對細胞周期非依賴的神經膠質瘤表面抗原特異的人單克隆抗體的制作方法

專利名稱：對細胞周期非依賴的神經膠質瘤表面抗原特異的人單克隆抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及IgM同種型的單克隆抗體(MAb)及其編碼cDNA的特征。具體地，本發明涉及兩種針對惡性神經膠質瘤細胞系的人單克隆抗體。這些人抗-神經膠質瘤單克隆抗體在治療這種急性腦腫瘤中具有潛在的臨床價值。本發明包括這些與單克隆抗體結合的細胞表面標記物。
惡性神經膠質瘤是所有原發性腦腫瘤中最常見的一種。它們也是臨床上最難治療的。根據它們在顱內的位置，在表現任何癥狀之前，可以長至相當大。它們的生物行為極具侵襲性，盡管它們很少轉移到中樞神經系統之外。
單獨用手術和放射治療很少能起到治療效果；在最好的護理下，平均存活為一年以下。此外，盡管竭力引進新的輔助療法，對惡性神經膠質瘤病人的預后在過去三十年中基本上沒有改變。
許多輔助療法包括免疫療法，或者是目前還不有效，或者造成令人難以接受的嚴重發病的危險性。然而，隨著Kohler和Milstein(1975)開發的鼠雜交瘤技術，用單克隆抗體進行的腫瘤免疫診斷和免疫治療已經成為大有前途的研究領域。
對鼠單克隆抗體的研究已經使人們大致了解了神經膠質瘤生物學及其異質性。出于種種原因，這些試劑不適合在臨床上用于人體。相反，與鼠單克隆抗體相比，人單克隆抗體能提供更大的特異性和生物相容性。
惡性神經膠質瘤是神經上皮腫瘤，一般出現在大腦半球中。在該組腫瘤中，包括退行性(anaplastic)星形細胞瘤、退行性少突神經膠質細胞瘤、退行性室管膜瘤和多形性成膠質細胞瘤。這些腫瘤在顯微鏡下都具有一些共同的特征，例如細胞密集、有絲分裂個體數目增加、染色過深的核多形性和細胞多形性。在多形性成膠質細胞瘤中，都存在上述特征，而且還有假柵式(pseudopalisade)的壞死、伴隨假玫瑰花結(pseudorosette)形成的毛細血管內皮增生和間充質的增生。這些腫瘤呈異質性并表現出腫瘤間和腫瘤內的多樣性，這是治療中遇到的主要決定因素。因為對分化程度低的神經膠質瘤細胞而言存在很少的標記物，因此在原本異質性群體中選擇性地靶定這些細胞是非常有利的，因為消除這種低分化細胞腫瘤的失敗會不可避免地導致腫瘤的復發。
已經表明，許多惡性神經膠質瘤病人顯著地呈現免疫抑制，尤其是在細胞介導的功能方面，盡管少數病人是惡病質的。在無明顯的系統缺損下發現的免疫抑制暗示，前者是由于腫瘤內在機制造成的，而不是通常情況下過度的腫瘤負擔的反應。惡性神經膠質瘤病人的體液免疫機制似乎也被抑制，盡管它們是完好的。
惡性神經膠質瘤與衍生出它們的正常細胞具有許多共同的抗原。因此，幾乎不可能制備常規的針對神經膠質瘤組織的異種抗血清(heteroantisera)，因為它們有某種程度的與正常成人腦的交叉反應。共享的抗原按性質分可以是細胞內的、膜相關的、或細胞外的。
糖脂和碳水化合物結構在細胞相互作用、分化和腫瘤發生中的作用最近已引起重視。已知神經節苷脂這一亞類糖脂在細胞粘附和增殖的調控中發揮重要作用。當細胞進行惡性轉化時，在其表面神經節苷脂的化學性質會發生微妙的質和量的改變。
惡性神經膠質瘤是非常血管化的腫瘤。然而，存在血腦屏障的破壞或完全缺失。血腦屏障存在于正常的健康腦中，通過它腦被正常地“保護起來”，也就是與免疫系統的或其他血液攜帶物質的效應隔開。由于患這些腫瘤的病人中血腦屏障的破壞，免疫系統可以到達腫瘤細胞。
Schnegg等人(1981)和Bourdon等人(1983)報道了針對神經膠質瘤細胞系的鼠單克隆抗體的研究，這兩個小組都用培養的人神經膠質瘤細胞系免疫鼠，然后用脾細胞分別與鼠骨髓瘤系P3X63-Ag8或P3X63-Ag8.653融合。Schnegg等人(1981)所描述的單克隆抗體BF7、GE2似乎相對地限于神經膠質瘤，而抗體CG12(de Tribolet，etal.1984)與神經膠質瘤、黑素瘤和神經母細胞瘤等一系列瘤反應。抗體81C6由Bourdon等人(1983)產生和鑒定，發現其與在神經膠質瘤、神經母細胞瘤、黑素瘤、肉瘤和培養的成纖維細胞中表達的神經膠質瘤-間充質胞外基質(glioma-mesenchyalextracellular matrix，GMEM)抗原反應。除了上述之外，GMEM抗原還在正常的肝竇狀隙、脾紅髓竇狀隙、腎髓小管間質組織和腎小球膜中發現。盡管正常的成人和胎兒腦對CG12的吸收會導致其結合活性的喪失，但是BF7、GE2和81C6都不受這種處理的影響。
來自惡性神經膠質瘤病人的人單克隆抗體(HMAb)的報道已出現于文獻中。然而，這些抗體中的任何一種都沒有被很好地表征。
Sikora等人(1982)報道了對0.25％戊二醛固定的神經膠質瘤細胞有反應的HMAb的產生情況。這些研究者獲得了來自12位做惡性神經膠質瘤顱骨切開手術病人的腫瘤內的淋巴細胞，并將它們與EBNA+8-氮鳥嘌呤抗性的人成淋巴細胞樣細胞系LICR-LON-HMy2(已知該細胞系分泌γ和λ鏈)融合。獲得了來自5個病人的總計71個雜交瘤。沒有報道亞克隆試驗，也沒有顯示或證明雜交瘤的單克隆性。該研究還報道了HMAb與其他腫瘤細胞系的交叉反應性。缺點是顯而易見的需要來自人腦的腫瘤內細胞作為原料。
在Sikora等人(1983)隨后的研究中，作者總結到，對于挑選出用于研究的某一HMAb，該HMAb呈低親和性，因為需要高濃度才能顯現出與靶目標的反應性。
本發明的發明人和同事報道了產生5個雜交瘤細胞系，它們中的每個都產生IgM同種型的抗-神經膠質瘤HMAb(Dan，et al.，1992)。這5個雜交瘤的產生是通過將來自4位患星形細胞腫瘤的病人的外周血淋巴細胞與人骨髓瘤樣細胞系TM-H2-SP2進行體細胞融合。
這5個雜交瘤的產生基于這樣的原則患神經腫瘤的病人擁有具備抗-神經膠質瘤特異性的循環B淋巴細胞，并且基于這樣的原則來自神經膠質瘤病人的腫瘤反應抗體可識別人神經膠質瘤中共同的、非等位基因的決定簇(這些決定簇與被異種系統所識別的決定簇在特異性和分布方面存在差異)。
因此，通過融合人骨髓瘤樣細胞系和從患神經膠質瘤病人處獲得的B細胞而產生了這5個雜交瘤。通過適當地培養獲得的雜交瘤，可以獲得可使用量的有效的針對人神經膠質瘤的HMAb。
