神經膠質細胞促有絲分裂因子，其制備和應用的制作方法

專利名稱：神經膠質細胞促有絲分裂因子，其制備和應用的制作方法
相關申請的參考本申請為如下申請的部分繼續申請系列號No.08/036,555，申請日1993-3-24，系列號No.07/965,173，申請日1992-10-23，系列號No.07/940,389，申請日1992-9-3，系列號No.07/907,138，申請日1992-6-30，系列號No.07/863,703，申請日1992-4-3。
本發明的背景本發明涉及存在于脊椎動物中的若干多肽，這些多肽為神經膠質細胞包括施旺細胞的促有絲分裂生長因子。本發明還涉及能夠制備這些因子的方法，以及這些因子在治療上的應用。
脊椎動物神經膠質細胞構成了中央和周圍神經系統的特異的連接組織。重要的神經膠質細胞包括施旺細胞，它為神經元提供代謝支援，并為某些周圍神經元的軸突提供髓磷脂鞘，因而形成各神經纖維。施旺細胞在鄰近的神經元的軸突周圍形成同軸的膜層，并圍繞軸突生長、扭轉，支持神經元，并提供鞘的作用。這些髓磷脂為許多神經纖維的易感因子，而且，施旺細胞的損傷或生長發育的失常，可導致許多周圍神經系統疾病和失調，如嚴重的脫髓鞘或神經退化等病征。在神經系統的發育中，很顯然，細胞需有各種因子調節其分化與生長，而近年來各種此類因子已經得到了鑒定，其中包括已發現的一些對于施旺細胞分化或發育起作用的因子。
Brockes等，(另有其它文獻)，于“神經科學雜志”(J.Neuroscience，4，(1984)75-83)上描述了一種從牛腦和腦垂體組織的抽提物中得到的蛋白質生長因子，命名為神經膠質生長因子(Glial Growth Factor，GGF)，該因子刺激在含10％牛胎血清培養基中培養的鼠的施旺細胞分化。該因子據描述分子量為31,000道爾頓并易形成二聚體。在“酶學方法”(Meth.Enz.，147(1987)，217-225)中描述了一種以施旺細胞進行的GGF試驗。
Brockes等，(文獻同上)，還描述了一種使GGF明顯均質的純化方法。簡要地，其描述的一種大量純化的方法包括從冷凍牛前葉中抽提，得到的樣品材料進行層析，從CM-纖維素上用NaCl梯度洗脫。然后用Ultrogel柱進行凝膠過濾，接著用磷酸-纖維素柱洗脫，最后是小量SDS-凝膠電泳。方法也可變動，以CM-纖維素材料直接應用于磷酸纖維素柱，收集過柱組分并以天然制備凝膠電泳純化，隨后進行最后的SDS凝膠電泳。
Brockes等發現以前的報道的凝膠過濾實驗中(Brockes等(“生物化學雜志”J.Biol.chem.225(1980)8374-8377)，生長因子的活性主峰遷移至分子量56,000道爾頓，而在上述的前一種流程中，更具活性的部分為分子量31,000道爾頓。據稱，在此流程中經過CM-纖維素梯度洗脫后，使得GGF二聚體被大大地去除了。
Benveniste等(PNAS，82(1985)，3930-3934)描述了一種T淋巴細胞衍生的神經膠質生長促進因子。這種因子在還原條件下，SDS-凝膠上呈現出明顯的分子量變化。
Kimura等(“自然”，Nature，348(1990)，257-260)描述了從一坐骨神經鞘腫瘤中得到的一種因子，稱之為神經鞘瘤衍生生長因子(Schwannoma-derived growth factor，SDGF)。作者稱SDGF并不刺激氚標記的TdR進入施旺細胞，而與之相反，在同樣條件下，含有GGF的部分純化的腦垂體組分卻有此活性。SDGF的表觀分子量處于31000D至35000D之間。
Davis和Stroobant(細胞生物學雜志，J.Cell.Biol.，110(1990)1353-1360)描述了對若干候選促有絲分裂劑的篩查。實驗使用大鼠施旺細胞，培養基含有10％FCS(牛胎血清)，在加入或不加入forskolin的條件下，測試各待測樣品對施旺細胞中DNA合成的刺激能力。這些被測試的因子之一為GGF-羧甲基纖維素組分(GGF-CM)，當FCS存在，不論有否forskolin，它都具有促細有絲分裂作用。這項工作揭示，在forskolin存在下(主要條件，也需其它)，血小板衍生的生長因子(PDGF)對施旺細胞是一有效的促有絲分裂劑。PDGF從前曾被以為對施旺細胞沒有作用。
Holmes等(“科學”，Science(1992)2561205)和Wen(“細胞”，Cell(1992)69559)稱，編碼與受體(p185erbB2)結合的蛋白質DNA序列，與多種人類腫瘤相關。
p185erbB2蛋白是一185KD的跨膜蛋白，具有色氨酸激酶活性。該蛋白由erbB2原癌基因編碼(Yarden和Ullrich“生化年評”Ann.Rev.Biochem.57443(1988))。erbB2基因，也稱HER-2(在人細胞中)，和neu(在鼠細胞中)，它與表皮生長因子(EGF)的受體緊密相關。近來的證據表明與p185erbB2相互作用的蛋白(和激活p185erbB2激酶的蛋白)能誘導攜帶p185erbB2受體的細胞的增殖(Holmes等Science 2561205(1992)；Dobashi等Proc.Natl.Acad.Sci.888582(1991)；Lupu等Proc.Natl.Acad.Sci.892287(1992))。再有的證據是，表達p185erbB2結合蛋白的基因產生許多大小不同、差異剪切的RNA轉錄產物，因而產生一系列的蛋白質，它們具有不同的長度，但具有一些共同的肽序列和特定的肽序列。人乳腺癌(MDA-MB-231)中得到的差異剪切的RNA轉錄產物支持了這點(Holmes等Science 2561205(1992))。更進一步的支持是作為p185erbB2受體的配體的蛋白(本發明公布于此)，該蛋白具有寬廣的長度變化范圍(見下文)。
本發明概述總體上，本發明提供了刺激神經膠質細胞(尤其是施旺細胞和中央神經系統的神經膠質)有絲分裂的方法，以及呈現這種神經膠質細胞促有絲分裂活性的新型蛋白。此外，本發明還提供了編碼這些蛋白DNA，和編碼與之或相關蛋白結合的抗體的DNA。
本發明的新型蛋白包括編碼由已知多肽的序列經可變的剪切而成的產物。總的來說，這些已知蛋白為GGF/p185erbB2蛋白家族的成員。
特別指出，本發明提供了含有一特異通式的若干多肽，以及編碼這些多肽的DNA序列。這些多肽含有如下的通式WYBZCX其中，WYBAZCX由如圖3l所示氨基酸序列組成(SEQ ID Nos.136-139，141-147，160，161，173-178，42-44，77)；；其中的W含有多肽片段F，或不含有；其中的Y含有多肽片段E，或不含有；其中的Z含有多肽片段G，或不含有；其中的X含有多肽片段C/D HKL，C/DH，C/D HL，C/D D，C/D′HL，C/D′HKL，C/D′H，C/D′D，C/D C/D′HKL，C/DC/D′H，C/D C/D′HL，C/D C/D′D，C/D D′H，C/D D′HL，C/D D′HKL，C/D′D′H，C/D′D′HL，C/D′D′HKL，C/D C/D′D′H，C/D C/D′D′HL或C/D C/D′D′HKL；在此情況下，要么a)F，Y，B，A，Z，C，或X至少其中之一為牛來源的；或者b)Y含有多肽片段E；或者c)X含有多肽片段C/D HKL，C/D D，C/D′HKL，C/D C/D′HKL，C/D C/D′D，C/DD′H，C/D D′HL，C/D D′HKL，C/D′D′H，C/D′D′HKL，C/D C/D′D′H，C/D C/D′D′HL，C/D C/D′D′HKL，C/D′H，C/D C/D′H，或C/D C/D′HL。
再有，本發明包括含有編碼片段5′FBA3′的DNA序列，以及具有氨基酸序列如圖31所示(SEQ ID Nos.136，138，139，173-175)的相應的多肽片段；含有編碼片段5′FBA′3′的DNA序列，以及具有氨基酸序列如圖31所示(SEQ ID Nos.136，138，140，173，174)的相應的多肽片段；含有編碼片段5′FEBA3′的DNA序列，以及具有氨基酸序列如圖31所示(SEQ ID Nos.136-139，173-175)的相應的多肽片段；含有編碼片段5′FEBA′3′的DNA序列，以及具有氨基酸序列如圖31所示(SEQ ID Nos.136-138，140，173，174)的相應的多肽片段；以及含有編碼GGF2HBS5的cDNA克隆片段的DNA序列(ATCC保藏號No75298，保藏日1992-9-2)。
本發明還包括通式FBA，FEBA，FBA′，FEBA′代表的多肽，以及編碼這些多肽的DNA序列，其中這些多肽片段的相應的氨基酸序列如圖31所示，各自對應SEQ ID Nos.(136，138，139，173-175)，(136-139，173-175)，(136，138，140，173，174)，和(136-138，140，173，174)。純化的GGF-II多肽(SEQ ID No.167)也包括在本發明之內。
作為本發明的一方面還包括，用于治療神經膠質，特別是用于治療中央神經系統的少突神經膠質細胞、小膠原細胞和星形膠原細胞疾病的這些多肽與為其編碼的DNA，及其給藥方法。
本發明還包括成熟的GGF肽及編碼其的DNA，不包括N-末端的信號序列，它可用于中央神經系統的治療以及制備對上述多肽特異的抗體。這些抗體可用來純化本文描述的多肽及診斷。
本發明還包括帶有編碼上述氨基酸的DNA序列的載體。本發明還包括帶有編碼上述氨基酸的DNA序列的宿主細胞。本發明還包括那些與p185erbB2受體結合并且具有體內或/和體外刺激神經膠質細胞有絲分裂的化合物。
本發明的再一方面為抗本文描述的新型多肽的抗體。此外，本文所述的多肽的抗體可用于純化本發明的多肽；該多肽的抗體也可用于抑制神經膠質細胞有絲分裂的治療。
本發明還提供了一種方法，用于刺激神經膠質細胞有絲分裂。該方法中用如下通式定義的多肽與神經膠質細胞接觸WYBAZCX其中，WYBAZCX由如圖31所示氨基酸序列組成(SEQ ID Nos.136-139，141-147，160，161，173-178，42-44，77)；；其中的W含有多肽片段F，或不含有；其中的Y含有多肽片段E，或不含有；其中的Z含有多肽片段G，或不含有；其中的X含有多肽片段C/D HKL，C/DH，C/D HL，C/D D，C/D′HL，C/D′HKL，C/D′H，C/D′D，C/D C/D′HKL，C/DC/D′H，C/D C/D′HL，C/D C/D′D，C/D D′H，C/D D′HL，C/D D′HKL，C/D′D′H，C/D′D′HL，C/D′D′HKL，C/D C/D′D′H，C/D C/D′D′HL或C/D C/D′D′HKL。
本發明還包括神經膠質細胞促有絲分裂因子的制備方法。其中包括上述在允許表達本發明的DNA序列的條件下將修飾后的宿主細胞的培養。
利用本發明肽還可制成藥劑用于人和動物。此外，藥劑可以單位劑量形式與可接受的稀釋劑、載體或賦形劑合用。
