專利名稱：抗蛋白酶k降解的腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種存在于腦膜炎奈瑟氏球菌表面的高度保守的，免疫可及的抗原。這種獨特的抗原可為新的免疫治療、預防和診斷藥物提供基礎，這些藥物可用于腦膜炎奈瑟氏球菌疾病的治療，防護和診斷。更確切地說，本發明涉及一種抗蛋白酶K的腦膜炎奈瑟氏球菌的表面蛋白，該蛋白的表觀分子量為22kDa其相應的核苷酸序列及衍生的氨基酸序列(序列SEQ ID NO1號至序列SEQ ID NO26號)；生產這種腦膜炎奈瑟氏球菌的22kDa的表面蛋白的重組DNA方法；同腦膜炎奈瑟氏球菌的22kDa的表面蛋白抗結合的抗體以及腦膜炎奈瑟氏球菌疾病的診斷，治療和預防的方法及組合物。
背景技術：
在全世界范圍，腦膜炎奈瑟氏球菌是死亡和發病的一個主要原因。腦膜炎奈瑟氏球菌既可引起地方病也可引發傳染病，主要是腦膜炎和腦膜炎球菌血癥〔Gold，腦膜炎奈瑟氏球菌疾病的演變69頁，Vedros N.A.，CRC Press(1987)，Schwartz等，臨床微生物學綜述2，p.S118(1989)〕。事實上，在美國，這種有機體是僅次于b型流感嗜血桿菌的引起細菌性腦膜炎的最普遍的病因，大約占所有病例的20％，有充分的資料證明，抗腦膜炎奈瑟氏球菌的主要防御機制是殺菌血清的活力。并且，抵御細菌侵入是同血清中存在的抗腦膜炎抗體相關聯〔Goldschneider等，實驗醫學雜志129，1307頁(1969)；Goldschneider等，實驗醫學雜志129，1327頁(1969)〕。
根據莢膜抗原的不同，腦膜炎奈瑟氏球菌可分為多個血清型組。目前，已知有12個血清型組，然而其中以血清型組A、B、C、Y和W-135最為常見。在血清型組內部，可根據莢膜蛋白和莢膜上的脂多糖再分為各血清類型，亞型及免疫型〔Frasch等，傳染病綜述.7,504頁(1985)〕。
當前能提供的莢膜多糖疫苗不能有效地抵抗所有的腦膜炎奈瑟氏球菌分離株并且也不能有效地誘導小兒產生保護抗體〔Frasch，臨床微生物學綜述.2，p.S134(1989)；Reingold等柳葉刀，114頁(1985)；Zollinger in Woodrow和Levine，新一代疫苗，325頁，MarcelDekker Inc.N.Y(1990)〕。目前，血清型組A、C、Y和W-135的莢膜多糖用于生產抵御此菌的疫苗。這些多糖疫苗在短期內有效。然而，被注射疫苗的個體不能產生免疫記憶，所以他們在三年內必須被重新免疫以維持抵御水平。
進一步說，這些多糖疫苗不能在二歲以下兒童中誘發產生足夠水平的殺菌抗體來達到理想的保護效果，而該病的主要受害者正是這些小兒。在發達國家中，血清型組B是腦膜炎疾病主要病因之一。然而，當前卻沒有有效的疫苗一抵抗此種細菌。事實上，血清型群體B的多糖不是一種好的免疫原，其僅能誘導很低的IgM反應，并且IgM具有較差的特異性，因而保護性也差〔Gotschlich等，實驗醫學雜志129頁，1349(1969)；Stevakis等，傳染病雜志149,387頁(1984)；Zollinger等，臨床研究雜志63,836頁(1979)〕。再者，新生兒的人腦組織的糖蛋白中存在有非常相似且能引起交叉反應的結構，這可能使得想提高血清型群體B的多糖的免疫原性的企圖受挫。
為了得到更有效的疫苗，其它的腦膜炎奈瑟氏球菌的表面抗原正在調研中，比如脂多糖，毛(pili)蛋白和位于外膜上的一些蛋白。還有些報道表明在接受免疫的志愿者及病愈恢復期病人的血清中存在一定的抗前述表面蛋白抗原的免疫反應及殺菌抗體〔Manderell和Zollinger，傳染病免疫57，1590頁(1989)；Poolman等，感染與免疫40，398頁(1983)；Rosenquist等，臨床微生物學雜志26，1543頁(1988)；Wedge和Froholm，感染與免疫51，571頁(1986)；Wedge和Michaelsen，臨床微生物學雜志25，1349頁(1987)〕。
更進一步，有報道稱直接抗外膜蛋白，如類1，2/3和類5的單克隆抗體隆抗體也有殺菌效應并且在實驗中可保護動物免遭感染〔Brodeur等，感染與免疫.50，510頁(1985)；Frasch等，臨床醫學研究9，101頁(1986)；Saukkonen等，微生物病原學3，261頁(1987)；Saukkonen等，疫苗7，325頁(1989)〕。
基于腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白而制備的抗原，在動物及人體均表明共有免疫原的作用，其中的一些已在進行臨床測試〔Bjune等，手術刀1093頁(1991)；Costa等，HIPH年鑒14，215頁(1991)；Frasch等，醫學和營養學，43，177頁(1982)；Frasch等，歐洲臨床微生物學雜志4，533頁(1985)；Frasch等in Robbins，細菌疫苗262頁Praeger Publications，N.Y.(1987)；Frasch等，傳染病雜志158，710頁(1988)；Moreno等，感染與免疫.47，527頁(1985)；Rosenqvist等，臨床微生物學雜志26，1543頁(1988)；Sierra等，NIPH年鑒14，195頁(1991)；Wedge和Froholm，感染與免疫.51，571頁(1986)；Wedge和Michaelsen，臨床微生物學雜志25，1349頁(1987)；Zollinger等，臨床研究雜志63，836頁(1979)；Zollinger等，NIPH年鑒14，211頁(1991)〕。但是，株系內的外膜蛋白存在有很大的抗原變異性，這將限制其在疫苗上的應用〔Frasch，臨床微生物學綜述p.S134(1989)〕。事實上，從一種血清型細菌提取的抗原所制備的殺菌抗體嚴格地只對該種血清型或相關的血清型細胞有作用〔Zollinger in Woodrow和Levine，新一代疫苗，325頁，Marcel Dekker Inc.N.Y.(1990)〕更進一步，在小兒中由這些疫苗產生的保護作用尚待明確。高度保守的腦膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白，如類4〔Munkley等，微生物病原體11，447頁(1991)〕蛋白和脂蛋白(lip protein)(也叫H.8)，并不能誘導產生殺菌抗體，因而并非理想的免疫候選者。為了改進這些疫苗，需要有高保守的，位于所有腦膜炎奈瑟氏球菌株系表面的蛋白，且此蛋白可以誘導產生殺菌抗體，以便開發一種廣譜的疫苗。
目前實驗室中用于檢測腦膜炎奈瑟氏球菌的方法有涂片制備后進行格蘭氏染色，膠乳凝集或共凝集，在加富培養基和選擇性培養基上培養并分離細菌〔Morello等in Balows，臨床微生物學手冊，258頁，美國微生物學聯合會，華盛頓(1991)〕。碳水化合物降解測試常用來證明腦膜炎奈瑟氏球菌分離物的鑒定。絕大多數上述的實驗過程是耗時的并且需受過訓練的人員。市售的凝集或共凝集反應試劑盒中含有多價血清，該血清可以直接抗絕大多數流行的血清型組所表達的莢膜抗原，所以可用于快速鑒別腦膜炎奈瑟氏球菌。然而，這些多價血清通常是非特異性的，并且可同其它細菌發生交叉反應，正因如此，它必須同格蘭氏染色和細菌培養等方法聯用。所以，需要另一種有效的替代辦法來提高診斷的速度及可靠性。
發明公開本發明通過提供了一種高度保守的，位于腦膜炎奈瑟氏球菌表面的且是免疫可及的抗原，解決了前述的問題。本發明還提供了編碼前述抗原的重組DNA分子，用這類DNA分子轉化的單細胞宿主，以及制備基本上純的重組抗原的方法。本發明也提供了特異性抗前述腦膜炎奈瑟氏球菌抗原的抗體。本發明中的抗原和抗體為腦膜炎奈瑟氏球菌疾病的檢測、防止及治療提供了獨一無二的方法及藥物組合物的基礎。
優選的抗原是腦膜炎奈瑟氏球菌的22kDa的表面蛋白，包括其片段，類似物及其衍生物。優選的抗體也是特異地抗腦膜炎奈瑟氏球菌的22kDa表面蛋白的單克隆抗體Me-1和Me-7。這些抗體對腦膜炎奈瑟氏球菌有高的溶菌性并能被動地保護小鼠免遭實驗性感染。
本發明進一步提供了一種方法，該方法可用于分離新的腦膜炎奈瑟氏球菌表面抗原及其特異性抗體。
附圖簡述
圖1示腦膜炎奈瑟氏球菌608B株的22kDa表面蛋白的核苷酸序列及推知的氨基酸序列(SEQ ID NO1；SEQ ID NO2)。氨基酸殘基用常規的三字符表示開放閱讀框是從143堿基起始密碼子到667堿基的終止密碼子。方框表示一般所公認的核糖體結合位點，下劃線處顯示的是一般所公認的-10啟動子序列。一個含19個氨基酸的線號肽也以下劃線示出。
圖2顯示了腦膜炎奈瑟氏球菌608B株(B2aP1.2)外膜制備的經α-胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶消化后，經14％SDS-PAGE膠，再用考馬斯藍染色的結果。泳道1中有下列分子量標準磷酸化酶b(97,400)；牛血清白蛋白(66,200)；卵清蛋白(45,000)；碳酸酐酶(31,000)；大豆胰蛋白酶抑制劑(21,500)；和溶菌酶(14,400)。泳道2示未經消化的外膜制備物對照。泳道3示經α-胰凝乳蛋白酶消化的制備物(2mg的酶/mg蛋白)；泳道4示胰蛋白酶消化的制備物。
圖3a是腦膜炎奈瑟氏球菌608B株(B2aP1.2)的外膜制備物經蛋白酶K消化后，經14％SDS-PAGE膠，再用考馬斯藍染色的結果。泳道1、3、5、7示未經消化的對照。泳道2、4、6、8示用蛋白酶K(2IU/mg蛋白)消化后的外膜制備物。泳道1至4示在pH7.2下處理制備物。泳道5至8為在pH 9.0下處理制備物。泳道1、2、5和6示在無SDS下處理制備物。泳道3、4、7、8示有SDS的條件下處理制備物。分子量標準顯示于左側(單位為千道爾頓)。
圖3b是重組的22kDa蛋白經親合純化后，經14％SDS-PAGE膠，再用考馬斯藍染色后的電泳遷移圖。泳道1中含下列分子量標準磷酸化酶b(97,400)，牛血清白蛋白(66,200)，卵清蛋白(45,000)，碳酸酐酶(31,000)，大豆胰蛋白酶抑制劑(21,500)和溶菌酶(14,400)。泳道2中為5μg經親合純化后的重組的22kDa蛋白對照。泳道3示5μg經親合純化后的重組22kDa蛋白100℃下加熱5分鐘處理后的電泳圖，泳道4中為5μg經親合純化后的重組22kDa蛋白100℃下加熱10分鐘處理后的電泳圖。泳道5中為5μg經親合純化的重組22kDa蛋白100℃下加熱15分鐘處理后的電泳圖。
圖4是經14％SDS-PAGE膠后用考馬斯亮藍染色。及其相應的Western印跡后的結果，這些結果顯示了特異性地抗腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的單克隆抗體的反應性。由腦膜炎奈瑟氏球菌608B株(B2aP1.2)制備的外膜制備物(A)未經處理；(B)經蛋白酶K處理(2 IU/mg蛋白)。泳道1為分子量標準及外膜制備物經14％SDS-PAGE膠電泳后的特征遷移圖。泳道2示Me-2；泳道3示Me-3；泳道4示Me-5；泳道5示Me-7；泳道6為一無關的作為對照的單克隆抗體。分子量標準是磷酸化酶b(97,400)，牛血清白蛋白(66,200)，卵清蛋白(45,000)，碳酸酐酶(31,000)，大豆胰蛋白酶抑制劑(21,500)和溶菌酶(14,400)。圖4中顯示的Me-2、Me-3、Me-5、Me-6和Me-7的免疫印跡結果同Me-1的免疫印跡結果相一致。
圖5表示單克隆抗體同未經處理的細菌細胞的結合力。作為代表的單克隆抗體Me-5和Me-7的結果在縱軸上以計數/分鐘表示。橫軸上表示本測試用到的不同的細菌株。流感嗜血桿菌孔蛋白-特異性單克隆抗體用作陰性對照。低于500計數/分鐘的本底被記錄且被從結合數據中減去。
圖6結果示濃集大腸桿菌BL 21(DE3)株的培養上清而得到的腦膜炎奈瑟氏球菌重組的22kDa表面蛋白的純化經14％SDS-PAGE凝膠電泳，染色并且做其相應的Western印跡。圖6(A)為經14％SDS-PAGE膠后考馬斯藍及銀染的結果，泳道1包含下列分子量標準，磷酸化酶b(97,400)，牛血清白蛋白(66,200)，卵清蛋白(45,000)，碳酸酐酶(31,000)，大豆胰蛋白酶抑制劑(21,500)和溶菌酶(14,400)。泳道2為抽提腦膜炎奈瑟氏球菌608B株(血清型B2aP1.2)而得到的外膜蛋白制備物。泳道3示經濃集的大腸桿菌BL 21(DE3)(10mg)的培養物上清。泳道4示經親合純化的腦膜炎奈瑟氏球菌重組的22kDa表面蛋白(1mg)。圖6(B)是親合純化的腦膜炎奈瑟氏球菌重組的22kDa表面蛋白經α-胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶和蛋白酶K消化后，經14％SDS-PAGE膠并用考馬斯藍染色的電泳圖。泳道1包括下列分子量標準磷酸化酶b(97,400)，牛血清白蛋白(66,200)，卵清蛋白(45,000)，碳酸酐酶(31,000)，大豆胰蛋白酶抑制劑(21,500)和溶菌酶(14,400)。泳道2至泳道5為經純化的腦膜炎奈瑟氏球菌重組的22kDa的表面蛋白(2mg)。泳道7至10為牛血清白蛋白(2mg)。泳道2和7中為未經消化的蛋白(“NT”)。泳道3和8為經α-胰凝乳蛋白酶(“C”)處理的蛋白(2mg酶/mg蛋白)。泳道4和9為經胰蛋白酶(“T”)處理的蛋白(2mg酶/mg蛋白)。泳道5和10為經蛋白酶K(“K”)處理的蛋白(2 IU/mg蛋白)。圖6(C)是用單克隆抗體Me-5時另一相同膠做Western印跡后得到的圖象。
圖7示經蛋白-A純化后的抗-腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的單克隆抗體，其對腦膜炎奈瑟氏球菌608B株(B2aP1.2)的作用，即其殺菌活性。圖的縱軸示腦膜炎奈瑟氏球菌暴露于不同濃度的單克隆抗體后的存活百分率(單克隆抗體濃度在橫軸上顯示)。
圖8示腦膜炎奈瑟氏球菌MCH 88株22kDa表面蛋白的核苷酸序列及推知的氨基酸序列(SEQ ID NO3，SEQ ID NO4)。氨基酸殘基用常規的三字符表示。開放閱讀框是從116堿基的起始密碼子到643堿基的終止密碼子。
圖9示腦膜炎奈瑟氏球菌Z4063株22kDa表面蛋白的核酸序列及推知的氨基酸序列(SEQ ID NO5；SEQ ID NO6)。氨基酸殘基用常規的三字符表示。開放閱讀框顯示從208堿基的起始密碼子到732堿基的終止密碼子。
圖10示淋病奈瑟氏球菌b2株22kDa表面蛋白的核酸序列及推知的氨基酸序列(SEQ ID NO7，SEQ ID NO8)。氨基酸殘基用常規的三字符表示。開放閱讀框是從堿基241的起始密碼子至堿基765的終止密碼子。
圖11顯示了奈瑟氏菌屬四個株間DNA序列的共有序列，并且也揭示了多個株中特定的核苷酸的替換或插入。
圖12顯示了奈瑟菌屬四個株間蛋白序列的共有序列，并且同時揭示了各個株中特定的氨基酸的插入或替換。
圖13示大鼠中對重組的22kDa蛋白的免疫反應的時效，是用相應的ELISA(酶連免疫吸附法)滴度來反映的。大鼠注射的外膜制備物來自大腸桿菌JM 109株，該菌帶有質粒pN2202，或者是帶有對照質粒pWRS30。特異的體液免疫的發展過程也用ELISA分析，該法用來自腦膜炎奈瑟氏球菌608B株(B2aP1.2)的外膜制備物作為包被抗原。
圖14示食蟹猴中的對重組的22kDa蛋白的免疫反應的時效，是用相應的ELISA滴度來表示的。這兩只猴每次注射分別用100μg(K28)和200μg(I276)的親合純化的22kDa蛋白免疫。對照猴(K65)用150μg的無關重組蛋白按同樣的步驟免疫。特異的體液免疫的發展過程也用ELISA分析，該法用來自腦膜炎奈瑟氏球菌608B株(B2aP1.2)的外膜制備物作為包被抗原。
圖15示本發明中合成的肽段及其在全長22kDa的蛋白中的相對位置，該22kDa蛋白為腦膜炎奈瑟氏球菌608B株(B2aP1.2)的蛋白。
圖16是質粒pNP2204的圖譜，該質粒上含有編碼腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的基因22kDa；氨芐抗性基因AmpiR；氨基抗性編碼區，ColEl，復制起始區；CI857，噬菌體λCI857溫度敏感阻遏物基因λPL，噬菌體λ轉錄啟動子，T1轉錄終止子，轉錄方向用箭頭指示。用來插入在p629質粒上的22kDa基因的限制酶切位點是BglII和BamHI。
發明詳述在我們研究腦膜炎奈瑟氏球菌外膜的超結構時，我們發現一個新的低分子量的22kDa蛋白，它有獨特的性質。此外膜蛋白對于蛋白水解酶如蛋白酶K，一個林伯氏白色念球菌(霉菌)來源的絲氨酸蛋白酶，的處理有著很高的抗性。這一點十分令人吃驚，因為抗蛋白酶K的蛋白在自然界是很少的，這是由于蛋白酶K的水解力強，最適pH范圍廣并且該酶的肽鍵特異性也低〔Barrett，A.J.and N.D.Rawlings，生化協會學報(1991)19707～715〕現僅有幾例報道描述了一些原核來源的蛋白具有對蛋白酶K的抗性。蛋白酶K抗性蛋白僅在鉤端螺旋體屬內的物種〔Nicholson，V.M.and J.F.Prescott，獸醫微生物學(1993)36123-138〕，支原體〔Bulter，G.H.等，感染免疫學(1991)591037-1042〕Spiroplasma mirum〔Bastian F.O.等，臨床微生物學雜志(1987)252430～2431〕以及病毒和朊病毒中有發現〔Onodera，T.等，微生物免疫學(1993)37311-316；Prusiner，S.B.等，美國國家科學院院刊(1993)902793-2797〕。這里，我們描述了以這種蛋白作為手段來提高腦膜炎奈瑟氏球菌感染的預防，治療和診斷。
這樣，本發明的一個方面是我們提供了一種高度保守的，免疫可及的腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白，及其片段，類似物和衍生物。正如此處所用到的，“腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白”指任何由自然發生的腦膜炎奈瑟氏球菌基因所編碼的腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白。根據本發明，這種腦膜炎奈瑟氏球菌蛋白可以是自然界來源，或是通過分子生物學技術的運用而得到，目標是產生一種重組蛋白，或是其片段。
此處所用的“高保守”意思是編碼這種腦膜炎奈瑟氏球菌的表面蛋白的基因及其蛋白產物存在于50％以上的已知的腦膜炎奈瑟氏球菌菌株中。優選的，此基因及其蛋白存在于99％以上的已知的腦膜炎奈瑟氏球菌菌株中。實施例2和4中提出一種方法，用此法，本領域的技術人員可以檢測眾多的不同的腦膜炎奈瑟氏球菌的表面蛋白，在確定它們是否是“高保守”。