獲得的人單克隆抗體的一個明顯特征是它們之間的高度相似性，盡管它們用來自4個不同的腫瘤病人的細胞產生，這些病人的腫瘤類型、病史、或腫瘤發展階段不同。而且與已有技術相比，這些HMAb表現出更高的相容性和對人靶細胞更高的識別靈敏度。這些HMAb不與正常的人星形細胞結合。
這些HMAb可用于神經腫瘤放射性定位的診斷成像，用于免疫治療如通過直接作用或將這些HMAb與化學治療劑相連從而使其能直接導向腫瘤細胞。為了具有臨床價值，人單克隆抗體應滿足下列標準1)標記表面，即結合于活腫瘤細胞，2)識別細胞周期非依賴的腫瘤特異性抗原，和3)在體外能同樣好地與腫瘤細胞結合，而不論它們的培養活力、生長特征或培養密度。在獲得的5個抗-神經膠質瘤HMAb中，至少有2個滿足這些標準并且已經被鑒定。這兩個HMAb被命名為BT34/A5和BT32/A6。
本發明提供了編碼HMAb BT34/A5和BT32/A6可變區的輕鏈和重鏈的cDNA序列。本發明包括相應的氨基酸序列和具有所述特征的可變區鏈的IgM同種型人單克隆抗體，以及具有這些鏈的其他蛋白質或蛋白質結合物。具體地，本發明包括具有含超變區(互補決定區，CDR)的輕鏈和重鏈的任何蛋白質或蛋白質結合物(即免疫結合物)，該超變區與本發明的輕鏈和重鏈的超變區相同或至少90％同源。如本領域技術人員所知，免疫結合物包括與抗原結合分子結構相結合的藥物、毒素、細胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他診斷或治療分子。本發明還包括與本發明的HMAb結合的細胞表面標記物或抗原。人單克隆抗體的制備進行細胞融合，以制備人骨髓樣細胞系TM-H2-SP2和來自8個不同的腦腫瘤病人(編號為BT-24、BT-27、BT-32、BT-34、BT-38、BT-39、BT-54、和BT-55)的外周B淋巴細胞(PBL)的雜交瘤。這些病人，有男性和女性，年齡為5-55歲，所患的腫瘤包括原纖維星形細胞瘤、少突神經膠質細胞瘤、原發性神經外皮腫瘤和成膠質細胞瘤。融合按以前所述方法進行(Dan，et al.，1992)。用補充有L-谷氨酰胺(292mg/l)和L-天冬酰胺(44mg/l)的新鮮組織培養基和胎牛血清(FCS)，在96微孔板上孵育細胞。雜交瘤的產生被定義為含有大于50-100個細胞的大集落(肉眼可見)的微孔數除以總接種數，并以百分比表示，為0-19.5％。
在所有樣品中供融合的PBL數目為6.0×106-5.8×107。盡管每個融合體的骨髓瘤細胞與淋巴細胞的比例維持恒定為1∶4，但使用的鋪板密度為1.0×105-2.5×105骨髓瘤細胞/每毫升融合混合物。在某些融合體中選擇較低的鋪板密度，以利于獲得更好的起始單克隆性，而較高的鋪板密度利于提高雜交瘤產生。在所有融合體中，聚乙二醇的濃度為50％(v/v)。
典型地，在融合后4-6周出現可見的雜交瘤生長，而微孔中新的生長常繼續數周以便觀察。一般，最早出現的雜交瘤集落常最穩定。并不是所有在96微孔(0.28cm2/孔)培養期結束時可見的大集落都能成功地繁殖至適合在24孔培養皿(2.01cm2/孔)中生長的數量。例如與BT-54的融合體中，最初在96微孔中長出了7個集落，只有一個能夠在體外長時間生長。沒有觀察到在融合后3月發生雜交瘤生長失敗的例子。
篩選雜交瘤是否存在人免疫球蛋白以及與自身腫瘤的3M KCl抽提物、或者戊二醛固定的神經膠質瘤細胞系的反應性。
篩選了總計1121個含有來自所述融合體的假定的雜交瘤生長的孔，其中發現162(14.5％)個與腫瘤抽提物或神經膠質瘤細胞系反應。對兩個融合體，即BT-27和BT-32，篩選其與數種神經膠質瘤細胞系的反應性，各微孔中發現在多重ELISA(酶聯免疫吸附測定)中呈陽性的例子。
在最后兩個融合體BT-54和BT-55中，對ELISA進行改良以便僅檢測含有反應性IgM類型的微孔。這種改良是通過用來自雜交瘤BT-27/2D2的培養上清液替換TM-H2作為對照，并加入堿性磷酸酯酶偶聯的羊抗-人IgM作為第二抗體而實現的。其理由是，對來自BT-24、BT-27、BT-32和BT-34的34個雜交瘤中存在的免疫球蛋白鏈的分析揭示所有的這34個雜交瘤都含有IgM，而對這些雜交瘤中的少數進行仔細研究揭示僅IgM擔負抗腫瘤活性。來自病人BT-27細胞的雜交瘤BT27/2D2，它在各種免疫反應性的ELISA測定中始終呈陰性，因此選擇它作為非特異的IgM對照(1-4μg/ml)。
對通過上述融合系列而獲得的總計9個免疫球蛋白高產雜交瘤，用FACS-III流式細胞計數儀(Flow Cytometer)篩選與人神經膠質瘤系SK-MG-1的反應性。發現來自雜交瘤BT27/1A2、BT27/2A3、BT32/A6、BT34/A5和BT54/B8的5種上清液可標記這種特定的神經膠質瘤細胞系。所有的5種上清液都含有腫瘤反應性IgM類型。因此，來自8個融合體和在6周時肉眼可見的總計59個雜交瘤中，只有5個(8.4％)與神經膠質瘤細胞系的細胞表面反應從而能夠在培養中維持生長。已注意到，BT27/2A3對SK-MG-1的標記可以得到加強，如果在測試前將SK-MG-1維持于高細胞密度。
所有5種雜交瘤上清液都發現含有μ重鏈。只有BT34/A5含有λ輕鏈，其他4種HMAb含有κ輕鏈。通過使用流式細胞計量術(FCM)分析和FITC-偶聯的羊抗-人IgM(IgG組份，μ鏈特異的；Cappel Laboratories，Cochranville，PA)，每個HMAb都顯示可標記于人神經膠質瘤系SK-MG-1的細胞表面。這表明IgM分子結合于腫瘤細胞膜表面(數據未示)。
在培養中維持約6個月之后，估計的BT27/1A2的IgM濃度為5.0μg/ml；對于BT27/2A3，IgM濃度為44μg/ml；對于BT32/A6，IgM濃度為3.5μg/ml；對于BT34/A5，IgM濃度為2.4μg/ml；對于BT54/B8，IgM濃度為22.4μg/ml。再連續培養6個月后，發現IgM的產量水平是相當的。
