專利名稱：癌癥化學預防劑的制作方法
技術領域：
本發明系關于2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯和其藥物學上可接受的鹽做為癌癥化學預防劑的新用途。
多數抗癌藥是用于癌癥病人的化學治療，但人們近來已經在試圖研制癌癥的化學預防劑。癌癥化學預防劑，像此處所用的，系指在預防癌癥中有效的化合物或含有相同活性成分的藥物組合物。
許多化合物，包括原來為其他治療目的而開發的一些化合物，現已知具有癌癥化學預防活性。例如奧替普拉(oltipraz)，5-(2-吡嗪基)-4-甲基-1，2-二硫醇-3-酮，起始用為抗血吸蟲病藥，后發現其具有抑制化學誘導致癌作用的效用，現正由美國國家癌癥研究中心開發為一種癌癥化學預防劑[見V.R.Chinthalapally，K.Tohomo，G.Kelloff and B.S.Reddy，Careinogenesis，12，pp，1051-1055(1991)]。
本發明者以前曾開發了硫代乙烯酮衍生物及其無毒性的鹽，它們具有優良的治療和預防肝臟疾病的活性(見美國專利No.5,103,013)。在這些化合物中，十分意外地發現2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯及其藥物學上可接受的鹽具有優良的癌癥化學預防活性。
因此，本發明的首要目的是為2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯及其藥物學上可接受的鹽提供作為癌癥化學預防劑的新用途。
依據本發明，此處提供一種2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯及其藥物學上可接受的鹽在制造預防癌癥的藥物中的新用途。
本發明的上述和其他目的及特征可從下列的描述，連同附圖一起看將變得明顯，其中，
圖1顯示2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯對由氨基甲酸乙烯酯所誘導的TA98和TA100突變的影響。
通式(I)的2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯和其藥物學上可接受的鹽可應用效突變試驗，DNA共價結合試驗和小鼠皮膚癌試驗來測定它們的癌癥化學預防活性。 苯并(a)芘(一種環境致癌物的原型，“B[a]P”)可被單氧合酶，特別是在細胞色素PIA和細胞色素P3A--細胞色素P45-(CYP)的亞族--中的單氧合酶致活形成一個親電的環氧化物，即苯并[a]芘-7，8二氫二羥基-9，10-環氧化物(BPOE)，此化合物具有致突變和致癌活性[見J.M.Sayer，Whalen and D.M.Jerina，Drug Metab.Rev.20，pp 155-182(1989)]。此外，氨基甲酸乙烯酯(VC)被細胞色素P2E1活化為親電的和有致癌作用的最終環氧代謝物(VC環氧化物)[見F.P.Guengerich，D.H.Kim and M.Iwasaki，Chem.Res Toxicol.，4，PP 168-179(1991)] 。
2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯及其藥物學上可接受的鹽，如試驗范例所描述的，能夠有效地抑制由苯并[a]芘，苯并[a]芘-7，8二氫二羥基-9，10-環氧化物，氨基甲酸乙烯酯和氨基甲酸乙烯酯環氧化物誘導的突變；苯并[a]芘與DNA的結合；和小鼠皮膚癌。據此，2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯及其藥物學上可接受的鹽可用于預防癌癥。
2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯及其可做為藥用的鹽可用美國專利No.5,103,013所描述的方法容易地制得。
本發明還提供一種包含有效量的2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯或其藥物學上可接受的鹽以及可做為藥用載體的預防癌癥藥物組合物。
按照本發明，藥物組合物可用藥物學上可接受的載體制成各種劑型。能在本發明中應用的藥物學上可接受的載體包括，但不限于此，適當的稀釋劑，溶劑，填充劑，結合劑，分散劑，崩解劑，表面活性劑，潤滑劑，賦形劑和濕潤劑。如需要時本組合物還可進一步包括增溶劑，緩沖劑，防腐劑，著色劑，香料，甜味劑和同類物。
本發明的藥物組合物劑型可按照希望的用藥方式制備。例如口服劑型像片劑，膠囊和顆粒，可應用習用的方法用稀釋劑(如蔗糖，乳糖，葡萄糖，淀粉，甘露醇)，結合劑(如糖漿，阿拉伯膠，山梨醇，黃蓍膠，羥丙基纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，淀粉糊)；崩解劑(如淀粉，羧甲基纖維素或其鈣鹽，微晶纖維素，交聯聚乙烯吡咯烷酮，淀粉-甘醇酸鈉)；潤滑劑(如滑石粉，硬脂酸鎂，硬脂酸鈣，二氧化硅)；濕潤劑(如十二烷基硫酸納，甘油)和同類物制備。
