專利名稱：重組蛋白提取純化新工藝的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物制藥領域。
許多基因工程菌(大腸桿菌)所表達的重組蛋白多(均)以包涵體形式存在，如白介素-2，人粒細胞集落刺激因子，白介素2-粒巨細胞集落刺激因子融合蛋白......等，因此從包涵體中提取純化重組蛋白的工藝引起高度重視，因為純化工藝的優劣直接影響產品的質量及效率，從而直接影響經濟效益。
在重組蛋白提取純化工藝中，必須先用蛋白變性劑(溶解劑)將包涵體中的重組蛋白變性溶解，以便純化除去雜質，這是關鍵技術之一。然后于適宜條件下進行復性，以重獲天然活性。因此重組蛋白由變性到復性是其關鍵技術之二。上述兩個關鍵技術主要影響產品的純度及效率。
目前已有技術對提取純化蛋白存在以下問題。
1.重組蛋白在鹽酸胍或尿素單一變性劑中溶解度有限，在降低變性劑＜4mol/L時，重組蛋白不能與雜蛋白、核酸解離而被析出，嚴重影響產品回收率。
2.為了提高重組蛋白的純度，采取先純化后復性的工藝程序，然而，由于變性劑的濃度高，粘稠度大、用量也大，因而操作難度很大，成本高。
3.由于重組蛋白長時間與高濃度變性劑作用，導致變性劑及其產物對重組蛋白的共價修飾，致使重組蛋白復性率降低，產品收率隨之降低。
鑒于已有技術存在上述問題。其結果是工藝復雜操作難度大，產品的純度及收率均低，進而導致成本高，不利于工業化生產。
本發明的目的就是尋找一條工藝簡單，產品的純度及收率均高，而成本低的提取純化工藝。本
發明內容
附工藝流程示意圖凡由基因工程菌大腸桿菌表達的重組蛋白，是以包涵體形式存在，并從包涵體中提取純化重組蛋白的，均可按本發明的提取純化工藝流程進行生產。提取純化程序是將工程菌破碎，包涵體洗滌，重組蛋白變性純化，重組蛋白二次變性純化，重組蛋白復性，離子交換層析，分子篩層析，即得重組蛋白，其具體工藝如下一、工程菌破碎1.取工程菌，按每克濕菌加5-10倍緩沖液(1)(20mmol/LTris-HCl(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸)，pH8.0)，洗滌細菌，于4℃離心，7000(rpm)×10min(分鐘)，棄上清液。
2.按每克濕菌加溶菌酶5毫克，同時加5-10倍量的緩沖液(2)(50mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)，pH8.0)，于4℃攪拌1.5-2.5小時，在-20℃放置過夜。
3.將過夜菌化凍后，用超聲破碎，30秒×10次，每次間隔1-2min，至液體變稀薄、起泡為止，鏡檢細菌破碎率為98％以上。
二、包涵體洗滌1.取超聲破碎菌液，離心4000rpm×5min 4℃，留沉淀。
2.將沉淀物(包涵體)用以下緩沖液(3)(4)(5)(6)(7)(8)依次分別進行充分攪拌洗滌，于4℃離心12000rpm×20min，洗1-2次，留沉淀物(包涵體)備用。分別洗滌的目的在于除棄混合在包涵體的質脂體、脂多糖、核酸及雜蛋白等雜質。
各緩沖液成分如下緩沖液(3)20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，pH8.0緩沖液(4)20mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，2mmol/L2-ME(二巰基乙醇)，0.5％曲通X-100，pH8.0緩沖液(5)與緩沖液(3)相同緩沖液(6)2mol/L尿素，20mmol/L Tris-HCl，2mmol/LEDTA，pH8.0緩沖液(7)70％異丙醇，20mmol/L Tris-HCl，pH8.0緩沖液(8)20mmol/L Tris-HCl，pH8.0三、重組蛋白變性純化1.將洗滌后的包涵體按濕重加5-10倍量的鹽酸胍緩沖液(9)(6-8mol/L鹽酸胍，10mmol/L DTT(二硫蘇糖醇)，1mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCl，pH7.0-8.5)，充分攪拌25-35分鐘后，此時重組蛋白變性溶解，于4℃離心12000rpm×30min，取上清液得重組蛋白溶液。