此處所用的“免疫可及的”指的是腦膜炎奈瑟氏球菌的表面蛋白位于菌體表面并且抗體可及并與其作用。實施例2中提出一種方法，用此種方法，本領域的技術人員可以檢測眾多的不同的腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白，以確定它們的否是“免疫可及的”。免疫可及性可用其它方法確定，包括凝集反應分析、ELISA分析、RIA、免疫印跡分析、斑點-酶分析、表面可及性分析、電鏡分析，或是這些分析的組合。
此處所用的腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白的“片段”包括至少含一個肽表位的多肽，或其類似物和衍生物。這類肽可通過分子生物學的應用獲得或者用傳統的液相或固相肽合成技術來合成。
此處所用的腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白“類似物”包括這樣一些蛋白或其片段，在這些蛋白中，自然發生序列中的一個或多個氨基酸殘基被其它的氨基酸殘基所替換，只要此蛋白的整體功能和其具保護性的特征依舊保存。這些類似物可以合成生產或用重組DNA技術生產。比如通過對天然發生的腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白的突變生產一個類似物，這些方法在本領域內部是盡人皆知的。
例如，正如圖10中所述，其中一個這樣的類似物由淋病奈瑟氏球菌b2株的編碼22kDa蛋白的基因所編碼生產的重組蛋白中選出。另一個類似物是通過分離乳糖奈瑟氏球菌來源的相應基因而得到。
此處所用的腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白的“衍生物”是指被共價修飾過的蛋白或蛋白片段，比如，用二硝基苯酚修飾，目的是使其在人體內有免疫原性。本發明中的衍生物也包括本發明中的氨基酸類似物的衍生物。
應該理解的是通過本發明的實施例，本領域的技術人員可以通過適當的實驗來決定一個特定的片段，類似物或衍生物在腦膜炎奈瑟氏球菌疾病的診斷、防御或治療上是否有用。
本發明也包括腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白，片段，類似物和衍生物的多聚體形式。這些多聚體形式包括，例如，一個或多個多肽通過抗生素蛋白/生物素、戊二醛或二甲基辛二酰亞胺(suberimidate)等交聯劑交聯在一起。這類多聚體形式也包括含有2個或更多串聯或反向鄰近的腦膜炎奈瑟氏球菌序列的多肽，這種多肽是由重組DNA技術產生的多順反子mRNA產生的。
本發明提供了基本上純的腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白。術語“基本上純”指的是根據本發明該表面蛋白不含其它腦膜炎奈瑟氏球菌來源的蛋白。基本上純的腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白的制備可通過多種常規方法實現，比如用實施例3和11中所述的方法。
另一方面，本發明特別提供了腦膜炎奈瑟氏球菌的22kDa表面蛋白，或其片段，類似物或衍生物，其氨基酸序列如圖1所示(SEQ IDNO2)。
另一方面，本發明特別提供了腦膜炎奈瑟氏球菌的22kDa表面蛋白及其片段類似物或衍生物，其氨基酸序列如圖8(SEQ ID NO4)和圖9(SEQ ID NO5)所示。這個片段可能是從圖15(SEQ IDNO9到SEQ ID NO26)所列的肽中選出的。
另一方面，本發明提供了一個22kDa的淋病奈瑟氏球菌的表面蛋白或其片段，類似物或衍生物，其氨基酸序列如圖10所示(SEQ ID NO8)從以上可清楚地看出，任何關于腦膜炎奈瑟氏球菌的22kDa蛋白的論述也包括從奈瑟氏菌屬的其它物種如淋病奈瑟氏球菌或乳糖奈瑟氏球菌中分離到的或是由分離自這些物種的基因產生的22kDa蛋白。
依據本發明，腦膜炎奈瑟氏球菌的22kDa表面蛋白可用下列特征進一步定性。
(1)根據SDS-PAGE凝膠電泳估計其分子量約為22kDa；(2)其在SDS-PAGE膠上的泳動性不因還原劑的處理而受影響；(3)其等電點(PI)范圍為pI8到pI10；(4)其對蛋白水解酶如α-胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K的降解有高的抗性；(5)高碘酸鹽氧化不能消除直接抗腦膜炎奈瑟氏球菌表面22kDa蛋白的抗體同其的特異性結合；(6)它是一個高保守的抗原；(7)在未經處理的腦膜炎奈瑟氏球菌表面，抗體可同該蛋白相接觸；(8)其能誘導產生殺菌抗體；(9)其能誘導產生抗體，該抗體可抵抗實驗侵染；(10)當被注射入動物宿主后，它能誘導免疫反應的發展，免疫反應可抵御腦膜炎奈瑟氏球菌的感染。
本發明還首次提供了編碼腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的DNA序列(SEQ ID NO3、SEQ ID NO5和SEQ ID NO7)。本發明的更優的DNA序列選自(a)圖1的DNA序列(SEQ ID NO1)；(b)圖8的DNA序列(SEQ ID NO3)；(c)圖9的DNA序列(SEQ ID NO5)；(d)圖10的DNA序列(SEQ ID NO7)；(e)前述DNA序列的類似物或衍生物；(f)與前述DNA序列可簡并的DNA序列；和(g)前述任何DNA序列的片段；其中所說的序列編碼的產物可顯示腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的免疫活性。
這類片段是優選的肽，正如圖15所述(SEQ ID NO9，SEQID NO26)。
優選地，本發明首次提供了編碼腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的DNA序列(SEQ ID NO1)。本發明更優選的DNA序列選自(a)圖1的DNA序列(SEQ ID NO1)；(b)前述DNA序列的類似物或衍生物；(c)與任一上述序列可簡并的DNA序列；和(d)任一前述DNA序列的片段，此處所說的序列編碼的產物可顯示腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的免疫活性。
腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的編碼基因的類似物或衍生物將用實施例4中所述的條件同22kDa蛋白編碼基因雜交。
本發明的目的，如果腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa的表面蛋白的片段，類似物或衍生物在注射給動物宿主后能誘發免疫反應的發展，且免疫反應又能抵御腦膜炎奈瑟氏球菌的感染，則它們有該22kDa的表面蛋白的“免疫活性”。本領域的技術人員通過實施實施例6中所提出的方法可以確定一個特定的DNA序列編碼的產物是否有腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa蛋白的免疫活性。
本發明中的腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白的分離方法包含下列步驟a)分離-腦膜炎奈瑟氏球菌培養物；b)從該細菌培養物中分離外膜部分；并且c)從外膜部分分離所說的抗原。
特別需指出，前述步驟(c)可以包含其它的步驟用蛋白酶K處理腦膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白抽提物，然后用常規的分離技術比如離子交換和凝膠層析及電泳等將蛋白分成各組分。
另一種方法并且是一種優選的方法是，正如在實施例3中所特別描述的，用分子生物學技術生產本發明中的腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白，分子生物學技術特別適用于制備基本上純的重組的腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白。
這樣，本發明的另一個方面就是提供了一種制備重組的腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的方法，也包括制備其片段，類似物及衍生物，該方法包括步驟(1)培養單細胞宿主菌，該菌是經重組DNA分子轉化過的，而該重組DNA分子含有目的蛋白或其片段，類似物或衍生物的編碼序列，以及含同該編碼序列相連的一個或多個表達調控序列，和步驟(2)收集基本上純的蛋白，片段，類似物或衍生物。·為了使得轉染的基因在宿主體內高表達，該基因必須經操作同轉染和翻譯表達調控序列相連，這些調控序列在所選定的表達宿主體內是有功能的，這點是本領域內所熟知的。優選地，表達調控序列和目的基因應包含在一個含有細菌選擇標記和復制起點的表達載體中，如果表達宿主為真核細胞，該表達載體還應包含一個在表達宿主內有效的表達標記。
可以用很多的表達宿主/載體組合來表達本發明中的DNA序列。有效的真核宿主表達載體包括，比如，來自SV40，牛乳頭瘤病毒，腺病毒和巨細胞病毒的表達調控序列。有效的細菌宿主表達載體包括已知的細菌質粒，如來自大腸桿菌的質粒ColE1，pCR1，pBR322，pNB9及其衍生質粒，廣泛宿主質粒，如RP4，噬菌體DNA，如眾多的λ噬菌體的衍生物，如NM989，以及其它DNA噬菌體，比如M13和絲狀單鏈DNA噬菌體。有效的酵母細胞表達載體包括2μ質粒及其衍生物。有效的昆蟲細胞表達載體包括pVL941。
此外，有許多表達調控序列都可用于這些載體來表達本發明中的DNA序列。這些有效的表達調控序列包括那些連有前述表達載體的結構基因的表達調控序列。有效的表達調控序列的例子包括，如SV40或腺病毒的早期和晚期啟動子，Lac系統，trp系統，TAC和TRC系統，λ噬菌體的主操縱子和啟動子區，fd包被蛋白的控制區，3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動子，酸性磷酸酶的啟動子，如Pho5，酵母α-結合系統的啟動子和其它已知序列，這些已知序列可控制原核和真核細胞基因的表達，或足可控制原核，真核生物病毒的基因的表達，以及上述這些序列的組合。腦膜炎奈瑟氏球菌的22kDa表面蛋白的表達調控序列用于在大腸桿菌中表達該蛋白時是非常有效的(實施例3)。
用前述載體轉化宿主細胞構成了本發明的另一方面。許多單細胞宿主在表達本發明中的DNA序列時都是有效的。這些宿主包括熟知的真核和原核宿主，比如一些大腸桿菌株、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬、真菌、酵母、昆蟲細胞如草地夜蛾(SF9)、動物細胞如CHO和小鼠細胞、非洲綠猴細胞如COS1，COS7，BSC1，BSC40和BMT10，以及組織培養的人和植物細胞。優選的宿主包括細菌如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌及組織培養的哺乳動物細胞。
當然，應該明白的是并非所有的載體和表達調控序列在表達本發明的DNA序列時是一樣好的，對同樣的表達系統，所有的宿主系統也并非是一樣好。然而，本領域的技術人員可以通過適當的實驗，在本發明范圍內，在這些載體，表達調控序列和宿主間進行選擇。比如，在選擇載體時，也必須考慮宿主，因載體須在宿主中復制。載體的拷貝數，控制拷貝數的能力，和由該載體編碼的任意其它蛋白如抗生素標記的表達，也均需考慮。
在選擇表達調控序列時，也需考慮許多因素。這些因素包括，例如，該序列的相對強度，它的控制性，和其同本發明中的DNA序列的相容性，特別應考慮其潛在的二級結構，單細胞宿主的選擇應考慮其與所選載體的相容性，本發明中DNA序列的編碼產物的毒性，它們的分泌特性，其正確折疊蛋白的能力，其發酵或培養的需求，以及本發明中的DNA序列的編碼產物應該容易從宿主中純化。
在這些參考中，本領域的技術人員可選擇不同的載體/表達調控序列/宿主組合，通過發酵或大規模動物培養來表達本發明中的DNA序列。
本發明中的DNA序列編碼的多肽可通過發酵或細胞培養分離制得并且可用多種的常規方法對之純化。本領域的技術人員在本發明范圍內可選擇最合適的分離、純化技術。
本發明中的腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白對由腦膜炎奈瑟氏球菌感染引起疾病的預防，治療和診斷都將是有用的。
本發明中的腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白對由淋病奈瑟氏球菌或乳糖奈瑟氏球菌感染引起的疾病的預防，治療和診斷都將是有用的。
根據本發明，腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白特別適合于產生抗腦膜炎奈瑟氏球菌疾病的抗體，并形成抗病的保護性反應。
根據本發明，腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白特別適合于產生抗淋病奈瑟氏球菌疾病或乳屑奈瑟氏球菌疾病的抗體，并形成抗病的保護性反應。
我們特別提出一種腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白或其片段，類似物或衍生物用作免疫原和疫苗，該蛋白的氨基酸序列如圖1(SEQID NO2)所示。
我們特別提出一種腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白或其片段，類似物或衍生物用作免疫原和疫苗，其氨基酸序列如圖1(SEQ ID NO2)，圖8(SEQ ID NO4)，圖9(SEQ ID NO6)或圖10(SEQ ID NO8)所示。
可對此腦膜炎奈瑟氏球菌的表面蛋白運用標準的免疫技術以使之可被用作免疫原和疫苗。特別是，任何合適的宿主被注射藥理學上有效劑量的腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白后，可產生單克隆或多價抗腦膜炎奈瑟氏球菌的抗體，或是誘發抗腦膜炎奈瑟氏球菌疾病的保護性免疫反應的形成。在宿主被注射前，可使腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白形成合適的顆粒，這樣我們提供一種藥物組合物，其包含一種或多種腦膜炎奈瑟氏球菌表面抗原或其片段。優選地，此抗原就是腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白或其片段，類似物或衍生物。另加一種或多種藥學上可接受的賦形劑。此處用的“藥理學上有效劑量”指的是一種或多種腦膜炎奈瑟氏球菌表面抗原或其片段的劑量，該劑量可以誘導產生足夠高的抗腦膜炎奈瑟氏球菌抗體的滴度，此抗體滴度可用來治療或預防腦膜炎奈瑟氏球菌感染。
本發明中的腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白也可為腦膜炎奈瑟氏球菌感染的診斷測試提供基礎。有幾種診斷方法是可行的。比如，本發明提供了一種方法來檢測一個生物樣品中的腦膜炎奈瑟氏球菌抗原，該樣品含有或懷疑含有腦膜炎奈瑟氏球菌抗原，方法包括a)從患者處分離生物樣品；b)將該生物樣品同抗-抗腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的抗體或其片段溫育，形成混合物，并c)在混合物中檢測特異結合抗體或片段，以顯示腦膜炎奈瑟氏球菌抗原的存在。
優選的的用于前述診斷方法中的抗體是Me-1和Me-7。
另一方面，本發明提供了一種方法來檢測生物樣品中的腦膜炎奈瑟氏球菌抗原特異的抗體，該樣品含有或懷疑含有所說的抗體，方法包括a)從患者處分離生物樣品；b)將該生物樣品同本發明中的腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白或其片段溫育，形成混合物；并c)在混合物中檢測特異結合的抗原或其片段以顯示特異性地抗腦膜炎奈瑟氏球菌的抗體的存在。本領域的技術人員會認識到這種診斷測試可采用幾種形式，包括免疫測試如酶連免疫吸附分析(ELISA)，注射免疫分析或膠乳凝集分析，來決定該蛋白的特異性抗體是否存在于生物體中。
本發明中的DNA序列也可用來設計探針并檢測一含有或懷疑含有奈瑟菌的生物樣品中存在的病原奈瑟菌。本發明的檢測方法包含下列步驟a)從患者處分離生物樣品；b)將生物樣品同含本發明DNA序列的探針溫育，形成混合物；并c)檢測混合物中的特異結合的DNA探針來顯示奈瑟菌的存在。
優選的的DNA探針含有下列圖中所示的堿基序列圖1(SEQ IDNO1)，圖8(SEQ ID NO3)，圖9(SEQ ID NO5)，或圖10(SEQ ID NO7)，或是圖11(SEQ ID NO9)中的共有序列。
更優選的DNA探針應含有圖1(SEQ ID NO1)中的525堿基對序列。
作為一種診斷腦膜炎奈瑟氏球菌感染的方法，本發明的DNA探針也可用來檢測樣品中的環形腦膜炎奈瑟氏球菌的核酸，比如用多聚酶鏈式反應探針可用常規技術合成并且可固化于固相物上，或者也可用可檢測的標記來標記探針。
這一應用中的優選的DNA探針是一含有同腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的基因中的至少6個連續核苷酸互補的一段寡聚核苷酸，基因的序列見圖1(SEQ ID NO1)，圖8(SEQ ID NO3)，圖9(SEQ ID NO5)，圖10(SEQ ID NO7)，或圖11(SEQID NO9)中的共有序列。
該應用中更為優選的DNA探針是一含有同腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的基因中至少6個連續核苷酸互補的一段寡聚核苷酸，該基因序列在圖1中(SEQ ID NO1)。
另一種檢測病人中的腦膜炎奈瑟氏球菌的診斷方法包含以下步驟a)用一種可檢測的標記來標記本發明中的抗體或其片段；b)對病人使用標記的抗體或標記片段，并c)檢測病人中的特異結合的標記抗體或片段以揭示腦膜炎奈瑟氏球菌的存在。
為了純化任何的抗-腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白抗體，可用親合層析法，親合層析中需用固化的腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白作為親合介質。