本發明進一步提供一種通過將有效量的2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯及其藥物學上可接受的鹽施用于主體從而在主體內預防癌癥的方法。
劑量可隨用藥方法和劑型，以及年齡，體重，病人的狀態和敏感性不同而變化。在口服用藥的情況下，有效的日劑量范圍，例如，可從20mg至1g。單劑量單位含2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[-N(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯及其藥物學上可接受的鹽的量為由20mg至200mg，可方便地用來符合日劑量的需要。使用的劑量和劑量單位可超出上述范圍。
下列的試驗例和實施例是為了說明本發明某些方面的目的，在任何方面都不應被認為是限制本發明的范圍。
試驗例1突變試驗
2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯對由B[a]P，BPDE，VC和VC環氧化物誘導的突變的癌癥化學預防活性如下進行評價。
雄性Sprague-Dawley大鼠(鼠齡40至45天)在標準條件下(12h白天-12h黑夜循環，溫度21±2℃)用標準實驗室飼料塊和水隨意喂養。在處死前連續五天在腹膜內注射阿羅克樂(Aroclor)1254(溶于玉米油中500mg/kg)。大鼠以CO2窒息處死，立即取出它們的肝臟并原地浸泡于冰冷的KCl等滲溶液中。肝組織經稱重后切碎，并在三倍體積的冰冷0.25M蔗糖溶液中用電動的Potter-Elvehjem玻璃-Teflon勻漿器做成勻漿。勻漿在9000×g離心30分鐘，上清液(S9部分)用做酶的來源。1-1.由B[a]P誘導的突變Ames His+逆轉分析是按照液體預孵育法用鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)TA98和TA100做為試驗株進行的[見D.M.Maton and B.N.Ames，Mutation Res.，113，pp173-221(1983)]。
TA98和TA100(1至2×109/盤)分別與溶于DMSO的2.5μg B[a]P一起加入到上述獲得的由阿羅克樂1254誘導的含有NADPH產生系統的鼠肝后線粒體(postmitochondrial)上清液中(50μg約等于2mg蛋白質)。向其中加入不同量的2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯并在37℃預孵育20分鐘。
混合物用軟瓊脂稀釋，傾在硬瓊脂盤上，再孵育48小時以使His+逆轉菌落生長。所得數據用自發逆轉數校正。結果見表1。
表1
*化合物2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯1-2.由BPDE誘導的突變Ames His+逆轉分析是按照液體預孵育法用鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)TA100做為試驗株進行的[見D.M.Maton and B.N.Ames，Mutation Res，113，pp173-221(1983)]。
25nmol的BPDE與鼠傷寒沙門氏菌TA100在無或有給定量的2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯存在下在37℃一起孵育20分鐘。
然后，混合物用軟瓊脂稀釋，傾于硬瓊脂盤上，再孵育48小時以使His+逆轉菌落生長。結果見表II所示。數據以兩次分析的平均值表示。
表II
*化合物2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯1-3 由VC誘導的突變重復例1-1的操作方法，不同之處在于，鼠傷寒沙門氏菌TA100和TA1535為試驗株，氯基甲酸乙烯酯(10μmol)做為致突變劑并使用2.5μg和25μg的2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯本品對VC所誘導的突變的作用示于圖1。1-4 由VC環氧化物誘導的突變重復例1-2的操作方法，不同之處在于，鼠傷寒沙門氏菌TA100為試驗株外，并用氨基甲酸乙烯酯(25和50nmol)做為致突變劑。
本品對VC環氧化物所誘導的突變的作用示于表III。
表III