取鹽酸胍溶解液，加入緩沖液(10)(10mmol/L DTT，1mmol/LEDTA，20mmol/L Tris-HCl，pH8.0)將鹽酸胍緩沖液濃度稀釋到4-5mol/L，攪拌，于4℃離心12000rpm×20min，棄沉淀物。上清液繼續再加緩沖液⑩將鹽酸胍濃度稀釋到2-3mol/L，攪拌，于4℃離心12000rpm×20min，留沉淀物(此沉淀物為重組蛋白)，然后將沉淀物用緩沖液(11)(20mmol/L Tris-HCl，10mmol/L DTT，1mmol/L EDTA，pH8.0)沖洗，離心10000rpm×10min，沖洗1-2次留沉淀物。四、重組蛋白二次變性純化取第一次純化的沉淀物用尿素緩沖液(12)(6-8mol/L尿素，1mmol/L EDTA，100mmol/2-ME，20mmol/L NaAc(醋酸鈉)，pH3.5-7.0)變性溶解，于4℃離心12000rpm×20min，離心棄不溶物，留上清液調整蛋白濃度為8-10mg/克備用。在此工藝程序上，本發明與已有技術質的區別，在于對重組蛋白采取了兩種變性溶解體系，進行交替變性溶解純化處理，可顯著地提高重組蛋白的溶解度(500-600倍)，并充分利用其溶解度大大增加這一特性，刻意降低(稀釋)變性劑的濃度(0.1mol/L)，其目的在于使重組蛋白與雜蛋白、核酸自行解離，以達純化，提高收率。而已有技術采取單一變性劑的處理，只能將變性劑的濃度降到＞4mol/L，此濃度不能使重組蛋白與雜蛋白、核酸等有效地自行解離，因而重組蛋白與雜質一起析出，棄掉，故收率顯著降低。五、重組蛋白復性將尿素液調整蛋白濃度為8-10mg/ml溶液，緩慢加入復性緩沖液(13)(1mmol/L EDTA，1mmol/L還原型谷胱苷肽，0.1mmol/L氧化型谷胱苷肽，20mmol/L醋酸鈉，pH4.0)，即在80-100分鐘內將6-8mol/L尿素緩沖液的濃度逐步(梯度)稀釋到0.1mol/L，于4℃過夜，然后用緩沖液(14)(10mmol/L醋酸鈉，pH4.0)透析，或經超濾平衡去除復性緩沖液，得重組蛋白。
本發明在此工藝環節上的重大技術特征，在于采用復性緩沖液梯度稀釋變性劑的同時，進行逐步還原復性的方法，其結果1.簡化了整個后續的純化工藝。
2.極大的減少了變性劑的用量，從而減少了在變性劑條件下進行色譜分離的麻煩。
3.在整個操作中重組蛋白與變性劑作用時間很短，因而可避免變性劑及其產物對重組蛋白的共價修飾餒，重組蛋白復性率可達95％以上。
六、離子交換層析(去除核酸熱原)1.將CM Sepharose FastFlow(一種陽離子交換層析填料)裝入玻璃層析柱，用2倍柱床體積的0.5mol/L氫氧化鈉洗脫一次，用無熱原水洗滌層析柱，以除去氫氧化鈉，至流出液的pH7.0止，然后用2-3倍柱床體積的20mmol/L醋酸鈉-醋酸，pH4.0緩沖液平衡層析柱。
2.取復性的重組蛋白加入緩沖液(15)(20mmol/L醋酸鈉-醋酸，pH4.0)，然后以每小時50-70毫升的流速上層析柱。再用2倍柱體積的緩沖液(15)洗脫，流速為25-30ml/小時，最后用氯化鈉緩沖液(16)(0.3mol/L氯化鈉，20mmol/L醋酸鈉-醋酸，pH4.0)洗脫，在紫外監測儀的紫外吸收值為零時停止收集。
七、分子篩層析(去除異構體、熱原)1.將凝膠排阻層析填料(Sephacryl S-200)裝玻璃層析柱，用0.5mmol/L氯氧化鈉沖洗進行去熱原處理。然后用2倍柱體積的緩沖液(17)(0.004％吐溫-80，10mmol/L醋酸鈉-醋酸，pH4.0)平衡層析柱。
2.取經離子交換層析處理的重組蛋白，加入緩沖液(17)，按10％柱體積上樣并洗脫，流速為50-60ml/小時，收集蛋白峰，在紫外監測儀的紫外吸收為零時停止收集，即可獲得重組蛋白。
本發明與已有技術比較具有以下優點見下表本發明與已有技術比較變性劑用量變性劑作用時間重組蛋白純度OD280/260成品(ml) (小時) (％) (吸光度)* (％已有技術 150085 60 1.0 1本發明150 2 ＞90 1.5 3差異 100倍 80以上 30 0.5 2*OD280/260值越大，產品純度越高，含核酸等雜質越少。
