通過表達高水平的抗生物素蛋白誘導植物雄性不育性的制作方法

專利名稱：通過表達高水平的抗生物素蛋白誘導植物雄性不育性的制作方法
背景技術：
本發明涉及使用編碼抗生物素蛋白的DNA分子控制植物育性的方法。特別是，本發明涉及生產表達抗生物素蛋白的轉基因雄性不育植物的方法。此外，本發明涉及在雄性不育植物子代中恢復雄性育性的方法。
花粉育性的控制在雜種作物生產中是重要的，參見例如J.M.Poehlman，BREEDING FIELD CROP，3rd ed.(Van Nostrand andReinhold，New York，NY，1987)，該書通過引用結合到本文中。例如在雜種玉米生產中，通常在花粉散發之前，物理除去雄性花序或雄穗，達到花粉育性的控制。人工去雄穗的工作量很大。雖然機械去雄穗比人工去雄穗的工作量小，但它的可靠性較小，需要隨后檢查作物，并且可能需要進行補救性人工去雄穗。兩種去雄穗方法都引起母本產量的損失。
然而，大多數重要的主要作物在同一個花內具有雄性和雌性兩個功能器官；因此，去雄不是一個簡單的操作。盡管在花粉散發前可以手工除去花粉形成器官，但該方式雜種生產的工作量極大，并且極其昂貴。
也可以通過應用具有殺雄配子性質的葉噴霧劑控制花粉育性。Cross等人，Sex Plant Reprod.4235(1991)。例如將乙烯利撒到花藥上，導致小麥花粉額外的有絲分裂，導致大麥絨氈層細胞退化，導致畫眉屬花粉畸形或花粉敗育。Bennet等人，Nature 240566(1972)，Colhoun等人，Plant Cell Environ.621(1983)；Berthe等人，Crop Sci.1835(1978)。然而，化學方法的工作量大，并且存在將化學藥品毒性導入環境的潛在問題。
此外，使用殺配子劑的雜種種子的工業生產受費用和化學藥品可用性的限制，也受施藥可靠性和作用時間的限制。殺配子劑的一個嚴重的限制是它們具有毒害植物的作用，其嚴重性取決于基因型。其它限制包括這些化學藥品可能對花期較長的作物無效，因為產生的新花可能不受影響。因此，需要重復使用化學藥品。
目前大田作物的許多工業雜種種子生產系統依賴于傳粉控制的遺傳方法。用作母本的植物或者不能散粉、產生生化上不能進行自花受精的花粉，或者不能制造花粉。不能自花受精的植物稱為“自交不親和”。與使用自交不親和性系統有關的困難包括自交不親和母系的可用性及其繁殖，以及自交不親和性的穩定性。在某些情況下，可用化學方法克服自交不親和性，或在阻斷花粉的生化機制被激活前對未成熟芽進行人工授粉。可失效的自交不親和性系統通常非常易受惡劣氣候條件的傷害，后者破壞或減小生化阻斷自花傳粉的效力。
工業種子生產較廣泛感興趣的是造成雄性不育的基于遺傳花粉控制的系統。這些系統有兩個一般類型(1)核雄性不育性，這是因為一個或多個核基因發生突變，不能形成花粉，或(2)細胞質遺傳的雄性不育性，通常稱為“細胞質雄性不育性”(CMS)，其中因為細胞質細胞器(通常為線粒體)的改變，花粉形成被阻斷或花粉敗育。
核不育性可以或者是顯性，或者是隱性。如果可以進行母系的營養繁殖或無性繁殖，那么顯性不育性只能用于雜種種子的形成。如果不育性植物或可育性植物易于區別，那么可以使用隱性不育性。然而，顯性不育性系統和隱性不育性系統的工業實用性分別受無性繁殖的費用和自花能稔植物母系選株的限制。
盡管有涉及使用CMS的雜交方案，但是其工業價值有限制。一個CMS系統的實例是位于細胞質的線粒體中的一個特異性突變，在適當的核背景下導致不能形成成熟花粉。在某些情況下，核背景可以補償細胞質突變，形成正常花粉。特異性核“恢復基因”使得具有CMS線粒體的植物形成花粉。一般來說，使用CMS進行工業種子生產涉及使用三個育種系一個雄性不育系(母本)；一個保持系，與雄性不育系同源，但含有完整功能的線粒體；和一個父本系。父本系可以攜帶或可以不攜帶細胞質特異性恢復基因。
對于諸如蔬菜之類雜種的種子回收不重要的作物而言，可以使用CMS系統，而不用恢復。對于雜種的果實或種子為工業產品的作物而言，必須用父本的特異性恢復基因恢復雜種種子的育性，或必須對雄性不育雜種授粉。可以通過用小比例的雄性可育植物進行授粉而完成。在大多數物種中，由于所有的細胞質細胞器都只由卵細胞遺傳，因此CMS特征是母體遺傳的。
CMS系統具有一些限制，可以妨礙它們作為生產雄性不育植物的唯一方法。例如，玉米的一種特殊CMS類型(T細胞質)賦予對特定真菌感染產生的毒素的敏感性。雖然許多作物仍使用CMS系統，但它在某些環境條件下可能發生故障。
因此，顯然非常需要除人工、機械、化學和常規遺傳方法外的控制花粉生產的方法。
發明概述因此，本發明的一個目的是提供產生雄性不育植物的方法，即通過異源表達抗生物素蛋白使植物不育。
本發明的另一目的是提供一個嵌合基因，該基因包含編碼抗生物素蛋白的DNA序列，操作性地與植物啟動子序列連接。
本發明的另一目的是提出逆轉因表達抗生物素蛋白引起的雄性不育性的方法。
按照本發明的一個實施方案，通過提供包含操作性地與植物啟動子連接的編碼抗生物素蛋白核苷酸序列的分離DNA分子，達到這些目的和其它目的。在一個推薦實施方案中，該分離的DNA序列包含于一個表達載體中。在另一推薦實施方案中，該植物啟動子序列為組成型啟動子，在另一推薦實施方案中，組成型啟動子為遍在蛋白質啟動子。
按照本發明的另一實施方案，提供一轉基因植物，其中該植物包含異源核苷酸序列，后者包含抗生物素蛋白基因，并且該異源核苷酸序列提高植物組織中抗生物素蛋白的濃度，引起雄性不育性。在一個推薦實施方案中，轉基因植物為玉米植株、大豆植株或向日葵植株。在另一推薦實施方案中，該異源DNA分子還包含一個組成型啟動子序列，后者在一個推薦實施方案中為遍在蛋白質啟動子序列。
按照本發明的再一個方面，提供產生轉基因雄性不育植物的方法，包括將包含一個啟動子和一個抗生物素蛋白基因的表達載體導入植物細胞中，其中啟動子控制抗生物素蛋白基因的表達，而抗生物素蛋白基因的表達引起雄性不育性。在一個推薦實施方案中，由該植物細胞再生轉基因植物。在另一推薦實施方案中，該啟動子包括遍在蛋白質啟動子或可誘導啟動子。
按照本發明的再一個方面，提供使用抗生物素蛋白基因產生雄性不育雜種植物的方法，包括產生包含上述DNA分子的第一親本雄性不育植株，其中抗生物素蛋白的表達引起雄性不育性；產生表達第二外源基因的第二轉基因親本植株；以及第一親本與第二親本異花受精，產生表達第二外源基因的雜種植株，其中第二外源基因的產物減少雜種植株中抗生物素蛋白的表達，由此產生雄性可育雜種植物。
在本發明該方面的一個推薦實施方案中，第二外源基因選自反義基因、核酶基因和外導序列(extemal guide sequence)基因。在另一推薦實施方案中，反義基因包含抗生物素蛋白mRNA序列，在再一推薦實施方案中該mRNA序列在可誘導啟動子的控制下。在另一推薦實施方案中，核酶基因包含抗生物素蛋白mRNA序列。在再一推薦實施方案中，外導序列基因包含抗生物素蛋白mRNA序列。在再一推薦實施方案中，第一親本植株的DNA分子還包含操作性地與所述啟動子連接的LexA操縱子，其中第二外源基因為LexA阻遏物基因。在另一推薦實施方案中，啟動子序列為包含一個花藥框的花藥特異性啟動子序列，花藥框選自SEQ ID NO1的核苷酸序列、SEQ ID NO2的核苷酸序列、SEQ ID NO3的核苷酸序列和它們的一個功能片斷。