5個HMAb中的3個用ELISA測試其相對反應性。在測試的上清液最初濃度下，反應性的次序是BT27/2A3＞BT27/1A2＞BT32/A6，這與它們各自的IgM濃度的次序是一致的。用ELISA分析得出的最終效價(它給出比對照IgM基線高得多的O.D.讀數)是，對BT27/2A3為1∶16，對BT27/1A2為1∶4，對BT32/A6為1∶2。因為該測試涉及在最初步驟中加入等體積即50μl的PBS，所以在ELISA中測試的最初稀釋度為1∶2。在任何稀釋曲線中沒有最初的平臺期，這表明在所用的ELISA條件下腫瘤抽提物的數量并不是限制因素。單克隆性的確定根據Maniatis等人(1982)的方法，從TM-H2-SP2、BT27/1A2、BT27/2A3、BT32/A6和BT27/2D2細胞中分離基因組DNA。將10微克DNA用BamHI和HindIII限制性內切酶(＞3單位/μg DNA；Boehinger-Mannheim，West Germany)按制造商給出的條件，在37℃消化過夜。消化后，DNA在0.8％(w/v)瓊脂糖凝膠上電泳(Maniatis，et al.，1982)，然后用常規方法轉至Genescreen Plus膜(NEN，Boston，MA)上。用鯡魚精子DNA(Boehinger-Mannheim，West Germany)預雜交后，用比活性為5-6×108/μg的32P-標記的JH探針(Oncor Inc.，Gaithersburg，MD)在65℃Southern印跡雜交過夜(Kaufmann，et al.1985)。探針包括完整的人JH區域，總長為5.6kbp(Ravetch，et al.1981)。洗滌后，于-70℃將印跡暴露于帶增感屏的Kodak X光膠片。
Southern印跡分析揭示，雜交瘤BT27/1A2、BT27/2A3、BT32/A6中每個都具有兩條與JH基因區域同源的重排條帶。雜交瘤BT27/2D2似乎具有3條這樣的條帶。用于該試驗的B細胞融合配體TM-H2-SP2只有一條條帶而另一條明顯缺失。此外，在任何“雜交瘤”中沒有JH區域發生TM-H2-SP2型重排的證據。發現作為對照的正常PBL DNA(它由60-70％T細胞衍生的遺傳物質構成)產生與胎盤(種系)DNA相同的印跡圖案。在各樣品中，還有一條共同的低分子量的、含有不相關序列的條帶。
Ig重鏈基因位于人14號染色體上，它有4個不同元件構成，分別為VH(可變(variable))、DH(多變(diversity))、JH(連接(joining))和CH(恒定(constant))區。在種系DNA中，這些區域被間插序列所隔開，而一旦細胞開始向B細胞分化，這些間插序列便被拼接去除。
最初認為，只有一條染色體發生重排而另一條染色體維持種系構型(等位基因排斥原則)。然而在鼠重鏈基因中，第二條染色體基本上總是重排的(Nottenburg andWeissman，1981)。因比提出，對于給定細胞，功能性重排的可能性一定非常低(Coleclough，et al.1981)。因而人們會遇到每個細胞中兩個非功能、或一個功能和一個非功能、但極少兩個功能重鏈發生重排的情況，這些觀察結果對鼠是有效的，而且似乎對更高等的哺乳動物也是對的(Korsmeyer，et al.1983)。
用于這些試驗的重鏈探針包括了整個人種系JH區域。在種系DNA發生重排的情況下，用限制性內切酶BamHI和HindIII消化會產生長度與5.6kbp的JH探針不同的DNA片段。在各雜交瘤中發現兩個這樣的片段，表明對各雜交瘤都檢測到兩個重鏈重排，這與3個中每個雜交瘤的單克隆起源是一致的。流式細胞計量術用生長至匯合并維持該狀態的細胞，對培養的人細胞系和株進行流式細胞計量術分析，其中在標記前至少24小時前更換新鮮培養基。維持并使用來自高細胞密度培養物(即接近飽和)的懸浮培養細胞系。按上述方法平行地對2個或多個進行篩選，其中用建立的陽性細胞系來證實HMAb免疫反應性的存在。
用人細胞系進行FCM篩選的結果總結于表1和表2。測試了幾類神經外皮的和非神經外皮的腫瘤和組織。對30種研究的細胞系，所有的5種HMAb都表現出類似的反應格局，只有少數顯著例外。例如，人上皮宮頸癌細胞系ME180與BT27/1A2和BT27/2A3反應，但不與BT32/A6反應。抗體BT34/A5和BT54/B8都不能與神經膠質瘤細胞系SKI-1反應，但是可以標記黑素瘤細胞系M-4。
只有HMAb BT32/A6有單一的反應格局。抗體BT27/1A2和BT27/2A3都表現出一種反應格局，抗體BT34/A5和BT54/B8具有另一種反應格局，這兩種格局間稍有差別。沒有HMAb與測試的任何血液細胞系反應。
表13種HMAb的反應性腫瘤類型細胞系BT27/1A2aBT27/2A3BT32/A6神經膠質瘤 SK-MG-1 陽性b陽性陽性SK-MG-13 陽性陽性陽性SKI-1 陽性陽性陽性LN-215陰性陰性陰性LN-340陰性陰性陰性U-178 陽性陽性陽性U-373 陽性陽性陽性黑素瘤 M-4 陰性陰性陰性IGR-37陰性陰性陰性IGR-39陰性陰性陰性神經母細胞瘤IMR-32陰性陰性陰性SK-N-MC 陰性陰性陽性成視網膜細胞瘤 Y-76 陰性陰性陰性血液細胞CEM-Tc陰性陰性陰性K-562d陰性陰性陰性HL-60e陰性陰性陰性其他腫瘤HeLaf陽性陽性陽性ME180f陽性陽性陰性C-33Af陰性陰性陰性SW1166g陰性陰性陰性SW1417g陰性陰性陰性SW948g陰性陰性陰性HT29g陰性陰性陰性J82h陰性陰性陰性胚胎成纖維細胞 HEF 陰性陰性陰性WI-38 陰性陰性陰性注a雜交瘤；b檢測到該細胞以高于對照抗體的標記水平的程度與HMAb結合；cT-細胞白血病；d慢性髓細胞白血病；e急性早幼粒細胞白血病；f上皮宮頸癌；g結腸腺癌；h過渡型膀胱細胞癌；N.D.未測試。
表2HMAb BT34/A5和BT54/B8的反應性腫瘤類型細胞系 BT34/A5aBT54/B8 BT27/2A3神經膠質瘤 SK-MG-1陽性b陽性陽性SKI-1 陰性陰性陽性U-373 陽性陽性陽性黑素瘤 M-4陽性陽性陰性血液細胞CCRF-CEMc陰性陰性陰性K-562d陰性陰性陰性HL-60e陰性陰性陰性U-937f陰性陰性N.D.