用上述作為神經膠質細胞有絲分裂劑的多肽接觸神經膠質細胞以刺激其有絲分裂的方法也是本發明的一部分。本發明還包括采用一定的有效劑量的多肽給藥使脊椎動物(最好為哺乳動物，首推人)神經膠質細胞進行有絲分裂的方法。
本發明的又一方面為利用所述的多肽治療疾病或失調的方法。例如，用如述多肽有效治療或預防神經疾病或神經失調的方法。對所限定的多肽敏感或有反應的細胞所屬的神經系統的病理生理狀況的預防和治療方法也為本發明的一個部分。
本發明還包括治療有關周圍神經系統損傷、中央神經系統損傷、神經退化失調、周圍或中央神經系統髓鞘化、或施旺細胞、少突神經膠質細胞、小神經膠質細胞和星型神經膠質細胞的損傷或缺失等情況的方法。例如，感覺或運動神經纖維的神經病，或神經退化失調的治療都包括在內。所有這些病例中，治療包括以有效劑量多肽給藥。
本發明還包括采用上述的多肽的有效劑量給藥來誘導神經再生和/或修復的方法。這種治療方法是采用該多肽和一種藥物有效載體一起給藥。
本發明包括將上述多肽用于制造藥品。
本發明還包括將上述多肽用于--免疫哺乳動物生產必要時用于治療或診斷的抗體--通過競爭試驗對具有相當于這些多肽的受體結合特性的分子作鑒定或定量；和/或--利用上述多肽和能與多肽特異結合的受體一起接觸樣品，以檢測與多肽結合的競爭抑制性--在一親和分離程序或親和層析中用來分離相應的受體。
本發明還包括神經膠質瘤的預防和治療方法。該方法包括施用一種能抑制上述多肽結合的物質的有效劑量。
本發明還包括刺激神經膠質細胞有絲分裂活性的方法，通過對神經膠質細胞施用一種--來自人乳腺細胞系MDA-MB231的30KD的多肽因子；或--來自大鼠轉化成纖維細胞系I-EJ的35KD的多肽因子；或--來自人乳腺細胞系SKBR-3的75KD的多肽因子；或--來自大鼠轉化成纖維細胞系I-EJ的44KD的多肽因子；或
--來自活化的小鼠腹膜巨噬細胞的25KD的多肽因子；或--來自人乳腺細胞系MDA-MB231的45KD的多肽因子；或--來自人T-細胞系ATL-2的7至14KD的多肽因子；或--來自牛腎細胞的25KD的多肽因子；或--來自腦的42KD的多肽因子(ARIA)；或本發明還包括分別采用如圖38至43和序列號154至159的多肽EGFL1，EGFL2，EGFL3，EGFL4，EGFL5和EGFL6在體內和體外刺激神經膠質細胞有絲分裂的方法。
本發明還包括采用具有如圖45所示序列的多肽GGF-II來刺激神經膠質細胞有絲分裂。
本發明的另一方面還包括采用上述的多肽刺激施旺細胞產生生長因子，這些生長因子可收集起來用于科研和治療。
更進一步，這里所述的肽類可用于誘導中央神經膠質增殖和髓鞘再生來治療疾病，特別是治療需要髓鞘再生的疾病，如MS。
本發明的另一方面為上述的新型多肽可用于刺激乙酰膽堿受體的合成。
如上所述，本發明提供了來自包括牛和人的哺乳動物的新型的神經膠質細胞生長因子，它們與已知的因子不同。這些因子對生長在胎牛血漿(FCP)條件下的施旺細胞有促有絲分裂的作用。本發明還提供了制備這些因子的方法流程以及限定這些因子和其它因子活性的改進方法。這些因子的在治療學上的應用是本發明的更重要一個方面。
因此，本發明的重要部分是(a)一個在提供胎牛血漿時具有刺激神經膠質細胞，特別是施旺細胞有絲分裂活性的基本多肽因子，其分子量約30KD至36KD，其氨基酸序列包括一個或多個如下的多肽序列FKGDAHTEASLADEYEYMXKTETSSSGLXLKASLADEYEYMRKAGYFAEXAR
TTEMASEQGAAKEALAALKFVLQAKKETQPDPGQILKKVPMVIGAYTEYKCLKFKWFKKATVMEXKFYVPKLEFLXAK；和(b)一個在提供胎牛血漿時具有刺激神經膠質細胞特別是施旺細胞分裂活性的基本多肽因子，其分子量約55K至63KD，其氨基酸序列包括一個或多個如下的多肽序列VHQVWAAKYIFFMEPEAXSSGLGAWGPPAFPVXYWFVVIEGKASPVSVGSVQELQRVCLLTVAALPPTKVHQVWAAKKASLADSGEYMXKDLLLXVEGKVHPQRRGALDRKPSCGRLKEDSRYIFFMEELNRKNKPQNIKIQKK
從較小分子量的多肽因子和較大分子量的多肽因子衍生而來的上述新型多肽的序列，也是本發明的權益內容。這些來源于本發明的多肽因子的序列可制作成探針，用于從不同物種中探查、分離或制備這些因子(或相關基因序列)，或通過重組技術制備這些因子，或用傳統技術產生相應抗體，(優選單克隆抗體)，它們本身可用作為探查工具，甚至可能用于治療。本發明還包括分離到的編碼神經膠質細胞促有絲分裂活性劑的基因序列或其片段，它們可通過利用本發明上述所提供的用于制備新型多肽的序列的方法而得到。
從本發明中高度純化的因子得到的短肽，可以使其它序列得以確定(見下面的實施例)。
因此，本發明還包括一個具有神經膠質細胞促有絲分裂活性的多肽因子，并包括一個由如下描述所編碼的氨基酸序列(a)分別為圖28a，28b，或28c，序列號133-135所示的DNA序列(b)圖22序列號89所示的DNA序列(c)圖28a序列號133所示核苷酸281-557序列中代表的DNA序列，或(d)與(a)，(b)或(c)中任一DNA序列雜交的DNA序列。
本發明還包括與上述序列有大于60％(優選大于80％)同源性的序列。
盡管目前的發明沒有限定一特殊的雜交條件，但下面的方案可在需要時作為總的指導方法通過缺口翻譯或按Schowalter和Sommer(“分析生化”Anal.Biochem.，17790-94，1989)的PCR反應給DNA探針標記高度比活性(大致108至10932Pdmp/ug)，經G-150Sephadex柱脫鹽純化。探針變性(沸水浴10分鐘，接著浸入冰水中)后，按106dpm32P/ml用量加入到含10％硫酸葡聚糖的80％緩沖液B(2g聚乙烯吡咯烷，2g Ficoll-400，2g牛血清蛋白，50ml 1M Tris HCl(pH7.5)，58g NaCl，1g焦磷酸鈉，10g二烷基磺酸鈉，950ml H2O)雜交液，于60℃孵育過夜(16小時左右)。于60℃洗滌膜，先在緩沖液B中洗15分鐘，接著在2×SSC，0.1％SDS中洗3次每次20分鐘，然后在1×SSC，0.1％SDS中洗20分鐘。
在其它方面，本發明提供了(a)一個來自牛腦垂體物質的基本多肽因子，無論是否還原條件，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳觀察其分子量在30KD至36KD左右，所用的分子量標準為
溶菌酶(雞蛋白)14400大豆胰蛋白酶抑制劑21500碳酸酐酶(牛) 31000卵清蛋白(雞蛋白) 45000牛血清蛋白66200磷酸酶B(兔肌肉) 97400在提供胎牛血清時，該因子具有包括刺激大鼠施旺細胞分裂的促神經膠質細胞有絲分裂活性，經反相HPLC分離，于4℃保存在0.1％三氟乙酸中十周后，仍保留至少50％的上述活性。
(b)來自牛腦垂體的一個基本多肽因子，在非還原條件下，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳觀察其分子量在55KD至63KD左右，所用的分子量標準為溶菌酶(雞蛋白)14400大豆胰蛋白酶抑制劑21500碳酸酐酶(牛) 31000卵清蛋白(雞蛋白) 45000牛血清蛋白66200磷酸酶B(兔肌肉) 97400所述等同的人因子是由此文闡述的DNA克隆GGF2HBS5所編碼，該因子具有神經膠質細胞促有絲分裂活性，其中包括在胎牛血漿存在條件下刺激大鼠施旺細胞分裂。并且經反相HPLC分離后，在0.1％三氟乙酸溶液中于4℃保溫4天后，仍保持有至少50％的活性。
為了便于說明，本發明的低分子量和高分子量因子在下文中分別以“GGF-I”和“GGF-II”來表示。“GGF2”是指各種分離出的、包含有源于GGF-II蛋白的多肽序列的克隆(即GGF2HBS5，GGF2BPP3)。
應該指出本文所引用的分子量范圍并不精確，依特殊多肽因子的來源不同而有細微的改變。例如，差異達10％對于不同來源的材料而言并非不可能。
本發明的另一重要方面是指編碼具有神經膠質細胞促有絲分裂活性的多肽的DNA序列，它包括(a)圖28a、28b或28c中所示的任一DNA序列，SEQ IDNo.133-135；(b)圖22所示之DNA序列，SEQ ID.No.89；(c)圖28a所示的281位到557位核苷酸所表示的DNA序列，SEQ ID No.133；(d)可同上文(a)、(b)或(c)中所示序列中任何一個雜交的DNA序列。
本發明的另一方面應用了這一事實，即神經膠質生長因子和P185erbB2配體蛋白為同一基因所編碼。由此基因衍生出各種各樣的信使RNA剪切變異體(及其所致蛋白)，其中許多蛋白產能結合并激活P185erbB2。已使用該基因(GGF-II)的幾種產物顯示具有促施旺細胞有絲分裂活性。本發明提供了將GGF/P185erbB2配體基因的所有已知產物作為施旺細胞促有絲分裂劑的用途。(于上文所列參考文獻中說明)。
本發明也涉及其它非天然分離出的神經膠質生長因子基因的剪切變異體。圖30，給出了通過聚合酶鏈式反應實驗(由反轉錄RNA進行)和cDNA克隆分析(如文中提供)而得知的剪切形式，以及由已發表的編碼P185erbB2配體蛋白的序列(Peles等，《細胞》69205，1992和Wen等，《細胞》69599，1992)所得知的剪切形式。連同其它在本文中公開的剪切形式，這些形式代表了存在的可能剪切形式。因此本發明的另一方面涉及編碼由此基因而來的新型蛋白因子的核苷酸序列。本發明也提供了這些因子的制備方法。這些新因子的治療應用是本發明的另一個方面。
因此，本發明的其它重要方面是(a)一系列具有促神經膠質細胞有絲分裂活性包括刺激施旺細胞分裂的人和牛多肽因子。這些肽序列于圖31、32、33和34，SEQ ID Nos 136-137，173中分別列出。。
(b)一系列具有促神經膠質細胞有絲分裂活性并能刺激施旺細胞分裂的多肽因子，它們已經純化并鑒定。其方法參見下列文獻LuPu等，《Science》2491552，1990；LuPu《美國國家科學進展》USA892287，1992，Holmes等，《科學》2561205，1992；Peles等，69205，1992；Rarden和Peles，《生物化學》303543，1991；Dobashi等，《美國國家科學進展》，888582，1991；Davis等，《生化及生物物理研究通訊》，1791536，1991；Beaumont等，PCT專利申請PCT/US91/03443，1990；Greene等，PCT專利申請PCT/US91/02331，1990；Usdin和Fischbach，《細胞生物學雜志》103493-507，1986；Falls等，《冷泉港生物專題季刊》，55；397-406，1990；Harris等，《美國科學進展》887644-7668，1991；和Falls等，《細胞》72801-815，1993。