這樣，根據本發明的另一方面，我們提供了一種共價結合于不溶支持物上的腦膜炎奈瑟氏球菌的22kDa表面蛋白或是其一部分或是其類似物，該蛋白的氨基酸序列包括圖1(SEQ ID NO2)，圖8(SEQ IDNO4)，圖9(SEQ ID NO6)或圖10(SEQ ID NO8)中的序列。
根據本發明中的一個優選的方面，我們提供了一種共價結合于不溶支持物上的腦膜炎奈瑟氏球菌的22kDa表面蛋白或是其一部分或是其類似物，該蛋白的氨基酸序列包括圖1(SEQ ID NO2)的序列。
本發明的另一個特點是運用本發明中的腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白作為免疫原來產生特異性抗體，這樣就可對腦膜炎奈瑟氏球菌的感染進行診斷，或者特別的是可對之進行治療。用合適的篩選方法可以確定合適的抗體，比如通過在一個測試模型中測量特定抗體對腦膜炎奈瑟氏球菌感染的被動抵御力來衡量特定抗體的能力。動物模型中的一例即小鼠模型將在實施例中描述。抗體可以是完整抗體也可是其抗原結合部分并且其通常可以屬于任一類免疫球蛋白，抗體或片段可以是動物來源，特定是哺乳動物來源，進一步特定為鼠，大鼠或人類來源。抗體可以是天然抗體或其片段，如果需要，也可是重組抗體或其片段。術語重組抗體或抗體片段的意思是用分子生物學技術產生的抗體或抗體片段。抗體或抗體片段可以是多克隆的，或優選的，是單克隆來源。它可以是對許多個腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白相關的表位特異但它最好是對一個表位特異，優選地，此抗體或其片段是對一個或多個腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白相關的表位特異。此處描述的Me-1和Me-7單克隆抗體也是優選的。
實施例為了更好地理解本發明，提出以下實施例。這些實施例只以闡明為目的，在任何方面均非用來限制本發明的范圍。實施例1描述了用蛋白水解酶處理腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白制備物并在其后對腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白進行鑒定。實施例2描述了腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的特異性的單克隆抗體的制備。實施例3描述了腦膜炎奈瑟氏球菌重組22kDa表面蛋白的制備。實施例4描述了用DNA探針來鑒定表達腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的生物體。實施例5描述了用抗腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的單克隆抗體來保護小鼠免受腦膜炎奈瑟氏球菌的感染。實施例6描述了用純化的重組22kDa表面蛋白來誘導抗腦膜炎奈瑟氏球菌感染的保護性反應。實施例7描述了對22kDa蛋白的序列及腦膜炎奈瑟氏球菌其它株(MCH88和E4063)的編碼蛋白的基因序列的鑒定，并且也鑒定了淋病奈瑟氏球菌的一個株。實施例8描述了兔和猴對此22kDa腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白的免疫反應。實施例9描述了對該22kDa腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白的不同的免疫表位進行做圖的方法實施例10描述了用熱來誘導一個表達載體以達到大規模生產該22kDa表面蛋白。實施例11描述了當用重組技術生產此22kDa表面蛋白時，它的純化過程。實施例12描述了用22kDa表面蛋白作人的疫苗。實施例1蛋白水解酶處理腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜制備物及其后的一種抗酶水解的腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的鑒定。
由全細胞，經氯化鋰，或十二烷基肌氨酸鈉抽提制備的幾種抗原制備物被用于研究腦膜炎奈瑟氏球菌外膜的超結構。格蘭氏陰性細菌的外膜作為菌體內部和環境的界面，其中含有絕大多數的可自由暴露給宿主免疫防御的抗原。本研究的主要目標是鑒定一種能誘導抗腦膜炎奈瑟氏球菌的保護性反應的新抗原。發明者用的鑒定這種抗原的一種方法是，用蛋白水解酶部分降解上述的抗原制備物。這種酶處理產生的抗原決定簇然后可用下列分析來鑒定，即分析這些經處理的抗原制備物的免疫性和保護性。令我們吃驚的是，在用電泳分離腦膜炎奈瑟氏球菌氯化鋰外膜抽提物后，經考馬斯亮藍R-250染色，我們觀察到一低分子量條帶不會因蛋白水解酶處理而破壞。考馬斯亮藍用來染蛋白或多肽并且其與外膜的另一些主要組分多糖或脂沒有或幾乎沒有親和性。該低分子量抗原可被考馬斯亮藍染色這一事實提示至少部分的該抗原是由肽組成并且此肽不被蛋白酶消化，或者由其它外膜結構保護其免遭酶的降解。進一步，如下面所示，即使在過度處理時，作用力非常強大的蛋白酶K也不能降解此低分子量抗原。
從不同的腦膜炎奈瑟氏球菌株用氯化鋰抽提來得外膜制備物，抽提按以前發明人描述的方法進行〔Brodeur等，感染與免疫50，510頁(1985)〕。這些制備物中的蛋白成分用Lowry法確定，該法適用于膜組分〔Lowry等，生物化學雜志193，265頁(1951)〕。得自腦膜炎奈瑟氏球菌608B株的外膜制備物在37℃和不斷振搖的條件下，和牛胰來源的α-胰凝乳蛋白酶(E.C.3.4.21.1)(Sigma)或牛胰(E.C.3.4.21.4)(Sigma)來源的胰蛋白酶類I處理24小時。酶濃度為每毫克被處理蛋白加2mg酶。同樣的外膜制備物用不同濃度(0.5到24mg/mg蛋白)的林伯氏白色念珠菌來源的蛋白酶K(Sigma或Boehringer Mannheim Laval.Canacla)(E.C.3.4.21.14)處理。為了蛋白酶K對蛋白的降解，用了不同的實驗條件。樣品在振搖或不振搖時在37℃或56℃下溫育1、2或24或48小時。樣品混合物的pH被調為7.2或9.0。也在一些樣品中加入了1％的十二烷基磺酸鈉(SDS)(體積比)。處理后，馬上用SDS-PAGE凝膠電泳分離樣品，膠濃度為14％(重量/體積)，電泳裝置用MiniProtean II(Bio-Rad，Mississauga，Ontario，加拿大)系統電泳按制造者說明進行。蛋白在SDS和2-巰基乙醇存在下于100℃加熱5分鐘，用14％SDS膠分離，并用考馬斯亮藍R-250染色。
圖2示得自腦膜炎奈瑟氏球菌608B株(B2aP1.2)的外膜制備物，經α-胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶在37℃下處理24小時后，14％SDS-PAGE凝膠電泳分離所得的遷移圖象。同未處理時對照(圖2，泳道2)相比，處理過的樣品(圖2，泳道3和4)中可看到高分子量蛋白和幾個主要的外膜蛋白被強烈地水解消化。相反，一分子量為22kDa的蛋白帶即使被處理24小時也不受任一蛋白水解酶的影響。
這個特別的蛋白用更強烈的水解條件用蛋白酶K做進一步的研究(圖3)，由于蛋白酶K肽鍵特異性低且最適pH寬，故是最強大的蛋白水解酶之一。令人驚訝的是，該22kDa蛋白可抵御2個國際單位的蛋白酶K在56℃下作用24小時(圖3，泳道2)。這樣的處理在我們實驗室中是用來制備幾乎不含蛋白的脂多糖或DNA的。事實上，外膜制備物經此強烈的蛋白水解處理后，只能看到小肽。進一步，長時間的處理，至48小時，或高的酶量(至24個國際單位)的處理也不能改變該22kDa蛋白的量。將反應混合物pH升至9.0或是加入1.0％SDS，一種強烈的蛋白變性劑，SDS-PAGE電泳顯示該22kDa蛋白的量及其遷移并不受影響(圖3，泳道4，6和8)。聯用此二種變性條件通常導致外膜制備物中的蛋白的完全降解，以剩下氨基酸殘基。低分子量多肽在消化時經常可觀察到并被認為是敏感蛋白在酶處理時未能完全消化的片段。這些片段最有可能受到外膜中碳水化合物和脂的保護而免遭進一步降解。處理過的樣品中的分子量為28kDa和34kDa的帶分別是殘余的酶以及存在于所有檢測過的酶制劑中的一種污染蛋白。
有興趣的是，關于該22kDa蛋白抗蛋白酶的研究顯示了另一表觀分子量為18kDa蛋白帶似乎也能抗酶的降解(圖3a)。當經親合純化的重組22kDa蛋白經SDS-PAGE凝膠后，分析其遷移圖象從而得到了這個18kDa蛋白的線索(圖3b)。在上樣前，當經親合純化的重組22kDa蛋白在含有去污劑SDS的樣品緩沖液中再加熱一段時間時，那條18kDa的帶才是明顯的。用Edman降解法進行N-末端氨基酸分析(實施例3)表明18kDa蛋白帶氨基酸殘基(E-G-A-S-G-F-Y-V-Q)同第1～9位氨基酸相對應(SEQ ID NO1)。這些結果表明SDS-PAGE上看到的18和22kDa二蛋白帶事實上是來自同一蛋白。這最后的結果也顯示前導序列從成熟的18kDa蛋白上被切去。將進行進一步的研究來確定分子修飾以解釋這種表觀分子量的變化并且來估計其對該蛋白抗原性及保護性的影響。
結論是，這種有著抵御蛋白水解消化的非常罕見的性質的腦膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白的發現使得對其分子和免疫特性進行了進一步的研究。實施例3中純化的，由大腸桿菌生產的重組22kDa表面蛋白也有很強的抗蛋白酶K降解的特性。目前，我們正試圖理解是什么機制導致了腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的這種不尋常的對蛋白水解酶的抗性。實施例2特異性抗22kDa腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白的單克隆抗體的產生此處所述的單克隆抗體由三個獨立的融合實驗得到。用分屬血清型群體A、B、C的腦膜炎奈瑟氏球菌株604A，608B和224/C的外膜制備物去免疫雄性Balb/c小鼠(Chares River實驗室，St-Constant，魁北克，加拿大)。按先前發明者所述的方法用氯化鋰抽提制得外膜制備物〔Brodeur等，感染與免疫50，510頁(1985)〕。這些制備物中所含的蛋白用Lowry法確定，該法適用于膜級分〔Lowry等，生物化學雜志193, 265頁(1951)〕，用10mg的上述外膜制備物的不同的組合，對多群小鼠進行二次腹膜內及皮下注射，間隔為3周。用于免疫的佐劑為弗氏完全或不完全佐劑(Gibco試驗室，Grand Island，N.Y.)或QuilA(Cedarlane實驗室，Hornby，Ont.，加拿大)，這要依小鼠群體而定。在融合步驟前三天，免疫過的小鼠接受最后一次靜脈注射，用10mg的上述的外膜制備物。用于產生能分泌所需單克隆抗體的雜交瘤細胞系的融合方案以前已由發明人提出〔Hamel等，醫學微生物學雜志25，2434頁(1987)〕。單克隆抗體Me-1，Me-2，Me-3，Me-5，Me-6和Me-7的類，亞類及輕鏈類型用以前報道的ELISA來確定〔Martin等，臨床微生物學28，1720頁(1990)〕并且列于表1中。
單克隆抗體的特異性用Western免疫印跡檢測，方法依據先前發明人所述〔Martin等，歐洲免疫學雜志18，601頁(1988)〕進行并有如下修改。從不同的腦膜炎奈瑟氏球菌株獲得的外膜制備物在14％SDS-PAGE膠上電泳分離。用半干儀(Bio-Rad)將蛋白從膠上轉至硝酸纖維素膜上。每塊膠(6×10厘米)用60mA電流作用10min，電印跡緩沖液含有25mM Tris-HCl，192mM甘氨酸和20％甲醇，pH 8.3。Western印跡實驗清楚地表明單克隆抗體Me-1，Me-2，Me-3，Me-5，Me-6和Me-7識別腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa蛋白的特定的表位(圖4A)。SDS-PAGE凝膠和相應的Western印跡分析也表明該蛋白的分子量不隨菌株的變化而變化。然而，該蛋白在外膜制備物中的量卻隨菌種不同而變化，并且同菌株的血清型組無關。更有甚者，在用2 IU的蛋白酶K/mg蛋白處理外膜制備物后(處理在實施例1中描述，上文)，這些單克隆抗體仍能識別腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白上的各自的表位(圖4B)。令人感興趣的是，在酶消化后，表位仍舊未受影響，這樣證實了在膜制備物中既使它們同抗體是可及的，也不會被酶處理所破壞。后者的結果暗示所觀察到的抗蛋白酶K的現象的機制很可能同表面結構阻抑酶同該蛋白接近無關，或者也表明該機制同膜對深嵌其內的蛋白提供保護無關。Me-1的免疫印跡的結果同其它5個單克隆抗體的結果相一致，這在圖4中沒有表示。
又進行了一系列實驗來對此腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白定性并將之同其它已知的腦膜炎奈瑟氏球菌的表明蛋白區分。存在或不存在巰基乙醇時，在電泳樣品緩沖液中的外膜制備物在100℃加熱5分鐘，或在37℃和56℃加熱30分鐘，SDS-PAGE膠上未觀察到腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白表觀分子量的變化。這顯示了存在于外膜上的22kDa表面蛋白的遷移并不受熱或2-巰基乙醇影響。
用高碘酸鈉氧化來確定單克隆抗體是否同腦膜炎奈瑟氏球菌外膜制備物上的碳水化合物表位起反應。該法按照先前發明者所述〔Martin等，感染與免疫60，2718-2725頁(1992)〕進行。用100mM的高碘酸鈉室溫下對外膜制備物處理1小時并不能改變單克隆抗體同腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的反應性。這一處理一般可以消除抗體同其特異的碳水化合物的結合。
單克隆抗體2-1-CA2(由PA.Bhattaoharjee博士提供，WalteReed Army Institute of Research，華盛頓，哥倫比亞特區)是一種脂蛋白特異的抗體(也叫H.8)，該脂蛋白在所有病原奈瑟菌中均是一種表面抗原。這種單克隆抗體同外膜制備物的反應性用來同Me-5單克隆抗體的反應性作比較。此種脂-特異性單克隆抗體同一分子量為30kDa的蛋白帶反應，而Me-5單克隆抗體同22kDa蛋白帶反應。該結果清楚地表明腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白同脂蛋白無關，而脂蛋白為另一高保守的外膜蛋白。
為證明在未處理過的腦膜炎奈瑟氏球菌細胞表面，該22kDa蛋白是暴露在外的，用了放免的方法，該方法按先前發明人描述的進行〔Proulx等，感染與免疫59，963頁(1991)〕。該法中用的是86小時和18小時的細菌培養物。6個單克隆抗體分別同以下菌株反應，9個腦膜炎奈瑟氏球菌菌株(各株的血清型組在圖5的括號中顯示)。2個淋病奈瑟氏球菌菌株(“NG”)2個粘膜炎莫拉氏菌菌株(“NC”)和2個乳糖奈瑟氏球菌菌株(“NL”)。放射免疫實驗證明單克隆抗體識別的表位是暴露在未經處理的多個不同的血清型和血清型組的腦膜炎奈瑟氏球菌分離物的表面而且也是同蛋白水解酶可及的(圖5)。單克隆抗體同其位于所有被檢測的腦膜炎奈瑟氏球菌表面的靶表位強烈結合。記錄到的結合值(3000到35000CPM間)隨菌株不同而異，并且受到細菌生理狀態的影響。流感嗜血桿菌孔蛋白-特異的單克隆抗體被用作每種菌株的陽性對照。500CPM以下的計數被記下并隨后從每個結合值中減去。就本法中所檢測的腦膜炎奈瑟氏球菌菌株而言，圖5中所示的單克隆抗體Me-5和Me-7的結果代表了用單克隆抗體Me-1，Me-2，Me-3和Me-6所得的結果，就其它測試的菌的菌株而言，所示的Me-7的結合活力代表了識別同樣菌株的其它單克隆抗體的結合活力。
也估計了被單克隆抗體識別的表位的抗原保守性。斑點一酶免疫法被用于快速篩選抗大量的細菌菌株的單克隆抗體。本法按先前發明者所述進行〔Lussier等，免疫分析雜志10，373頁(1989)〕。本研究中用了71種腦膜炎奈瑟氏球菌菌株。樣品包含19個血清型組A的分離物，23個血清型組B的分離物，13個血清型組C的分離物，1個血清型組29E的分離物，6個血清型組W-135的分離物，1個血清型組X的分離物，2個血清型組Y的分離物，2個血清型組Z的分離物，和4個當未劃分血清型組的菌的分離物(“NS”)。這些分離物由下列單位獲得加勒比流行病中心，西班牙港，特立尼達；東安大略兒童醫院，渥太華，加拿大；Department of Saskatchewan Health，Regiha，加拿大；Laboratorire de SantèPublique Du Ouèbec，蒙特利爾，加拿大；Max-Planck Institut fur Molekulare Genetik，柏林，FRG；蒙特利爾兒童醫院，蒙特利爾，加拿大；維多利亞綜合醫院CeeneralHospital，Halifax，加拿大；以及我們自己的菌株收藏。以下的菌種也被檢驗16種淋病奈瑟氏球菌，4種灰色奈瑟氏球菌，5種乳糖奈瑟氏球菌，1種黃色奈氏球菌，1種淺黃奈氏球菌，3種粘液奈瑟氏球菌，4種深黃/干燥奈瑟氏球菌，5種深黃色奈瑟氏球菌，1種干燥奈瑟氏球菌，1種微黃奈瑟氏球菌和5種粘膜炎莫拉氏菌，1種糞產堿菌(ATCC8750)，1種弗氏檸檬酸菌(ATCC 2080)，1種遲鈍愛德華氏菌(ATCC 15947)，1種陰溝腸桿菌(ATCC 23355)，1種產氣腸桿菌(ATCC 13048)，1種大腸桿菌，1種氣味黃桿菌，流感嗜血桿菌類型b的一種(Eagan株)，1種肺炎克氏桿菌(ATCC 13883)，1種雷氏變形菌(ATCC 25932)，1種普通變形菌(ATCC 13315)，1種綠濃桿菌(ATCC 9027)，1種鼠傷寒沙門氏菌(ATCC 14028)，1種粘質沙番氏菌(ATCC 8100)，1種弗氏志賀氏菌(ATCC 12022)，1種索氏志賀氏菌(ATCC 9290)。這些菌來自下單位美國標準培養物保藏中心或加拿大，渥太華的疾病控制實驗中心的收藏。單克隆抗體同最相關的奈氏菌株的反應性列于表1中。Me-7這種單克隆抗體可識別全部71種檢測腦膜炎奈瑟氏球菌菌株上的其特異性的表位。該單克隆抗體，以及Me-2，Me-3，Me-5和Me-6也同屬于奈瑟氏菌屬的其它一些特定的菌種反應，這表明它們的特異的表位在奈瑟菌科中一些密切相關的菌中也表達。單克隆抗體Me-1除可同一種乳糖奈瑟氏球菌有輕微反應外，其中能同腦膜炎奈瑟氏球菌分離物反應。Me-1繼而再用另外177個腦膜炎奈瑟氏球菌分離物樣品進一步測試，結果它可以正確地識別多于99％的總的受試腦膜炎奈瑟氏球菌菌株。除表1列的奈瑟氏菌菌株外，單克隆抗體不能同上面所提的任何其它菌種起反應。