從上表可以看出1.本發明比已有技術，在使用變性劑量少100倍，而清除變性劑的工作效率將提高100倍，其成本顯著降低。
2.本發明比已有技術變性劑與重組蛋白作用時間少80小時以上，導致重組蛋白共價修飾大大減少，因而產品總收率提高。
3.本發明比已有技術對重組蛋白在純度上提高30％。
4.本發明與已有技術在重組蛋白總收率分別為34％，10％，若將純度計算在內，則分別為30.6％和6％，就產品收率而言，其經濟效益本發明比已有技術增加25％，或降低成本25％以上。
實施例一、重組人粒細胞集落刺激因子的提取純化工藝1.菌體破碎(1)取工程菌100克加1000ml 20mmol/L Tris-HCL(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，pH8.0，洗滌細菌，于4℃離心7000rpm×10min(分鐘)，棄上清。
(2)濕菌加入溶菌酶500mg，50mmol/L Tris-HCL，1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)，pH8.0緩沖液1000ml，于4℃攪拌2h(小時)，在-20℃放置過夜。
(3)將上述細菌化凍后超聲，30sec(秒)×10次，每次間隔1min，至液體變稀薄、起泡為止。鏡檢細菌破碎率＞98％。2.包涵體的洗滌(1)取菌體破碎液離心4000rpm×5min，4℃，留沉淀。
(2)用20mmol/L Tris-HCL，2mmol/L EDTA，，pH8.0液洗滌。
(3)用20mmol/L Tris-HCL，10mmol/L EDTA，2mmol/L2-ME(2-巰基乙醇)，0.5％Tritonx-100(曲通X-100，一種去垢劑)，pH8.0液洗1次，去脂質。
(4)用20mmol/L Tris-HCL，2mmol/L EDTA，pH8.0液洗2次，以去除Tritonx-100。
(5)用2mol/L尿素，20mmol/L Tris-HCL，2mmol/LEDTA，pH8.0液洗1次，去除雜蛋白。
(6)70％異丙醇，20mmol/L Tris-HCL，pH8.0洗一遍，去除脂多糖。
(7)用20mmol/L Tris-HCL，pH8.0洗2次去除異丙醇。
以上步驟加緩沖液500ml，于4℃離心12000rpm×20min后，棄上清。3.重組蛋白變性純化(1)包涵體溶于變性劑取包涵體沉淀物，加入7mol/L鹽酸胍，10mmol/L DTT(二硫蘇糖醇)，1mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCL，pH8.0，濃度為20％。充分攪拌溶解30min后，于4℃離心12000rpm×30min，取上清，得到重組蛋白初提物，并將其稀釋到50μg/ml。
(2)向7mol/L鹽酸胍溶解的包涵體中加入含10mmol/LDTT，1mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCL，pH8.0緩沖液，將鹽酸胍濃度分兩次降低，至重組蛋白全部析出，4℃離心12000rpm×20min，棄上清，沉淀用20mmol/L Tris-HCL，10mmol/L DTT，1mmol/L EDTA，pH8.0的緩沖液洗2次，10000rpm×10min離心得沉淀4.重組蛋白二次變性純化8.0mol/L尿素，1mmol/L EDTA，100mmol/L 2-ME，20mmol/L NaAc，pH4.0溶解上述沉淀，離心(12000rpm×20min)去不溶物，調整蛋白濃度為8-10毫克/毫升。5.重組蛋白復性在尿素緩沖液中緩慢加入復性液(1mmol/L EDTA，1mmol/L還原型谷胱苷肽(GSH)，0.1mmol/L氧化型谷胱苷肽(GSSG)，20mmol/L NaAc，pH4.0)，即在80min內降低尿素濃度至1.0mol/L，再一次稀釋到0.1mol/L，復性物4℃過液，然后用10mmol/L NaAc，pH4.0中透析或超濾平衡去除復性劑。6.離子交換層析(去核酸、熱源)(1)裝JCM Sepharose FF(一種陽離子交換層析填料)層析柱，用2倍柱床體積0.5mol/L NaoH(氫氧化鈉)洗脫一次(無熱原處理)，以無熱原水洗至流出液的pH7.0，然后用20mmol/L NaAc-HAC(醋酸鈉-醋酸)pH4.0平衡。