(c)一種具有神經膠質細胞促有絲分裂活性并能刺激施旺細胞分裂的多肽因子，其氨基酸序列示于圖32，SEQ ID.No.148，它由圖32SEQ.ID.No.148所示牛DNA序列所編碼。
上文所述并在圖31、32、33、34、SEQ.ID.Nos136-150，173-176，178，42-44，77中分別列出的新型人多肽序列代表了一系列能從天然來源<適宜組織中制備的cDNA文庫>的以全長互補DNAs(cDNAs)形式分離出的剪切變異體，或者由該領域中技術人員從單個外顯子<例分離出的外顯子>組合成DNA構建體。
能同P185erbB2受體特異結合的其它化合物，特別是肽類，也可按照本發明用作神經膠質細胞促有絲分裂劑。某種推薦化合物可按P185erbB2結合與否作常規篩選，如果結合，則可用本文中所闡述的方法篩選其神經膠質細胞促有絲分裂活性。
本發明包括任何不顯示明顯降低活性的上述多肽因子的修飾或等同物。例如，氨基酸組成或順序發生改變但對活性并無大的不利影響的修飾包括在內。依照說明的方法，天然蛋白的突變在EP-A109748中加以公開，其中通過以中性氨基酸替換天然序列中與生物活性無關的任一半胱氨酸的方法避免了不需要的二硫鍵。本文中所包括的效果和應用的陳述均據此構思，使那些運用修飾或等同物的效果和應用成為本發明的一部分。
本發明中的新序列體現了重組技術的益處，本發明包括下列方面(a)包括上面所限定的DNA序列的DNA構建體，由該構建體轉化選定的突主細胞之后，在該宿主內，該DNA序列位于載體內可操作的讀框位置(其定位相對控制序列而言可使序列表達)含可控起動子的控制序列，如色氨酸起動子)。應該注意到起動子和調控序列(如果有)的選擇均是本技術領域中技術人員的一般性選擇知識。
(b)經導入在(a)中所述的構建體而被修飾的宿主細胞，該所述的DNA序列可在所述的宿主細胞中得到表達-宿主細胞的選擇并不關鍵，被選細胞可以是原核或真核，也可以是經本領域的已知方法遺傳上加以修飾而導入了特定構建物的細胞；(c)制備前文所指定的因子的過程包括在能使該DNA序列得以表達條件下培養經修飾的宿主細胞，這些條件可由重組DNA技術領域中的技術人員針對任何指定實施方案很容易的確定。通過本方法制備的神經膠質細胞促有絲分裂劑均被包含于本發明中。
在本領域中，沒有任何其它種因子具備本新型多肽因子所有的各項特性。
如文中所述，用于鑒定本因子的施旺細胞試驗采用了胎牛血漿的基本成分。除了以10％FCP代替10％FCS外，該試驗在所有其它方面均與Brockes等在《酶學方法》(同上)中所說明的方法一致。這種差異在試驗中是相當重要的，因為胎牛血漿(相對于血清)中無血小板來源的因子可通過消除了可能源自其它因子的假效應，從而能給出一個嚴謹的作用于施旺細胞的活性的定義。
本發明還包括文中所指定的多肽的制備過程，其中包括抽提脊椎動物腦材料獲取蛋白，將所得的抽提物經羥基磷灰石HPLC層析純化，然后將各組分進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，收集具有可觀測到的分子量范圍在30KD到36KD，和/或55KD到63KD的組分。在兩種情況下，將各組分進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳并使用下列分子量標準
溶菌酶(雞蛋清)14,400大豆胰蛋白酶抑制劑21,500碳酸酐酶(牛) 31,000卵清白蛋白(雞蛋清)45,000牛血清白蛋白 66,200磷酸化酶B(兔肌肉) 97,400對于小分子量組分，可進行還原或非還原條件下的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，而大分子量組分，則進行非還原條件下的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。然后在胎牛血漿條件測試各組分刺激大鼠施旺細胞分裂的活性。
優選的是上述過程通過進行羧甲基纖維素層析如從牛垂體材料中分離各相關組分開始的，最好也在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳前進行羥基磷灰石HPLC，陽離子交換層析，凝膠過濾和/或反相HPLC純化。在該過程的每一步驟中，可基本上按Brockes在《酶學方法》(同上)中所說明的方法，除了以10％FCP代替10％FCS進行試驗，用施旺細胞摻入放射性碘脫氧尿嘧啶來測試其活性。如前文提及，本實驗中對CNS或PNS細胞，例如施旺細胞的促有絲分裂效果本身而言也是本發明的方面之一。
因此，本發明同時也包括了對神經膠質細胞促有絲分裂活性的試驗，其中胎牛血漿本底被用作評估所試驗物質刺激神經膠質細胞中DNA的合成情況。
本發明的另一方面是由上文所定義的任一因子，必要時佐以可接受的稀釋劑，載體、賦形劑或以單一藥劑形式制成藥劑以供人或動物使用。在應用本發明因子時，可實施傳統的醫學實踐以提供合適的配方或組合物。
因此，本發明所配藥劑可用于大腸道形式給藥，例如靜脈內、皮下、肌肉內、眼眶內、眼內、心室內、顱內、囊內、脊柱內、腦池內、腹膜內、以及局部，鼻孔內、氣霧劑形式、劃痕式、口腔、面頰、直腸，陰道等方式給藥。
本發明所制藥劑也可通過在病人體內轉植入表達本發明DNA的宿主細胞的方式給藥，或者通過外科手術植入該藥以在病人體內釋放。
非腸道藥可以是液體或懸濁液；口腔給藥則可是片劑或膠囊；鼻腔給藥則可以是粉劑，滴鼻液或氣霧劑。
本領域所周知的制配成藥的方法可在如“Remington藥物科學”中找到。非腸道藥可含例如賦形劑、無菌水、鹽水或聚乙二醇類物質，如聚乙烯乙二醇、植物油、水化萘，以及生物相容并可被降解的交脂類多聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，以用于控制本發明因子的釋放。其它潛在可用的非腸道釋放系統可輔以包括乙烯-醋酸乙烯脂共聚顆粒、滲透泵、移植性輸注系統和脂質體。用于吸入式給藥的配方可包括賦形劑，如乳糖，也可是液體制劑，如含聚氧乙烯-9-月桂基醚、甘氨膽酸鹽、脫氧膽酸鹽，或者是油狀液制劑用以滴鼻液方式給藥，又或是以膠形式施于鼻內。非腸道給藥配方也可包含甘氨膽酸鹽以用于面頰給藥，含甲氧水楊酸脂以用于直腸內，或者含檸檬酸以用于陰道內。
本發明因子可作為唯一活性成分使用，也可與其它活性成分結合使用，例如，能促進神經疾病中神經元存活的其它生長因子，或是肽酶，蛋白酶抑制劑能與之結合使用。
本發明藥劑中該因子的濃度將依據各種因素加以改變，包括用藥劑量，以及用藥途徑。
一般情況下，本發明因子將以含有0.1％到10％的化合物的生理緩沖液形式用于非腸道方式給藥。一般劑量范圍是每天每公斤體重1mg到1g；優選劑量范圍是每天每公斤體重0.01mg到100mg。給藥優選劑量可依病人的病理類型及進展程度、病人總的健康狀況、藥的組成及給藥途徑而定。
如上文提及，施旺細胞(周邊神經系統的神經膠質細胞)在本發明因子的刺激下進行分裂。周邊神經系統的施旺細胞參與支持神經元并構建圍繞單個神經纖維的髓磷脂鞘。該鞘對于電沖動從感覺受體到肌肉的正確傳導是很重要的。
在許多周邊神經疾病中施旺細胞和神經纖維被損壞，或為主要，或為次要原因。許多神經疾病中同時損壞感覺和運動纖維(Adams和Victor，《神經學原理》)。這些疾病中最重要的可能是與糖尿病、多發性硬化癥、蘭-格-巴氏綜合癥相關的神經疾病，以及癌癥和有毒試劑(其中一些是用于治療癌癥)所引起的神經疾病。
本發明是針對一些普通的原因如感染或外傷引起的神經系統受到損害的情況而進行治療或預防。因此，本神經膠質細胞生長因子不僅可用于治療脫髓鞘或喪失施旺細胞的神經系統疾病，同時對周邊神經損傷所引發的神經系統疾病也有相當價值。在周邊神經受損后，再生過程是以施旺細胞的生長和重建為先導，其后才是神經纖維的再生到其靶位。通過加速施旺細胞的分裂，就能促進損傷后的再生進程。
類似方法可用于治療中樞神經系統(腦和脊髓)的損傷和神經變性的疾病。
有許多神經膠質細胞瘤，其中最普遍的一種可能是神經纖維瘤，它是由神經膠質細胞過度生長而形成的斑狀小腫瘤。同時，也可注意到非常相似于GGF的活性在一些施旺細胞瘤中也存在，因此本因子與其受體作用的抑制劑提供了一種對神經膠質腫瘤的治療方法，即施用有效量的物質以抑制上述因子與受體的結合。
總的來說，本發明包括該多肽因子在由對該因子敏感或具反應性的細胞參與的神經系統的任何病生理狀態的預防和治療中的作用。
本發明的多肽因子也可作為免疫原以制造抗體，例如按標準技術制造的單克隆抗體，這類抗體也包括于本發明中。這些抗體隨后可用于治療或診斷目的。因此，那些與該因子水平不正常相關的狀態也可用這類抗體檢查到。利用標準方法，體外技術也可用于對分離出的樣品進行分析。成像技術也可用于其中，例如將抗體以放射性同位素標記，利用腫瘤成像的最新技術可于體外成像。
本發明也包括本因子作為神經膠質細胞促有絲分裂劑在體內及體外的一般應用及被應用的這類因子本身。通過注射有效劑量的本發明因子而在脊椎動物體內產生神經膠質細胞有絲分裂效果的方法即為其一特殊實施方案。本發明優選實施方案即是那種預防或治療神經系統紊亂或疾病的方法。
本發明的更普通的方面是本發明因子在制藥中的應用，尤其是用于制造用作神經系統疾病或紊亂的治療或神經的修復、再生的藥物。
本發明同時也包括了該因子在鑒定和定量具有相應于該多肽的受體結合特性的分子的競爭性試驗中的應用。該多肽可選擇性的用放射性同位素標記。競爭性試驗能鑒定相關受體的拮抗劑和促進劑。
另一方面，本發明提供了該因子在親合分離過程選擇性地包括親和層析中的應用，用于分離各相應受體。這一分離相應于蛋白的受體的方法為本領域所熟知，并且有相當多的技術可應用于本發明因子。例如，就IL-6和INFr而論，讀者可參考Novick.D.等，《層析雜志》1990，510331-7。關于促性腺激素釋放激素可參考Hozum.E.，《層析雜質》1990，510233-8。關于G-CSF可參考Fukunaga.R.等《生物化學雜志》，26513386-90。關于IL-2可參考Smart.J.E.等，1990，《皮膚病研究雜志》，94158s-163s。關于人γ-干擾素可參考Stefanos.S.等，1989，《干擾素研究雜志》9719-30。
附圖的簡述圖將被首先說明。


圖1到圖8與實施例1相關，并簡述如下圖1為羧甲基纖維素層析得到的產物的分離圖譜。
圖2為羥基磷灰石HPLC層析得到的產物的圖。
圖3為Mono S FPLC層析得到的產物的分布圖。
圖4為凝膠過濾FPLC層析得到的產物的分布圖。
圖5和圖6為反相HPLC層析得到的兩種部分純化的多肽產物的圖。
圖7和圖8說明的是以胎牛血漿為背景經反相HPLC純化的GGF-I和GGF-II組分的劑量-反應曲線。
圖9到圖12列出了源于GGF-I和GGF-II的肽段序列。SEQ ID.Nos 1-20，22-29，32-53和169，(參見下文實施例2)，圖10和圖12特別說明了新的序列。
圖10表A中，列出了用于設計簡并寡核苷酸探針和簡并PCR引物的GGF-I肽段序列。(SEQ ID Nos 20，1，22-29和17)。表A中的一些序列也可用于設計合成肽，表B列出了那些太短(少于6個氨基酸)而不能用于設計簡并探針和PCR引物(SEQ ID Nos 17和25)的新型肽序列。