在本發明該方面的再一推薦實施方案中，花藥框具有SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的核苷酸序列，而花藥特異性啟動子還包含一個核心啟動子，該核心啟動子選自CaMV 35S核心啟動子、SEQ ID NO4的核苷酸序列、SEQ ID NO5的核苷酸序列、SEQ ID NO6的核苷酸序列和它們的一個功能片斷。
按照本發明的再一個方面，提供使因表達抗生物素蛋白而雄性不育的植物恢復育性的方法，包括向植物噴灑生物素溶液。
附圖簡述

圖1表示抗生物素蛋白編碼質粒PHI5168。
圖2表示編碼bar基因的質粒PHI610。
推薦實施方案的詳細說明1.定義在以下說明中，大量使用多個術語。為了便于理解本發明，提供以下定義。
結構基因為轉錄為信使RNA(mRNA)、然后翻譯為特定多肽的氨基酸序列特征的DNA序列。
外源基因在本說明書中是指操作性地與至少一個異源調控成分連接的DNA序列。例如，如果由5126基因的花藥特異性調控成分控制，那么除玉米5126結構基因外的任何基因都被認為是外源基因。
啟動子為指導基因(諸如結構基因、反義基因、核酶基因或外導序列基因等)轉錄的DNA序列。啟動子通常位于基因5’區，接近轉錄起始位點。如果啟動子為可誘導啟動子，那么相應于誘導物增加轉錄速率。相反，如果啟動子為組成型啟動子，那么轉錄速率不受誘導物的調控。植物啟動子為植物組織中指導基因轉錄的啟動子序列。
核心啟動子含有啟動子功能的基本核苷酸序列，包括TATA框和轉錄起點。根據該定義，核心啟動子在缺乏增強活性或賦予組織特異性活性的特定序列的情況下，可能具有或不具有可檢測的活性。例如，SGB6核心啟動子由SGB6基因轉錄起始位點5’方向(5’-ward)的大約38個核苷酸組成，而花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S核心啟動子由35S基因組的轉錄起始位點5’方向的大約33個核苷酸組成。
組織特異性啟動子為這樣一種DNA序列，當它操作性地與一個基因連接時，它指導的該基因的轉錄水平在生物體特定組織中比該生物體中的一些或所有其它組織高。例如，花藥特異性啟動子為指導植物花藥組織中相關基因較高水平轉錄的DNA序列。例如，SGB6花藥特異性啟動子可以指導外源基因在花藥組織中表達，而不在根組織或胚芽鞘組織中表達。
這里所用的“花藥特異性啟動子”包括兩個功能成分一個“花藥框”和一個核心啟動子。特定的花藥框可能具有標準增強子的功能特征。花藥框和核心啟動子的組合可以比單獨的核心啟動子更大程度地刺激基因表達。甚至在含有得自不同基因的花藥框和核心啟動子的嵌合花藥特異性啟動子的情況下也是如此。下面描述這類嵌合花藥特異性調控成分。
操縱子是位于基因5’方向的DNA分子，它含有由阻遏蛋白識別并結合的核苷酸序列。阻遏蛋白與其識別的操縱子的結合導致基因轉錄的抑制。例如，LexA基因編碼與LexA操縱子結合的阻遏蛋白。
分離的DNA分子為由生物體DNA分離的DNA片斷。例如，編碼抗生物素蛋白基因的克隆DNA分子為一個分離的DNA分子。分離的DNA分子的另一實例為化學合成的DNA分子或酶法制備的cDNA，它不整合入生物體的基因組DNA。
增強子為可以增加轉錄效率的DNA調控成分。
互補DNA(cDNA)為用酶(反轉錄酶)由mRNA模板形成的單鏈DNA分子。通常，與mRNA的部分互補的引物用于反轉錄的起始。本領域技術人員也使用術語“cDNA”，是指由這種單鏈DNA分子與其互補DNA鏈組成的雙鏈DNA分子。
術語表達是指基因產物的生物合成。例如，在結構基因的情況下，表達涉及將結構基因轉錄為mRNA，然后將mRNA翻譯為一種或多種多肽。
克隆載體是一種諸如質粒、粘粒或噬菌體之類的DNA分子，它能夠在宿主細胞中自主復制。克隆載體通常含有一個或少數限制性內切酶識別位點，這些位點上可以以確定的方式插入外源DNA序列，而不損失載體的基本生物學功能；還含有標記基因，后者適用于用克隆載體轉化的細胞的識別和篩選。標記基因通常包括提供四環素抗性或氨芐青霉素抗性的基因。
表達載體是包含在宿主細胞中表達的基因的一種DNA分子。基因表達通常在某些調控成分(包括組成型啟動子或可誘導啟動子、組織特異性調控成分和增強子)的控制下。我們說這一基因與調控成分“操作性地連接”。
重組宿主可以為任何或者含有一個克隆載體或者含有一個表達載體的原核細胞或真核細胞。該術語也包括已經進行遺傳工程、在宿主細胞的染色體或基因組中含有一個或多個克隆基因的那些原核細胞或真核細胞。
轉基因植物為具有一個或多個含有外源基因的植物細胞的植物。
在真核生物中，RNA聚合酶II催化結構基因的轉錄，產生mRNA。可以設計一個DNA分子，使其含有RNA聚合酶II的模板，其中RNA轉錄物的序列與一定特定的mRNA互補。該RNA轉錄物稱為反義RNA，而編碼反義RNA的DNA序列稱為反義基因。反義RNA分子能夠與mRNA分子結合，導致mRNA翻譯的抑制。
核酶為含有一個催化中心的一種RNA分子。該術語包括RNA酶、自身拼接RNA和自身切割RNA。編碼核酶的DNA序列稱為核酶基因。
外導序列為一種RNA分子，它將一個內源核酶(RNA酶P)導向特定種類的胞內mRNA，導致該mRNA被RNA酶P切割。編碼外導序列的DNA序列稱為外導序列基因。2.概述本發明通過制備表達抗生物素蛋白的轉基因植物，提供產生雄性不育植物的方法。抗生物素蛋白可以以非組織特異性方式以組成型表達，或可以以花藥特異性方式表達。也提供恢復雄性育性的方法。
分離抗生物素蛋白基因，將其插入適于導入植物組織的表達載體中。表達載體還包含一個啟動子，后者可以為組成型啟動子、非組織特異性啟動子(諸如遍在蛋白質啟動子等)、組織特異性啟動子(諸如花藥特異性啟動子等)或可誘導啟動子。通過標準方法將表達載體導入植物組織中，篩選并繁殖轉基因植物。表達抗生物素蛋白的轉基因植物為雄性不育的。通過在轉基因植物中共表達抑制抗生物素蛋白基因轉錄或抑制抗生物素蛋白mRNA翻譯的第二基因，可以恢復雄性育性。或者，可以通過用生物素溶液噴灑發育的植物，恢復雄性育性。3.編碼抗生物素蛋白的DNA分子的分離可以用已知方法分離編碼抗生物素蛋白的核苷酸序列。例如，可以用Gope等人，Nucleic Acids Res.153595(1987)所述方法(該論文通過引用結合到本文中)，從雞輸卵管cDNA文庫中分離編碼雞卵清抗生物素蛋白的cDNA。
或者，可以由已知產生抗生物素蛋白的生物體的基因組DNA中獲得抗生物素蛋白基因的基因組克隆。例如，可以用Keinanen等人，Eur.J.Biochem.220615(1994)所述方法，由雞基因組DNA中克隆雞抗生物素蛋白基因。