(2)60ml/h將樣品上于層析柱，再用2倍柱體積的20mmol/L NaAc-HAC pH4.0洗脫，流速30ml/h，再用含1.0mol/L NaCl(氯化鈉)的20mmol/L NaAc-HAC，pH4.0梯度洗脫，收集主蛋白峰。在紫外監測儀的紫外吸收值為零時停止收集。7.分子篩層析(去除異構體、熱原，換體系)(1)Sephacryl S-200(一種凝膠排阻層析填料)層析柱去熱原處理。
(2)用2倍柱體積0.004％Tween-80，10mmol/LNaAc-HAC，pH4.0平衡層析柱。
(3)按10％柱體積在上述緩沖體系中上樣并洗脫，流速60ml/h。收集蛋白峰，在紫外監測儀的紫外吸收值為零時，停止收集。實施例二、rhIL2-PE66(基因重組人白細胞介素II-綠膿桿菌外毒素66，分子量80KD)提取純化工藝1.菌體破碎
(1)取工程菌100克加1000毫升20mmol/L Tris-HCl(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液)，PH8.0，洗滌細菌，于4℃離心7000rpm×10min(分鐘)，棄上清。
(2)加入溶菌酶500mg；50mmol/L Tris-HCl，1mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸二鈉)，pH8.0緩沖液1000ml，于4℃攪拌2h，在-20℃放置過夜。
(3)將上述細菌化凍后超聲，30sec(秒)×10次，每次間隔1min，至液體變稀薄、起泡為止。鏡檢細菌破解率＞98％。2.包涵體的洗滌(1)上清離心4000rpm×5min，4℃，留沉淀。
(2)用20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，pH8.0液洗滌。
(3)用20mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，2mmol/L 2-ME(2-巰基乙醇)，0.5％TritonX-100(曲通X-100，一種去垢劑)，pH8.0液洗1次，去脂質。
(4)用20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，pH8.0液洗2次，以去除TritonX-100。
(5)用2mol/L尿素，20mmol/L Tris-HCl，2mmol/LEDTA，pH8.0液洗1次，去除雜蛋白。
(6)70％異丙醇，20mmol/L Tris-HCl，pH8.0洗一遍，去除脂多糖。
(7)用20mmol/L Tris-HCl，pH8.0洗2次去除異丙醇。
以上步驟均加500ml緩沖液洗滌，于4℃離心12000rpm×20min后棄上清。3.重組蛋白變性純化用8mol/L鹽酸胍溶解包涵體，然后加入含10mmol/L DTT，1mmol/L EDTA，的20mmol/L Tris-HCl，PH8.0緩沖液，將鹽酸胍濃度分兩次降至2mol/L，攪拌10min后離心12000rpm×20min，重組蛋白全部析出，12000rpm×20min，棄上清，沉淀用20mmol/L Tris-HCl(含10mmol/L DTT，1mmol/L EDTA)，pH8.0的緩沖液洗2次，10000rpm×10min離心得沉淀。4.重組蛋白二次變性純化用8.0mol/L尿素，1mmol/L EDTA，100mmol/L 2-ME，20mmol/L Tris-HCl，pH8.0溶解，離心(12000rpm×20min)，留上清液，并調整蛋白濃度為8-10mg/ml備用。5.重組蛋白的復性將上述重組蛋白2次變性溶解液緩慢加入復性液(1mmol/LEDTA，1mmol/L還原型谷胱苷肽(CSH)，0.1mmol/L氧化型谷胱苷肽(GSSG)，20mmol/L Tris-HCl，pH8.0)，在90min內降低尿素濃度至1.0mol/L，再一次稀釋到0.1mol/L，復性物4℃過夜，然后用20mmol/L Tris-HCl，pH8.0透析或超濾平衡去除復性劑。6.離子交換層析(去核酸、熱源)(1)將CM Sepharose FastFlow(一種陽離子交換層析填料)裝入玻璃層析柱，記錄裝填體積，用2倍柱床體積的0.5mol/L NaoH(氫氧化鈉)洗脫一次(去除體系內的熱原質污染)、以無熱原水洗滌層析柱(去除NaOH)至流出液的pH7.0，然后用2-3倍柱床體積的20mmol/L NaAc-HAC(醋酸鈉-醋酸)pH4.0緩沖液平衡層析柱。