結論是，發明人生產出6種可特異性地同腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白起反應的單克隆抗體。運用這些單克隆抗體，我們揭示了它們特異的表位是1)位于一存在于腦膜炎奈瑟氏球菌外膜上的抗蛋白酶K的22kDa蛋白上，2)在腦膜炎奈瑟氏球菌各分離物中保守，3)暴露于未處理的腦膜炎奈瑟氏球菌表面并且是抗體可及的，和4)這些單克隆抗體同腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的反應性不被高碘酸鈉處理影響，提示其特異性表位不在碳水化合物上。
盡管我們發現腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa蛋白在嚴格條件下加熱時，其遷移會變為18kDa蛋白的遷移，然而我們發現其遷移不被2-巰基乙醇處理所影響。
我們還揭示該腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白在抗原性方面與脂蛋白無相似處，而脂蛋白是另一低分子量且高度保守的存在于腦膜炎奈瑟氏球菌外膜上的蛋白。
正如將要在實施例3中所示，這些單克隆抗體同純的，重組22kDa表面蛋白也能反應，這些重組蛋白是將含有編碼腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的基因的質粒載體pNP2202轉化大腸桿菌BL 21(DE3)株后制得。
表1 單克隆抗體同奈瑟菌屬各種菌分離物的反應性
未區分血清型組的分離物實施例3腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的分子克隆，基因測序，高產率表達及其純化A.分子克隆根據制造商的建議(普洛麥格公司，麥迪遜，威斯康星)，建立腦膜炎奈瑟氏球菌608B株(B2aP1.2)的λGEM-11基因組文庫。簡要地說，608B株的基因組DNA經Sau 3AI部分消化，9到23kb間的片段用瓊脂糖凝膠純化，然后連接到GEM-11臂的BamHI位點上。得到的重組噬菌體用于轉染大腸桿菌LE392株(普洛麥格)，然后將菌鋪LB瓊脂板。用實施例2中的腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白特異的單克隆抗體按下面的方法去對文庫進行免疫篩選，得到19個陽性噬菌斑。平板在-20℃下放置15分鐘以使上層瓊脂變硬。將硝酸纖維素膜輕輕放在平板的表面上，4℃，30分鐘，以吸附重組病毒克隆產生的蛋白。然后用PBS-吐溫0.02％(體積比)洗膜并進行前述的免疫印跡〔Lussier等，免疫分析雜志10，373頁(1989)〕。在擴增和DNA純化后，一個病毒克隆，定名為克隆8，其中含13kb插入片段，被選出來進行亞克隆。用SacI消化該克隆后，得到5和8kb二個片段。這二個片段用瓊脂糖凝膠純化后連接到低拷貝數質粒pWKS30的Sac I限制性位點上〔Wang and Kushner，基因，100，195頁(1991)〕。此重組質粒用于轉化大腸桿菌JM 109株(普洛麥格)，轉化按照生產商的建議用電穿孔法(Bio-Rad，Mississauga Ont.，加拿大)進行。得到的克隆用實施例2中的腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白特異的單克隆抗體篩選。僅是含有8kb插入片段的質粒轉化產生的細菌的克隆是陽性的。陽性克隆的Western印跡分析(方法見實施例2中)表明，由大腸桿菌表達的蛋白是完整的，且其在SDS-PAGE凝膠上的遷移同腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白一致。進一步減小插入片段長度，即用Cla I消化含8kb插入片段的克隆，得到2.75kb片段，將之連入pWKS30質粒的Cla I位點。所得克隆的Western印跡分析再一次清楚地表明大腸桿菌表達的蛋白是完整且其在SDS-PAGE凝膠上的遷移同天然的腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白一致。
限制性酶切分析表明，二個命名為pNP2202和pNP2203的克隆含有2.75kb的插入片段，且方向相反，此二克隆用于繼續進行編碼腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白基因的序列分析。由發瑪西亞生物技術公司(Piscataway，NJ)購得的“雙鏈巢居缺失試劑盒”用于從二克隆產生一系列的巢居缺失，方法按生產商提供的進行，得到的截短的插入片段用于測序，測序從pWKS30載體上的M13E正向引物進行，用AppliedBiosystems Inc.(Foster City，CA)公司的自動測序儀，型號373A，按制造者的說明進行，用的試劑盒是“Taq染色脫氧終止子循環測序試劑盒”。B.序列分析插入片段從二個方向測序后，核酸序列顯示了一個含525個核苷酸的開放閱讀框(包括終止密碼子)，編碼蛋白由174個氨基酸殘基組成，其預期分子量為18,000 Dalton，pI值為9.93，核酸及所得的氨基酸序列列于圖1中(SEQ ID NO1，SEQ ID NO2)。
為了驗證該克隆基因的正確表達，得自腦膜炎奈瑟氏球菌608B株的天然22kDa表面蛋白的N-末端氨基酸序列被測定，以同由核酸序列推知的氨基酸序列作比較。來自腦膜炎奈瑟氏球菌608B株的外膜制備物用14％SDS-PAGE凝膠電泳分離并按照先前所描述的方法〔Sambrook等，分子克隆實驗指南，冷泉港實驗室出版社(1989)〕軒到聚偏二氟乙烯膜上(Millipore Products，Bedford MA)。22kDa蛋白帶從膠上切下并進行Edman降解，用的是Applied Biosystems.Inc.公司(FosterCity，CA)的473A型自動蛋白測序儀，按廠商的說明進行。氨基酸序列E-G-A-S-G-F-Y-V-Q-A同開放閱讀框l～10的氨基酸相對應(SEQ ID NO2)，這表明腦膜炎奈瑟氏球菌608B株的22kDa表面蛋白有一19氨基酸的前導肽(SEQ ID NO2中的氨基酸殘基-19到-1)。
搜索已有的數據庫后表明該腦膜炎奈瑟氏球菌608B株的22kDa表面蛋白(SEQ ID NO2)或其基因(SEQ ID NO1)在以前未有報道。C.重組腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的高產率表達及純化開發以下方法是為了使表達于大腸桿菌的重組腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表明蛋白的產量最大化并純化之。這一方法是基于此觀察，即帶有質粒pNP2202的大腸桿菌BL 21(DE 3)株生產的重組22kDa表面蛋白大量存在于外膜中，但同時也可在培養上清中得到，在上清中，它是含量最豐富的蛋白。所以培養物上清被用于用親合層析柱來純化所重組22kDa蛋白(圖6A)。
按廠商的說明，將單克隆抗體Me-2、Me-3和Me-5(實施例2中所述)固化于經溴化氰活化的Sepharose 4B(發瑪西亞生物技術公司，Piscataway，NJ)上以產生親合層析柱的基質。
過夜培養的帶有質粒pNP2202的大腸桿菌BL 21(DE 3)株接種于含25mg/ml氨芐(Sigma)的LB液體培養基中(Gibco Laboratories，Grand Island，N.Y.)，在37℃下振搖培養4小時，以制備培養物上清。菌體用2次4℃下10,000g，10分鐘的離心從培養基中除去。培養物上清用0.22mm膜(Millipore，Bedfords，MA)過濾，然后用一截流量為10,000 Daltons的超濾膜(Amicon Co.，Bererly，MA)將上清濃縮約一百倍。為了使膜顆粒完全溶解，向濃縮過的培養物上清中加入EmpigenBB(Calbiochem Co.，LaJolla，CA)至終濃度為1％(體積比)懸液于室溫放1小時，再用幾升含有0.05％Empigen BB(體積比)的10mMTris-HCl緩沖液，pH7.3，透析，然后在4℃以10,000g離心20分鐘。將抗原制備物加入親合基質中，在不斷振搖下，于4℃放置過夜。膠漿注入一層析柱并用含0.05％Empigen BB(體積比)的10mMTris-HCl緩沖液反復洗滌。然后用含1M LiCl的10mM Tris-HCl緩沖液pH7.3，將重組22kDa蛋白洗脫下來。含有洗脫下的蛋白的溶液再用幾升的含0.05％Empigen BB的10mM Tris-HCl緩沖液，pH7.3，反復透析。在每步純化過程中，均用考馬斯藍和銀染SDS-Page膠〔Tsaiand Frash，分析生化分析生物化學119，19頁(1982)〕來估測重組22kDa表面蛋白的純度，代表性結果于圖6A中給出。膠的銀染結果表明純化過程可產生很純的重組22kDa蛋白，僅存有很少量的大腸桿菌脂多糖。
純化的重組22kDa表面蛋白的抗蛋白水解也被證明，結果于圖6B中給出。如實施例1中所描述的，純化的重組22kDa表面蛋白2mg/mg蛋白的α-胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶以及每毫克蛋白用2 IU的蛋白酶K在37℃不斷振搖下處理1小時。任何處理后均未觀察到蛋白量的減少。與之相對比，對照蛋白〔本例中用牛血清白蛋白(BSA，Simga)〕則部分或全部被降解，降解程度依賴于所選用的酶。進一步，更長時間的處理也不能導致該蛋白的任何改變。后面的這些結果表明轉化的大腸桿菌可以表達完整的重組22kDa表面蛋白，并且同天然存在的腦膜炎奈瑟氏球菌的蛋白一樣，這種重組蛋白也是對于三種蛋白水解酶水解有強的抗性。此外，純化的但未鑲嵌在大腸桿菌外膜上的重組22kDa表面蛋白對于蛋白水解酶的作用依舊有高的抗性。
我們也證明了酶處理對于該重組22kDa蛋白的抗原性質的影響。通過ELISA和Western免疫印跡可以判定實施例2中所述的單克隆抗體可識別按上述過程純化的重組22kDa表面蛋白(圖6C)。進一步，單克隆抗體Me-5及其它22kDa蛋白-特異性單克隆抗體同純化的重組22kDa表面蛋白的反應性不因酶處理而改變，這就證明了重組22kDa蛋白的抗原性似乎同天然蛋白的相似。
重要的數據顯示于實施例3中并可總結如下1)得到了腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的完整的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO1；SEQ ID NO2)；2)天然蛋白N-末端序列分析證明確實克隆了腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa基因；3)該蛋白以前未見記述；4)可以轉化宿主如大腸桿菌并獲得該重組腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的高產表達；5)可得到不含其它腦膜炎奈瑟氏球菌分子的重組蛋白且該蛋白幾乎不含大腸桿菌的級分；6)純化過的重組22kDa表面蛋白依然對諸如α-胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶和蛋白酶K的水解有強的抗性；并且7)該重組22kDa蛋白的抗原性同天然的腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的相一致。實施例4 編碼腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的基因的分子保守性為了證明奈瑟氏菌屬內部各種分離物間編碼腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的基因的分子保守性，做了DNA點雜交來檢測不同的奈瑟氏菌的種及其它細菌的種。首先，用PCR擴增525堿基對的腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的編碼基因，用瓊脂糖凝膠純化后再按廠商的說明，用非放射性的地高辛DNA標記及檢測系統(寶靈曼，Laval，加拿大)對之進行隨機引物標記。
按廠商的說明(寶靈曼)進行點印跡。簡要地說，待檢細菌株點樣于一張帶子電荷的尼龍膜上(寶靈曼)，干燥后再依照地高辛用戶指南中的菌落轉移說明處理，在含50％甲酰胺(Sigma)的溶液中于42℃下做預雜交及雜交。預雜交液中含有100mg/ml的變性的鯡魚精子DNA(寶靈曼)作為補充封閉劑來避免DNA探針的非特異性雜交。嚴格漂洗及用化學發光的收光物PPD底物進行檢測均按地高辛系統的用戶指南進行。
對于被檢測的71個腦膜炎奈瑟氏球菌，用單克隆抗體Me-7得到的結果同用525bp的DNA探針得到的結果完全一致。根據該結果，被檢的所有腦膜炎奈瑟氏球菌菌株均含有腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白基因且均表達蛋白，因為它們均可被單克隆抗體識別。由此證明了該蛋白在腦膜炎奈瑟氏球菌分離物中高度保守(表2)。
DNA探針也檢測到編碼腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的基因也存在于所有檢測的淋病奈瑟氏球菌菌株中。
相反，單克隆抗體Me-7卻僅同16個經檢測的淋病奈瑟氏球菌菌株中的2個起反應，表明在淋病奈瑟氏球菌中，特異性的表位是以某種方式不存在的，不可及或是受到修飾，或者是絕大多數的淋病奈瑟氏球菌菌株不表達此蛋白，既使它們在其基因組中有編碼序列(表2)。
在乳糖奈瑟氏球菌中也觀察到二種檢測法有很好的一致性，因為僅發現有1種乳糖奈瑟氏球菌是有基因卻不表達蛋白(表2)。該結果也可用最后一段中的理由來解釋。
這可以表明，盡管淋病奈瑟氏球菌菌株表面的該22kDa蛋白未表達或不被接近，但淋病奈瑟氏球菌或乳糖奈瑟氏菌的22kDa蛋白的編碼基因卻可用于重組質粒的構建，該重組質粒用于生產22kDa表面蛋白或其類似物，所有的這些蛋白或其類似物均可用于防御，檢測或診斷奈瑟氏菌的侵染。更具體地說，這種侵染可來自腦膜炎奈瑟氏球菌，淋病奈瑟氏球菌和乳糖奈瑟氏球菌。因此，該22kDa表面蛋白或其類似物可用作生產疫苗來抵御這類感染。此外，該22kDa蛋白或其類似物也可用于生產一可檢測或診斷這種感染的試劑盒。
用粘膜炎莫拉氏菌得到的結果表明，在5個經檢測的菌株中，3個同單克隆抗體Me-7起反應，但無一例同DNA探針反應，表明腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的編碼基因在這些菌株的基因組中不存在(表2)。
也檢測了幾個其它的奈瑟氏菌屬的菌及其它細菌(見腳注，表2)并發現它們在二種測試中無一是陽性結果。后一結果似乎能說明22kDa表面蛋白的基因僅在奈瑟氏菌科密切相關的種中存在。
表2 525堿基對DNA探針和Me-7單克隆抗體同不同奈瑟氏屬菌種間的反應性
(表2的腳注)也用二種方法測試了以下奈瑟氏屬菌和其它細菌并且結果為陰性1種灰色奈瑟氏球菌，1種黃色奈瑟氏球菌，1種淺黃色奈瑟氏球菌，2種粘液奈瑟氏球菌，4種深黃/干燥奈瑟氏球菌，1種深黃奈瑟氏球菌，1種干燥奈瑟氏球菌，1種微黃奈瑟氏球菌，1種糞產堿菌(ATCC8750)，1種百日咳博德特氏菌(ATCC 9340)，1種支氣管炎博德特氏菌，1種弗氏檸檬酸菌(ATCC 2080)，1種遲鈍愛德華氏菌(ATCC 1594)，1種大腸桿菌，1種氣味黃桿菌，流感嗜血桿菌類型b的一種(Eagan株)，1種肺炎克氏桿菌(ATCC 13883)，1種雷氏變形菌(ATCC 25932)，1種普通變形菌(ATCC 13315)，1種綠膿桿菌(ATCC 9027)，1種鼠傷寒沙門氏菌(ATCC 14028)，1種粘質沙雷氏菌(ATCC 8100)，1種弗氏志賀氏菌(ATCC 12022)，1種索氏志賀氏菌(ATCC 9290)，和1種嗜麥芽黃單孢菌。
結論是，DNA雜交實驗清楚地表明編碼腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的基因在病原性奈瑟氏菌中高度保守。進一步說，所得結果清楚地顯示出DNA探針可以成為快速和直接檢測臨床標本中的病原性奈瑟氏細菌的有用的工具。該探針甚至可進一步精制為可區分腦膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌。實施例5 單克隆抗體的細菌裂解性及其保護性特征仿照以前講述的方法〔Brodeur等，感染與免疫50，510頁(1985)；Martm等，感染與免疫60，2718(1992)〕，在體外估測純化的腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白特異的單克隆抗體的裂解細菌的能力。在存在有豚鼠血清補體的情況下，純化的單克隆抗體Me-1和Me-7可有效殺滅腦膜炎奈瑟氏球菌608B株。相對較低濃度的每種單克隆抗體均可減少多于50％的活細菌。用較高濃度的純化的單克隆抗體Me-1和Me-7導致細菌克隆形成單位數急劇減少(至99％)。重要的是，這些單克隆抗體的殺菌活動是補體依賴性的，因為在56℃加熱30分鐘熱滅活豚鼠血清后，殺菌活性完全消失。其它單克隆抗體對于同一細菌株未顯示出重要的殺菌活性。幾個實驗的組合，有代表性的結果于圖7中給出，其中Me-7的結果同Me-1的結果相一致。所示的Me-2的結果具代表性且同其它單克隆抗體Me-3，Me-5和Me-6所得的結果一致。
先前由發明者之一所描述的鼠的感染模型〔Brodeur等，感染與免疫50，510頁(1985)；Brodeur等，加拿大微生物學雜志32，33頁(1986)〕被用于測算每種單克隆抗體的保護性。簡要地說，在細菌攻擊前18小時，用600ml的含單克隆抗體的腹水液對Balb/c小鼠進行腹膜內注射。然后用含有4％粘蛋白(Sigma)，1.6％血紅蛋白(Sigma)及1000個克隆形成單位的腦膜炎奈瑟氏球菌608B株的懸液1ml對小鼠進行攻擊。幾個實驗的總結果列于表3中。重要的是要注意只有具有菌裂解能力的單克隆抗體Me-1和Me-7可以保護小鼠抗實驗用腦膜炎奈瑟氏球菌的侵染。事實上，在細菌攻擊前注射含這二種單克隆抗體的腹水液可大大提高Balb/c小鼠的存活率，至70％或更多，而接受600mlsp 2/0誘導腹水液或600m1含有無關單克隆抗體的腹水液的對照組群體的存活率僅只9％。結果也顯示了在細菌攻擊前18小時注射400Hg的蛋白A純化的Me-7可使80％的小鼠存活。其后做的實驗是用來決定保護50％的小鼠存活所需的最低抗體濃度。對于其它的腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白特異性單克隆抗體，觀察到較低的存活率從20％到40％。表3 抗腦膜炎奈瑟氏球菌608B株(B2aP1，2)的腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白特異的單克隆抗體的免疫保護能力的評估