也可以采用聚合酶鏈反應(PCR)，用標準方法分離抗生物素蛋白基因。參見Erlich，PCR TECHNOLOGYPRINCIPLES ANDAPPLICATIONS FOR DNA AMPLIFICATION(Stockton Press，NY，1989)和Innis等人，PCR PROTOCOLSA GUIDE TO METHODS ANDAPPLICATIONS(Academic Press，San Diego，1990)。諸如ELONGASETM系統(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)之類的長核苷酸序列的PCR擴增方法，也可以用來獲得較長的核苷酸序列，諸如編碼抗生物素蛋白的基因組克隆。與已知的抗生物素蛋白基因序列的5’末端和3’末端互補的PCR引物可以用市售的寡核苷酸合成儀、諸如Applied Biosystems(Foster City，CA)供應的那些合成儀來合成。在一個推薦實施方案中，該引物包括含有限制性核酸內切酶切割位點的其它核苷酸序列。這類位點的存在使得在用適當的限制性內切酶處理后，將PCR產物定向克隆到適當的克隆載體中。參見在CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Ausubel等人Eds(JohnWiley & Sons，New York，1987)第15.7.1頁中Finny的“MolecularClonig of PCR Products”。
PCR的模板DNA可以或者是cDNA或者是基因組DNA，可以用本領域眾所周知的方法由適當的生物體制備。Sambrook等人，MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL，SecondEdition，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY1989)。可以用諸如TriazolTM(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)之類的市售試劑，直接由鳥類、爬行動物或兩棲動物組織制備基因組DNA。或者，可以用市售的藥盒(Pharmacia，Piscataway，NJ)，用由雞輸卵管組織提取的mRNA制備編碼抗生物素蛋白的cDNA。用標準技術，使用poly(dT)或隨機六聚物引物，將該mRNA制劑用作cDNA合成的模板。參見Sambrook等人，supra。然后，用市售藥盒(Pharmacia)進行cDNA合成，使用Saiki等人，Science 239487(1988)的方法，將cDNA直接用于PCR。
用上述方法分離的基因組DNA或cDNA片斷可以按照常規技術(諸如使用限制性內切酶降解產生適當末端，使用堿性磷酸酶處理以避免DNA分子不合適的連接，以及用適當的連接酶連接等)，插入諸如噬菌體或粘粒載體之類的載體中。Ausubel等人(eds.)，CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，第3.0.5-3.17.5頁(1990)[“Ausubel”]公開了這類載體的操作技術。
或者，采用相互引發長寡核苷酸，合成編碼抗生物素蛋白的DNA分子，可以獲得編碼抗生物素蛋白的核苷酸序列。參見例如Ausubel等人第8.2.8-8.2.13頁。也參見Wosnick等人，Gene 60115(1987)。目前采用聚合酶鏈反應的技術提供合成最大為1.8千堿基對長度的基因的能力。Adang等人，Plant Molec.Biol.211131(1993)；Bambot等人，PCR Methods and Applications 2266(1993)。合成的抗生物素蛋白基因的核苷酸序列可以基于任何已知的編碼抗生物素蛋白的DNA分子。參見例如Gope等人，supra。
可以用諸如限制性內切酶分析、Southem分析、引物延伸分析和DNA序列分析之類的多種標準技術分析這些克隆。例如引物延伸分析或S1核酸酶保護分析可以用來將克隆基因轉錄的假定起始位點定位。Ausubel第4.8.1-4.8.5頁；Walmsley等人，在METHODS INMOLECULAR BIOLOGY，VOL.7GENE TRANSFER ANDEXPRESSION PROTOCOLS，Murray(ed.)，第271-281頁(HumanaPress Inc.1991)中的“Quantitative and Qualitative Analysis of ExogenousGene Expression by the S1 Nuclease Protection Assay”。4.將抗生物素蛋白基因克隆到達載體中和制備轉基因植物一旦分離出抗生物素蛋白基因，則用標準方法將其放入表達載體中。參見Sambrook等，supra。適當表達載體的選擇取決于將表達載體導入宿主細胞的方法。表達載體通常含有(1)編碼細菌復制原點和抗生素抗性基因的原核DNA成分，用于細菌宿主中表達載體的生長和篩選；(2)用于插入外源DNA序列(例如抗生物素蛋白基因)的克隆位點；(3)控制外源基因轉錄起始的真核DNA成分，諸如啟動子等；(4)控制轉錄物加工的DNA成分，諸如一個轉錄終止/加poly(A)的序列等；以及(5)編碼標記蛋白(例如報道基因)的基因，其中該基因操作性地與控制轉錄起始的DNA成分連接。在METHODS IN PLANTMILECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY，Glick等人(eds)第89-119頁(CRC Press，1993)中Gruber等人的“Vector for PlantTransformation，”中有植物表達載體和報道基因的一般描述。
在本發明的一個推薦實施方案中，使用植物遍在蛋白質啟動子系統。植物遍在蛋白質啟動子是本領域眾所周知的。參見例如歐洲專利申請0 342 926，該專利申請通過引用結合到本文中。遍在蛋白質啟動子為組成型啟動子。
在本發明的另一推薦實施方案中，使用可誘導啟動子對抗生物素蛋白表達進行誘導調控。這一可誘導啟動子的實例為玉米的谷胱甘肽S轉移酶系統。參見Weigand等人，Plant Mol.Biol.7235(1986)。該方法也用于可逆誘導雄性不育性。因此，抗生物素蛋白的表達和伴隨的雄性不育性可以根據需要，通過激活啟動子來控制。當不激活啟動子時，抗生物素蛋白不表達，植物為雄性可育。
可以將含有抗生物素蛋白基因的表達載體導入原生質體中，或導入完整的組織(諸如未成熟胚和分生組織)中，或導入愈傷組織培養物中，或導入分離的細胞中。表達載體最好導入完整的組織中。例如在METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY ANDBIOTECHNOLOGY，Glick等人(eds)第67-88頁(CRC Press，1993)中Miki等人的“Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants，”和在CORN AND CORN IMPROVEMENT，3rd Edition，Sprague等人(eds)，第345-387頁(American Society of Agronomy，Inc.et al.1988)中Phillips等人的“Cell/Tissue Culture and In Vitro Manipulation”中提供了培養植物組織的一般方法。