Rajig陰性陰性N.D.其他腫瘤HeLah陰性陰性陽性ME180h陰性陰性陰性C-33Ah陰性陰性陰性SW1417i陰性陰性陰性SW1463i陰性陰性陰性J82j陰性陰性陰性胚胎成纖維細胞 IMR-90 陽性陽性N.D.
WI-38 陰性陰性陰性注a雜交瘤；b見表1；cT-細胞白血病；d慢性髓細胞白血病；e急性早幼粒細胞白血病；f組織細胞淋巴瘤，單核細胞樣；gB細胞淋巴瘤；h上皮宮頸癌；i結腸腺癌；j過渡型膀胱細胞癌；N.D.未測試。
盡管對一系列的人腫瘤細胞系的反應格局上存在某些小差別，所有5種HMAb都可識別類似的分子物質，無論是生物化學組成還是生物分布方面，盡管它們來自4個患不同腫瘤的不同病人。免疫過氧化物酶染色對于一系列腫瘤細胞的免疫過氧化物酶染色分析，選擇了抗體BT32/A6。腫瘤細胞在蓋玻片上于完全培養基中生長2-3天，用PBS洗滌，用2％甲醛于室溫下固定20分鐘。在用PBS洗滌后，細胞與1％正常羊血清一起孵育60分鐘。再次用PBS洗滌，細胞在室溫下或者與10-20μg/ml MAb或者與對照人骨髓瘤IgM一起孵育120分鐘。再次用PBS洗滌后，在室溫下將細胞用生物素化的羊抗-人IgM染色60分鐘，然后與HRP標記過的鏈球菌抗生物素蛋白再孵育60分鐘，隨后用PBS洗滌。使用于50mMTris-HCl緩沖液(pH7.0)中的0.06％二氨基聯苯胺和0.01％過氧化氫，引發過氧化物酶反應10分鐘。細胞用蘇木精短暫地對染色。如表3所示，染色結果大體證實了流式細胞計量術結果，不同點在于在該測試中HMAb與黑素瘤和神經母細胞瘤細胞系的結合為陽性。
表3HMAb BT32/A6的反應性-過氧化物酶染色腫瘤類型細胞系 BT32/A6神經膠質瘤 SK-MG-1陽性U-373 陽性U-178 陽性U-87MG 陽性神經母細胞瘤SK-N-SH陽性SK-N-MC陽性黑素瘤 SK-MEL5陽性SK-MEL3陽性SK-MEL28 陽性A-375 陽性乳房癌 BT-20 陽性MDA MB-468 陽性MCF-7 陽性結腸癌 HT-29 陰性SK-CO1 陰性人成纖維細胞WI-38 陰性MCR-5 陰性與正常的人星形細胞的反應性評估了培養的人星形細胞與HMAb的標記情況。所有的(抗體)試劑都檢查其與已有的陽性人神經膠質瘤細胞系(U-373)的免疫反應性。HMAb BT27/1A2、BT27/2A3和BT32/A6中沒有一個與培養的來自兩個人的星形細胞發生標記。抗體BT34/A5和BT54/B8也不能與得自一個個體的正常人星形細胞發生標記。相對親和性為了確定5種HMAb的相對抗體親和性，使用改進的De Bernado和Davies(1987)方法。在長時間(18小時)或短時間(4小時)于4℃孵育后，5種HMAb與病人BT-37(多形性成膠質細胞瘤)的腫瘤抽提物的ELISA結果用O.D.測量值表示。對兩個時間點各HMAb的O.D.讀數的比較揭示，對BT32/A6和BT54/B8而言，孵育時間更長會得到統計學上顯著性(p＜0.05)的增加。其他3種HMAb(BT27/A6BT27/2A3和BT34/A5)中沒有一種表現出在4℃長時間孵育后反應性的顯著增加。這些觀察結果暗示，BT32/A6和BT54/B8在低溫下是低親和性抗體。
在長時間孵育(4℃18小時)后，所有的5種HMAb都由ELISA證實與對照相比呈陽性(p＜0.05)，然而在短時間孵育(4℃4小時)后，只有BT27/A6、BT27/2A3和BT34/A5呈明顯陽性；而BT32/A6和BT54/B8并不起陽性反應，這可能是因為它們的低親和性本質。初步的抗原鑒定檢查了培養的神經外皮細胞系的總脂類抽提物的斑點印跡。LN-340和M-4神經膠質瘤和黑素瘤細胞系是以前顯示不與5種HMAb中任何一種反應的神經膠質瘤和黑素瘤細胞系。與對照HMAb BT27/2D2相比，當用來自神經膠質瘤細胞系U-373的糖脂測試時，表現出某種程度的對5種HMAb的潛在反應性。至于神經膠質瘤系SK-MG-1，除BT54/B8之外的所有HMAb都表現出與脂類抽提物有某種程度反應性，盡管這些斑點印跡的質量并不完全令人滿意。
對從SK-MG-1神經膠質瘤細胞制備而得的總脂類抽提物進行免疫色譜，其中使用BT34/A5和親代系TM-H2作為對照。觀察到單一的Rf＝0.60特異性條帶。此外，在BT34/A5和TM-H2泳道中都有Rf＝0.80的非特異性條帶。在另外試驗中，與BT/2D2相比，BT27/1A2和BT27/2A3都獲得了類似結果，即Rf＝0.60的特異性條帶。用HMAbBT54/B8進行的免疫色譜不能揭示存在任何特異性的條帶格局，但該結果與斑點印跡試驗是一致的。
這些結果暗示，HMAb識別糖脂或神經節苷脂的決定簇，該決定簇在糖蛋白的相關檢查中沒有檢測出。附圖的簡述

圖1A-1D是刮下的SK-MG-1細胞的流式細胞計量術分析圖。
圖2A和2B是可通透用BT32/A6(圖2B)標記的PI的神經膠質瘤細胞相對對照(圖2A)的流式細胞計量術圖。
圖3顯示了在不同分流比下傳代匯合的SK-MG-1細胞培養物時活細胞對非活細胞的比例。
圖4顯示在各自分流比下細胞生長速率。
圖5顯示了在不同分流比下細胞周期各階段中細胞的相對數目。所示的趨勢與圖4所示的生長速率的增加是一致的。
圖6顯示了MAb BT32/A6標記SK-MG-1細胞相對培養物分流比。人單克隆抗體BT32/A6選擇MAb BT32/A6用于進一步鑒定。
制備BT32/A6的細胞培養上清液用補充有10％胎牛血清(FBS)、1％L-谷氨酰胺和1％HT(Gibco，Grand Island，NY)的RPMI-1640培養基，在T175平方厘米燒瓶(Costar，Cambridge，MA)或3升攪拌瓶(Kontes，Vineland，NJ)中使細胞生長。在生長4或5天后，當細胞密度為1-2×106/升時，通過在500g離心10分鐘而收獲上清液。該上清液或者直接使用，或者濃縮和純化然后再使用。對于細胞培養上清液的濃縮，在minitan濃縮器(millipore，Bradford，MA)中使用下限為10,000分子量的切向流量膜(tangential flow menbrane)。IgM抗體的純化在含有固定式離子交換ABx(J.T.Baker Inc.，Phillipsburg，NJ)、Q-Sepharose Fast Flow和Superose-6(Pharmacia，Uppsala，Sweden)柱色譜上進行。