圖12表A中，列出了用于設計簡并寡核苷酸探針和簡并PCR引物的GGF-II肽段序列(SEQ ID Nos45-52)。表A中的一些序列也可用于設計合成肽，表B列出了那些太短(少于6個氨基酸)而不能用于設計簡并探針和PCR引物(SEQ ID No.53)的新型肽序列。
圖13到圖20同實施例3相關，下文中說明了本發明因子的促有絲分裂活性。
圖21到圖28(a、b和c)同實施例4相關，簡述如下圖21列出了由圖10表A和圖12表A中的新型肽序列設計而來的簡并寡核苷酸探針(SEQ ID Nos54-88)圖22(SEQ ID No.89)列出了一段源自重組牛基因組噬菌體GGF2BG1的推測的牛GGF-II基因序列，包括了簡并寡核苷酸探針609和650(分別參見圖21，SEQ ID Nos.69和72)的結合位點。此圖為該DNA序列的編碼鏈以及由第三讀框推導出的氨基酸序列。由因子2(實線)來的第12肽序列是66個氨基酸開放讀框(核苷酸75-272)的一部分。
圖23是指簡并PCR引物(表A，SEQ ID Nos.90-108)和用于實驗中從垂體后葉中分離出的以RNA形式存在的牛GGF-II編碼序列片段的特定PCR引物(表B SEQ ID Nos 109-119)圖24列出了9個特異的相鄰的牛GGF-II cDNA結構，以及利用圖7表A和表B所列引物，和從垂體后葉分離出的RNA進行PCR擴增實驗所得到的序列。本圖最上一行是在cDNA特定結構中起作用的編碼序列的簡圖。
圖25是牛重組唾菌體GGF2BG1的物理圖譜，其中牛的區段約20kb長，含有牛GGF-II基因的2個外顯子(實線)。XbaI、SpeI、NdeI、EcoRI、KpnI和SstI的切割位點已經標在該圖譜上，陰影部分是指被亞克隆的以用于測序的片段。
圖26為推測的牛GGF-II基因的三種可替換基因產物的結構簡圖。外顯子按其被發現的順序從A到E列出。另一種的剪切形式1、2和3產生3種可導出的重疊蛋白結構。(GGF2BPP1、2和3)它們示于圖28a、b、c中(如下文所述)。
圖27(SEQ ID Nos 120-132)是在圖28a、28b和28c(如下所述)所示的推導出的蛋白序列中所鑒定的GGF-I和GGF-II與列于圖10和圖12中新型肽序列的比較。本圖表明了九種新型GGF-II肽序列中的六種可由這些推測的蛋白序列加以說明，同時也可找到兩種類似于GGF-I序列的肽序列。
圖28a(SEQ ID No.133)列出了編碼鏈DNA序列以及由圖26中所示的剪切形式所得到的cDNA推導出的氨基酸序列。這一推測的牛GGF-II基因的部分cDNA編碼一個長206個氨基酸的蛋白。粗體表示的肽是從圖10和圖12中列出的肽中鑒定出的。可能的糖基化位點以底下劃線表示(連同聚腺苷化信號AATAAA)。
圖28b(SEQ ID No.134)是一個編碼鏈的脫氧核糖核酸序列及從在圖26中剪切形式No.2獲得的cDNA推導得到的氨基酸序列。推定的牛的GGF-II基因的這部分cDNA編碼長281個氨基酸的蛋白質。粗體形式表示的肽鏈是在圖10和12列出的序列中鑒定得到的。潛在的糖基化位點加下劃線標著(連同聚腺苷化信號AATAAA)；圖28c(SEQ ID No.135)是一個編碼鏈的脫氧核糖核酸序列及從在圖26中剪切形式No.3獲得的cDNA推導得到的氨基酸序列表。推定的牛的GGF-II基因的這部分cDNA編碼257個氨基酸長度的蛋白質。粗體表示的多肽是在圖10和12的列出的序列中鑒定的。潛在的糖基化位點加下劃線(連同聚腺苷化信號AATAAA)；圖29，涉及實施例6，是一張通過southern blot顯示推定的牛GGF-II基因序列和許多哺乳動物脫氧核糖核酸的基因序列的交叉雜交分析放射自顯影照片。濾膜上包含了圖上所列各種被EcoRI消化的脫氧核糖核酸(每泳道5微克)。探針在每一種脫氧核糖核酸樣品中都檢測到單一的強帶，包括一個由圖25中的物理圖譜所預測的牛脫氧核糖核酸中4kb的片段。也可以觀察到一些相對弱小強度的條帶，可以代表相關脫氧核糖核酸序列。從每個其它哺乳動物脫氧核糖核酸樣品得到的強雜交帶大概地代表那些種類的GGF-II同源性。
圖30是一個典型的剪切突變體的圖。
由F，E，B，A，G，C，C/D，，C/D′，D，D′H，K，和L代表這些編碼區段，得自純化的蛋白質的多肽序列的定位被指定位“0”。
圖31(SEQ ID Nos.136-147，160，161，173-178，42-44，77)是脫氧核糖核酸序列和預測的GGF的編碼區段的肽序列的列表。
第1行是預測的牛GGF基因序列的氨基酸序列的列表，第2行是牛GGF的核苷酸序列，第3行是人類GGF(heregulin)的核苷酸序列(核苷酸堿基的配對以豎線表示)。第4行是預測的人類GGF/heregulin的氨基酸序列的列表。編碼區段E，A′和K僅僅代表牛類的序列，編碼區段D′僅僅代表人類(heregulin)序列。
圖32(SEQ ID No.148)是預測的GGF之氨基酸序列和BPPS的核苷酸序列。上行是核苷酸序列而下行是預料的氨基酸序列。
圖33(SEQ ID No.149)是預測的GGF2BPP2的氨基酸序列和核苷酸序列。上行是核苷酸序列而下行是預料的氨基酸序列。
圖34(SEQ ID No.150)是預測的GGF2BPP4的氨基酸序列和核苷酸序列。上行是核苷酸序列而下行是預料的氨基酸序列。
圖35(SEQ ID Nos.151-152)以人類EGF(hEGF)校正兩個GGF多肽序列(GGF2bpp4和GGF2bpp5)。星號表明保守的半胱氨酸位置。
圖36描述GGF活性水平(施旺細胞促有絲分裂實驗)和一個約200KD的蛋白質酪氨酸磷酸化反應與GGF量增長相對應的情況(抗磷酸化酪氨酸多克隆抗體做的Western Blot放射自顯影照片上200kd條帶的強度)。
圖37是一個從圖31中的序列衍生的剪切變異體。
圖38是EGFL1(SEQ ID No.為154)預測的氨基酸序列(底部)和核酸序列(頂部)。
圖39是EGFL2(SEQ ID No.為155)預測的氨基酸序列(底部)和核酸序列(頂部)。
圖40是EGFL3(SEQ ID No.為156)預測的氨基酸序列(底部)和核酸序列(頂部)。
圖41是EGFL4(SEQ ID No.為157)預測的氨基酸序列(底部)和核酸序列(頂部)。
圖42是EGFL5(SEQ ID No.為158)預測的氨基酸序列(底部)和核酸序列(頂部)。
圖43是EGFL6(SEQ ID No.為159)預測的氨基酸序列(底部)和核酸序列(頂部)。
圖44是該克隆的大規模編碼區段圖譜。T3指的是細菌噬菌體的啟動子，用于從克隆產生mRNA。R是限制性內切酶EcoRI位點。5′UT指5′非翻譯區。E，B，A，C，C/D′，以及D指的是編碼區段。0是翻譯的啟始的位點。^是與牛的E片段同源的5′限制區(參見實施例6)和3′UT指的是3′非翻譯區。
圖45是預測的GGF2HBS5的氨基酸序列(中間)和核酸序列(頂部)(SEQ IDNo.167)。底部(間斷的)序列代表從GGF-II制劑推知的多肽序列。(參見圖11，12)。
圖46是一張描述重組人和牛膠質生長因子的施旺細胞促有絲分裂活性的圖表。
圖47是一個劑量反應曲線，描述以CHO細胞條件培養基的不同劑量樣品給藥后施旺細胞增殖活性的數據。
圖48是一個劑量反應曲線，描述利用含有GGF2HBS5的cDNA克隆的桿狀病毒轉染的SF9昆蟲分泌到胞外培養基中的促神經細胞有絲分裂的活性。
圖49是用GGF多肽抗體進行的重組CHO細胞的條件培養基的Western blot。
圖50(A)是一從陽離子交換柱洗脫下來的重組(COS細胞產生)人GGF-II(γhGGF-II)促施旺細胞增殖的活性的圖；圖(B)是用針對rhGGF-II特異肽段的多克隆抗體對重組GGFII峰進行的免疫印跡分析。
圖51(A)是一用陽離子交換柱對γhGGF-II(CHO細胞產生)進行純化得到的組分的圖表；(B)是用γhGGF-II的特異抗體與(A)中所述的組分樣品進行Western blot的照片。
圖52是一張描述在用重組神經膠質生長因子處理施旺細胞時的酪氨酸磷酸化作用的凝膠照片。
圖53是GGFHBS5，GGFHFBI和GGFBPP5多肽序列(SEQ ID NO.170，171，和172)。
圖54是CHO細胞表達載體pcDHFRpolyA的圖譜。
圖55是cDNA編碼的成熟的hGGF2的氨基酸序列(SEQ ID NO.179)。
本發明祥述本發明涉及新的神經膠質生長因子的分離和純化和編碼這些因子的DNA序列的克隆。本發明的其他部分是幾種基因剪切變異體，它們潛在地編碼一系列神經膠質細胞生長因子。特別是GGF2HBS5，編碼與牛的GGF-II等效的人GGF的一種變異體。很明顯，編碼GGF蛋白和p185erbB2結合蛋白的基因產生很多大小不同的，被不同程度剪接的RNA轉錄物，它們可產生一系列長度不同，同時又含有共同序列及一些特定序列的蛋白。經過不同程度剪接過的序列可以從牛的腦垂體后葉RNA，人乳腺癌RNA(MDA-MB-231)(Holmes et al.“科學”Science 2561205(1992))和雞腦中的RNA(Fall et al“細胞”Cell.721-20(1993)重新獲得(如這里所述)。進一步的證據來自那些有著廣泛大小范圍的蛋白質，它們既可以作為施旺細胞的有絲分裂刺激原(在下面公開)，也可作為p185erbB2受體的配體(見下文)通過對比編碼GGF和p185erbB2的基因的核苷酸序列，兩者同源的事實得到了進一步證明(科學，Science256(1992)，1205-1210)。Holmes等人論述一種分子量為.45千道爾頓的可以和p185erbB2受體蛋白特異結合的蛋白的純化方法。受體蛋白p185erbB2和幾種人的惡性腫瘤相關。幾種編碼Heregulin-α的互補DNA克隆已經被分離出來。Peles等(“細胞”Cell 69205(1992))和Wen等(“細胞”Cell 69559(1992))論述了從大鼠細胞分離出1.互補DNA，此DNA編碼一個被稱為“神經分化因子”(NDF)的蛋白。NDF互補DNA的轉錄產物具有和p185erbB2結合的活性。Usdin和Fischbach，細胞生物學雜志，J.Cell.Biol.103493-507(1986)；Falls等，冷泉港生化分析會議錄55397-406(1990)；Harris等“美國國家科學進展” ，Proc.Natl.Acad.Sci.USA887664-7668(1991)；Falls等，“細胞”Cell72801-815(1993)論述了一個分子量為42KD的糖蛋白的純化，它可以和受體蛋白p185erbB2相結合，并論述了幾種互補DNA克隆的純化(Falls等“細胞”72801-815(1993))。另外幾組研究人員已經報道了具有p185eroB2結合活性的各種分子量大小不同的蛋白的純化。這些科學工作者包括Lupu等，1992，“美國國家科學進展”892287；Yarden和Peles(1991)“生物化學”303543；Lupu等(1990)“科學”2491552；Dobashi等(1991)“生物化學和生物物理研究通訊”Biochem.Biophys.Res.Comm.，1791536；Huang等(1992)“生物化學雜志”J.Biol.Chem.25711508-11512。其他實施方案本發明包括和圖31(SEQ ID No.136-147，160，161，173-178，42-44，77)中的編碼片段實質上同源的任何蛋白，也包括其它自然產生的GGF多肽。還有的是等位基因突變，自然突變，誘導突變，在任何高或低水平的嚴格的條件下，與自然產生的核酸雜交的DNA所編碼的蛋白(對高或低嚴格條件的定義見“當代分子生物學指導”，JohnWiley&Sons，NewYork，1989，6.3.1-6.3.6詳見參考文獻)，以及被抗GGF多肽的血清特異結合的多肽或蛋白。該術語也包括含有來自圖31的GGF肽段的嵌合多肽。