將表達載體導入植物組織的方法包括根癌農桿菌直接感染植物組織或將植物組織與根癌農桿菌共培養。Horsch等人，Science 2271229(1985)。最好用解除武裝的Ti質粒作為外源DNA序列的載體。可以采用例如歐洲專利申請116 718(1984)和270 822(1988)中所述步驟進行轉化。推薦的Ti質粒在邊界序列之間或至少在右邊界序列的上游含有外源DNA序列。
采用諸如直接基因轉移(參見例如PCT申請WO 85/01856和歐洲申請275 069)、體外原生質體轉化(例如美國專利4,684,611)、植物病毒介導的轉化(例如歐洲申請067 553和美國專利4,407,956)和脂質體介導的轉化(例如美國專利4,536,475)之類的步驟，可以用其它類型的載體轉化植物細胞。Fromm等人，Bio/Technology 8833(1990)和Gordon-Kamm等人，The Plant Cell 2603(1990)提供了適當的玉米轉化方法。Christou等人，Trends in Biotechnology10239(1992)和Lee等人，Proc.Nat’l Acad Sci.USA 886389(1991)描述了水稻的標準轉化方法。可以采用與轉化玉米或水稻的相似技術轉化小麥。此外Casas等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 9011212(1993)描述了轉化高粱的方法，而Wan等人，Plant Physiol.10437(1994)描述了轉化大麥的方法。
一般來說，直接基因轉移法優選用于單子葉植物的轉化，特別是諸如水稻、玉米、高粱、大麥或小麥之類的谷類。適當的直接轉移法包括微彈(microprojectile)介導的傳送、DNA注射、電穿孔等。參見例如Gruber等人，supra、Miki等人，supra和Klein等人，Bio/Technology10268(1992)。更優選用生物彈道(biolistic)裝置，通過微彈介導的傳送將表達載體導入單子葉植物組織中。5.雄性育性的調控A.雄性不育植物的產生為了誘導根據本發明的雄性不育性，構建一個表達載體，其中編碼抗生物素蛋白的DNA序列操作性地與調控植物組織中基因轉錄的DNA序列連接。以上描述了表達載體的一般要求。為了通過表達抗生物素蛋白得到雄性不育性，抗生物素蛋白最好不是僅僅以瞬時方式表達，而是將表達載體以這樣的方式導入植物胚胎組織，使得抗生物素蛋白在成熟植株的發育晚期表達。例如采用提供表染色體復制的植物病毒載體，可以達到有絲分裂的穩定性。
提供獲得有絲分裂穩定性的推薦方法是將表達載體序列整合到宿主染色體中。將表達載體通過微彈傳送到植物組織中，或采用上述其它標準方法，可以提供這種有絲分裂穩定性。參見例如Fromm等人，Bio/Technology 8833(1990)、Gordon-Kamm等人，The Plant Cell 2603(1990)和Walters等人，Plant Molec.Biol.18189(1992)。
抗生物素蛋白基因導入植物組織后的轉錄最好由非特異性刺激基因在植物組織中表達的組成型啟動子控制。適用于此目的的組成型啟動子的一個實例為supra所述的遍在蛋白質啟動子。
抗生物素蛋白基因的轉錄也可以由以組織特異性方式刺激基因表達的啟動子控制。特別推薦的花藥特異性啟動子為由玉米B73自交系分離的5126啟動子。5126啟動子刺激從四分孢子期至早單核小孢子期的花藥表達外源基因。
另一適宜的花藥特異性啟動子為SGB6啟動子，它也由B73系分離。SGB6啟動子可以在小孢子發育的四分孢子期至中單核期的花藥絨氈層細胞中誘導外源基因的表達。
或者，采用花藥框和核心啟動子的組合，可以提供花藥特異性的基因表達。特別推薦的花藥框為5126花藥框，包含以下核苷酸序列5′GCGGCCGCGG ATCCGCTCAT CTGCTCGGTA CCAACCAGCCCGCCGGCGCC TAGGCGAGTA GACGAGCCAT GGTTGGTCGGTTTCCTATTA CCATGCACAG ATCT 3′[SEQ ID NO1].
AAAGGATAAT GGTACGTGTC TAGA
另一適宜的花藥框位于94個堿基對的DNA片斷中，該片斷由SGB6轉錄起始位點上游的第583-490位核苷酸定義。該94個堿基對的SGB6花藥框的核苷酸序列為(-5 83) ACAGTTCACT AGATATGCAT GATCTTTAAC AATTGCTGCTTGTCAAGTGA TCTATACGTA CTAGAAATTG TTAACGACGAGGATTGTGCG GTTTCTTTTG GCACAAATGG CATGAACAGACCTAACACGC CAAAGAAAAC CGTGTTTACC GTACTTGTCTGTAATCCGGG ACGC(-490)[SEQ ID NO2].
CATTAGGCCC TGCG或者，由玉米G9啟動子獲得適宜的花藥框，它在發育的減數分裂期至四分孢子期刺激基因表達。G9花藥框包含以下核苷酸序列5′GCGGCCGCGG ATCCTGGCTG GATGAAACCG ATGCGAGAGACGCCGGCGCC TAGGACCGAC CTACTTTGGC TACGCTCTCTAGAAAAAAAA ATTGTTGCAT GTAGTTGGCG CCTGTCACCCTCTTTTTTTT TAACAACGTA CATCAACCGC GGACAGTGGGAACCAAACCA GTAGTTGAGG CACGCCCTGT TTGCTCACGATTGGTTTGGT CATCAACTCC GTGCGGGACA AACGAGTGCTTCACGAACeT AGATCT 3′[SEQ ID NO3].
AGTGCTTGCA TCTAGA可以按照上述方法通過合成寡核苷酸獲得5126、SGB6和G9花藥框。本領域技術人員會理解，可以進行缺失分析，將公開的花藥框中的一個或多個其它花藥特異性調控序列定位。這類花藥框的“功能片斷”也可以用來調控花藥特異性方式的抗生物素蛋白的基因表達。
推薦的核心啟動子得自5126核心啟動子、SGB6核心啟動子、G9核心啟動子和花椰菜花葉病毒35S核心啟動子。
特別推薦的核心啟動子為5126核心啟動子，它包含以下核苷酸序列
5′AGATCTAAGT AAGGTATATA TGTGCATAGT CTCCTAATTCTCTAGATTCA TTCCATATAT ACACGTATCA GAGGATTAAGTTCATCTTCA ACCTCTAGCT GATTGATCTC TGGTATTTACAAGTAGAAGT TGGAGATCGA CTAACTAGAG ACCATAAATGCACTCTTTCC TTCCTTCCTT CCTTCAATTC TAAATACCACGTGAGAAAGG AAGGAAGGAA GGAAGTTAAG ATTTATGGTGAAATCAAAGT TGCTTTGCCA TG 3′[SEQ ID NO4].
