溶解在25ml含有1克氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)的碳酸氫銨飽和水溶液中，并在暗處25℃下培育7天，以進行還原胺化作用。然后干燥除去碳酸氫銨，用例如凝膠-滲透色譜法或陽離子交換層析來純化XLLG胺化(與茚三酮有反應活性)的衍生物。認為產物是寡糖基-1-氨基-1-脫氧糖醇，即XLLG的衍生物，其中還原性末端D-葡萄糖被1-氨基-1-脫氧-D-葡萄糖醇代替。
將寡糖基-1-氨基-1-脫氧糖醇(50mg)溶解在3ml 3％的四硼酸鈉(四硼酸二鈉；pH＝9.0-9.5)溶液中，在攪拌下逐漸加入含10mg新鮮制備的麗絲胺若丹明磺酰氯(lissamine rhodamine sulphonyl chioride)(從Molecular Probes Inc.，USA購得)的0.75ml干的二甲基甲酰胺(DMF)溶液，使混合物在暗處培育過夜。再加入另外0.75ml含10mg麗絲胺若丹明磺酰氯的DMF，并使混合物再培育8小時。用凝膠滲透色譜法，然后再在C18-硅石凝膠柱中反相層析來純化所得亮粉紅色的寡糖基-1-氨基-1-脫氧糖醇基-麗絲胺-若丹明共軛物(稱作XLLGol-SR)。在水洗后一根柱后，加入甲醇組分并在約50％甲醇下洗出XLLGol-SR。
2.木聚糖浸透過的紙的制備用1％木聚糖的水性溶液潤濕Whatman No.1號濾紙并干燥。將XLLGol-SR制品稀釋在足量的75％水性丙酮中使在580nm波長處的吸光度(A580)為0.2；然后將木聚糖涂覆的Whatman No.1號濾紙浸在溶液中并重新干燥；生成物成為“XET紙”。用非水性粘合劑將合適大小的(如72×108mm)的XET紙粘在不吸收光的介質如透明醋酸酯薄片上。
3.進行測定(a)用斑點印跡法測定水性溶液中的XET活性(i)將待測定XET活性的原料(如生長植物的莖)在合適的緩沖液(如含有10mM氯化鈣和10mM二硫蘇糖醇，pH5.5的250mM琥珀酸鹽)中均一化，對均漿物離心獲得澄清的上清液。其它可測定XET活性的樣品包括從層析柱上洗脫下的各部分、植物細胞懸浮培養物的用過的培養基或用對XET活性的影響有待研究的物質處理過的XET樣品。
(ii)將每種酶溶液用移液管點涂在XET紙的作過標記的位置上。如果點樣量為4μl，則樣品間距可方便地為9mm(即中心間距，如標準的96穴測試平板的格式)。
(iii)將XET紙迅速(在點樣干之前)夾在兩層塑料間(如投影儀上所用的醋酸酯薄片)并在如20℃下培育1小時。
(iv)將培育后的XET紙及其塑料襯底紙面朝下地置于含約150ml溶劑(如新鮮制備的乙醇/甲酸/水，體積比為1∶1∶1)的碟中，溶劑會將未反應的XLLGol-SR從紙上除去，而不除去由于XET催化的經轉糖苷化反應已與木聚糖結合的XLLGol-SR。這時紙很容易從塑料襯底上脫下。
(v)然后使紙在流水下沖洗5分鐘，再用約100ml丙酮沖洗5分鐘，然后完全干燥。如果需要，干燥可在80℃的烘箱內處理5分鐘來加速。
(vi)然后在短波紫外燈下檢查紙(如發射波長為254nm；需穿戴上合適的眼睛和皮膚保護設施)。粉紅色斑點表示活潑的XET，它可用掃描分光熒光儀來定量。該測定方法可用來測試促進或抑制XET活性的物質存在。
(b)活性印染對植物組織或酶譜中的XET活性定位將XET-紙用緩沖液處理，如噴灑含10mM氯化鈣和10mM二硫蘇糖醇，pH5.5的500mM琥珀酸鹽。將植物組織切開，形成外露的表面；為對葉子表面的XET活性作區域圖，最好將葉子壓在試紙和一粗糙表面(如砂紙)間或將試紙上的葉子壓在非常冷(如-80℃)而重的金屬平面下來促進組織的破裂(然后升至室溫)。然后將外露的組織表面、或凝膠電泳圖譜或其它可在其上作XET活性區域圖的表面在濕紙上壓1分鐘，使酶轉移至紙上。然后將酶原料從XET紙上除去，并進行上述步驟(iii)至(vi)。