MAb的最終濃度用多克隆人IgM(Cappel Labs.，Malvern，PA)產生的標準曲線，通過抗原俘獲ELISA確定。與報道(Dan，et al.1992)一致，SK-MG-1神經膠質瘤細胞(最初命名為AJ；Pfreundschuh，et al.，1978)的FCM分析揭示，存在兩個不同的細胞群，為“小”和“大”細胞(根據前向散射圖)。通過用機械方式將細胞從燒瓶上刮下，而從組織培養物上切下SK-MG-1神經膠質瘤細胞，觀察結果是基于該神經膠質瘤細胞而獲得的。當SK-MG-1細胞用胰蛋白酶或EDTA(它們對細胞的苛刻程度較低)取下時，FCM分析顯示只有一種細胞群(結果未示)。對刮下的SK-MG-1細胞的熒光激活分揀揭示，“小”細胞有2.0％的集落形成效率(colony-forming efficiency，CFE)，而“大”細胞的CFE為38.0％，高幾乎20倍。當刮下的SK-MG-1神經膠質瘤細胞用PI(碘化丙錠，propidium iodide)單獨標記時，僅在“小”細胞而沒有在“大”細胞中觀察到PI熒光的增加。因為死細胞會被PI標記，因此可以得出結論刮下的SK-MG-1中“大”細胞是活的，而“小”細胞是無活力的。活細胞的表面標記當非活“小”細胞反向進入(backgated)前向散射對90度散射圖時，它們在縱坐標上是位置低于活的“大”細胞的單獨群。在“大”細胞周圍劃定一個區域(圖1A中區域‘A’)，在所有的FCM樣品中都加入PI以進一步協助只允許進入活的和可存活的SK-MG-1神經膠質瘤細胞。在圖1B中，標為‘B’的區域為沒有被PI標記的SK-MG-1細胞。在‘B’右側的雙峰代表攝人PI的SK-MG-1神經膠質瘤細胞(區域‘C’)，它們是無活力的。雙峰分別代表細胞周期中G0/G1和G2/M峰。圖1C為同時進入的來自區域‘A’和區域‘B’的SK-MG-1細胞，因此它們是活的并且能夠在體外形成集落。這些細胞已被對照MAb所標記。發現這些細胞的平均FITC熒光在加入HMAb BT32/A6后的增加程度＞360％(圖1D)。因此人IgM MAbBT32/A6可標記那些有活力并且在體外可形成集落的活SK-MG-1神經膠質瘤細胞的表面。細胞周期非依賴的抗原的表達通過放入可通透PI(圖1B，區域‘C’)的并用MAb BT32/A6標記的SK-MG-1神經膠質瘤細胞，研究整個細胞周期中BT32/A6抗原的表達。結果示于圖2B，表明在G0/G1和G2/M期中都可標記腫瘤細胞。在細胞周期的S期中SK-MG-1細胞的標記最低，這在圖上沒有反映。
對細胞周期各階段標記情況的觀察得到下列發現的支持發現在近100％活的SK-MG-1細胞中有熒光增加。在任何時刻，都有一定比例的SK-MG-1細胞處于細胞周期的各階段。因此近100％細胞被標記必然意味著，處于各細胞周期中的所有SK-MG-1細胞都被MAb BT32/A6所標記。因此，BT32/A6抗原在活細胞表面的表達是不受研究時細胞傳代比例和在SK-MG-1培養密度下細胞周期狀態的影響。抗原表達和培養物分流比將SK-MG-1神經膠質瘤細胞的匯合培養物以分流比0、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32和1∶64進行傳代，然后在標準條件下生長3天，在下列參數方面有明顯趨勢1)活細胞對非活細胞的比例(圖3)，2)細胞生長速度(圖4)，和3)在細胞周期G0/G1、S和G2/M期中細胞的相對數目(圖5)。在培養物活力(用活細胞對非活細胞的比例確定)和細胞生長速度(用第3天細胞數目(以第0天細胞數目的百分比形式表示)確定)之間存在非常顯著的相關性，其r＝0.991，p＜0.01。
相對培養物活力、生長速度和細胞周期階段而言，在作為培養物分流比函數的MAbBT32/A6對SK-MG-1神經膠質瘤細胞的標記中，沒有觀察到明顯趨勢(r＝-0.303，p＞0.05，圖6)。所述數據不能反駁虛假設，即使用Student’s t-測試時的回歸線斜率為零。因此，MAb BT32/A6對SK-MG-1的標記與下列因素無關1)培養物活力，2)生長速度，和3)研究中傳代分流比范圍內細胞周期階段。補體介導的細胞毒性用含有5％FBS和5mM HEPES，pH7.2的RPMI-1640培養基洗滌人神經膠質瘤(SK-MG-1)細胞。將50微升含5×105細胞/毫升的SK-MG-1懸浮液在96孔板(Costar，Cambridge，MA)的園底微滴定孔中，與50微升培養基(對照)或不同稀釋度的MAb(測試樣品)在室溫下孵育2小時。所有樣品都重復一次。然后微滴定板在400g離心5分鐘。除去上清液，向各孔中加入50微升培養基或1∶10兔補體(Cederlane Laboratories，Hornby，ON，加拿大)稀釋液。再在37℃孵育90分鐘。孵育后，板在400g離心5分鐘并除去25微升上清液，然后置于冰上。在分析結束時，用等體積的0.2％錐蟲藍對細胞懸浮液樣品進行染色，在血細胞計數儀上計算活細胞的百分比。計算兩個樣品的平均活力。因MAb造成的特異細胞毒性的百分比用下列公式確定 結果總結于表4。
表4人MAb BT32/A6的補體依賴的細胞毒性 注a兔補體，b未測試。HMAb BT32/A6和BT34/A5的鑒定用標準程序(Le Boeuf et al.(1989)，Schroeder et al.(1990))，獲得HMAb BT32/A6和BT34/A5輕鏈和重鏈可變區的DNA序列。從雜交瘤細胞系BT32/A6和BT34/A5中抽提mRNA，并用對V-區序列特異的引物通過PCR擴增V-區cDNA。制備合適的克隆表達載體，在含有氨芐青霉素的LB培養基中使細菌培養物生長。用ALKALI法(Molecular cloning，Maniatis)微量制備雙鏈DNA，用United States Biochemical試劑盒和方案對DNA測序。
因為人IgM的輕鏈和重鏈恒定區的DNA序列是已知的，所以對人IgM可變區的測序將導致對其的完全鑒定。
在序列表中給出了各種序列。HMAb BT34/A5具有編碼VH(μ)鏈的363個核苷酸的cDNA序列(SEQ ID NO1)。還闡述了30個核苷酸長的、VH(μ)BT34/A5的部分信號序列(SEQ ID NO2)。這些cDNA編碼序列顯示，BT34/A5 VH(μ)由121個氨基酸殘基(SEQ ID NO3)構成，而部分信號序列由10個氨基酸殘基構成(SEQ IDNO4)。