以下的實施例并不是為了限制本發明而同樣是為了給出一個有用的說明，并為有效的制備技術提供特別的指導。
如在實施例3中看到，此種因子對一些細胞類型表現出促有絲分裂的活性。與成纖維細胞相關的活性表明它的傷口修復功能，而本發明包含了這種應用。有關制劑和/或藥物及其制造的本發明的簡潔陳述將清楚地逐一體現在適當的產品和應用中。這顯然是一個合理的展望，所給出的報告是和成纖維生長因子FGFs具有相似活性。參見，例如，Sporn等，“多肽生長因子及它們的受體”中的396頁(Baird和Bohlen)，題為“傷口愈合和組織修復中的FGFs”實施例1從牛的腦垂體純化GGF-I和GGF-III.CM因子組分的制備將4000個冷凍的完整的牛的腦垂體(約12kg)過夜融化，水中輕洗，分批在有同體積的0.15M硫酸銨溶液的一個攪拌器中勻漿。用1.0M的HCL將勻漿液pH調至4.5并在1×4900g離心80分鐘。上清中的任何脂質都可在通過玻璃絲時被濾去。當用1M的NaOH將上清的pH調至6.5后，加入固體硫酸銨至飽和度36％。攪拌數小時后，4900g離心80分鐘，沉淀棄去。用玻璃絲過濾后再向上清中加入固體硫酸銨至溶液飽和度為75％，再攪拌數小時后，4900g離心80分鐘沉淀重懸于兩升0.1M的磷酸鈉pH6.0溶液中，并在40升同樣的緩沖液中透析3次，當確定電導率小于20.0西門子時，以每分鐘2ml的流速上樣于裝有羧甲基纖維素(CM-52，華特曼)的生物處理柱(120×113mm，Pharmacia)。柱子先用兩倍體積pH為6.0的0，1M的磷酸鈉溶液沖洗，接著是兩倍體積50mM的NaCL溶液，最后是兩倍體積含有0.2MNaCL的同樣的緩沖液沖洗。在最后的步驟，收集到10ml(5分鐘)的組分，將從第78到118份的樣品合在一起，用10倍體積的10mM的Ph6.0的磷酸鈉溶液透析兩次，然后以100000g離心60分鐘澄清。II.羥基磷灰石柱HPLC至今為止，HPLC羥基磷灰石柱并不是一種用于分離神經膠質細胞生長因子的技術，但在本發明中卻證明為一種有效的方法。從以上CM纖維素凝膠色譜柱獲得的樣品，先經過0.22μm濾膜(Nalgene)過濾后，室溫上樣于一個裝有預柱(15×25mm，Biorad)的高效羥基磷灰石柱(50×50，Biorad)上，該柱已用10mM磷酸鉀pH6.0的溶液平衡，然后以2ml/分的流速和如下線性梯度進行洗脫時間(分)B％ 溶劑A10mM磷酸鉀，pH6.00.0 0 溶劑B1.0M磷酸鉀，pH6.05.0 07.0 2070.020150.0100180.0100185.00在梯度洗脫中，以每份6.0ml(3分鐘)的量按份收集，39-45份合并在一起，并在10體積的50mM的Ph6.0的磷酸鈉溶液透析。III Mono S FPLC柱對一濃度較高的樣品，經過Mono S FPLC柱之后，可以為其后的凝膠過濾做好準備。
從羥基磷灰石柱上收集下來的樣品以100,000g自旋澄清的方式除去其中的任何顆粒狀物質，再上樣于一個HR10/10 Mono S陽離子交換制備柱(100×10mm，Phamacia)，在常溫下以1.0ml/min的流速用pH6.0的50mM的磷酸鈉溶液再平衡。在此條件下，結合的蛋白用以下的所示的線性梯度程序來洗脫。時間(分) ％B溶劑A 50mM磷酸鉀 pH6.00.0 0 溶劑B 1.2M氯化鈉 50mM磷酸鈉 pH6.070. 030240.0100250.0100260.00在整個梯度洗脫中以每份1ml(1分)來按份收集。99-115份收集在一起。IV凝膠過濾柱FPLC這一步涉及本發明兩個因子的分離，然后進行最終純化，得到含量豐富的組分。
為達到這一目的，按照廠商指導說明，填充了一個Superose 12 FPLC制備柱(510×20mm，Pharmacia)。為標定此制備柱，根據廠商指導說明，檢測其理論塔板數，測得其值為9700理論塔板數。
在室溫下，從Mono S洗脫下來的樣品以2.5ml等分的量上樣于Superose12 FPLC柱，此制備柱于50mM磷酸鈉，0.75NaCL PH6.0(預先經過一個C18反相柱)洗脫，流速1.0ml/min。加樣后35分鐘，以每份1ml(0.5分鐘)按份收集，每次循環的第27份至41份(GGF-II)和42份至57份(GCF-I)分別收集在一起。V反相HPLC上述Superose12柱收集的GGF-I和GGF-II分別被分成三等份，每一份上樣于一個C8反相柱(Aquapore RP-300 7μ C8 220×4.6mm，應用生物系統)以一個保護筒保護(RP-8，15×3.2mm，應用生物系統)，并且以0.5ml/min流速在40℃平衡，蛋白按照這些條件和利用下面的線性梯度洗脫。時間(分) ％B溶劑A0.1％三氟乙酸(TFA)0溶劑B90％乙腈，0.1％的三氟乙酸6066.662.0 10072.0 10075.0 0在梯度洗脫開始后15.2分鐘，200ml(0.4分鐘)份收集在硅化過的管子中(Multitube管，Bioquote)VI.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳在這一步應用了低范圍的蛋白分子量標準，目錄號161-0304，此標準品出自英國Watford，Bio-Rad有限實驗室，采用的蛋白和分子量標準都在以前列出過。
從反相柱上所得的47份至53份(GGF-I)和61份至67份(GGFII)分別合并。7μl此反應物和等體積的0.0125M Tris-HCL，4％SDS，20％甘油，和作用于GGF-I的10％β-巰基乙醇一起煮沸5分鐘，并上樣于有4％積層膠的11％聚丙烯酰胺Laemmli凝膠。加50伏電壓后，電泳16小時。然后固定并以銀染法染色(Amersham)。在此條件下，能看到各因子有分散的幾條帶，根據蛋白標準品，能判斷出相對分子量30000道爾頓至36000道爾頓(GGF-I)和55000道爾頓至63000道爾頓(GGF-II)。從染色的膠上能見到能見到從反相柱上所得樣品中有少量相當于GGF-I，GGF-II水平的其他蛋白。VII三氟乙酸中的穩定性在三氟乙酸存在下，獲得了本發明因子的穩定性資料，如下所述GGF-I從反相HPLC柱上制備的物質，置于0.1％三氟乙酸和乙腈中。
在上柱的12小時期間和這之后的于40℃孵育10周內，一直分析此樣品，發現在孵育之后GGP-I仍保留的活性至少是從柱上直接下來的樣品活性的50％。GGF-II從反相HPLC柱上制備的樣品，放于0.1％的三氟乙酸和乙腈中，保存于-20℃。在其解凍后和40℃孵育4天之后，再檢測此樣品。孵育之后，GGF-II仍有至少為剛剛解凍樣品活性的50％。
用于上述研究中的三氟乙酸濃度是反相色譜柱中最常用的濃度。VIII活性的分析條件除非特別指出，所有的操作都在37℃進行，并參照圖1和圖6。在每個階段的活性檢測都使用經如下方法修正的Brockes(Meth.Enz.Supra)技術。即在準備施旺細胞時，除了加上DMEM培養基(Dulbecco改進的伊格爾氏培養基)，PCS和GGF之外，還加上5mM的forskolin。
在分析中應用的細胞是無成纖維細胞并且傳代次數少于10次的施旺細胞。這些細胞用胰蛋白酶從試管中轉移并按每孔3300細胞的方式鋪板于96孔板的底部。
在檢測溶液加入之后最后24小時再加入[125I]IUdR，每個分析摻入的背景(未刺激)小于100個cpm，并且依施旺細胞培養的批次和傳代次數，最大摻入量是背景的20-200倍。
從如上所述的反相HPLC得到的GGF-I和GGF-II的收集液，用和上述完全一樣的每個因子的曲線，以及用每種分析方法修改的上述方法，所不同的是用牛胎血漿代替牛胎血清而得到其它因子的曲線，得到了針對每種因子的兩條劑量反應曲線。結果如圖7和8所示。實施例2 純化的GGF-I和GGP-II的氨基酸序列氨基酸序列分析研究是用高度純化的牛垂體GGF-I和GGF-II來進行。以傳統的單字母密碼描述序列。對還原化且羥基甲基化的樣品用賴氨酸肽內切酶及V8蛋白酶消化得肽段，其中GGF-II的賴氨酸肽內切酶降解是利用從11％SDS-PAGE的55-65 RD區(分子量相當于以上引用的分子標準)洗提得到的材料進行的。
降解GGF-I得到總共21種肽序列(見圖9，SEQ ID Nos 1-20，169)，其中12種肽(見圖10，SEQ ID Nos.1，22-29，17，19和32)不存在于現有的蛋白數據庫中，因此代表著一些獨有的序列。對于GGF-II得到總共12種肽序列(見圖11，SEQ ID Nos.33-39，51，52，164-166)，其中10種肽(見圖12，SEQ ID Nos.45-43)不存在于現有的蛋白數據庫，因此是一些獨有序列(有一例外是肽GGP-II06，它顯示許多蛋白具有的相同序列，因此在給予少量殘基的情況也許它沒有意義)。這些新序列非常可能和GGFsI及II的部分真實氨基酸序列相一致。
GGFI-I07和GGF-II12的序列尤其值得重視，此兩者顯然是非常相關，這種相似性說明這些肽的序列幾乎肯定是GGF族蛋白，不可能來自污染蛋白。
另外，在肽段GGF-II02，序列XSS與位點X的天冬氨酸上N連接的碳水化合物成分的出現相一致。
一般在圖9和圖11中，X代表一個測序周期中無法確定稱呼的位置上未知的殘基，這是因為該測序周期同一位置可能有多個相同大小的信號或者因為就沒有信號。星號指示那些最后一個氨基酸與現在所示肽段所說的最后一個氨基酸相同的肽段。在剩余的肽段中，所述最后一個氨基酸的信號強度沒有足夠的能力將序列持續到那條肽的末端。右邊一攔表示用GCG軟件包中的FASTA和TFASTA程序進行計算機數據庫檢索，來分析NBRF和EMBL序列數據的結果。在這一欄中，只要肽段序列中不同的氨基酸不超過兩個，即可認為是相同名稱的蛋白。問題標記表明有3個不同錯配也是允許的。它們的簡寫如下所示。