(2)以60ml/h的流速將樣品于20mmol/L NaAc-HAC pH4.0緩沖液上于層析柱，再用2倍柱體積的20mmol/L NaAc-HACpH4.0洗脫，流速30ml/h，再用含0.3mol/LNaCl(氯化鈉)的20mmol/L NaAc-HAC，pH4.0洗脫，目的是用具有相當離子強度的NaCl置換被吸附于陽離子層析柱上的hG-CSF重組蛋白。在紫外監測條件下，收集蛋白峰于0.3mol/L NaCl洗脫時呈一對稱的單一峰，紫外吸收值為零時停止洗脫。7.分子篩層析(去除異構體、熱原，換體系)(1)將凝膠排阻層析填料(Sephacryl S-200)，同上述方法裝入玻璃層析柱層析柱，并經0.5mol/L NaoH進行去熱原質處理。
(2)用2倍柱體積0.004％Tween-80，10mmol/L NaAc-HAC，pH4.0平衡層析柱。
(3)按10％柱體積在上述緩沖體系中上樣并洗脫，流速60ml/h。收集蛋白峰，紫外監測吸收零時停止洗脫。
權利要求
1.一種基因工程菌所表達的重組蛋白，是以包涵體形式存在的提取、純化工藝，其特征在于將工程菌破碎，包涵體洗滌，重組蛋白變性純化，重組蛋白二次變性純化，重組蛋白復性，離子交換層析，分子篩層析即得純化的重組蛋白。
2.根據權利要求1所述的工程菌破碎，其特征在于將工程菌用緩沖液(1)洗滌、離心，留沉淀，加溶菌酶緩沖液(2)，于4℃攪拌，放置-20℃過夜，化凍后用超聲破碎至鏡菌破解率大于98％，可得包涵體混合液。
3.根據權利要求1所述的包涵體洗滌，其特征在于將包涵體混合物于4℃離心，其沉淀物分別用以下緩沖液(3)(4)(5)(6)(7)(8)依次進行洗滌，4℃離心1-2次，得包涵體沉淀物。
4.根據權利要求1所述的重組蛋白變性純化，其特征在于將包涵體溶于6-8mol/L鹽酸胍緩沖液(9)中，離心，取上清液加緩沖液(10)將鹽酸胍濃度，稀釋到4-5mol/L，離心，取上清液，再加緩沖液(10)將鹽酸胍稀釋至2-3mol/L，離心，沉淀物用緩沖液(11)沖洗兩次，留沉淀物。
5.根據權利要求1所述的重組蛋白二次變性純化，其特征在于將沉淀物加6-8mol/L尿素緩沖液(12)變性溶解，離心，留上清液。
6.根據權利要求1所述的重組蛋白復性，其特征在于將變性溶于尿素緩沖液的重組蛋白，調正濃度為8-10毫克/毫升、然后緩慢加入復性緩沖液(13)，即在80-100分鐘內，將尿素濃度稀釋至0.1mmol/L，最后于4℃用緩沖液(14)透析或超濾平衡除去復性緩沖液。
7.根據權利要求1所述的離子交換層析，其特征在于將復性重組蛋白加入緩沖液(15)上層析柱，然后用緩沖液(15)洗脫，最后用緩沖液(16)洗脫至紫外吸收值零時為止。
8.根據權利要求1所述的分子篩層析，其特征在于將經離子交換層析的重組蛋白加入緩沖液(17)后上柱并洗脫，至紫外吸收值零時即停止。
全文摘要
本發明屬生物制藥領域。凡由基因工程菌(大腸桿菌)表達,以包涵體形式存在,并從包涵體中提取純化重組蛋白的均可適用此工藝。本工藝的特征在于采取兩種變性溶解劑體系,進行兩次變性溶解、純化,及先復性后純化的程序,因而本發明比已有技術可使重組蛋白的溶解度增加500—600倍,變性劑的用量減少100倍左右,工作效率相應提高上百倍,重組蛋白純度提高30%左右,而產品總收率增加24%以上,因此本發明是工藝簡單、產品純度及收率均明顯提高、成本則顯著降低、經濟效益甚高的提取純化新工藝。
文檔編號C07K1/00GK1169998SQ96106778
公開日1998年1月14日 申請日期1996年7月10日 優先權日1996年7月10日
發明者王小寧, 馬驪, 范富林, 賀海平, 方向東 申請人:廣州南方生物技術有限公司