結論是，這些結果清楚地表明腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的特異性抗體可有效地保護小鼠以抵抗實驗中的致死的菌的攻擊。由抗原誘導的保護性抗體是最重要的標準之一，此標準用來確定是否再進行進一步的潛在疫苗候選者的研究。實施例6 用純化的重組22kDa表面蛋白免疫后引起的抗細菌攻擊的保護純化的重組22kDa表面蛋白按照實施例3中提供的方案制備，然后用于免疫Balb/c小鼠以確定其對致死量的腦膜炎奈瑟氏球菌608B株(B2aP1.2)攻擊的保護效果。在所進行的實驗中，為了保證在疫苗制備中不含有其它腦膜炎抗原，決定用純化的重組蛋白代替天然的腦膜炎蛋白。用于這些實驗中的感染小鼠的模型在以前已被其中的一個發明人所描述〔Brodeur等，感染與免疫50，510頁(1985)；Brodeur等，加拿大微生物學雜志32，33頁(1986)〕。每只小鼠用100ml的含10或20μg純化的重組22kDa表面蛋白的抗原制備物皮下注射三次，注射間隔為3周。Quil A用作這些實驗中的佐劑，其濃度為每次注射25μg。對照組小鼠按同樣的步驟注射，注射的是10或20μg的BSA，20μg濃縮的大腸桿菌BL 21(DE 3)株的培養物上清，該大腸桿菌所帶質粒pWKS30上無編碼腦膜炎奈瑟氏球菌蛋白的基因插入，上述大腸桿菌的制備方法見實施例3中。或是向對照組注射磷酸鹽緩沖液。在每次注射前，均取每只鼠的血清樣本以便分析抗重組蛋白的免疫反應的發展過程。第三次免疫后2周，所有小鼠均腹膜內注射1ml含1000個克隆形成單位的腦膜炎奈瑟氏球菌608B株的懸液，懸液中還含4％粘蛋白(Sigma)和1.6％的血紅蛋白(Sigma)。
這些實驗的結果列于表4中。80％的用純化的重組22kDa表面蛋白免疫過的小鼠在細菌攻擊后存活下來，而對照組中存活率僅0％到42％。重要的是，對照組中注射濃縮的大腸桿菌培養上清的小鼠并不能抵抗細菌的攻擊。后一結果清楚地表明培養基中的成分或純化后少量留存的大腸桿菌的抗原并不是所觀察到的抗腦膜炎奈瑟氏球菌的原因。表4 用純化的重組22kDa表面蛋白免疫后獲得的抵抗其后的腦膜炎雙球菌608B株(B2aP1.2)攻擊的保護作用
結論純化的重組22kDa表面蛋白的注射可極大地保護被免疫鼠，以抵御由腦膜炎奈瑟氏球菌引起的致死性感染的發生依據本發明，抗體是以由鼠雜交瘤細胞系產生的單克隆抗體Me-1和Me-7為例，此二抗體已于1995年7月21日存入美國馬里蘭州洛克維爾的美國典型培養物保藏中心(ATCC)。保藏號是HB 11959(Me-1)和HB 11958(Me-7)。實施例7 腦膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌的其它株的序列分析按實施例3中所述，從不同株的腦膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌的基因組DNA中分離含有編碼22kDa表面蛋白基因的2.75kb的Cla I消化的DNA片段。a)MCH 88株MCH 88株(臨床分離物)的核酸序列如圖8中所示(SEQ ID NO3)。根據608B株得到的實驗證據(實施例3)推導出假定的先導肽序列，對應于氨基酸-19至-1(M-K-K-A-L-A-A-L-I-A-L-A-L-P-A-A-A-L-A)。搜索已建立的數據庫后證明從腦膜炎奈瑟氏球菌MCH 188株(SEQID NO4)得到的22kDa表面蛋白或其基因(SEQ ID NO3)以前未有報道。b)Z4063Z4063株〔Wang J.F.等，感染與免疫60，5267頁(1992)〕的核酸序列列于圖9中(SEQ ID NO5)根據608B株得到的實驗證據(實施例3)推導出假定的先導肽序列，對應于氨基酸-19到-1(M-K-K-A-L-A-T-L-I-A-L-A-L-P-A-A-A-L-A)。搜索已建立的數據庫后證明從腦膜炎奈瑟氏球菌Z4063株(SEQ ID NO6)得到的22kDa表面蛋白或其基因(SEQ ID NO5)以前未有報道。c)淋病奈瑟氏球菌b2株淋病奈瑟氏球菌b2株(血清型1奈瑟氏菌國家基金中心，LCDC.渥太華，加拿大)的核酸序列列于圖10中(SEQID NO7)。根據608株(實施例3)得到的實驗證據，推導出假定的先導肽序列，對應于氨基酸-19到-1(M-K-K-A-L-A-A-L-I-A-L-A-L-P-A-A-A-L-A)。搜索已建立的數據庫后證明從淋病奈瑟氏球菌b2株(SEQ ID NO8)得到的22kDa表面蛋白或其基因(SEQ ID NO7)以前未有報道。
圖11示已檢測的所有四個菌株的DNA序列中的相同的序列。MCH88株在217位核苷酸處有一個密碼子(TCA)的插入，但總的來說，四種菌株有驚人的同源性。
圖12示四個菌株不推得的氨基酸序列的同源性。在四個菌株中，有大于90％的相同性。實施例8 兔和猴子對腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的免疫反應用重組22kDa蛋白免疫兔和猴以估測定除鼠之外的物種中的抗體反應。a)兔用帶有質粒pN2202或對照質粒pWKS30的大腸桿菌JM 109株外膜制備物免疫雄性新西蘭兔(菌株和質粒在實施例3中描述)。按以前由發明者所述的方法〔Brodeur等，Infect感染與免疫50，510頁(1985)〕用氯化鋰抽提得到外膜制備物。制備物中蛋白的成分用適用于膜組分的Lowry法確定〔Lowry等，生物化學雜志193，265(1951)〕。用上述的150μg的其中一種外膜制備物對兔進行皮下和幾個位點的肌內注射二次，間隔為3周。QuilA用作這些免疫實驗的佐劑，終濃度為20％(體積比)。特定體液反應的形成用ELISA和Western免疫印跡，按發明者以前描述的方法進行分析〔Brodeur等，感染與免疫50，510頁(1985)；Martin等，歐洲免疫學雜志18，601，(1988)〕，其中ELISA的包被抗原用的是從腦膜炎奈瑟氏球菌608B株(B2aP1.2)抽提制得的外膜制備物，堿性磷酸酶或過氧化物酶標記的驢抗兔免疫球蛋白用于這些方法中(Jackson Immuno ResearchLaboratories，West Grove，PA)。
同QuilA佐劑一起注射含有22kDa重組蛋白的大腸桿菌外膜制備物在兔中誘導了強的特異性體液反應，ELISA測定其1/32,000(圖13)。注射重組22kDa蛋白后誘導產生的抗體同純化的重組22kDa蛋白起反應，但更重要的是，它們也能識別腦膜炎奈瑟氏球菌外膜上表達，折疊和鑲嵌的天然蛋白。Western免疫印跡實驗清楚地表明第二次注射后產生的抗體可在硝基膜上識別Mab Me-2(實施例2中描述)也識別的同一條蛋白帶，而Me-2是特異性抗22kDa蛋白的。b)猴子向二只食蟹猴分別注射100μg(K28)和200μg(I 276)的親合層析純化的重組22kDa蛋白，共注射二次。用于生產和純化大腸桿菌BL21 DE 3株的蛋白的方法在實施例3中已敘述過。終濃度為20％(體積比)的Alhydrogel(Cedarlane Laboratories，Hornby，Ont.，Canada)用作這些免疫試驗的佐劑。對猴子進行間隔為三周的二次肌內注射。對照組猴子(K65)用一不相關的重組蛋白制備物按同樣的步驟免疫。按前述方法分析血清。在這些方法中，用了堿性磷酸酶或過氧化物酶標記的羊抗人免疫球蛋白(Jackson ImmunoResearch Laboratories.WestGrove，PA)。
用每次注射100μg)的純化的蛋白免疫的K28猴的特異的抗體反應較用200μg的蛋白注射的I276猴的特異的抗體反應出現得快且較強烈(圖14)。第一次注射后21天，用Western免疫印跡可檢測出被免疫猴子的血清中出現天然22kDa蛋白的特異性抗體，但在對照猴的血清中，二次對照抗原注射后仍舊無抗體出現。結論實施例2和5中所示的數據清楚地表明注射重組22kDa蛋白可在小鼠中誘導直接抗腦膜炎奈瑟氏球菌的保護性體液反應。更重要的是，本例中的結果顯示這種免疫反應并非限于一個物種，該重組表面蛋白也可刺激諸如兔和猴等其它物種的免疫系統。實施例9 22kDa腦膜炎奈瑟氏球菌蛋白的表位圖譜用一個發明者所描述的方法可以對腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的表位作圖〔Martin等，感染與免疫(1991)591457～1464〕。用18個相重疊的合成肽成功地對線性表位進行了鑒定，這些合成肽覆蓋了來自菌株608B(圖15)的腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa蛋白的整個序列，并且和此蛋白免疫后得到了超免疫血清。22kDa蛋白上的免疫決定部分的鑒定有助于新的有效的疫苗的設計。進一步地，這些B細胞表位的定位也提供了腦膜炎奈瑟氏球菌外膜上的該蛋白的結構構型的有價值的信息。
所有肽均由BioChem Immunosystems Inc.公司(蒙特利爾，加拿大)用Applied Biosystems(Foster City Calif)的自動肽合成儀合成。合成肽用反相高壓液相色譜純化。肽CS-845，CS-847，CS-848，CS-851，CS-852和CS-856(圖15)溶于小體積的6M鹽酸胍(J.T.Baker)或二甲基亞砜(J.T.Baker)中。這些肽然后用蒸餾水調至1mg/ml。所有其它肽均溶于蒸餾水中并調至1mg/ml。
在pH 9.6的50mM碳酸鹽緩沖液中將合成肽以50μg/ml的濃度包被到微滴定板上(Immulon 4，Dynatech Laboratories Inc，Chantilly，VA)以進行肽的酶連免疫吸附實驗(ELISA)。室溫溫育過夜后，滴定板用含0.05％(體積比)吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗，然后用含0.5％(重量體積比)牛血清白蛋白(Sigma)的PBS封閉。用親合純化的重組22kDa表面蛋白免疫小鼠或猴子，然后取其血清并將之稀釋，ELISA板的每個孔中均加入100μl的稀釋物并在37℃溫育1小時。將板洗三次，再加上按生產商建議稀釋后的連有堿性磷酸酶的羊抗鼠或抗人的免疫球蛋白100μl(Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)。37℃溫育1小時后，洗板并加入100μl含1mg/ml的對-硝基-苯基磷酸(Sigma)的二乙醇胺(10％(體積比)pH9.8)。60分鐘后，用微滴定板閱讀儀讀取反應的光密度變化(λ＝410nm)。
用親合層析純化的重組22kDa蛋白免疫鼠和猴后得到的抗血清(實施例8)與18個相互重疊的合成肽一起成功地用于定位蛋白上的B細胞表位，這些表位成簇位于該蛋白的三個抗原結構域中。
第一個區域在氨基酸殘基51和86間。用不同算法進行計算機分析提示該區最有可能在免疫上是重要的，因為此區為親水性且表面暴露。進一步，比較列于圖12中的四種蛋白序列表明其中的一個主要變化，即在73位插入一個氨基酸殘基，也是位于該區。
抗血清鑒別出的第二個抗原區域位于氨基酸殘基110和140間。有趣的是，序列分析表明在四種蛋白序列中不保守的14個氨基酸中的7個成簇位于蛋白的此區內。
第三個抗原結構域位于該蛋白的一個高保守的區域內，在氨基酸31和55間，該區僅被猴子的血清識別。實施例10 大規模生產該22kDa表面蛋白的熱-誘導表達載體將編碼腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的基因插入質粒p629中〔George等，生物和工程(Bio/technology)5600～603(1981)〕。質粒p629用pL啟動子來控制22kDa表面蛋白的合成，同時該質粒帶有噬菌體λcI 857溫度敏感抑制基因的一斷序列，但該基因的功能性Pr啟動子已被刪除。溫度從30℃變化至高于38℃可以失活cI 857阻遏物，結果是質粒編碼的該蛋白就會表達。在大規模發酵中，用溫度改變來誘導大腸桿菌內基因的表達是有利的，因其可用現代發酵罐簡單地完成。其它的誘導質粒一般需向培養基中加入特殊的分子例如乳糖或異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)以誘導目的基因的表達。
用PCR從腦膜炎奈瑟氏球菌608B株的基因組DNA中擴增出一540核苷酸的片段，所用引物為OCRR85′-TAATAGATCTATGAAAAAAGCACTTGCCAC-3′和OCRR93′-CACGCGCAGTTTAAGACTTCTAGATTA-5′。此二引物同22kDa基因的二端的核苷酸序列相對應。為了向在PCR產物的克隆，引物上加入了BgI II(AGATCT)的位點。PCR產物用瓊脂糖凝膠純化后用BglII消化。然后將此525堿基對的Bgl II片段插入質粒p629的Bgl II和BamHI位點上。含有PCR產物插入的質粒定名為pNP2204并用于轉化大腸桿菌DH5αF′IQ株。質粒pNP2204的部分圖譜列于圖16中。得到的菌斑用實施例2中所述的腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白特異的單克隆抗體去篩選。所得克隆的Western印跡分析清楚地表明由大腸桿菌合成的蛋白是完整的且其在SDS-PAGE膠上的遷移同天然腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的相同。從所選克隆提取DNA產將之測序。質粒中的插入片段的核酸序列同圖1中所示的編碼腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa蛋白的基因的序列完全一致。
為了研究該22kDa表面蛋白的合成水平，溫度誘導質粒pNP2204用于轉化下列大腸桿菌菌株W3110，JM105，BL21，TOPP1，TOPP2和TOPP3。確定了每株菌中22kDa表面蛋白的合成水平及其在不同細胞級分中的定位。在LB肉湯培養基(Gibco BRL，Life TechnologiesGrand Island，NY)中用三角瓶振搖培養表明溫度從30℃升至39℃可有效誘導該基因的表達。合成水平的時間過程測定表明在誘導后30分鐘該蛋白就出現并且該蛋白的量在誘導期穩步增加，SDS-PAGE凝膠的結果同前述結果一致。對于大腸桿菌W 3110和TOPPl株，測出每升培養物中22kDa蛋白的表達水平在8到10mg間。在此二株菌中，大部分的22kDa蛋白是整合入細菌外膜中。實施例11 腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa蛋白的純化因為發現大部分的22kDa蛋白是嵌于大腸桿菌菌株的外膜上，所以此處的純化方案不同于實施例3中的那一個，在實施例3中，大量蛋白被釋放到培養物上清中。帶有質粒pNP2204的大腸桿菌W3110或TOPPl株，30℃下的過夜培養物接種到含50μg/ml的氨芐(Sigma)的LB肉湯培養基中，30℃下旋轉培養(250rpm)直至其菌體密度為0.6(λ＝600nm)，在此點，培養溫度變為39℃并培養3到5小時也誘導蛋白的產生。4℃下以8000g離心15分鐘收集菌體，然后在pH7.3的磷酸緩沖液(PBS)中洗二次。菌體用超聲破碎(沖擊破碎或用細菌破碎儀進行機械破碎也可)。未破碎細胞以5,000g離心5分鐘除去并棄掉。在10℃下，10,000g離心1小時將外膜同胞質且分分離。含膜的沉淀塊用小量的pH7.3的PBS重懸。為了將22kDa表面蛋白從膜上溶解下來，需用諸如Empigem BB(Calbiochem Co.，Lajolla，CA)，Zwiffergent-3.14(Calbiochem Co.，)或β-辛基葡糖苷(Sigma)等去污劑。加入到膜級分的去污劑的終濃度為3％，混合物于20℃溫育1小時。不溶物通過10℃下100,000離心一小時除去。
22kDa蛋白可被三種去污劑有效溶解，但β-辛基葡糖苷的優點在于用其可以輕易除去幾種不想要的膜蛋白，因為這些膜蛋白不溶于它，這樣就可用離心將這些膜蛋白從上清中分離。含22kDa蛋白的上清用PBS緩沖液反復透析以去除去污劑。可用蛋白酶K處理(實施例1中所述)以進一步從22kDa表面蛋白制備物中去除不想要的蛋白。用硫酸銨或有機溶劑分布沉淀及超濾是另外的二步，此二步可以除去不想要的核酸及脂多糖。此二步過后，可用凝膠過濾和離子交換層析來得到純的22kDa蛋白。實施例3中所述的親合層析，也可用來純化此22kDa蛋白。實施例12 用22kDa蛋白作為人的疫苗為了制備一個為人所用的疫苗，需從此處所描述的多肽中選擇合適的22kDa表面蛋白抗原。比如，本領域的技術人員可以設計出一種同此含有免疫原表位的22kDa多肽或其片段有關的疫苗。分子生物學技術的應用特別適合于制備基本上純的重組抗原。
疫苗的組分可采用不同的形式。這些包括，如固體、半固體和液體劑量形式，諸如粉劑、液體溶液或懸液及脂質體。基于我們的信念，本發明的22kDa表面蛋白抗原當施用于人時可誘導保護性免疫反應，本發明的組合物將同那些用于免疫人的其它蛋白和多肽相似，比如破傷風和白喉。因此，本發明的組合物將優選地包括一種藥理學可接受的佐劑，比如不完全弗氏佐劑、氫氧化鋁、胞壁肽、水油乳劑、脂質體、ISCOM或CTB，或是非毒性B亞基形式霍亂毒素。最優選地是該組合物包括水油乳劑或氫氧化鋁作為佐劑。
該組合物將以多種藥理學可接受形式中的一種施用于患者，這些形式包括肌內、真皮內、皮下或表面施用。優選地，該疫苗將肌內施用。
一般地講，用藥量將包括初次注射，大多數是同佐劑一起使用，每位患者用約0.01到10mg，更好的是用0.1到1.0mg的22kDa表面蛋白抗原，其后最有可能的是再進行一次或多次的加強劑量注射。優選地，加強注射將在初次注射后1到6個月進行。
疫苗發展中需考慮的一個問題是粘膜免疫。理想的粘膜免疫疫苗是經口服或鼻內使用一劑或幾劑后，能誘導產生系統免疫，并能在適當的表面誘導產生保護性抗體。粘膜疫苗組合物可以包括佐劑，惰性顆粒載體或重組活載體。