HMG-1 高變動性蛋白-1組HMG-2 高變動性蛋白-2組LH-α黃體化激素α亞基LH-β黃體化激素β亞基實施例3 純化后的GGF-I和GGF-II的促有絲分裂活性對于經過高度純化的含有GGF-I和GGF-II的樣品的促有絲分裂活性的測定采用一種定量的方法，此法只需一個微培養就可以進行DNA合成，細胞形態，細胞數目以及細胞抗原表達的檢測。這項技術是由Muir等人以前發表的一種方法(分析生物化學185，377-382，1990.)改進而來。主要的改進在于1)使用非包被的滴定板，2)每孔的細胞數，3)用5％的胎牛血漿(FBP)代替10％的胎牛血清(FCS)，4)在同時加入培養基的有絲分裂劑和溴脫氧尿苷(BrdU)存在時的孵育時間。此外單層細胞在固定前不清洗以避免細胞損失，同時鼠抗BrdU的單克隆抗體同過氧化物酶結合的羊抗鼠免疫球蛋白抗體的孵育時間也加倍以增加測定的靈敏性。這種適用于大鼠坐骨神經施旺細胞的測定方法在對細胞培養條件作適當修改后也可用于幾種其它的細胞系的測定方法。I.有絲分裂檢測方法第一天，純化后的施旺細胞接種于含5％FBP/DMEM的非包被的96孔板(5,000細胞/孔)，第二天，向培養物中加入GGFs或其它測試因子，同時加入BrdU至終濃度為10mM。48小時后(第四天)吸出培養基以終止BrdU的摻入，加入200μl/孔70％的乙醇，室溫固定細胞20分鐘。接著用水清洗細胞，用100μl 2N HCl 37℃溫育10分鐘使DNA變性，吸出液體后，向每孔中加入pH9.0，0.1M硼酸緩沖液中和殘余的酸，用磷酸緩沖鹽水PBS清洗細胞，將細胞用50μl封閉緩沖液(PBS含0.1％Triton X 100和2％正常山羊血清)37℃處理15分鐘。吸出液體后，加入鼠抗BrdU單克隆抗體(Dako公司，Santa Barbara，CA)(50μl/孔，在封閉緩沖液中稀釋至1.4g/ml)并在37℃溫育2小時。用含0.l％Triton X-100的PBS清洗三次除去未結合的抗體，再加入過氧化物酶結合的山羊抗鼠IgG抗體(Dako公司，Santa Barbara，CA)(50μl/孔，在封閉緩沖液中稀釋至2μg/ml)37℃溫育1小時。PBS/Triton清洗三次，再用PBS清洗一次后，加入100μl/孔含0.05％可溶性色素原氧-苯二胺(OPD)及0.02％過氧化氫的50mM磷酸/檸檬酸緩沖液，pH5.0。室溫反應5-20分鐘后從每孔中吸出80l液體轉至一個含40μl/孔2N硫酸的干凈的96孔板以終止反應。用Plate reader(Dynatech Labs)記錄490nm的光吸收值，含單層細胞的測試板經PBS清洗兩次后加入100μl/孔的底物二氨基聯苯胺(DAB)和0.02％過氧化氫以產生不溶性的產物對BrdU-DNA進行免疫細胞化學染色，10-20分鐘后用水清洗終止染色反應，用倒置顯微鏡對BrdU4-陽性的核進行觀察和計數，某些情況下可用0.001％的甲苯胺藍對陰性核進行負染，計數方法如前所述。II.用于檢測有絲分裂的細胞系Swiss 3T3纖維母細胞細胞來源于Flow Labs，在補充了10％FCS，青霉素和鏈霉素的DMEM培養基中于37℃含10％CO2的潮濕空氣中培養。細胞每兩天補加培養基或傳代一次。對于促有絲分裂活性檢測，將細胞以5,000細胞/孔的密度接種于完全培養基中并溫育一星期直至細胞匯合并休眠。移去含血清的培養基，用無血清的培養基清洗單層細胞。每孔加入100μl含有絲分裂劑及10μM BrdU的無血清的培養基并溫育48小時。對與GGFs和血清或PDGF(作為陽性對照)反應的不同劑量均進行測定。
BHK(幼齡倉鼠腎)21 C13纖維母細胞細胞來源于歐洲動物細胞培養收藏中心(ECACC)，在含5％磷酸胰蛋白胨，5％FCS，青霉素和鏈霉素的GMEM培養基(Glasgow Modified EagleMedium)中在含5％CO2的潮濕空氣中于37℃培養，細胞每二至三天補加培養基或傳代一次。對于促有絲分裂活性檢測，將細胞以3,000細胞/孔的密度接種于完全培養基中并培養24小時，移去含血清的培養基，并用無血清培養基清洗，代之以100μl含0.1％FCS的GMEM或僅用GMEM。加入GGFs和FCS或bFGF作為陽性對照，同時加入10μM BrdU，溫育48小時。細胞培養物處理方法如前述的施旺細胞。
C6大鼠膠質瘤細胞株在39代收獲的細胞，在含5％FCS，5％馬血清(HS)，青霉素和鏈霉素的DMEM培養基中在含10％CO2的潮濕空氣中于37℃培養。細胞每三天補加培養基或傳代一次。對于促有絲分裂活性檢測，將細胞以2,000細胞/孔的密度接種于完全培養基中培養24小時。用無血清的培養基清洗后，以1∶1的DMEM與含0.1％FCS的F12培養基取代原有培養基。對與GGFs，FCS和aFGF反應的各種劑量均進行測定，細胞ELISA測定方法如前述的其它細胞株。
PC12(鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤)細胞來源于ECACC，在含10％HS，5％FCS，青霉素及鏈霉素的RPMI1640培養基中于37℃含5％CO2的潮濕空氣的膠原包被的培養瓶中培養。細胞每三天補加80％的新鮮培養基以替換原有培養基。對于促有絲分裂活性檢測，將細胞以3,000細胞/孔的密度接種于含完全培養基的經膠原包被的96孔板(50μl/膠原，Vitrogen Collagen公司，1∶50稀釋，37℃30分鐘)中，溫育24小時。之后用新鮮的RPMI培養基或含1mM胰島素或1％FCS的RPMI培養基取代該培養基。如前例對與作為陽性對照的FCS/HS(1∶2)及與GGFs反應的各種劑量進行測定。48小時后固定細胞如前所述進行ELISA測定。III.促有絲分裂測定結果本例中所有實驗樣品均為經過Sepharose12層析純化法(見實施例1，section D)高度純化過的含GGF-I和GGF-II(GGFs)的樣品。
首先，將BrdU摻入測定結果與由J.P.Brockes(酶學方法147217，1987)發表的基于[125]I-UdR摻入分裂細胞DNA的經典的對施旺細胞的促有絲分裂測定法相比較。
圖13表示了這兩種方法在對同樣細胞培養條件下(5,000細胞/孔，在GGFs存在時，在5％FBP/DMEM中溫育48小時)所得到的結果的比較。可以清楚地看出，結果很相似，但是從圖中曲線左側的移動趨勢可以看出，BrdU摻入法表現得更靈敏一些，例如可以降低GGFs的濃度。
正如“促有絲分裂的檢測方法”一節中所描述的，通過測量OPD過氧化物酶反應產生的可溶性產物密度而對具免疫活性的BrdU-DNA定量后，含單層細胞的初始測定平板還可以進行第二次反應，以產生可將BrdU陽性的核染色的不溶性的DAB產物。培養平板還可以再在倒置顯微鏡下檢測以觀察細胞形態，BrdU-陽性核及陰性核的數目。
在圖14a和14b中，由測定490nm處的吸收值而得出的BrdU-DNA的免疫活性，分別與BrdU-陽性的細胞核數目及在相同的培養物中BrdU-陽性的細胞核占每孔細胞總數的百分比相比較，標準偏差小于10％。這兩種評估方法表現出很好的相關性并且這兩者在GGFs最高劑量值的差別可以解釋為兩種方法中可被檢測為BrdU-陽性細胞的DNA合成程度的差別。
與[125]I-UdR摻入法相比，BrdU摻入測定法還可以額外提供有關多肽對于施旺細胞的生物活性的有用的信息。例如，圖15中的數據顯示GGFs可以作用于施旺細胞誘導其DNA合成，但低劑量的GGFs卻可以增加48小時后平板培養中陰性細胞的數目。
這種測定方法被用于幾種不同來源的細胞株。圖16比較了施旺細胞和Swiss3T3纖維母細胞對GGFs的促有絲分裂反應；盡管3T3纖維母細胞獲得的反應較弱，仍能在培養物中檢測到清楚的BrdU陽性核。同時平行做了在幾種不同劑量的FCS和人重組PDGF存在下的對照培養物表明細胞可對適當的刺激作出反應(未列出)。
利用BHK21 C13細胞株對纖維母細胞對GGFs的反應能力進行了進一步的測定，這種來源于腎臟的纖維母細胞在匯合時并未表現出接觸抑制或進入休眠狀態，因此設計的實驗條件在不損傷細胞活性的前提下能得到一個非常低的增殖背景。如圖17和圖18所示，GGFs對BHK21 C13細胞具有明顯的促有絲分裂活性，圖17表示的是在0.1％FCS存在下由GGFs刺激BHK21 C13細胞而摻入到DNA中的BrdU。這種在FCS存在下的良好的有絲分裂反應表明細胞培養條件不是限制因素。圖18中GGFs的促有絲分裂活性表示為BrdU-陽性與BrdU-陰性細胞數和每孔計數的細胞總數，這兩個實驗的數據均由重復兩次的結果綜合而來，每孔細胞最少取三個視野計數。正如所觀察到的在低劑量時對施旺細胞有增殖效應，GGFs還增加了非反應細胞的存活數。隨著加入至培養基中的GGFs的量不斷增加，BrdU-陽性細胞的百分率也成比例地增加。當更高劑量的GGFs存在時，48小時后細胞總數最少增加了一倍，證實GGFs能誘導BHK C13細胞的DNA合成及增殖。在相同條件下，當存在2％FCS時，細胞溫育48小時后可以增殖6倍(未列出)。
C6神經膠質瘤細胞為研究神經膠質細胞特性提供了一個很有用的模型，細胞所表現出的表型似乎依賴于細胞代數，在早期細胞表型更接近于星形細胞，晚期(超過70代)更接近于少突神經膠質細胞。這幾次實驗所用的C6細胞為39代到52代之間，C6細胞是一個具有高度增殖傾向的群體，因此可將實驗條件優化至BrdU摻入的背景很低。由對FCS發生反應的劑量(圖19)可以看出，0.1％血清的存在對保持細胞活性而不明顯損傷促有絲分裂反應是十分必要的。
圖20中對aFGF(酸性纖維母細胞生長因子)和GGFs的促有絲分裂反應表示為FCS存在下(8％)所得到的BrdU最大摻入的百分比，該值是兩個試驗中的兩個平行試驗的平均值。GGFs的效應可以與純化后的aFGF制劑相比，據報道，aFGF是C6細胞的一種特異性的生長因子(Lim R.et al.，細胞調節1741-746，1990)，因此被用作陽性對照。由于平板培養中的細胞密度很高，對BrdU陽性細胞和陰性細胞直接計數是不可能的，與迄今為止所報道的其他細胞株成對比的是，當PC12細胞處于可以與sera(常規用作保存細胞的FCS與HS的混合物)反應的培養條件下時，PC12對GGFs不表現出任何明顯的反應。然而每孔接種的細胞數似乎能影響PC12細胞的反應行為，因此還需要做更多的實驗。實施例4 編碼包括GGF-I與GGF-II多肽的蛋白質的核苷酸序列的分離及克隆GGF-II核苷酸序列的分離與克隆按此處描述的方法進行，利用肽的序列信息和文庫掃描，按如下方法進行。令人滿意的是能以圖4和圖5中的肽為起點按下述技術路線分離并克隆GGF-I序列，事實上，圖21，序列號No.54-88顯示了用于此目的可能的簡并寡核苷酸探針，圖23序列號No.90-119列出了可能的PCR引物。至于GGF-II也應用此方法得到其DNA和多肽序列、插入此DNA序列的DNA構建體和表達載體及由于導入此構成物/載體而改變遺傳特性的宿主細胞和培養這種細胞后得到的蛋白。本發明包括此類主題。
I.寡核苷酸探針和引物的設計與合成.