*化合物2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯如表I，II，III和圖1所示，2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯能劑量依賴地抑制由原型致突變劑，即B[a]P，BPDE，VC和VC環氧化物所誘地細菌突變。試驗例2.共價結合試驗含0.25μg[3H]-B[a]P(特異活性12.35mi/mmol的50mM磷酸鉀緩沖液(PH7.4)，2mg小牛胸腺DNA，25mgDTA，NADPH(0.65mM)和4mg肝后線粒體上清液的混合物2ml與不同濃度的2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯一起在37℃孵育30分鐘。
在去除蛋白質后用乙醇沉淀析出DNA。由此得到的DNA小球順序地用含1％NaCl的75％乙醇，75％乙醇，無水乙醇，丙酮和乙醚沖洗，然后干燥。
干燥的DNA樣品溶于15mM NaCl-1.5m檸檬酸鈉緩沖液(PH7.0)中。DNA的濃度以二苯胺方法測定，用小牛胸腺DNA做標準[見K.Burton and G.B.Peterson，Biochem J.，75，pp17-27，1960]。
等分的DNA溶液溶于Sovable(Dupont/NEN Rosearch Products，Boston，MA)中。以冰酯酸中和后，共價地結合在DNA上的放射性標記烴類在加入Liquescent(National Diagnostics，Manville，NJ)后像一種雞尾酒，用液體閃爍計數器測定其水平。結果示于表IV。
表IV
*化合物2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯如表IV所示，2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯能劑量依賴地抑制B[a]P對小牛胸腺DNA共價結合。試驗例3.小鼠皮膚癌試驗也研究了2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯對小鼠皮膚癌的抑制作用。二烯丙基硫醚是已知具有癌癥化學預防活性的化合物，它被用來做比較。3-1 由VC誘導的致癌作用雌性ICR小鼠(鼠齡6至7周)的背部剃毛。30支小鼠為一組以2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯2.5μmol溶于0.2％羧甲基纖維素鈉的溶液處理，或以8μmol二烯丙基硫醚溶于0.1M滅菌的磷酸鉀緩沖液的溶液處理。10分鐘后，小鼠以VC(5.8μmol)溶于含有15％DMSO的0.2ml丙酮溶液局部給藥。對照組則僅給以VC。
起始給藥后一周，小鼠以15nmol TPA(12-O-十四烷酰基佛波醇-13-醋酸酯)溶于0.1ml的丙酮溶液局部給藥，一周兩次以加速致癌過程。
間周計數并記錄直徑至少為1mm的腫瘤。結果示于表V。括弧內的數字為荷腫瘤的小鼠％。
V
*化合物2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯3-2 由B[a]P或VC誘導的致癌作用雌性CD-1小鼠(鼠齡6周)在腹膜內注射B[a]P(0.3μml)或VC(11.5μmol)溶于0.2ml丙酮的溶液或只給以同體積的丙酮前24小時和1小時，用胃管飼法給以三辛偶姻(Trioctanoin)，或2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯混懸于三辛偶姻(0.15mg/10μl/克體重)的混懸液或二烯丙基硫醚混懸于三辛偶姻(0.2mg/10μl/克體重)的混懸液。
起始給藥后一周，動物以15nmol TPA(12-O-十四烷酰基佛波醇-13-醋酸酯)溶于0.1ml丙酮的溶液局部給藥，一周兩次以促進致癌作用。
在起始給藥后16周計數并記錄直徑至少為1mm的腫瘤。結果示于表VI。
表VI
*化合物2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯如表V和表VI所示，以2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯預處理能有效地減少由B[a]P和VC誘發的皮膚癌。
在本發明關于特殊具體化的描述時，必須認識到由本領域熟練人員對本發明所做的各種修改和改進也應屬于所附權利要求所界定的本發明的范圍之內。
權利要求
1.2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯及其藥物學上可接受的鹽在制備預防癌癥的藥物中的一種用途。
全文摘要
2-(1，3-二噻四環-2-亞基)-2-[N-(4-甲基噻唑-2-基)氨基甲酰基]醋酸異丙酯及其藥物學上可接受的鹽在制備預防癌癥的藥物中的一種用途。
文檔編號C07D417/00GK1151865SQ96120319
公開日1997年6月18日 申請日期1996年10月14日 優先權日1995年10月14日
發明者李鐘郁, 俞重根, 李相昊 申請人:株式會社柳韓洋行