TTTAGTTTCA ACGAAACGGT ACSGB6核心啟動子由SGB6基因轉錄起始位點上游的大約38個核苷酸組成。適宜的SGB6核心啟動子具有以下核苷酸序列5′ATCTCACCCT ATTAATACCA TGCTGACGAGTAGAGTGGGA TAATTATGGT ACGACTGCTCCCAATAGC 3′[SEQ ID NO5].
GGTTATCG一個適宜的得自G9基因的核心啟動子包含核苷酸序列5′AGATCTCTAT AAAACACGCA GGGACTGGAA AGCGAGATTTTCTAGAGATA TTTTGTGCGT CCCTGACCTT TCGCTCTAAACACAGCTGAA AGCAGCCAAA ACGCAGAAGC TGCACTGCATGTGTCGACTT TCGTCGGTTT TGCGTCTTCG ACGTGACGTAACATCGAGCT AACTATCTGC AGCCATG 3′[SEQ ID NO6].
TGTAGCTCGA TTGATAGACG TCGGTAC5126、SGB6和G9的核心啟動子的功能片斷也提供適宜的核心啟動子。上面描述了獲得這類功能片斷的方法。
可以采用嵌合調控成分(包含一個基因的花藥框和第二基因的花藥特異性啟動子)，延伸抗生物素蛋白基因表達的發育窗口。例如，SGB6調控序列在發育的四分孢子期至中單核期刺激基因表達，而G9調控序列在減數分裂期間和至發育的四分孢子期刺激基因表達。SGB6花藥框和G9啟動子的組合在減數分裂期間和至發育的中單核期刺激外源基因的轉錄。因此，花藥框和花藥特異性啟動子的各種組合對本發明特別有用。
也可以使用病毒核心啟動子。適宜的病毒核心啟動子的實例包括花椰菜花葉病毒(CaMV)核心啟動子、玄參花葉病毒核心啟動子等。Gruber等人，supra。病毒核心啟動子最好為CaMV 35S核心啟動子或其變異體。
為了篩選轉化細胞，表達載體含有一個諸如除草劑抗性基因等的選擇性標記基因。例如，這類基因可以賦予對甲膦基高丙氨酸(phosphinothricine)、草甘膦、磺酰脲類、莠去津或咪唑啉酮的抗性。選擇性標記基因最好是bar基因或編碼甲膦基高丙氨酸乙酰轉移酶的pat基因。在Leemans等人，歐洲專利申請0-242-246(1987)和White等人，Nucleic Acids Res.181062(1990)中可以發現bar基因的核苷酸序列。Wohlleben等人，Gene 7025(1988)公開了pat基因的核苷酸序列。bar基因或pat基因的表達賦予對諸如glufosinate(在其它除草劑中以Basta和Ignite出售)和bialaphos(以Herbi-ace和Liberty出售)之類的除草劑的抗性。
表達載體可以含有在組成型啟動子或花藥特異性啟動子控制下編碼抗生物素蛋白的DNA序列以及在組成型啟動子控制下的選擇性標記基因。或者，選擇性標記基因可以在單獨的選擇性表達載體中，通過胚胎組織的“共轉化”傳遞到宿主細胞中。
B.F1雜種中雄性育性的恢復上述方法可以用來產生轉基因雄性不育植物，以在自交系之間大規模定向雜交中生產-F1雜種。如果轉基因雄性不育植物的所有卵細胞都不含有重組抗生物素蛋白基因，那么一部分F1雜種將具有雄性可育的表現型。另一方面，如果重組抗生物素蛋白基因存在于轉基因雄性不育植物的所有卵細胞中，因為由乙烯誘導的不育性為顯性，那么F1雜種將具有雄性不育的表現型。因此，可能需要采用雄性育性恢復系統，以生產雄性可育F1雜種。當收獲的產品為種子時，這一育性恢復系統在自花受精物種中具有特殊的價值。
通常提出的在一個轉基因植物系中恢復育性的方法需要產生第二“恢復”系轉基因植物。例如，將因靶酶的表達而雄性不育的轉基因植物與表達靶酶抑制劑的雄性可育植物按上述方法雜交。Mariani等人，Nature 357384(1992)。
在本情況下，類似的方法需要生產轉基因的恢復系植物，它表達靶為抗生物素蛋白mRNA的核酶，或表達反義抗生物素蛋白。例如，可以將核酶設計為表達指向mRNA分子中某一靶序列的核酸內切酶活性。例如，Steinecke等人，EMBO J.111525(1992)通過煙草原生質體中的核酶，達到最多100％抑制新霉素磷酸轉移酶的基因表達。最近，Perriman等人，Antisense Res.&Devel.3253(1993)采用表達修飾的錘頭核酶的載體，在煙草原生質體中抑制氯霉素乙酰轉移酶活性。在本發明正文中，抗生物素蛋白mRNA為核酶提供適當的靶RNA分子。
使用含有編碼反義RNA的核苷酸序列的表達載體，可以以相似的方法恢復育性。反義RNA分子與靶mRNA分子的結合導致翻譯的雜交停止。Paterson等人，Pro Natl.Acad.Sci.USA 744370(1987)。在本發明正文中，適宜的反義RNA分子具有與抗生物素蛋白mRNA互補的序列。在本發明一個推薦實施方案中，反義RNA在可誘導啟動子的控制下。因此，激活該啟動子使得雄性育性恢復。
在另一方法中，可以構建表達載體，其中表達載體編碼的RNA轉錄物能夠啟動RNA酶P介導的抗生物素蛋白mRNA分子的切割。按照該方法，可以構建外導序列，將內源核酶(RNA酶P)導向抗生物素蛋白mRNA，隨后由該細胞核酶切割該mRNA。Altman等人的美國專利5,168,053、Yuan等人，Science 2631269(1994)。外導序列最好包含一個與抗生物素蛋白mRNA互補的10-15個核苷酸的序列和3’-NCCA核苷酸序列，其中N最好為嘌呤。Id。外導序列轉錄物與靶類mRNA通過在mRNA和互補外導序列之間形成堿基對進行結合，由此啟動RNA酶P在位于堿基對區域5’端的核苷酸切割mRNA。Id。
在恢復雄性育性的另一方法中，轉基因雄性不育植物含有一個表達載體，后者除含有操作性地與抗生物素蛋白基因連接的啟動子序列外，也含有一個原核調控成分。產生轉基因雄性不育植物，它在該啟動子控制下表達一個原核多肽。在F1雜種中，該原核多肽與原核調控序列結合，阻遏抗生物素蛋白的表達。
例如，LexA基因/LexA操縱子系統用來調控按照本發明的基因表達。參見美國專利4,833,080(080專利)和Wang等人，Mol.CellBiol.131805(1993)。更具體地講，雄性不育植物的表達載體可以含有LexA操縱子序列，而雄性可育植物的表達載體含有LexA阻遏物的編碼序列。在F1雜種中，LexA阻遏物與LexA操縱子序列結合，抑制抗生物素蛋白基因的轉錄。
例如通過合成含有眾所周知的LexA操縱子序列的DNA片斷，可以獲得LexA操縱子DNA分子。參見例如’080專利和Garriga等人，Mol.Gen.Genet.236125(1992)。合成編碼LexA阻遏物的DNA分子，可以獲得LexA基因。上面討論了基因合成技術，例如Garriga等人，supra描述了LexA基因序列。或者編碼LexA阻遏物的DNA分子可以由質粒pBR500獲得。美國典型培養物保藏登記號為67758。