簡并寡聚DNA探針是由氨基酸序列(由來源于純化的GGF蛋白質的肽得到)反轉翻成核苷酸序列設計的。寡聚物可以是DNA序列的編碼鏈，也可以是非編碼鏈。當設計的寡聚核苷酸中包含絲氨酸、精氨酸或亮氨酸時，兩種不同的合成物分別制備以免混淆。例如在537和538位或609和610位的絲氨酸由TCN或AGY編碼，對于精氨酸或亮氨酸(例如544，545位)也采取類似的不同簡并密碼子分別合成.寡聚DNA是利用Biosearch 8750 4-柱DNA合成儀以0.2微摩爾的合成規模操作的β-氰乙基化學法合成的。寡聚核苷酸從柱子(500埃CpG樹脂)上洗脫后在濃縮的氫氧化胺中于55-60℃去保護6-24小時，去保護后的寡聚核苷酸在真空干燥后，在15％丙烯酰胺凝膠(20mono1bis)于含7M尿素的50mMTris-硼酸-EDTA緩沖液中電泳純化。通過紫外線照射探測凝膠中全長的寡聚核苷酸，切下相應的條帶在1.5ml H2O中振蕩4-16小時以洗脫DNA寡聚體。洗脫液干燥后重溶于0.1ml水中，測定其260nm的吸收值。
由以下公式計算DNA濃度(A 260×units/ml)(60.6/長度＝XM)加水將所有的寡聚核苷酸濃度調至50μM。
按上述方法設計的簡并探針如圖21，序列號No.54-88.
PCR引物的制備方法除下述的修改外大體與探針合成相同，在簡并寡聚核苷酸的5′端包括含有限制性位點的13個核苷酸的連接子用于克隆入載體。用1,000埃CpG樹脂以1微摩爾的規模合成DNA，在所有四個核苷酸正常地摻入簡并探針的位置處，使用inosine.PCR引物的純化包括乙醇沉淀及凝膠電泳純化。II.文庫構建及篩查牛基因組DNA文庫由Stratagene(目錄號945701)購買.文庫包括2×106個15-20kb左右的克隆到Lamda DashII載體的牛DNA Sau3A1部分酶切片段，牛腦全cDNA文庫從Clonetech(目錄號BL10139)購買。由牛的整個大腦，牛的腦垂體及牛的后垂體制備的mRNA用于構建cDNA文庫(In Vitrogen；Stratagene)。In Vitrogen制備了兩種cDNA文庫一個文庫用Lambda g10載體，另一個文庫用pcDNAI載體(一種質粒文庫)，在Lambda unizap載體制備Stratagene文庫，它們同都包括1.4×107個原始重組噬菌體。
牛基因組文庫以150,000到200,000個噬菌斑/板的密度接種于長有E.coli K12宿主菌LE392的23×23cm平板(Nunc)，每個平板大約相當于一個牛的基因組的DNA。37℃溫育過夜后，平板冷卻后按Maniatis等人的方法(260-81)轉膜，從每板用未帶電荷的尼龍膜(Pall Biodyne A或MSI Nitropure)從每板轉四個噬菌斑。DNA經紫外線照射5分鐘或80℃真空烘烤兩小時使之交聯固定于膜上，DNA探針經T4多聚核苷酸激酶(NewEngland Biolabs)用r32P ATP(New England Nuclear；6500Ci/mmol)標記，方法見供應商的說明書。簡單地說，50pmol簡并DNA寡聚體與600μCi r32P-ATP和5單位T4多聚核苷酸激酶于37℃溫育30分鐘，反應中止后，加入凝膠電泳上樣緩沖液，通過電泳純化放射性標記的探針。從凝膠上切下32P標記的探針并洗脫至水中。另一種方法是按Schowalter和Sommer，發表在生物化學分析17790-94(1989)上的方案利用PCR擴增摻入a-32P-dATP或a-32P-dCTP來標記DNA探針，PCR反應標記的探針用Sephadex G-150柱脫鹽純化。
預雜交和雜交均在GMC緩沖液(0.52M NaPi，7％SDS，1％BSA，1.5mM EDTA，0.1M NaCl，10mg/ml tRNA)中進行。用Oligowash(160ml 1M Na HPO，200ml 20％SDS，8.0ml 0.5M EDTA，100ml 5M NaCl，3632ml H O)洗膜。一般地，將相當于10個牛基因組DNA重復拷貝的20張膜(每張400平方厘米)置于200ml雜交液中與100pmol簡并寡聚核苷酸探針(128-512位的折疊)溫育.雜交反應于比由簡并探針計算出的最低熔點低5℃的溫度下過夜，最低熔點溫度的計算假設一對AT為2℃，一對CG為4℃。
在雜交溫度下的4-5小時中濾膜用反復更換的oligowash清洗，最終在3.2M氯化四甲銨，l％SDS清洗兩次，每次30分鐘，清洗時的溫度依賴于探針的長度。對20聚體，最終清洗溫度為60℃。濾膜安裝好后，用增感屏(Dupont Cronex Lightening Plus)對X光膠片(Kodak XAR3)曝光，通常情況下，對于文庫的篩查在負80℃下膠片曝光3到5天對探測二重信號是足夠了。分析結果后，濾膜可以被洗脫并再次用探針雜交。濾膜的洗脫方法是在含10mM EDTA pH8的1％SDS中用微波爐的最大功率連續煮兩次，每次15分鐘。濾膜可以經受最少三到四次洗脫并與不同的探針雜交。III.重組噬菌體的分離、生長及DNA的制備具體步驟見《重組DNA》(Maniatis等，260-281)的標準方法。IV.利用DNA消化和Southern印跡分析對分離的克隆進行分析重組噬菌體DNA樣品(2微克)按限制性內切酶供應商(New England Biolabs)推薦的條件消化，37℃溫育4小時后，反應產物在0.1M醋酸鈉存在下，用三倍體積乙醇沉淀。離心收集DNA沉淀，用75％乙醇漂洗，干燥。所有重溶的樣品均上樣至瓊脂糖凝膠(常在1％TAE緩沖液中，0.04M Tris醋酸，0.002M EDTA)。凝膠以1伏/厘米的場強電泳4到20小時。分子量標記包括Lambda DNA的HindIII酶切片段和/或X174 DNA的HaeIII酶切片段(New England Biolabs).凝膠用0.5微克/ml溴乙錠染色并照相。對于Southern雜交，純化DNA首先在凝膠中用0.125 N HCl處理，于0.5N NaOH中變性，在20×SSC(3M NaCl，0.03M檸檬酸鈉)中轉移至非變性尼龍膜吸印6-24小時，用0.5M Tris HCl pH7.5，0.15MNaCl中和濾膜，再用50mM Tris-硼酸EDTA輕微漂洗。
交聯時，濾膜先用透明塑料膜包裹，DNA的一面暴露于紫外光下5分鐘，雜交和清洗方法如文庫篩查中所述(見本實施例第二節)，為了用雜交分析來決定是否在其他物種中存在類似基因，作一些輕微的改動。DNA濾膜由Clonetech購買(目錄號7753-1)，每一泳道含有5微克EcoRI消化了的從各種不同物種得來的DNA，探針按前面第二節描述的用PCR擴增反應標記，在含10％硫酸右旋糖苷的80％緩沖液B(2g聚乙烯吡咯烷酮，2gFicoll-400，2g牛血清白蛋白，50ml 1M Tris-HCl(pH7.5)，58gNaCl，1g焦磷酸鈉，10g SDS，950ml H O)中雜交。探針在沸水浴10分鐘后立即置于冰水浴中冷卻而使探針變性，探針按106dpm32P/ml加入至雜交緩沖液中，60℃溫育過夜.濾膜先在60℃用緩沖液B漂洗，再依次用含0.1％SDS的2×SSC和含0.1％SDS的1×SSC漂洗。對于高嚴格條件，最后一次清洗應在含0.1％SIDS的0.1×SSC中漂洗，然后溫度升至65℃洗滌。
Southern雜交的結果被用于制備基因組克隆的限制性酶切圖譜，并顯示哪一個亞片段與GGF探針雜交(適于做亞克隆)。V.與雜交探針同源的DNA片段的亞克隆DNA消化產物(例如5微克)上樣至1％瓊脂糖凝膠中電泳，染色后從凝膠上切下相應的條帶，按廠商(Bio 101)提供的方案將DNA吸附于玻璃微珠并洗脫以使之純化。用T4連接酶(New England Biolabs)將回收的DNA片段(100-200ng)連接入去磷酸化的線性載體，如來源于PUC18的pT3T7(Ambion)。載體上帶有大腸桿菌β-內酰胺酶基因，因此可在含氨芐青霉素的平板上篩選轉化子，載體還可以給宿主細胞補充B-半乳糖苷酶，因而非重組子(藍斑)可以用異丙基硫代半乳糖苷和Bluogal(Bethesda Research Labs)檢測。連接反應的一部分產物用于轉化大腸桿菌K12 XL1 Blue感受態細胞(Stratagene目錄號200236)，在含50微克氨芐青霉素/ml的LB平板上檢測轉化子，挑選白色克隆并小量制備質粒DNA用于DNA酶切及DNA測序。再次鑒定所挑選的克隆是否插入了能與GGF探針雜交的DNA片段。VI.DNA測序按標準方案從5ml培養物中制備雙鏈質粒DNA模板，依照廠商的方案(對Sanger等人發表在PNAS；USA745463(1977)的方法的一個改進)用測序酶2.0和一個雙脫氧核苷酸試劑盒(US Biochemical)采取雙脫氧鏈終止法進行測序。此外，測序還可在DNA熱循環儀(Perkin Elmer型號4800)上利用循環測序試劑盒(來自新英格蘭生物技術公司科研實驗室)進行。操作依照說明書進行，所用引物是經過5’端標記的。測序所需引物或者由試劑盒中提供或者根據從克隆測定的序列來合成。測序反應物上樣并溶解于0.4mm厚的濃度為6％的聚丙烯酰胺凝膠。膠于燥后曝光于X光片。通常情況下，利用標準測序試劑盒時摻入35S，32P末端標記的引物用于測序循環反應。序列輸入DNA序列編輯器，輸入方向由膠底部至頂部(5’至3’方向)。數據分析用Genetics Computer Group(GCG，威斯康辛大學)提供的軟件。VII.RNA的制備和PCR擴增在基因組DNA檢到的并且含有編碼GGF肽的序列的開放閱讀框是通過垂體RNA的PCR擴增延伸的。RNA是按照胍-中性CsCl法制備(Chirgwin等，生物化學；185294，1979)從冰凍牛組織(Pelfreeze)中提取的。通過進行oligo-dT纖維素柱層析選擇Poly A RNA(Aviv和Leder，PNAS(美國)691408，(1972))。
特異性DNA靶序列的擴增是用逆轉成cDNA的來自總RNA或PolyA RNA的樣品和利用Perkin Elmer公司PCR/RNA試劑盒，批號N808-0017開始的。第一鏈的逆轉錄反應用1ug模板RNA，和加有限制酶識別位點接頭的Oligo dT引物或加有限制酶吸附位點的從克隆序列測定的特異反義鏈引物進行的。為產生第二條鏈，引物之一被引入鏈特異序列如同用于3’RACE反應的(Frohman等.PNAS(美國)858998，(1988))，如果第二靶位點已被末端轉移酶，在dATP參與下加尾于第一鏈反應產物。(例如，5’race反應，Frohman等，同前)則另一引物為加有限制酶識別位點的Oligo dT，另一方面，在描定PCR反應中第二鏈是簡并的，因此，代表獨特的肽序列。