HMAb BT34/A5的VL(λ)鏈具有333個核苷酸的cDNA編碼序列(SEQ ID NO5)，編碼111個氨基酸殘基的蛋白質鏈(SEQ ID NO6)。還闡述了30個核苷酸的部分信號序列(SEQ ID NO7)，它編碼10個氨基酸殘基(SEQ ID NO8)。
HMAb BT32/A6的VL(κ)鏈具有339個核苷酸的cDNA編碼序列(SEQ ID NO9)，編碼113個氨基酸殘基的蛋白質鏈(SEQ ID NO10)。還闡述了60個核苷酸的信號序列(SEQ ID NO11)，它編碼20個氨基酸殘基(SEQ ID NO12)。
HMAb BT32/A6的VH(μ)鏈的序列沒有被完全闡明，只有FR1和FR4區的部分序列。因此，該VH(μ)鏈的部分cDNA編碼序列為360個核苷酸(SEQ ID NO13)，它編碼120個氨基酸殘基的蛋白質鏈(SEQ ID NO14)。
對這些序列結果的最初分析表明，至少對于BT32/A6的VH(μ)而言，抗原結合位點可能位于CDR3區即SEQ ID NO14中氨基酸92-114。
此處鑒定的V鏈的超變區或互補決定區(complementarity determining region，CDR)特別令人感興趣，因為它們中至少部分涉及結合抗原。因此，本發明包括那些具有帶CDR的免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變鏈的分子，只要其CDR與此處鑒定的CDR具有90％以上的同源性。
因此，HMAb BT34/A5的VH(μ)鏈具有下列互補決定區(CDR)CDR1SEQ ID NO15CDR2SEQ ID NO16CDR3SEQ ID NO17HMAb BT34/A5的VL(λ)鏈具有下列CDRCDR1SEQ ID NO18CDR2SEQ ID NO19CDR3SEQ ID NO20HMAb BT32/A6的VH(μ)鏈具有下列CDRCDR1SEQ ID NO21CDR2SEQ ID NO22CDR3SEQ ID NO23HMAb BT32/A6的VL(K)鏈具有下列CDRCDR1SEQ ID NO24CDR2SEQ ID NO25CDR3SEQ ID NO26討論此處所示的數據顯示，被MAb BT32/A6識別的抗原的表達是獨特的，因為不論培養密度、培養活力或細胞周期階段，幾乎100％SK-MG-1細胞都表達這種抗原(用FCM確定)。由于HMAb BT34/A5與BT32/A6的相似性，對于BT34/A5的結合預計有類似的結果。該抗原識別是非常不尋常的，其理由是惡性神經膠質瘤一般被認為是異質性腫瘤，所以找到給定腫瘤的所有細胞中共有的生物特性是不同尋常的。事實上，異質性是大多數(如果不是全部的話)瘤形成組織的共同特征；它可能是通過“正常的”機制而發生，也可能是由于該癌細胞特有的增強的遺傳不穩定性所造成的。這暗示，按最嚴格意義，術語“腫瘤異質性”應保留給在細胞譜系中存在差異的情況。細胞周期效應和其他漸成現象在腫瘤細胞多樣性上又增加了復雜程度。
存在少數腫瘤特異性MAb，它們可識別100％所有的瘤形成細胞，即使在如SK-MG-1這樣的高傳代系中。在一次采用計算機輔助的細胞熒光計量術研究中，Stavrou等人(1989)報道了兩種這樣的MAb，MUC8-22和MUC2-63，可識別100％某種培養的星形細胞瘤和成膠質細胞瘤系(如86HG-63，86HG-39)，盡管這種觀察結果是罕見的。與作者同組的研究者發現，顯示與抗體結合的細胞百分比在不同細胞系之間，甚至在各細胞系不同傳代之間有所變化。
Kokunai等人(1990)報道，一種人MAb(CLN-IgG)識別神經膠質瘤相關的抗原，該抗原的表面表達受細胞周期狀態的影響。已表明，在神經膠質瘤細胞表面上，被CLN-IgG識別的抗原的表達在細胞周期G2/M期時明顯增加，而在G0/G1期顯著減少。這些發現具有重要的治療含義，因為最常規的輔助治療(如放療、化療)針對處于細胞周期中的腫瘤細胞，而認為腫瘤干細胞所存在的地方是有絲分裂相對靜止的、非細胞周期中的細胞群。如果基于MAb的腫瘤免疫治療要成功的話，它必須針對那些處于有絲分裂靜止的腫瘤細胞以及活躍分裂的腫瘤細胞。該需求意味著，MAb必須針對譜系依賴的而不是細胞周期依賴的腫瘤相關抗原。
迄今為止，其他只有一個報道涉及針對星形細胞瘤相關抗原的MAb，其中該抗原以細胞周期非依賴方式表達(Sarawar et al.，1991)，如FCM分析所示。這種特定的MAb被命名為M2，它是一種識別在大量不同的中樞神經系統腫瘤中表達的抗原決定簇的鼠MAb，這些腫瘤包括青少年星形細胞瘤、室管膜瘤、成神經管細胞瘤、腦膜瘤和少突神經膠質細胞瘤。還發現M2可與正常成人腦中所有區域中的星形細胞和少量神經元以及胎兒腦反應。
因此，人MAb BT32/A6識別與細胞周期非依賴的、在100％活SK-MG-1細胞上而不是在培養的正常人星形細胞上表達的神經膠質瘤相關抗原。BT32/A6抗原的表達不受細胞密度、生長速度或培養物活力的影響。該特征使MAb BT332/A6(以及可類似地獲得的其他MAb)可以非常好地適用于治療人惡性神經膠質瘤的輔助治療中。通過構建基于MAb BT332/A6可變區序列的免疫毒素，可以在體內導向增殖中(S、G2/M)以及非增殖中(G0/G1)的神經膠質瘤細胞。
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序列表(1)一般信息(i)申請人Michael D.Dan(ii)發明名稱對細胞周期非依賴的神經膠質瘤表面抗原特異的人單克隆抗體(iii)序列數目26(iv)通信地址(A)收信人Ridout & Maybee(B)街道2300 Richmond-Adelaide Centre101 Richmon Street West(C)城市Toronto(D)州Ontario(E)國家加拿大(F)郵編M5C3B1(v)計算機可讀介質(A)記錄介質類型磁盤-3.5英寸，1.4Mb(B)計算機IBM PC兼容型(C)操作系統MS-DOS 6.00(D)軟件Workperfect 5.1(vi)本申請數據(A)申請號(B)申請日(C)分類(vii)在先申請不適用(viii)律師/代理人信息(A)姓名Lake，James R.