上述實施例描述了本發明用于轉糖基酶XET時的情況。該方法也適用于測定糖基水解酶。例如被XLLGol-SR(沒有木聚糖)浸透的Whatman No.1號紙可用于斑點印跡法測定糖基水解酶(α-木聚糖苷酶、β-葡糖苷酶和β-半乳糖苷酶)一起催化XLLGol外水解活性。測定用上述3(a)相同的方法進行，除了在步驟(iv)中選用一種溶劑(如90％乙醇)將低于一定大小的XLLGol-SR水解產物而不是XLLGol-SR本身從紙上去掉；步驟(v)不用其它溶劑，而只是干燥。相應的糖基水解酶的活性在熒光紙背景上產生了非熒光的各點。
上述制備XLLGol-SR的方法很容易現成的作為有普遍價值的方法用于制備熒光標記的還原性寡糖或多糖。這些標記過的糖(如寡糖)可用于-對內切-和外切-糖基水解酶和轉糖基酶(包括那些與淀粉新陳代謝有關的酶)的各種酶測定；-用HPLC或TLC與純的糖基水解酶結合使用，以檢測、分離和表征感興趣的寡糖，寡糖作為可靠標記物；-作為植物組織適用的探針，在加入或不加入未標記木聚糖的情況下，用熒光顯微術來繪制組織化學中的XET活性區域分布。
正-糖基-1-氨基-1-脫氧-糖醇和/或正-寡糖基-1-氨基-1-脫氧糖醇用所述方法(還原性胺化)可從任何還原性寡糖出發來制得。從寡糖可獲得類似的產物，其中還原性末端是修飾過的糖；例如，當寡糖的還原性末端是己糖醛酸時，反應產物是正寡糖基-6-氨基-6-脫氧醛酸或其內酯。任何這些還原性胺化反應的產物可通過它們的氨基基團被檢測出(如用茚三酮著色)，它們可用于各種目的，包括-寡糖的色譜和電泳測定；-用作酶反應的調節劑。
參考文獻[1]Fry SC，Smith RC，Renwick KF，Martin DJ，Hodge SK，Matthews KJ(1992)“木聚糖內源轉糖基酶，一種來自植物的新的壁松弛酶活性”“Xyloglucan endo-transglycosyiase，a new wall-loosening enzyme activity from plants”，“生物化學雜志”“Biochemical Journal”282821-828[2]Fry SC，York WS.Albersheim P，Darvill A，Hayashi T，Joseleau J-P，Kato Y，Lorences EP，Maclachlan GA，McNeil M，Mort AJ，Reid JSG，Seitz，HU，SelvendranRR，Voragen AGJ，White AR(1993)一種用于木聚糖衍生所得的寡糖的明確命名”“An unambiguous nomenclature for xyloglucan-derived oligosaccharides”，“作物生理雜志”“Physiologia Plantarum”891-權利要求
1.一種檢測感興趣化合物的存在、或感興趣化合物樣品中的空間分布的方法，方法包括步驟用可與感興趣化合物反應或相互作用的標記物浸透或涂覆合適的基底材料，標記物用可被檢測的方式如熒光、放射性或上色來作標記，并對基底材料及與感興趣化合物反應或相互作用產生的產物有不同的親和性，方法還包括步驟，使浸透過的基底材料與測試的樣品接觸，使標記過的標記物與任何存在于樣品中的靶化合物反應或相互作用，用合適的溶劑除去不反應的標記過的標記物或標記過的反應產物，檢測留在所述基底材料上的標記過的標記物或檢測從所述基底材料上釋出的標記過的反應產物，以指示感興趣化合物的存在或不存在。
2.根據權利要求1所述的方法，其中感興趣的化合物是酶，標記物是酶的底物。
3.根據權利要求2所述的方法，其中酶是糖基水解酶、轉糖基酶或裂合酶。
4.根據權利要求3所述的方法，其中的酶與木聚糖、其它半纖維素、淀粉、糖原、殼多糖或果膠聚糖反應。