恢復育性的再一個方法利用抗生物素蛋白對生物素的高親和性，用生物素溶液噴灑發育的植物。生物素溶液也包含最小量的有機助溶劑(諸如DMSO)以確保生物素的完全溶解。在花粉發育的減數分裂期進行噴灑，以定期的間隔進行重復，直至觀察到花粉散發。噴灑之間的間隔為1-7天不等。在本發明的一個推薦實施方案中，每3-5天重復噴灑一次。
本領域技術人員可以采用原核調控系統(諸如Lac阻遏物/lac操縱子系統或trp阻遏物/trp操縱子系統等)，容易地設計其它雄性育性恢復策略。
因此，通過參考以下實施例，會更容易理解一般描述的本發明，通過說明提供實施例，這些實施例不是為了限制本發明。實施例1通過抗生物素蛋白的高度組成型表達制備雄性不育轉基因玉米歐洲專利申請0 442 174A1(通過引用結合到本文中)中已經描述了形成轉基因玉米植株的方法。其方法簡述如下。
PHI5168，一個攜帶遍在蛋白質啟動子控制下的抗生物素蛋白基因和含有一個PINII終止子序列的載體，用它形成轉基因玉米植株。圖1顯示了PHI5168的結構。PHI610是一個攜帶雙35S啟動子控制下的bar基因和攜帶一個PINII終止子序列的表達載體，將其與抗生物素蛋白構成物(construct)一起共轉化，通過用bialophos處理轉化混合物，進行轉基因植物的篩選。圖2顯示了PHI610的結構。按照Green等人，Molecular Genetics of Plants and Animals，editors Downey等人，Academic Press，NY，20，147(1983)的方法，將兩個表達載體轉化到胚胎發生懸浮培養物(得自第II型胚胎發生培養物)中。在Murashige等人，Physio.Plant；Vol 15，第453-497頁(1962)中所述的Murashige和Skoog(“MS”)培養基(添加2mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和30g/L的蔗糖)中維持培養物。在實驗前7天，懸浮培養物通過710微米篩，將濾液保持在MS培養基中。
通過在布氏漏斗(Whatman No.614)上進行真空過濾，由懸浮培養物收獲細胞，將100ml(鮮重)細胞置于3.3cm陪替氏平板中。將細胞分散于0.5ml新鮮的培養基中，形成細胞薄層。將未覆蓋的陪替氏平板置于粒子槍裝置(由Biolistics Inc.，Geneva NY制造)的樣品室中。用真空泵將樣品室內壓力減小至0.1大氣壓，以減少由于空氣摩擦引起的微粒子的減速。用鎢粒子(平均直徑為大約1.2微米)(GTE SylvaniaPrecision Materials Group，Towanda，Pennsylvania)轟擊細胞。通過將5μlDNA的TE緩沖液(pH7.7)溶液(1μg DNA/100λ)加入1.5ml Eppendorf管中的25μl 50mg鎢粒子/ml蒸餾水的懸浮液中，將PHI5168和PHI610的等量混合物裝載到微粒子上。粒子凝聚并在管中沉淀。
將含有外源基因的轉化植物細胞的培養物在560R(培養基)(具有1mg/ml bialaphos的N6基培養基)中培養4-8周。該培養基篩選表達Bar基因的細胞。
然后在胚胎發生培養物中誘導胚胎形成，將細胞萌發為植株。用兩個培養基順序萌發在愈傷組織維持培養基中觀察到的體細胞胚。首先將愈傷組織轉移到含有5.0mg/L吲哚乙酸(IAA)的培養基(成熟培養基)10-14天，以繼續增殖愈傷組織。轉移的愈傷組織為50mg/平板，以優化每單位組織塊的收率。
然后，將愈傷組織由“成熟”培養基轉移至第二培養基(與第一培養基相比，含有較低濃度的IAA(1mg/L))上。這時，將培養物置于光下。萌發的體細胞胚的特征為連接根入口的伸長綠苗。然后將體細胞胚轉移至培養管(150×25mm)中的培養基中，再培養10-14天。這時，植物大約高7-10cm，具有足夠的大小和活力在溫室條件下健化。
為了健化再生植株，將擬轉移至生長室中的植株從無菌容器中取出，沖去根部的固化瓊脂培養基。將小植株置于生長室的市售盆栽混合土中，該生產室配有霧化裝置維持接近100％的相對濕度而又不過度潤濕植物根部。在保濕室中3-4周后，植物茁壯得足以移植到大田條件下。
通過觀察雄性不育性，分析大田中的植株。然后，用標準方法，通過PCR和Southern印跡法，進一步分析篩選植株抗生物素蛋白基因的存在，通過ELISA，分析篩選植株抗生物素蛋白的表達。
通過PCR分析了94個植株，其中53個發現為可育的，41個為不育的。每個植株的育性與PCR檢測抗生物素蛋白基因的存在相比時，發現基因存在和植物不育性之間有98％相關性。通過Southern印跡法，詳細分析了5個植株抗生物素蛋白基因的存在。通過Southern分析，3個植株表現出含有抗生物素蛋白基因。所有3個植株都有不育性問題。沒有抗生物素蛋白基因的2個植株完全可育。因此，抗生物素蛋白基因的存在和不育性問題之間100％相關。實施例2使用含有雙載體(包括編碼抗生物素蛋白的DNA序列)的農桿菌菌株，產生雄性不育轉基因大豆植株形成轉基因大豆植株的方法為美國專利申請07/920,409(通過引用結合到本文中)中描述的方法。大豆(Glycine max)Pioneer變種9341的種子通過暴露于玻璃鐘罩中放出的次氯酸鈉進行表面消毒。將3.5ml鹽酸(34-37％w/v)加入100ml氯化鈉(5.25％w/v)中產生氣體。在大約1立方英尺體積的容器中暴露16-20小時。表面消毒的種子于室溫下，貯藏在陪替氏培養皿中。將按照不含植物生長調節劑的Gambourg的1/10強度的瓊脂固化培養基(含有最小量有機物的B5基礎培養基，Sigma Chemical Catalog No.G5893、0.32gm/L蔗糖、0.2％w/v 2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)(0.3mM))鋪平板，并于28℃、日照長度為16小時、冷白日光燈照度大約為20μEm-2S-1下培養，萌發種子。3或4天后，制備用于共培養的種子。除去種皮，除去子葉下3-4mm的伸長根。
含有修飾的雙質粒(含有抗生物素蛋白基因)的根癌農桿菌菌株LBA4404的過夜培養物，在基本A培養基(含有1μg/ml四環素)中生長至對數期，將其合并，在550nm下測定光密度。將足夠體積的培養物置于15ml/錐形離心管中，使得沉淀時，每管收集109細胞/ml的1-2×1010細胞。以6,000×g離心10分鐘進行沉淀。離心后，棄上清液，離心管于室溫下保持至需要接種物為止，但不超過1小時。