(B)登記號(C)參考/案卷號NOVBI/1H(ix)通訊信息(A)電話(416)868-1482(B)傳真(416)362-0823(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度363堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構 線性(xi)序列描述SEQ ID NO1CAG GTT CAG CTG GTG CAG TCT GGA GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGG GCC 48TCA GTG AAA GTC TCC TGC AAG GCT TCT GGT TAC ACC TTC ACC ACC TAT 96GGT CTC AGC TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT GAG TGG ATG 144GGA TGG ATC AGC GCT CAC AAT GGT AAC ACA AAC TCT GCA CAG AAG TTC 192CAG GGC AGA GTC TCC ATG ACC ACA GAC ACA TCC ACG AGC ACA GCC TAC 240ATG GAG GTG AGG AGC CTC AGA TCT GAC GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT 288GCG CGA GTC GGG GTA TGG GAC CTA TTG AAC TAC TTT GAC TAC TGG GGC 336CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA 363(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度30堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO2TTG GTG GCA GCA GCA ACA GGT GCC CAC TCC30(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度121氨基酸(B)類型氨基酸(C)股性不適用(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO3Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr20 25 30Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Trp Ile Ser Ala His Asn Gly Asn Thr Asn Ser Ala Gln Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Ser Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Val Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Val Gly Val Trp Asp Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度10氨基酸(B)類型氨基酸(C)股性不適用(D)拓撲結構線性
(xi)序列描述SEQ ID NO4Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly Ala His Ser5 10(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度333堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO5CAG TCT GTG CTG ACT CAG CCA CCC TCA GCG TCT GGG ACC CCC GGG CAG 48AGG GTC ACC ATC TCT TGT TCT GGA AGC AGC TCC AAC ATC GGA ACT AAT 96ACT GTA AAC TGG TAC CTG CAG CTC CCA GGA ACG GCC CCC AAA GTC CTC 144ATC TAT AGT AAT AAT CAG CGG CCC TCA GGG GTC CCT GAC CGA TTC TCT 192GGC TCC AAG TCT GGC ACC TCA GCC TCC CTG GCC ATC AGT GGA CTC CAG 240TCT GAG GAT GAG GCT GAT TAT TTC TGT GCA GCA TGG GAT GAC AGC CTG 288AAA GGT GTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT 333(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度111氨基酸(B)類型氨基酸(C)股性不適用(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO6Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln5 10 15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Thr Asn20 25 30Thr Val Asn Trp Tyr Leu Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val Leu35 40 45Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln65 70 75 80Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu85 90 95Lys Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly100 105 110(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度30堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO7CTC CTC ACT CAC TGT GCA GGG TCC TGG GCC 30(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度10氨基酸(B)類型氨基酸(C)股性不適用(D)拓撲結構線性
(xi)序列描述SEQ ID NO8Leu Leu Thr His Cys Ala Gly Ser Trp Ala5 10(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度339堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO9GAT ATT GTG ATG ACC CAG ACT CCA CTC TCC CTG CCC GTC ACC CCT GGA 48GAG CCG GCC TCC ATC TCC TGC AGG TCT AGT CAG AGC CTC TTG GAT AGT 96GAT GAT GGA AAC ACC TAT TTG GAC TGG TAC CTG CAG AAG CCA GGG CAG 144TCT CCA CAG CTC CTG ATC TAT ACG CTT TCC TAT CGG GCC TCT GGA GTC 192CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCA GGC ACT GAT TTC ACA CTG AAA 240ATC AGC AGG GTG GAG GCT GAG GAT GTT GGA GTT TAT TAC TGC ATG CAA 288CGT ATA GAG TTT CCT TTC ACT TTC GGC GGA GGG ACC AAG GTG GAG ATC 336AAA 339(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度113氨基酸(B)類型氨基酸(C)股性不適用(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO10Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly5 10 15Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser20 25 30Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val50 55 60Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys65 70 75 80Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln85 90 95Arg Ile Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile100 105 110Lys(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度60堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO11ATG AGG CTC CCT GCT CAG CTC CTG GGG CTG CTA ATG CTC TGG GTC CCT 48GGA TCC AGT GAG 60(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度20氨基酸(B)類型氨基酸(C)股性不適用(D)拓撲結構線性
(xi)序列描述SEQ ID NO12Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro5 10 15Gly Ser Ser Glu20(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度360堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO13GGG GGA GGC TTG GTC CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT TCA 48GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGC TAT GCT ATG CAC TGG GTC CGC CAG 96GCT CCA GGG AAG GGA CTG GAA TAT GTT TCG GCT ATT AGT AGT AAT GGG 144GGT AGC ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG AAG GGC AGA TTC ACC ATC TCC 192AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACT CTG TAT CTT CAA ATG AGC AGT CTG AGA 240GCT GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT GTG AAA GAC AGG TTA AAA GTG 288GAG TAC TAT GAT AGT AGT GGT TAT TAC GTT TCT CGG TTC GGT GCT TTT 336GAT ATC TGG GGC CAA GGG ACA ACG 360(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度120氨基酸(B)類型氨基酸(C)股性不適用(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO14Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser5 10 15Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln20 25 30Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val Ser Ala Ile Ser Ser Asn Gly35 40 45Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser50 55 60Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg65 70 75 80Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Lys Asp Arg Leu Lys Val85 90 95Glu Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Val Ser Arg Phe Gly Ala Phe100 105 110Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr115 120(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度5氨基酸(B)類型氨基酸(C)股性不適用(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO15Thr Tyr Gly Leu Ser5(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度17氨基酸(B)類型氨基酸