5.根據權利要求1至4的任一條所述的方法，其中標記物是如所確定的寡糖基-1-氨基-1-脫氧-糖醇OAD。
6.根據前述任一條權利要求所述的方法，其中標記物用麗絲胺若丹明磺酰氯作標記。
7.根據權利要求5或權利要求6所述的方法，適用于(a)水溶液斑點印跡測定(i)α-木糖苷酶、β-葡糖苷酶和β-半乳糖苷酶的活性或(ii)提高或降低α-木糖苷酶、β-葡糖苷酶和β-半乳糖苷酶活性的物質的存在，或(b)進行組織染色以研究植物組織中α-木糖苷酶、β-葡糖苷酶和β-半乳糖苷酶的活性的分布，或(c)進行凝膠電泳圖譜印跡以研究α-木糖苷酶、β-葡糖苷酶和β-半乳糖苷酶的活性在酶譜上的分布，其中底物是從木聚糖衍生獲得的寡糖如XLLG。
8.根據權利要求2或其任一附屬權利要求所述的方法，其中基底材料還用未標記過的所述酶的共同底物來浸透。
9.根據權利要求8所述的方法，適用于(a)進行水性溶液斑點印跡法測定(i)木聚糖內切轉糖基酶XET的活性，或(ii)是否存在促進或抑制XET活性的物質，或(b)進行組織染色以研究植物組織中XET活性的分布，或(c)進行凝膠電泳圖譜印跡法以研究XET活性在酶譜上的分布，其中底物是從木聚糖衍生獲得的寡糖如XLLG，基底材料還用未標記過的木聚糖浸透。
10.一種如所定義的寡糖基-1-氨基-1-脫氧-糖醇OAD。
11.一種生產權利要求10所述的OAD的方法，包括還原糖與銨鹽和還原劑的反應。
12.根據權利要求11所述的方法，其中銨鹽是碳酸氫銨。
13.根據權利要求11或12所述的方法，其中還原劑是氰基硼氫化鈉。
14.一種標記權利要求10所述的OAD的方法，包括使OAD與麗絲胺若丹明磺酰氯反應。
15.根據權利要求1至9的任一條所述的方法，其中基底材料是濾紙、硝基纖維素片，或電泳凝膠，如聚丙烯酰胺、瓊脂糖或淀粉。
16.根據權利要求15所述的方法，如依附于權利要求1至9的任一條，其中基底物質是合適的凝膠如聚丙烯酰胺，方法包括電泳分離蛋白質并原地鑒別這些可與浸透過的底物作用的蛋白質糖基水解酶和轉糖基酶，以形成一個酶譜。
17.如權利要求10所述并從XLLG衍生獲得的OAD和麗絲胺若丹明磺酰氯間形成的標記過的共軛物的應用，它用作植物組織適用的探針，在加入或沒有加入的未標記的木聚糖下繪制XET組織化學的活性區域分布。
18.如權利要求10所述的有與茚三酮反應活性的OAD在用包括HPLC和陽離子交換層析分析的色譜法或包括毛細管電泳或高壓紙電泳的電泳法來測定寡糖作為可靠的標準標記物的應用。
19.如權利要求10所述的OAD的標記過的共軛物在用包括HPLC、薄層層析或紙層析的色譜法或電泳法測定寡糖時用作可靠的標準標記物的應用。
20.一種測定如XET的工具，包括用權利要求10所述的OAD浸透的基底材料。
全文摘要
本發明公開一種檢測感興趣化合物(如酶)的存在,或在感興趣化合物樣品中空間分布的方法。步驟是用可與感興趣化合物反應或相互作用的標記物浸透或涂覆合適的基底材料,標記物用可被檢測的方式如熒光、放射性或上色來作標記,它對基底材料和與感興趣化合物反應或相互作用產生的產物有不同的親和性。方法還包括步驟,使浸透的基底材料與測試樣品接觸,使標記過的標記物與任何樣品中的靶化合物反應或相互作用,用合適的溶劑除去不反應的標記過的標記物或標記過的反應產物,檢測留在所述基底材料上的標記過的標記物或檢測從所述基底材料上釋出的標記過的反應產物,以指示感興趣化合物的存在或不存在。標記物可以是寡糖,最好是寡糖基－1－氨基－1－氨基－糖醇(OAD)。本發明也公開了制備OAD的方法。
文檔編號C07H15/04GK1196754SQ9619706
公開日1998年10月21日 申請日期1996年9月23日 優先權日1995年9月22日
發明者S·C·弗賴伊 申請人:諾佛·諾迪斯聯合股份有限公司