分批進行接種，使得每個種子平板用剛剛再懸浮農桿菌沉淀處理。細胞沉淀分別再懸浮于20ml接種培養基中，后者含有3.2g/LB5鹽(G5893)、2.0％w/v蔗糖、45μM 6-芐氨基嘌呤(BAP)、0.5μM吲哚丁酸(IBA)、100μM乙酰丁香酮(AS)，并用10mM MES緩沖至pH5.5。通過渦旋達到再懸浮。然后將接種物倒入含有制備的種子的陪替氏培養皿中，用手術刀分開子葉節。通過苗端縱向切開將種子分成兩半，保持兩個完整的子葉，來完成分開。然后用手術刀將苗端的兩半橇離相應子葉。然后，通過沿對稱軸重復刻劃，用手術刀分開子葉節。小心不要完全通過外植體切至軸端。在大致5分鐘內制備外植體，然后與細菌于室溫下溫育30分鐘，不進行攪拌。30分鐘后，將外植體轉移至用0.2％w/v Gelrite(Merck & Company Inc.)固化的相同培養基平板中。包埋外植體，使其近軸端向上并與培養基表面齊平，在大約20μEm-2S-1的冷白日光燈光下于22℃培養3天。
3天后，將外植體轉移至液體反選擇培養基中，后者含有3.2g/l B5鹽(G5893)、2％w/v蔗糖、5μM BAP、0.5μM IBA、200μg/ml萬古霉素、500μg/ml頭孢噻肟，用3mM MES緩沖至pH5.7。外植體于室溫下在每個陪替氏培養皿中用恒定的緩慢旋轉攪拌洗滌4天。更換4次反選擇培養基。
然后，將外植體挑到瓊脂固化的選擇培養基中，后者含有3.2g/lB5鹽(G5893)、2％w/v蔗糖、5.0μM BAP、0.5μM IBA、50μg/ml硫酸卡那霉素、100μg/ml萬古霉素、30μg/ml頭孢噻肟、30μg/ml羧噻吩青霉素-棒酸復合劑(timentin)，用3mM MES緩沖至pH5.7。選擇培養基用0.3％w/v Seakem瓊脂糖固化。將外植體近軸端向下包埋在培養基中，于28℃下培養，在冷白日光燈照度為60-80μEm-2S-1下的日照長度為16小時。
2周后，外植體在旋轉搖床上再用液體培養基洗滌。洗滌在含有50μg/ml硫酸卡那霉素的反選擇培養基中過夜進行。第二天，將外植體挑到瓊脂糖固化選擇培養基上。將它們近軸端向下包埋在培養基中，再培養2周。
在選擇培養基上1個月后，與黃化非健康組織相對照，可見到轉化組織為綠色扇形體的再生組織。丟棄沒有綠色扇形體的外植體，將具有綠色扇形體的外植體轉移至伸長培養基中，后者含有3.2g/l B5鹽(G5893)、2％w/v蔗糖、3.3μM IBA、1.7μM赤霉酸、100μg/ml萬古霉素、30μg/ml頭孢噻肟、30μg/ml羧噻吩青霉素-棒酸復合劑，用3mM MES緩沖至pH5.7。伸長培養基用0.2％w/v Gelrite固化。包埋綠色扇形體，使其近軸端向上，按照前述方法培養。在該培養基上繼續培養，每2周轉移至新鮮平板上。當苗長度為0.5cm時，將它們從基部切下，置于13×100ml試管中的生根培養基中。生根培養基含有3.2g/l B5鹽(G5893)、15g/l蔗糖、20μM煙酸、900mg/L焦谷氨酸(PGA)和10μM IBA。生根培養基用3mM MES緩沖至pH 5.7，并用0.2％w/v Gelrite固化。10天后，將苗轉移至不含IBA或PGA的相同培養基上。這些苗生根，將其在上述相同的環境條件下保持在試管中。
當根系很好地建立時，將小植株轉移至無菌土壤中。溫度、光照期和光強度保持與上述條件相同。
用ELISA證實并定量測定轉基因大豆植株中的抗生物素蛋白的表達，通過PCR和Southern印跡法證實該基因的存在。可以用這些相同的方法，在連續世代中評價表達穩定性。發現不育性問題與大豆中的抗生物素蛋白的表達相關。實施例3通過表達抗生物素蛋白制備雄性不育向日葵植株編碼抗生物素蛋白的表達盒用來產生轉基因向日葵植株和種子。將編碼抗生物素蛋白的DNA序列插入遍在蛋白質啟動子控制下的表達盒中。
然后，用EcoRI位點，在諸如PHI 5765之類的雙載體中亞克隆該表達盒。然后，將該雙載體轉移到根癌農桿菌輔助菌株中。
向日葵植株在按照Bidney等人，Plant Mol.Bio.Vol.18第301頁，1992所述方法進行微粒子轟擊后，用農桿菌菌株LBA4404轉化。簡單地講，將先鋒向日葵SMF-3系的種子除殼并進行表面消毒。種子在黑暗中，于26℃在用水潤濕的濾紙上吸漲18小時。除去子葉和根基，將分生組織外植體培養在374BGA培養基(MS鹽、Shephard維生素、40.mg/L硫酸腺嘌呤、3％蔗糖、0.8％植物瓊脂(phytagar)pH 5.6加0.5mg/L BAP、0.25mg/L IAA和0.1mg/LGA)中。24小時后，除去第一片葉，暴露頂端分生組織，將該外植體圓頂面向上置于含有水瓊脂的60mm×20mm陪替氏平板中心的2cm圓圈中。外植體用懸浮于TE緩沖液中的鎢粒子、或用與附有含抗生物素蛋白基因的表達質粒的粒子轟擊2次。分生組織外植體在光下，于26℃在374BGA培養基中再共培養72小時。
在72小時共培養后，將農桿菌處理的分生組織轉移至374培養基(具有1％蔗糖的374BGA，不含BAP、IAA或GA3)，添加250μg/ml頭孢噻肟。讓小植株在16小時日照長度和26℃的培養條件下，發育2周，發育為綠色或黃化。將小植株轉移至含有卡那霉素的培養基中，讓其生長。按實施例2所述方法證實并定量測定植株中抗生物素蛋白的存在。發現雄性不育性的存在與植株表達抗生物素蛋白相關。
雖然上述說明涉及具體的推薦實施方案，但應理解本發明并非如此有限。本領域技術人員會想到可以對公開的實施方案進行各種修改，這類修改將包括在以下權利要求書定義的本發明范圍內。本說明書中提到的所有的發表文章和專利申請表現出本發明所屬領域技術人員的水平。
序列表(1)一般資料(i)申請人(A)姓名PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL，INC.
(B)街道700 CAPITAL SQUARE，400 LOCUST STREET(C)城市DESMOINES(D)州IOWA(E)國家美國(F)郵政編碼50309(ii)發明題目通過表達高水平的抗生物素蛋白誘導植物雄性不育性(iii)序列數6(iv)相應的地址(A)收信人Foley&Lardner(B)街道3000 K Street，N.W.，Suite 500(C)城市Washington(D)州D.C.
(E)國家美國(F)郵政編碼20007-5109(v)計算機可讀形式(A)媒介類型軟磁盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(vi)本申請數據(A)申請號尚頒發(B)申請日期(vii)先前申請數據(A)申請號US 08/475,582(B)申請日期1995年6月7日(viii)代理律師/代理人資料
(A)姓名Bent，Stephen A.