本發明的抗22kDa表面蛋白抗體在被動免疫治療中有用，并在免疫預防感染人的腦膜炎奈瑟氏球菌或相關細菌如淋病奈瑟氏球菌或乳糖奈瑟氏球菌中有用。用于被動免疫的劑量形式及制度同其它被動免疫治療疫苗相似。
根據本發明，用作例子的抗體為雜交瘤產生的MABs Me-1和Me-7抗體，此二抗體已于1995年7月21日存入美國馬里蘭州洛克維爾的美國典型培養物保藏中心(ATCC)中，并被鑒定為鼠雜交瘤細胞系，分別為Me-1和Me-7。這些保藏物的保藏號是HB 11959(Me-1)和HB 11958(Me-7)。
我們此處描述的是本發明的許多具體實施方案，很明顯，可通過將基本實施方案改變來提供運用本發明中的組合物及過程的其它的實施方案。因此，本發明范圍包括所有的變化的實施方案及變體是完全可以理解的，這已在前面的特別聲明中定義，并將在附于后面的權利要求中定義；并且本發明不限于此處以實施例方式列出的特定的實施方案。
序列表(1)一般信息(i)申請人Brodeur，Bernard RMartin， DenisHamel， JoseeRioux， Clement(ii)發明標題腦膜炎奈瑟氏球菌抗蛋白酶K降解的表面蛋白(iii)序列數26(iv)通訊地址(A)地址Goudreau Gage Dubuc & Martineau Walker(B)街道800 Place Victoria，Suite 3400，Tour de la Bourse(C)城市蒙特利爾(D)州魁北克(E)國家加拿大(F)郵編H4Z 1E9(v)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM-個人計算機兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatertIn Release #1.0，Version 1.25版(vi)當前申請數據(A)申請號(B)申請日期(C)類別(vii)在先申請信息(A)申請號US 08/406,362(B)申請日期1995年3月17日(vii)在先申請信息(A)申請號US (PROVIS)60/001,983(B)申請日期1995年8月4日(viii)律師/事務所信息(A)名字Leclerc/Dubuc/Prince，Alain/Jean/Gaetan
(C)文獻/目錄號BIOVAC-1 PCT(ix)通訊信息(A)電話514-397-7400(B)電傳514-397-4382(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度830堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假說無(iv)反義無(vi)來源(A)生物體腦膜炎奈瑟氏球菌(B)株608B(ix)性質(A)名稱/鍵CDS(B)位置143..667(ix)性質(A)名稱/鍵信號肽(B)位置143..199(ix)性質(A)名稱/鍵成熟肽(B)位置200..667(xi)序列描述SEQ ID NO1TCGGCAAAGC AGCCGGATAC CGCTACGTAT CTTGAAGTAT TGAAAATATT ACGATGCAAA 60AAAGAAAATT TAAGTATAAT ACAGCAGGAT TCTTTAACGG ATTCTTAACA ATTTTTCTAA120CTGACCATAA AGGAACCAAA AT ATG AAA AAA GCA CTT GCC ACA CTG ATT GCC 172Met Lys Lys Ala Leu Ala Thr Leu Ile Ala-19 -15 -10CTC GCT CTC CCG GCC GCC GCA CTG GCG GAA GGC GCA TCC GGC TTT TAC 220Leu Ala Leu Pro Ala Ala Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe Tyr-5 1 5GTC CAA GCC GAT GCC GCA CAC GCA AAA GCC TCA AGC TCT TTA GGT TCT268Val Gln Ala Asp Ala Ala His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser10 15 20GCC AAA GGC TTC AGC CCG CGC ATC TCC GCA GGC TAC CGC ATC AAC GAC316Ala Lys Gly Phe Ser Pro Arg Ile Ser Ala Gly Tyr Arg Ile Asn Asp25 30 35CTC CGC TTC GCC GTC GAT TAC ACG CGC TAC AAA AAC TAT AAA GCC CCA364Leu Arg Phe Ala Val Asp Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro40 45 50 55TCC ACC GAT TTC AAA CTT TAC AGC ATC GGC GCG TCC GCC ATT TAC GAC412Ser Thr Asp Phe Lys Leu Tyr Ser Ile Gly Ala Ser Ala Ile Tyr Asp60 65 70TTC GAC ACC CAA TCG CCC GTC AAA CCG TAT CTC GGC GCG CGC TTG AGC460Phe Asp Thr Gln Ser Pro Val Lys Pro Tyr Leu Gly Ala Arg Leu Ser75 80 85CTC AAC CGC GCC TCC GTC GAC TTG GGC GGC AGC GAC AGC TTC AGC CAA508Leu Asn Arg Ala Ser Val Asp Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Gln90 95 100ACC TCC ATC GGC CTC GGC GTA TTG ACG GGC GTA AGC TAT GCC GTT ACC556Thr Ser Ile Gly Leu Gly Val Leu Thr Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr105 110 115CCG AAT GTC GAT TTG GAT GCC GGC TAC CGC TAC AAC TAC ATC GGC AAA604Pro Asn Val Asp Leu Asp Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr Ile Gly Lys120 125 130 135GTC AAC ACT GTC AAA AAC GTC CGT TCC GGC GAA CTG TCC GTC GGC GTG652Val Asn Thr Val Lys Asn Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Val Gly Val140 145 150CGC GTC AAA TTC TGATATGCGC CTTATTCTGC AAACCGCCGA GCCTTCGGCG704Arg Val Lys Phe155GTTTTGTTTT CTGCCACCGC AACTACACAA GCCGGCGGTT TTGTACGATA ATCCCGAATG 764CTGCGGCTTC TGCCGCCCTA TTTTTTGAGG AATCCGAAAT GTCCAAAACC ATCATCCACA824ACA830(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度174氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Lys Lys Ala Leu Ala Thr Leu Ile Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala-19 -15 -10 -5Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe Tyr Val Gln Ala Asp Ala Ala1 5 10His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro15 20 25Arg Ile Ser Ala Gly Tyr Arg Ile Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp30 35 40 45Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu50 55 60Tyr Ser Ile Gly Ala Ser Ala Ile Tyr Asp Phe Asp Thr Gln Ser Pro65 70 75Val Lys Pro Tyr Leu Gly Ala Arg Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Val80 85 90Asp Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Gln Thr Ser Ile Gly Leu Gly95 100 105Val Leu Thr Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr Pro Asn Val Asp Leu Asp110 115 120 125Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr Ile Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn130 135 140Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Val Gly Val Arg Val Lys Phe145 150 155(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度710堿基對(B)類型核酸(C)鏈雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假說無(iv)反義無(vi)來源(A)生物體腦膜炎奈瑟氏球菌(B)株MCH 88(ix)性質(A)名稱/鍵CDS(B)位置116..643(ix)性質(A)名稱/鍵信號肽(B)位置116..172(ix)性質(A)名稱/鍵成熟肽
(B)位置173..643(xi)序列描述SEQ ID NO3GTATCTTGAG GCATTGAAAA TATTACAATG CAAAAAGAAA ATTTCAGTAT AATACGGCAG 60GATTCTTTAA CGGATTCTTA ACCATTTTTC TCCCTGACCA TAAAGGAATC AAGAT ATG 118Mer-19AAA AAA GCA CTT GCC GCA CTG ATT GCC CTC GCC CTC CCG GCC GCC GCA166Lys Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala Ala-15 -10 -5CTG GCG GAA GGC GCA TCC GGC TTT TAC GTC CAA GCC GAT GCC GCA CAC214Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe Tyr Val Gln Ala Asp Ala Ala His1 5 10GCC AAA GCC TCA AGC TCT TTA GGT TCT GCC AAA GGC TTC AGC CCG CGC262Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro Arg15 20 25 30ATC TCC GCA GGC TAC CGC ATC AAC GAC CTC CGC TTC GCC GTC GAT TAC310Ile Ser Ala Gly Tyr Arg Ile Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp Tyr35 40 45ACG CGC TAC AAA AAC TAT AAA CAA GTC CCA TCC ACC GAT TTC AAA CTT358Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Gln Val Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu50 55 60TAC AGC ATC GGC GCG TCC GCC ATT TAC GAC TTC GAC ACC CAA TCC CCC406Tyr Ser Ile Gly Ala Ser Ala Ile Tyr Asp Phe Asp Thr Gln Ser Pro65 70 75GTC AAA CCG TAT CTC GGC GCG CGC TTG AGC CTC AAC CGC GCC TCC GTC454Val Lys Pro Tyr Leu Gly Ala Arg Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Val80 85 90GAC TTT AAC GGC AGC GAC AGC TTC AGC CAA ACC TCC ACC GGC CTC GGC502Asp Phe Asn Gly Ser Asp Ser Phe Ser Gln Thr Ser Thr Gly Leu Gly95 100 105 110GTA TTG GCG GGC GTA AGC TAT GCC GTT ACC CCG AAT GTC GAT TTG GAT550Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr Pro Asn Val Asp Leu Asp115 120 125GCC GGC TAC CGC TAC AAC TAC ATC GGC AAA GTC AAC ACT GTC AAA AAT598Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr Ile Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn130 135 140GTC CGT TCC GGC GAA CTG TCC GCC GGC GTA CGC GTC AAA TTC TGATATACGC 650Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ala Gly Val Arg Val Lys Phe145 150 155GTTATTCCGG AAACCGCCGA GCCTTTCGGC GGTTTTGTTT TCCGCCGCCG CAACTACACA 710(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度175氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Lys Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala-19 -15 -10 -5Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe Tyr Val Gln Ala Asp Ala Ala1 5 10His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro15 20 25Arg Ile Ser Ala Gly Tyr Arg Ile Ash Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp30 35 40 45Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Gln Val Pro Ser Thr Asp Phe Lys50 55 60Leu Tyr Ser Ile Gly Ala Ser Ala Ile Tyr Asp Phe Asp Thr Gln Ser65 70 75Pro Val Lys Pro Tyr Leu Gly Ala Arg Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser80 85 90Val Asp Phe Asn Gly Ser Asp Ser Phe Ser Gln Thr Ser Thr Gly Leu95 100 105Gly Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr Pro Asn Val Asp Leu110 115 120 125Asp Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr Ile Gly Lys Val Asn Thr Val Lys130 135 140Asn Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ala Gly Val Arg Val Lys Phe145 150 155(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度850堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假說無(iv)反義無(vi)來源(A)生物體腦膜炎奈瑟氏球菌(B)株Z4063(ix)性質(A)名稱/鍵CDS(B)位置208..732(ix)性質(A)名稱/鍵信號肽(B)位置208..264