(C)股性不適用(D)拓撲結構線性(xi)SEQUENCE DECRIPTIONSEQ ID NO16Trp Ile Ser Ala His Asn Gly Asn Thr Asn Ser Ala Gln Lys Phe Gln5 10 15Gly(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長度12氨基酸(B)類型氨基酸(C)股性不適用(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO17Val Gly Val Trp Asp Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr5 10(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長度13氨基酸(B)類型氨基酸(C)股性不適用(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO18Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Thr Asn Thr Val Asn5 10(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長度7氨基酸(B)類型氨基酸(C)股性不適用(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO19Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser5(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長度11氨基酸(B)類型氨基酸(C)股性不適用(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO20Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Lys Gly Val Val5 10(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長度5氨基酸(B)類型氨基酸(C)股性不適用(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO21Ser Tyr Ala Met His5(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長度17氨基酸(B)類型氨基酸(C)股性不適用(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO22Ala Ile Ser Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys5 10 15Gly(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)長度23氨基酸(B)類型氨基酸(C)股性不適用(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO23Asp Arg Leu Lys Val Glu Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Val Ser5 10 15Arg Phe Gly Ala Phe Asp Ile20(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)長度17氨基酸
(B)類型氨基酸(C)股性不適用(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO24Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu5 10 15Asp(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)長度7氨基酸(B)類型氨基酸(C)股性不適用(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO25Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser5(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)長度9氨基酸(B)類型氨基酸(C)股性不適用(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO26Met Gln Arg Ile Glu Phe Pro Phe Thr權利要求
1.一種分離的、編碼人單克隆抗體BT34/A5的重鏈μ亞組(VH(μ))的可變區的DNA，其特征在于，它具有SEQ ID NO1的核苷酸序列。
2.如權利要求1所述的分離的DNA，其特征在于，它還含有從該DNA的5’端延伸出的核苷酸信號序列，該信號序列在其3’端含有SEQ ID NO2的核苷酸序列。
3.一種分離的、編碼人單克隆抗體BT34/A5的輕鏈λ亞組(VL(λ))的可變區的DNA，其特征在于，它具有SEQ ID NO5的核苷酸序列。
4.如權利要求3所述的分離的DNA，其特征在于，它還含有從該DNA的5’端延伸出的核苷酸信號序列，該信號序列在其3’端含有SEQ ID NO7的核苷酸序列。
5.一種分離的、編碼人單克隆抗體BT32/A6的重鏈μ亞組(VH(μ))的可變區的DNA，其特征在于，它具有SEQ ID NO13的核苷酸序列。
6.一種分離的、編碼人單克隆抗體BT32/A6的輕鏈κ亞組(VL(κ))的可變區的DNA，其特征在于，它具有SEQ ID NO9的核苷酸序列。
7.如權利要求6所述的分離的DNA，其特征在于，它還含有從該DNA的5’端延伸出的核苷酸信號序列，該信號序列在其3’端含有SEQ ID NO11的核苷酸序列。
8.具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的免疫球蛋白VH(μ)鏈。
9.如權利要求8所述的VH(μ)鏈，其特征在于，它還含有位于其C末端處、具有SEQ ID NO4的氨基酸序列的信號序列。
10.一種免疫球蛋白VH(μ)鏈，其特征在于，它的互補決定區(CDR)具有SEQ IDNO15(CDR1)、SEQ ID NO16(CDR2)和SEQ ID NO17(CDR3)的氨基酸序列、或者與其具有至少90％同源性的序列。
11.具有SEQ ID NO6的氨基酸序列的免疫球蛋白VL(λ)鏈。
12.如權利要求11所述的VL(λ)鏈，其特征在于，它還含有位于其C末端處、具有SEQ ID NO8的氨基酸序列的信號序列。
13.一種免疫球蛋白VL(λ)鏈，其特征在于，它的CDR具有SEQ ID NO18(CDR1)、SEQ ID NO19(CDR2)和SEQ ID NO20(CDR3)的氨基酸序列、或者與其具有至少90％同源性的序列。
14.一種免疫球蛋白，其特征在于，其VH(μ)鏈和VL(λ)鏈分別具有SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
15.如權利要求14所述的免疫球蛋白，其特征在于，它是單克隆抗體。
16.如權利要求14所述的免疫球蛋白，其特征在于，它是同種型M。
17.人單克隆抗體BT34/A5。
18.一種免疫結合物，其特征在于，它具有VH(μ)鏈，該VH(μ)鏈的CDR具有SEQID NO15(CDR1)、SEQ ID NO16(CDR2)和SEQ ID NO17(CDR3)的氨基酸序列、或者與其具有至少90％同源性的序列，以及它具有VL(λ)鏈，該VL(λ)鏈的CDR具有SEQ ID NO18(CDR1)、SEQ ID NO19(CDR2)和SEQ ID NO20(CDR3)的氨基酸序列、或者與其具有至少90％同源性的序列。
19.如權利要求18所述的免疫球蛋白結合物，其特征在于，它是免疫毒素。
20.具有SEQ ID NO14的氨基酸序列的免疫球蛋白VH(μ)鏈。
21.一種免疫球蛋白VH(μ)鏈，其特征在于，它的CDR具有SEQ ID NO21(CDR1)、SEQ ID NO22(CDR2)和SEQ ID NO23(CDR3)的氨基酸序列、或者與其具有至少90％同源性的序列。
22.具有SEQ ID NO10的氨基酸序列的免疫球蛋白VL(κ)鏈。
23.如權利要求22所述的VL(κ)鏈，其特征在于，它還含有位于其C末端處、具有SEQ ID NO12的氨基酸序列的信號序列。
24.一種免疫球蛋白VL(κ)鏈，其特征在于，它的CDR具有SEQ ID NO24(CDR1)、SEQ ID NO25(CDR2)和SEQ ID NO26(CDR3)的氨基酸序列、或者與其具有至少90％同源性的序列。
25.一種免疫球蛋白，其特征在于，其VH(μ)鏈分別具有SEQ ID NO14和SEQ IDNO10所示的氨基酸序列。
26.如權利要求25所述的免疫球蛋白，其特征在于，它是單克隆抗體。
27.如權利要求26所述的免疫球蛋白，其特征在于，它是同種型M。
28.人單克隆抗體BT32/A6。
29.一種免疫結合物，其特征在于，它具有VH(μ)鏈，該VH(μ)鏈的CDR具有SEQID NO21(CDR1)、SEQ ID NO22(CDR2)和SEQ ID NO23(CDR3)的氨基酸序列、或者與其具有至少90％同源性的序列，以及它具有VL(κ)鏈，該VL(κ)鏈的CDR具有SEQ ID NO24(CDR1)、SEQ ID NO25(CDR2)和SEQ ID NO26(CDR3)的氨基酸序列、或者與其具有至少90％同源性的序列。
30.如權利要求29所述的免疫球蛋白結合物，其特征在于，它是免疫毒素。
31.一種細胞周期非依賴的、神經膠質瘤相關的細胞表面抗原，其特征在于，它被HMAb BT32/A6特異性結合，而且該抗原不存在于正常人星形細胞的表面。
32.一種細胞周期非依賴的、神經膠質瘤相關的細胞表面抗原，其特征在于，它被HMAb BT34/A5特異性結合，而且該抗原不存在于正常人星形細胞的表面。
全文摘要
本發明通過闡述編碼cDNA而表征了兩種IgM同種型的人單克隆抗體(HMAb)的可變鏈。HMAb可特異性地針對細胞周期非依賴的、神經膠質瘤相關的抗原，而且該抗體不識別培養的正常人星形細胞，基于鑒別出的序列的免疫結合物可以在體內導向增殖中以及非增殖中的神經膠質瘤細胞，從而提供治療這些腫瘤有用的輔助療法。
文檔編號C07K14/47GK1151184SQ95193668
公開日1997年6月4日 申請日期1995年6月16日 優先權日1994年6月21日
發明者邁克爾·D·丹 申請人:邁克爾·D·丹