(B)注冊號29,768(C)參考/代理機構編號33229/403/PIHI(ix)遠程通信資料(A)電話(202)672-5300(B)傳真機(202)672-5399(C)電傳904136(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特性(A)長度64個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(xi)序列描述SEQ ID NO1GCGGCCGCGG ATCCGCTCAT CTGCTCGGTA CCAACCAGCC TTTCCTATTA CCATGCACAG60ATCT 64(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特性(A)長度94個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(xi)序列描述SEQ ID NO2ACAGTTCACT AGATATGCAT GATCTTTAAC AATTGCTGCT GGATTGTGCG GTTTCTTTTG60GCACAAATGG CATGAACAGA GTAATCCGGG ACGC94(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特性(A)長度136個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(xi)序列描述SEQ ID NO3GCGGCCGCGG ATCCTGGCTG GATGAAACCG ATGCGAGAGA AGAAAAAAAA ATTGTTGCAT60GTAGTTGGCG CCTGTCACCC AACCAAACCA GTAGTTGAGG CACGCCCTGT TTGCTCACGA120TCACGAACGT AGATCT136(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特性(A)長度142個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(xi)序列描述SEQ ID NO4AGATCTAAGT AAGGTATATA TGTCATAGT CTCCTAATTC TTCATCTTCA ACCTCTAGCT60GATTGATCTC TGGTATTTAC CACTCTTCC TTCCTTCCTT CCTTCAATTC TAAATACCAC120AAATCAAAGT TGCTTTGCCA TG142(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特性(A)長度38個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(xi)序列描述SEQ ID NO5ATCTCACCCT ATTAATACCA TGCTGCGAG CCAATAGC38(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特性(A)長度107個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(xi)序列描述SEQ ID NO6AGATCTCTAT AAAACACGCA GGGACTGGAA AGCGAGATTT CACAGCTGAA AGCAGCCAAA60ACGCAGAAGC TGCACTGCAT ACATCGAGCT AACTATCTGC AGCCATG 10權利要求
1.一個分離的DNA分子，包含可操作地與植物啟動子序列連接的編碼抗生物素蛋白的一個核苷酸序列。
2.一個表達載體，包含權利要求1的分離的DNA分子。
3.按照權利要求2的表達，其中所述植物啟動子序列為組成型啟動子。
4.按照權利要求3的分離的DNA分子，其中所述組成型啟動子序列為遍在蛋白質啟動子序列。
5.轉基因植物，其中所述植物包含一個異源核苷酸序列，后者包含一個抗生物素蛋白基因，其中所述異源核苷酸序列增加該植物組織中抗生物素蛋白的濃度，并且由此所述較高的抗生物素蛋白濃度使得所述植物雄性不育。
6.按照權利要求5的轉基因植物，其中所述植物為玉米植株。
7.按照權利要求5的轉基因植物，其中所述植物為大豆植株。
8.按照權利要求5的轉基因植物，其中所述植物為向日葵植株。
9.按照權利要求5的轉基因植物，其中所述異源核苷酸序列還包含一個組成型啟動子序列。
10按照權利要求9的轉基因植物，其中所述組成型啟動子序列為遍在蛋白質啟動子序列。
11.產生轉基因雄性不育植物的方法，包括將包含一個啟動子和一個抗生物素蛋白基因的一個表達載體導入植物細胞中，其中所述啟動子控制所述抗生物素蛋白基因的表達，由此所述抗生物素蛋白基因的表達引起雄性不育性。
12.按照權利要求11的方法，還包括由所述植物細胞再生轉基因植株。
13.按照權利要求11的方法，其中所述啟動子包括遍在蛋白質啟動子。
14.用抗生物素蛋白基因產生雄性可育雜種植物的方法，包括以下步驟(a)產生包含按照按照權利要求1的DNA分子的第一親本雄性不育植株，其中抗生物素蛋白的表達引起雄性不育性；(b)產生表達第二外源基因的第二轉基因親本植株；(c)所述第一親本與所述第二親本異花受精，產生雜種植株。其中所述雜種植株表達所述第二外源基因，而所述第二外源基因的產物降低所述雜種植株中抗生物素蛋白的表達，由此產生雄性可育雜種植株。
15.按照權利要求14的方法，其中所述第二外源基因選自反義基因、核酶基因和外導序列基因。
16.權利要求15的方法，其中所述反義基因包括抗生物素蛋白的mRNA序列。
17.權利要求16的方法，其中所述核酶基因包括抗生物素蛋白的mRNA序列。
18.權利要求16的方法，其中所述外導序列基因包括抗生物素蛋白的mRNA序列。
19.權利要求14的方法，其中所述第一親本植物的所述DNA分子還包含可操作地與所述啟動子連接的LexA操縱子，而所述第二外源基因為LexA阻遏物基因。
20.權利要求2的表達載體，其中所述啟動子序列為包含選自以下花藥框的花藥特異性啟動子序列(a)具有SEQ ID NO1核苷酸序列的DNA分子；(b)具有SEQ ID NO2核苷酸序列的DNA分子；(c)具有SEQ ID NO3核苷酸序列的DNA分子；(d)(a)、(b)或(c)的一個功能片斷。
21.權利要求20的表達載體，其中所述花藥框具有SEQ ID NO1的核苷酸序列，而所述花藥特異性啟動子還包含選自以下的一個核心啟動子(a)CaMV 35S核心啟動子；(b)具有SEQ ID NO4核苷酸序列的DNA分子；(c)具有SEQ ID NO5核苷酸序列的DNA分子；(d)具有SEQ ID NO6核苷酸序列的DNA分子；(e)(b)、(c)或(d)的一個功能片斷。
22.權利要求20的表達載體，其中所述花藥框具有SEQ ID NO2的核苷酸序列，而所述花藥特異性啟動子還包含選自以下的一個核心啟動子(a)CaMV 35S核心啟動子；(b)具有SEQ ID NO4核苷酸序列的DNA分子；(c)具有SEQ ID NO5核苷酸序列的DNA分子；(d)具有SEQ ID NO6核苷酸序列的DNA分子；(e)(b)、(c)或(d)的一個功能片斷。
23.權利要求20的表達載體，其中所述花藥框具有SEQ ID NO6的核苷酸序列，而所述花藥特異性啟動子還包含選自以下的一個核心啟動子(a)CaMV 35S核心啟動子；(b)具有SEQ ID NO4核苷酸序列的DNA分子；(c)具有SEQ ID NO5核苷酸序列的DNA分子；(d)具有SEQ ID NO6核苷酸序列的DNA分子；(e)(b)、(c)或(d)的一個功能片斷。
24.由抗生物素蛋白的表達賦予雄性不育的植物中恢復育性的方法，包括用生物素溶液噴灑所述植物。
25.權利要求11的方法，其中所述啟動子包括誘導啟動子。
26.權利要求15的方法，其中所述反義基因可操作地與誘導啟動子連接。
全文摘要
通過增加植物組織中內源抗生物素蛋白的濃度,可以產生雄性不育植物。通過產生含有一個表達載體的轉基因植物,可以得到該效果,在該載體中一個啟動子操作性地與一個編碼抗生物素蛋白的DNA序列連接。也公開了恢復雄性育性的方法。
文檔編號C07K14/465GK1192784SQ96196046
公開日1998年9月9日 申請日期1996年6月6日 優先權日1995年6月7日
發明者J·A·霍華德, M·C·阿爾伯森 申請人:先鋒高級育種國際公司