(ix)性質(A)名稱/鍵成熟肽(B)位置265..732(xi)序列描述SEQ ID NO5CACCCATCCG CCGCGTGATG CCGCCACCAC CATTTAAAGG CAACGCGCGG GTTAACGGCT 60TTGCCGTCGG CAAAGCAGCC GGATACCGCT ACGTATCTTG AAGTATTAAA AATATTACGA 120TGCAAAAAGA AAATTTAAGT ATAATAAAGC AGAATTCTTT AACGGATTCT TAACAATTTT 180TCTAACTGAC CATAAAGGAA CCAAAAT ATG AAA AAA GCA CTT GCC ACA CTG 231Met Lys Lys Ala Leu Ala Thr Leu-19 -15ATT GCC CTC GCT CTC CCG GCC GCC GCA CTG GCG GAA GGC GCA TCC GGC 279Ile Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly-10 -5 1 5TTT TAC GTC CAA GCC GAT GCC GCA CAC GCA AAA GCC TCA AGC TCT TTA 327Phe Tyr Val Gln Ala Asp Ala Ala His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu10 15 20GGT TCT GCC AAA GGC TTC AGC CCG CGC ATC TCC GCA GGC TAC CGC ATC 375Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro Arg Ile Ser Ala Gly Tyr Arg Ile25 30 35AAC GAC CTC CGC TTC GCC GTC GAT TAC ACG CGC TAC AAA AAC TAT AAA 423Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys40 45 50GCC CCA TCC ACC GAT TTC AAA CTT TAC AGC ATC GGC GCG TCC GCC ATT 471Ala Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu Tyr Ser Ile Gly Ala Ser Ala Ile55 60 65TAC GAC TTC GAC ACC CAA TCG CCC GTC AAA CCG TAT CTC GGC GCG CGC 519Tyr Asp Phe Asp Thr Gln Ser Pro Val Lys Pro Tyr Leu Gly Ala Arg70 75 80 85TTG AGC CTC AAC CGC GCC TCC GTC GAC TTG GGC GGC AGC GAG AGC TTC 567Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Val Asp Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe90 95 100AGC CAA ACC TCC ACC GGC CTC GGC GTA TTG GCG GGC GTA AGC TAT GCC 615Ser Gln Thr Ser Thr Gly Leu Gly Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Ala105 110 115GTT ACC CCG AAT GTC GAT TTG GAT GCC GGC TAC CGC TAC AAC TAC ATC 663Val Thr Pro Asn Val Asp Leu Asp Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr Ile120 125 130GGC AAA GTC AAC ACT GTC AAA AAC GTC CGT TCC GGC GAA CTC TCC GCC 711Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ala135 140 145GGT GTG CGC GTC AAA TTC TGATATGCGC CTTATTCTGC AAACCGCCGA759Gly Val Arg Val Lys Phe150 155GCCTTCGGCG GTTTTGTTTT CTGCCACCGC AACTACACAA GCCGGCGGTT TTGTACGATA 819ATCCCGAATG CTGCGGCTTC TGCCGCCCTA T 850(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征
(A)長度174氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Lys Lys Ala Leu Ala Thr Leu Ile Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala-19 -15 -10 -5Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe Tyr Val Gln Ala Asp Ala Ala1 5 10His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro15 20 25Arg Ile Ser Ala Gly Tyr Arg Ile Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp30 35 40 45Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu50 55 60Tyr Ser Ile Gly Ala Ser Ala Ile Tyr Asp Phe Asp Thr Gln Ser Pro65 70 75Val Lys Pro Tyr Leu Gly Ala Arg Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Val80 85 90Asp Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Gln Thr Ser Thr Gly Leu Gly95 100 105Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr Pro Asn Val Asp Leu Asp110 115 120 125Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr Ile Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn130 135 140Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ala Gly Val Arg Val Lys Phe145 150 155(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度810堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假說無(iv)反義無(vi)來源(A)生物體淋病奈瑟氏球菌(B)株b2
(ix)性質(A)名稱/鍵CDS(B)位置241..765(ix)性質(A)名稱/鍵信號肽(B)位置241..297(ix)性質(A)名稱/鍵成熟肽(B)位置298..765(xi)序列描述SEQ ID NO7CCCCGCCTTT GCGGTTTTTT CCAAACCGTT TGCAAGTTTC ACCCATCCGC CGCGTGATGC 60CGCCGTTTAA GGGCAACGCG CGGGTTAACG GATTTGCCGT CGGCAAAGCA GCCGGATGCC 120GCCGCGTATC TTGAGGCATT GAAAATATTA CGATGCAAAA AGAAAATTTC AGTATAATAC 180GGCAGGATTC TTTAACGGAT TATTAACAAT TTTTCTCCCT GACCATAAAG GAACCAAAAT 240ATG AAA AAA GCA CTT GCC GCA CTG ATT GCC CTC GCA CTC CCG GCC GCC288Met Lys Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala-19 -15 -10 -5GCA CTG GCG AAA GGC GCA TCC GGC TTT TAC GTC CAA GCC GAT GCC GCA336Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe Tyr Val Gln Ala Asp Ala Ala1 5 10CAC GCC AAA GCC TCA AGC TCT GGT GGT TCT GCC AAA GGC TTC AGC CCG384His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro15 20 25CGC ATC TCC GCA GGC TAC CGC ATC AAC GAC CTC CGC TTC GCC GTC GAT432Arg Ile Ser Ala Gly Tyr Arg Ile Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp30 35 40 45TAC ACG CGC TAC AAA AAC TAT AAA GCC CCA TCC ACC GAT TTC AAA CTT480Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ale Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu50 55 60TAC AGC ATC GGC GCG TCC GTC ATT TAC GAC TTC GAC ACC CAA TCG CCC528Tyr Ser Ile Gly Ala Ser Val Ile Tyr Asp Phe Asp Thr Gln Ser Pro65 70 75GTC AAA CCG TAT TTC GGC GCG CGC TTG AGC CTC AAC CGC GCT TCC GCC576Val Lys Pro Tyr Phe Gly Ala Arp Leu Ser Leu Asn Arp Ala Ser Ala80 85 90CAC TTG GGC GGC AGC GAC AGC TTC AGC AAA ACC TCC GCC GGC CTC GGC624Hls Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Lys Thr Ser Ala Gly Leu Gly95 100 105GTA TTG GCG GGC GTA AGC TAT GCC GTT ACC CCG AAT GTC GAT TTG GAT672Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr Pro Asn Val Asp Leu Asp110 115 120 125GCC GGC TAC CGC TAC AAC TAC GTC GGC AAA GTC AAC ACT GTC AAA AAC720Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr Val Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn130 135 140GTC CGT TCC GGC GAA CTG TCC GCC GGC GTG CGC GTC AAA TTC TGATATACGC 772Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ala Gly Val Arg Val Lys Phe145 150 155GTTATTCCGC AAACCGCCGA GCCTTCGGCG GTTTTTTG 810(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度174氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO8Met Lys Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala-19 -15 -10 -5Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe Tyr Val Gln Ala Asp Ala Ala1 5 10His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro15 20 25Arg Ile Ser Ala Gly Tyr Arg Ile Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp30 35 40 45Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu50 55 60Tyr Ser Ile Gly Ala Ser Val Ile Tyr Asp Phe Asp Thr Gln Ser Pro65 70 75Val Lys Pro Tyr Phe Gly Ala Arg Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Ala80 85 90His Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Lys Thr Ser Ala Gly Leu Gly95 100 105Val Leu Ala Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr Pro Asn Val Asp Leu Asp110 115 120 125Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr Val Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn130 135 140Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ala Gly Val Arg Val Lys Phe145 150 155(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度16氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(vi)來源
(A)生物體腦膜炎奈瑟氏球菌(B)株608B(xi)序列描述SEQ ID NO9Met Lys Lys Ala Leu Ala Thr Leu Ile Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala1 5 10 15(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(vi)來源(A)生物體腦膜炎奈瑟氏球菌(B)株608B(xi)序列描述SEQ ID NO10Leu Ala Leu Pro Ala Ala Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe1 5 10 15(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(vi)來源(A)生物體腦膜炎奈瑟氏球菌(B)株608B(xi)序列描述SEQ ID NO11Gly Ala Ser Gly Phe Tyr Val Gln Ala Asp Ala Ala His Ala Lys1 5 10 25(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度l5氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(vi)來源(A)生物體腦膜炎奈瑟氏球菌(B)株608B(xi)序列描述SEQ ID NO12Ala Ala His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(vi)來源(A)生物體腦膜炎奈瑟氏球菌(B)株608B(xi)序列描述SEQ ID NO13Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro Arg Ile Ser Ala Gly Tyr Arg1 5 10 15(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質
(vi)來源(A)生物體腦膜炎奈瑟氏球菌(B)株608B(xi)序列描述SEQ ID NO14Ser Ala Gly Tyr Arg Ile Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp Tyr1 5 10 15(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(vi)來源(A)生物體腦膜炎奈瑟氏球菌(B)株608B(xi)序列描述SEQ ID NO15Phe Ala Val Asp Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Thr1 5 10 15(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(vi)來源(A)生物體腦膜炎奈瑟氏球菌(B)株608B(xi)序列描述SEQ ID NO16Tyr Lys Ala Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu Tyr Ser Ile Gly Ala1 5 10 15(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(vi)來源(A)生物體腦膜炎奈瑟氏球菌(B)株608B(xi)序列描述SEQ ID NO17Tyr Ser Ile Gly Ala Ser Ala Ile Tyr Asp Phe Asp Thr Gln Ser1 5 10 15(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(vi)來源(A)生物體腦膜炎奈瑟氏球菌(B)株608B(xi)序列描述SEQ ID NO18Phe Asp Thr Gln Ser Pro Val Lys Pro Tyr Leu Gly Ala Arg Leu1 5 10 15(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質
(vi)來源(A)生物體腦膜炎奈瑟氏球菌(B)株608B(xi)序列描述SEQ ID NO19Leu Gly Ala Arg Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Val Asp Leu Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(vi)來源(A)生物體腦膜炎奈瑟氏球菌(B)株608B(xi)序列描述SEQ ID NO20Ser Val Asp Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Gln Thr Ser Ile1 5 10 15(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(vi)來源(A)生物體腦膜炎奈瑟氏球菌(B)株608B(xi)序列描述SEQ ID NO21Ser Gln Thr Ser Ile Gly Leu Gly Val Leu Thr Gly Val Ser Tyr1 5 10 15(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(vi)來源(A)生物體腦膜炎奈瑟氏球菌(B)株608B(xi)序列描述SEQ ID NO22Thr Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr Pro Asn Val Asp Leu Asp Ala1 5 10 15(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(vi)來源(A)生物體腦膜炎奈瑟氏球菌(B)株608B(xi)序列描述SEQ ID NO23Val Asp Leu Asp Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr Ile Gly Lys Val1 5 10 15(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質
(vi)來源(A)生物體腦膜炎奈瑟氏球菌(B)株608B(xi)序列描述SEQ ID NO24Tyr Ile Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn Val Arg Ser Gly Glu15 10 15(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(vi)來源(A)生物體腦膜炎奈瑟氏球菌(B)株608B(xi)序列描述SEQ ID NO25Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Val Gly Val Arg Val Lys Phe1 5 10(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)長度25氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(vi)來源(A)生物體腦膜炎奈瑟氏球菌(B)株608B(xi)序列描述SEQ ID NO26Phe Ala Val Asp Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro Her Thr1 5 l0 5Asp Phe Lys Leu Tyr Ser Ile Gly Ala20 2權利要求
1.一種分離的抗原或其片段，其對于50％以上的已知的腦膜炎奈瑟氏球菌菌株是免疫可及的。
2.權利要求1的分離的抗原或其片段，其對于約99％的已知的腦膜炎奈瑟氏球菌菌株是免疫可及的。
3.權利要求1的分離的抗原或其片段，其免疫可及性按下述分析或分析的組合來確定凝集分析、ELISA分析、RIA分析、免疫印跡分析、斑點-酶分析、表面可及性法。
4.權利要求1分離的抗原或片段，其為蛋白質。
5.權利要求4的蛋白質，其分子量約為22kDa。
6.權利要求4的蛋白質，其分子量約為18kDa。
7.權利要求5的蛋白質，其氨基酸序列選自圖1(SEQ ID NO2)，圖8(SEQ ID NO4)，圖9(SEQ ID NO6)和圖10(SEQ ID NO8)的序列。
8.權利要求5中的蛋白質其具有圖1(SEQ ID NO1)的氨基酸序列。
9.權利要求5的以基本上純的形式存在的蛋白質。
10.權利要求9的蛋白質，由以下步驟獲得基本上純的形式。a)分離腦膜炎奈瑟氏球菌培養物；b)從菌體培養物分離外膜部分；并且c)從外膜部分分離所說的抗原。
11.權利要求10的蛋白質，其中的步驟(c)包括另外的在蛋白質分級分離后用蛋白酶K處理外膜部分這步。
12.一段DNA序列，其至少編碼腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的一個抗原的至少一個部分，所說的序列選自a)圖1(SEQ ID NO1)的DNA序列；b)圖8(SEQ ID NO3)的DNA序列；c)圖9(SEQ ID NO5)的DNA序列；d)圖10(SEQ ID NO7)的DNA序列；e)前述DNA序列的類似物或衍生物；f)與前述任何序列的DNA序列可簡并的DNA序列；和g)前述任何DNA序列的片段。其中所說序列編碼可表現出腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的免疫活性的產物。
13.一段DNA序列，其至少編碼腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的一個抗原的至少一個部分，所說序列選自a)圖1的DNA序列(SEQ ID NO1)；b)前述DNA序列的類似物或衍生物；c)與前述任何DNA序列可簡并的DNA序列；和d)任何的前述DNA序列的片段；其中所說的序列編碼一產物，該產物可表現出腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的免疫活性。
14.權利要求12的DNA序列，其中所說的類似物選自淋病奈瑟氏球菌的DNA。
15.權利要求12的DNA序列，其中所說類似物選自乳糖奈瑟氏球菌。
16.圖1式中的DNA序列(SEQ ID NO1)，從堿基143到667。
17.圖1式中的DNA序列(SEQ ID NO1)，從堿基200到667。
18.圖8式中的DNA序列(SEQ ID NO3)，從堿基116到643。
19.圖8式中的DNA序列(SEQ ID NO3)，從堿基173到643。
20.圖9式中的DNA序列(SEQ ID NO5)，從堿基208到732。
21.圖9式中的DNA序列(SEQ ID NO5)，從堿基265到732。
22.圖10式中的DNA序列(SEQ ID NO7)，從堿基241到765。
23.圖10式中的DNA序列(SEQ ID NO7)，從堿基298到765。
24.權利要求13的DNA序列的片段，其中所說的片段選自圖15中所示的肽之一(SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ IDNO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20，SEQID NO21，SEQ ID NO22，SEQ ID NO23，SEQ IDNO24，SEQ ID NO25和SEQ ID NO26)。
25.DNA序列的一個片段，包含圖1(SEQ ID NO1)中氨基酸31到55。
26.DNA序列的一個片段，包含圖1(SEQ ID NO1)中氨基酸51到86。
27.DNA序列的一個片段，包含圖1(SEQ ID NO1)中氨基酸110到140。
28.一種重組DNA分子，其包括選自如下的DNA序列權利要求13、16或17的DNA序列，以及與該DNA序列任意連接的一個或多個表達調控序列。
29.一種重組DNA分子，其包括選自如下的DNA序列權利要求14、15，或權利要求18～27中任意一項的DNA序列，以及與該DNA序列任意相連的一個或多個表達調控序列。
30.權利要求28的重組DNA分子，其中所說的表達調控序列為一可誘導的表達載體。
31.權利要求29的重組DNA分子，其中所說的表達調控序列是一可誘導的表達載體。
32.權利要求30或31的重組DNA分子，其中所說的載體可被選自以下刺激所誘導溫度，乳糖的存在，和IPTG的存在。
33.權利要求32的重組DNA分子，其中所說的載體選自λPL、λPR、TAC、T7、T3、LAC和TRP啟動子。
34.一種選自pNP2202，pNP2203和pNP2204的質粒。
35.用權利要求28的重組DNA分子轉化的單細胞宿主。
36.用權利要求29的重組DNA分子轉化的單細胞宿主。
37.權利要求35或36的單細胞宿主，其中宿主選自大腸桿菌JM109、大腸桿菌BL21(DE3)、大腸桿菌DH5αF′IQ、大腸桿菌W3110、大腸桿菌JM105、大腸桿菌BL21、大腸桿菌TOPP1、大腸桿菌TOPP2和大腸桿菌TOPP3。
38.權利要求35或36中的單細胞宿主，其中宿主選自大腸桿菌JM109和BL21(DE3)。
39.通過培養權利要求35或36中的單細胞宿主然后分離所述蛋白而得到的基本上純化的腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白。
40.由權利要求13、16和17中的任一DNA序列編碼的多肽。
41.由權利要求14、15和18到27中的任一DNA序列編碼的多肽。
42.一種產生DNA序列的方法，包括有培養權利要求35或36中的單細胞宿主和分離所說的DNA序列的步驟。
43.一種產生多肽的方法，包括有培養權利要求35或36中的單細胞宿主和分離所說的多肽的步驟。
44.用權利要求43的方法獲得的基本上純的多肽。
45.分離權利要求1的抗原的方法，包括a)分離腦膜炎奈瑟氏球菌培養物；b)分離來自菌體培養物的外膜部分；并且c)從外膜部分分離所說的抗原。
46.權利要求45的方法，其中步驟(c)包括另外的在將蛋白質分級分離后用蛋白酶K處理外膜部分這一步。
47.一種藥物組合物，含有權利要求1到5、8、13、16和17中的任一權利要求中的一個或多個抗原或其片段。
48.一種藥物組合物，含有權利要求40中的一個或多個抗原或其片段。
49.一種藥物組合物，含有權利要求41中的一個或多個抗原或其片段。
50.一種藥物組合物，含有權利要求6、7、9、12、14、15和18到27中的任一權利要求中的一個或多個抗原或其片段。
51.權利要求49的藥物組合物，其為疫苗。
52.權利要求50的藥物組合物，其為疫苗。
53.權利要求49的藥物組合物，還包括一種或多種藥用賦形劑。
54.權利要求50的藥物組合物，還包括一種或多種藥用賦形劑。
55.一種防止病人腦膜炎奈瑟氏球菌感染的方法，該法包括使用藥學上有效劑量的權利要求51或52中的疫苗。
56.藥學上有效量的腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白或其片段，類似物，及其衍生物在防止人腦膜炎奈瑟氏球菌感染中的應用。
57.藥學上有效量的淋病奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白或其片段，類似物，及其衍生物在防止人淋病奈瑟氏球菌感染中的應用。
58.藥學上有效量的腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白或其片段，類似物，及其衍生物在制備用于防止人腦膜炎奈瑟氏球菌感染的疫苗中的應用。
59.藥學上有效量的淋病奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白或其片段，類似物，及其衍生物在制備用于防止人腦膜炎奈瑟氏球菌感染的疫苗中的應用。
60.一種抗體或其片段，它能同多于50％的已知的腦膜炎奈瑟氏球菌菌株上均存在的分子量約為22kDa的蛋白特異性地結合。
61.權利要求60的抗體或片段，它能同約99％的已知的腦膜炎奈瑟氏球菌菌株特異結合。
62.權利要求60的抗體或片段，它是單克隆抗體或其片段。
63.權利要求62的單克隆抗體或片段，它是鼠來源的。
64.權利要求63的單克隆抗體或片段，它是一種IgG同種型。
65.權利要求62的單克隆抗體或片段，其是Me-1，Me-2，Me-3，Me-5，Me-6或Me-7。
66.權利要求62的單克隆抗體，其是單克隆抗體Me-1或Me-7。
67.一種分離權利要求60的抗體的方法，包括a)將腦膜炎奈瑟氏球菌制備物導入一哺乳動物；并且b)從含所說抗體的哺乳動物中分離血清。
68.一種分離權利要求62的單克隆抗體的方法，包括a)將腦膜炎奈瑟氏球菌制備物導入一哺乳動物的產生抗體的細胞；b)將抗體產生細胞同骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞；并且c)從雜交瘤細胞分離所說的單克隆抗體。
69.包括權利要求60到66任一項中的一種或多種抗體或其片段的藥物組合物。
70.權利要求69的藥物組合物，其為疫苗。
71.權利要求69的藥物組合物，還含有一種藥學上可接受的賦形劑。
72.權利要求69的藥物組合物，其中抗體是Me-1或Me-7。
73.治療腦膜炎奈瑟氏球菌感染或懷疑被感染的病人的方法，該方法包括施用藥學上可有效劑量的權利要求70的疫苗。
74.在含有或懷疑含有腦膜炎奈瑟氏球菌抗原的生物樣品中檢測腦膜炎奈瑟氏球菌抗原的方法，包括a)從患者分離生物樣品；b)將該生物樣品同權利要求60的抗體或片段溫育，形成混合物；并且c)檢測混合物中特異結合的抗體或片段，其表明有腦膜炎奈瑟氏球菌抗原的存在。
75.權利要求72的方法，其中抗體是Me-1或Me-7。
76.在含有或懷疑含有所說的抗體的生物樣品檢測腦膜炎奈瑟氏球菌抗原特異的抗體的方法，包括a)從患者分離生物樣品；b)將生物樣品同權利要求1的抗原或片段溫育以形成一混合物；并且c)在混合物中檢測特異結合抗原或片段，其表明有特異性抗腦膜炎奈瑟氏球菌抗原的抗體的存在。
77.權利要求76的方法，其中的抗原是腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白。
78.在含有或懷疑含有病原性奈瑟氏菌的生物樣品中檢測此類細菌的方法，包括a)從患者分離生物樣品；b)將該生物樣品同含權利要求13的DNA序列的探針溫育以形成一混合物；并且c)在混合物中檢測特異結合DNA探針，其表明有奈瑟氏菌的存在。
79.在含有或懷疑含有病原奈瑟氏菌的生物樣品中檢測此類細菌的方法，包括a)從患者分離生物樣品；b)將該生物樣品同含權利要求13的DNA序列的探針溫育以形成一混合物；并且c)在混合物中檢測特異結合的DNA探針，其表明有奈瑟氏菌的存在。
80.權利要求78的方法，其中DNA探針含有圖1(SEQ ID NO1)中的523堿基對序列的部分。
81.權利要求78的方法，其中DNA探針含有圖1(SEQ ID NO1)中的523堿基對序列的一部分。
82.權利要求79的方法，其中DNA探針含有完全的或部分的圖8(SEQ ID NO3)中的528堿基對的序列。
83.權利要求79的方法，其中DNA探針含有完全的或部分的圖9(SEQ ID NO5)中的525堿基對的序列。
84.權利要求79的方法，其中DNA探針含有部分或全部的圖10(SEQ ID NO7)的525堿基對的序列。
85.權利要求78的方法，其中DNA探針是一寡聚物，其含有同圖1(SEQ ID NO1)中的腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白至少6個連續的核苷酸相互補的一段序列。
86.權利要求79的方法，其中DNA探針是一寡聚物，其含有同選自下述的腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白至少6個連續的核苷酸相互補的一段序列圖8(SEQ ID NO3)，圖9(SEQ ID NO5)和圖10(SEQ ID NO7)。
87.權利要求85或86的方法，其進一步包括a)提供了一套寡聚物，其可用作聚合酶鏈式反應的引物并且其位于靶序列區側翼；并且b)通過聚合酶鏈式反應擴增靶序列區。
88.在患者中檢測腦膜炎奈瑟氏球菌的方法，包括a)用一可檢測標記來標記權利要求60的抗體或片段；b)對患者施用該標記的抗體或標記片段，并且c)在患者中檢測特異結合的標記抗體或標記片段以顯示存在腦膜炎奈瑟氏球菌。
89.藥學上有效劑量的特異性腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的抗體在預防人腦膜炎奈瑟氏球菌感染中的應用。
90.腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白或其片段，類似物或衍生物在制備用于檢測或診斷人腦膜炎奈瑟氏球菌感染的試劑盒中的應用。
全文摘要
腦膜炎奈瑟氏球菌菌體表面的一種高度保守的,免疫可及的抗原。在治療,預防和診斷腦膜炎奈瑟氏球菌病上有用的免疫治療,預防和診斷組合物及方法。一種抗蛋白酶降解的腦膜炎奈瑟氏球菌表面蛋白,其表觀分子量為22kDa,以及其相應的核苷酸及衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8),生產該腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白的重組DNA方法,以及與此腦膜炎奈瑟氏球菌22kDa表面蛋白結合的抗體。
文檔編號C07K16/12GK1188509SQ96193884
公開日1998年7月22日 申請日期1996年3月15日 優先權日1995年3月17日
發明者B·R·布羅德, D·馬丁, J·哈梅爾, C·里烏 申請人:生化疫苗公司