擴增的程序如下(1)95℃浸泡5分鐘；(2)95℃熱循環1分鐘；降溫至退火溫度45℃、50℃或55℃，1分鐘；持續退火溫度一分鐘，快速升溫至72℃超過1分鐘，72℃延伸1分鐘或1分10秒自動延伸。(3)72℃延伸循環5分鐘，(4)4℃浸泡，時間不定。熱循環周期(#2)，通常反應30輪。從100ul擴增反應液中取16ul，在2％Nusieve；1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳緩沖液是TAE，電壓為4伏/厘米，電泳3個小時。凝膠染色然后吸印到無電荷尼龍膜上，用作為引物內部序列的標記的DNA探針檢測。
特異擴增的DNA產物能從印進雜交實驗中被檢測出來。它們在膠上的位置可為純化和再擴增提供指導。如果合適的話，選定樣品的其余部分上樣到制備凝膠。電泳完畢后，從凝膠上切取0.5mm厚(它括特系產物的預定位置)的4-5片凝膠，切碎后浸入0.5ml電泳緩沖液中。40℃浸泡2-16小時。離心2分鐘除去凝膠，上層水相轉移入另一新管中。
再擴增是在相同于原始反應的引物和反應條件下，取5ul經洗脫的模板物質(大約是產物的1％)完成的。當擴增完成后，樣品用氯仿抽提并轉至新管。向反應體系中加入濃縮的限制酶緩沖液及酶，以便在接頭的限制酶位點處切開。經過消化的PCR產物經凝膠電泳純化，亞克隆至上述亞克隆毫節中描述的載體上DNA測序如上所述。VIII DNA序列分析應用區段裝配軟件裝配DNA序列并應用GCG的Gel Assemble，Map和Tramslate軟件應用推導氨基酸序列。推導出的氨基酸序列作為鈾間序列利用Word Search檢查蛋白質序列數據庫。分析是在VAX Station3100上進行，工作站在VMS5.1下運行。應用GCG7.0版進行數據搜尋，軟件為Swissprot，公開號碼為21。IX編碼GGF-I和GGF-II基因的克隆和測序結果如上所提到的，為了鑒定編碼牛GGF-II的DNA序列。從GGF-II肽序列設計簡并寡核苷酸探針。通過賴氨酰內肽酶降解純化的GGF-II制劑(見圖11和12)產生肽(序列號No.44)顯示與GGF-I07(序列號No.39)有很強的氨基酸序列同源性，后者是胰酶降解純化GGF-II制劑的產物。因此GGF-II12被用以設計10個簡并寡核苷酸探針(請看oligo.609，610和649至656，如圖21所示，序列號分別為69、70、71和79)。編碼兩個GGF-II12的重疊區域的兩套探針(一套為609，610，另一套為649-5656)用于探測兩套帶有目標基因的濾膜，雜交信號能被觀察到，但只有一個克隆與兩套探針雜交。該克隆(記為GGF2BG1)被純化了。
來自噬菌體的克隆GGF2BG1經Southern印跡分析確證兩套探針均與牛DNA序列雜交。近一步顯示兩套探針均能與克隆內同套DNA片段雜交，基于這些實驗，原克隆中一個4Kb的EcoR1酶切亞片段被鑒定、亞克隆和部分測序。圖22表示其核苷酸序列，(序列號No.89.)和從起始DNA序列推導出的氨基酸序列，其中包括了探針609和650的雜交位點并確證該部分牛基因組DNA編碼肽12(KASLADSGEYM)。
近一步的序列分析顯示GGF-II12位于有66個氨基酸的開放閱讀框內(如下)，它成為分離代表預測的牛GGF-II基因和cDNA的重疊序列的起點。
幾個PCR反應被用于獲得推測的牛GGF-II基因的另外的編碼序列。總RNA和寡聚dT選擇的(含多聚A)RNA樣品從牛的總垂體、垂體前葉、垂體后葉及下丘腦被分離出來。利用圖23，序列號109-119中列出的引物，以單側PCR反應(RACE)同時在3’和5’方向擴增cDNA末端，錨定PCR反應用代表其它GGF-II肽的簡并寡核苷酸引物進行。圖24概括了從這些實驗中得到的鄰近的DNA結構和序列。從3’RACE反應得到了三個相應的剪切過的cDNA序列，它們已被克隆和測序。5’RACE反應導致發現另外一個外顯子，它含有編碼至少52個氨基酸的編碼序列。通過對推導出的氨基酸序列分析發現GGF-II-6和與GGF-I-18序列相近的一個序列(如下)，錨定PCR反應鑒定出在300bp的另一個cDNA片段內含有肽GGF-II-1，2，3和10的編碼序列。這個片段(即，片段E，見圖31)的5’端限制是被編碼GGF-II-1肽和被用于PCR反應的寡核苷酸決定的(另外5’序列數據參見實施例6描述的人基因的克隆)。因此，這個克隆包含的核苷酸序列編碼全部九個新GGF-II肽序列中的六個。
克隆基因首先以GGF2BG1物理圖譜的形式描述，使我們如被發現的(見下文圖25)那樣確定編碼序列的位置。從上述編碼序列中設計的DNA探針已被用于鑒定該噬菌體克隆存在的含有外顯子的DNA片段，以及鑒定在兩個方向上與之有重疊的克隆。推測到的牛的GGF-II基因可分為至少5個編碼區域。編碼區域被定義為不連續長度的DNA，可利用通用遺傳密碼翻譯成多肽序列。編碼區域在圖31中有描述，現在應用的是(1)存在于GGF基因內的特殊外顯子(例如編碼區域a)或(2)從兩套或更多外顯子得來，這些外顯子出現在mRNA特殊亞類，每套都能被翻譯成特定多肽片段，如在基因產物顯示的。在權利要求書中提到的多肽片段是編碼區域DNA類似物的翻譯產物。僅有編碼區域A和B已被定義為外顯子并被測序和制作成圖。圖26概括了所鑒定的連續編碼序列。外顯子依其被發現的順序被列出來(α、β)。從內含子/外顯子的界限看，這是很明顯的即外顯子B可能包含于cDNA內，它將編碼區域E和A連接起來。也就是說為了不破壞閱讀框外顯子B不能被剪切。因此我們建議三種剪切形式能形成推測的牛GGF-II cDNA序列1，2，3。這些編碼序列被分別命名為GGF2BPP1.CDS，GGF2BPP2.CDS和GGF2B PP3.CDS。如圖28a(序列號No.133)、28b(序列號13.4)、28c(序列號135)所示，圖中同時列出由各種cDNA推導出的氨基酸序列。
推導的三種結構編碼長度依次為206，281和257個氨基酸的蛋白質。被推導的蛋白質序列的前183個氨基酸殘基在三種基因產物中是相同的。在184位克隆有顯著相差。編碼甘氨酸的密碼子GGT在GGF2BPP1中也作為GGF2BPP2和GGF2BPP3的剪切供體，或者可分別加到外顯子C、C/D，C/D’和D或C，C/D和D。如圖33所示(序列號No.149)，GGFIIBPP1是一個截短基因的產物，它的產生是由從編碼區域A剪切接合閱讀進入下一個插入序列(內含子)完成的。在圖31中被表示為編碼序列A’(序列號No.140)，轉錄終點鄰接典型的AATAAA多聚腺苷序列。提示這個截短的基因產物代表真正的成熟轉錄，另外兩個較長的基因產物擁有相同3’未轉譯序列和多聚腺苷酸位點。
所有這三種分子包含九個新GGF-II肽序列中的六個(見圖12)并且另一個肽是與GGF-I-18(見圖27)高度同源的。這些發現為這些重組分子編碼至少一個牛GGF-II區域提供了極大的可能性。近一步看這三種多肽計算出的等電點與GGF-I和II的物理特性是一致的。由于GGF-II的分子量大約為60KD，這三種cDNA中最長的應編碼具有近一半預計數目的氨基酸的蛋白質。
包括B和A外顯子的探針通過PCR擴增被稱記并用作篩查從牛垂體后葉分離的RNA制備的cDNA文庫。一個克隆(GGF2BPP5)顯示在圖30中描述的方式垂直包含另一DNA編碼序列(G)，其處于編碼片段A和C之間。整個核酸序列如圖32所示(序列號No.148)。來自最長的開放閱讀框的預測翻譯產物有241個氨基酸組成。第二個cDNA(GGF2BPP4)的一部分也從牛垂體后葉cDNA文庫中分離到，所用探針如上。圖30顯示克隆的位置圖。這個克隆在5’端是不完全的，在某種意義上說它是一個缺少編碼序列G和D的剪接變異體。BPP4也顯示除C/D區外具有H.KL區的新的3’末端。BPP4序列如圖34所示(序列號150)。實施例5 不同種屬中的GGF序列數據庫檢索沒有顯示任何預計的GGF翻譯產物與現有已知蛋白質序列相似之處，這提示GGF-II是一個新的蛋白家族或總家族中的第一位成員。在用其他哺乳動物DNA進行的高度嚴格的交叉雜交研究中(DNA印跡實驗)中，我們明顯地發現牛重組分子來源的DNA探針在各種被試樣品中能檢測到特異序列。一段高度同源的序列在人基因組DNA中也被檢測到。放射自顯影如圖29所示，各泳道雜交信號表示大鼠和人的GGF基因與探針的雜交情況。編碼該基因的許多cDNA序列最近由Holmes等報告(科學2561205，1992)及Wen等(細胞69559 1992)。實施例6 編碼人GGF2人序列的分離幾種包含有牛GGFII編碼區域E的人基因克隆由通過篩查從人腦干制備的人cDNA文庫分離到(Stratagene，catalog#935206)，這項策略的實施是基于大多數GGF2肽和從包含牛的E區域片段的克隆預測的肽序列之間有很強的關聯這個事實。這個文庫的篩查按實施例4第二部分進行。所用寡探針914-919如下914TCGGGCTCCATGAAGAAGATGTA915TCCATGAAGAAGATGTACCTGCT916ATGTACCTGCTGTCCTCCTTGA917TTGAAGAAGGACTCGCTGCTCA918AAAGCCGGGGGCTTGAAGAA919ATGARGTGTGGGCGGCGAAA用這些探針檢測到的克隆進一步用分子雜交分析。來源于編碼序列A(見圖21)的探針(通過標記片段A的聚合酶鏈反應(PCR)產物產生的)也被用于初級文庫的篩查。能與A和E衍生的探針雜交的克隆被選出。一個特定的GGF2HBS5克隆被選出來做進一步分析。這些克隆是以其編碼片段的形式表示的(如EBACC/D’D圖31所示)。克隆中的E片段是如圖37所示的截短形式牛中的E片段的人的等同物。GGF2HBS5所描述的所有“推測的”GGF-II候選者中最有可能編碼GGF-II的候選物。編碼區E的長度是由786個核苷酸和264個不翻譯的堿基序列組成。GGF2HBS5所編碼的蛋白質的預測大小是由423個氨基酸組成(約45KD，見圖45，序列號No.167)，它類似于脫糖基形式的GGF-II(見實施例16)的大小。另外，列于圖27中的7個GGF-II多肽與從E片段預測的蛋白質序列類同。II-6和II-12多肽是例外，其分別位于B編碼片段和A編碼片段。編碼GGF2HBS5蛋白質的RNA產生于體處翻譯系統，該系統由居于質粒載體(Bluescript sk(stratagene公司))，的T2噬菌體啟動子下啟動(見圖44)，該載體含有GGF2HBS5插入物。翻譯是在無細胞翻譯系統(兔網織紅細胞)中完成的。蛋白質產物的大小為45kd。在刺激施旺細胞的促有絲分裂活性檢測中分析該無細胞產物以確定其生物活性。用限制性培養基處理的施旺細胞通過125I-尿苷的摻入顯示其增殖提高并且也能對185Kd區域的蛋白質的酪氨酸磷酸化有所提高。
因此，在圖12中顯示GGF2HBS5所編碼的產物大小和編碼與圖12顯示的牛的肽高度同源的人肽的DNA序列的存在確證GGF2HBS5編碼牛GGF2的人類同物。由用GGFIIHBS5克隆轉化的細胞制備的限制性培養基有刺激施旺細胞有絲分裂活性。證實其基因產物是分泌型的(與BPP5基因產物不同)。另外，GGFIIBPP5基因的產物似乎通過P185erbB2這樣的酷氨酸激酶受體或相關受體介導施量細胞增殖(見實施例14)。實施例7 在昆蟲和哺乳細胞中表達人重組GGF2編碼人GGF2(如實施例6及HBS5)的GGF2HBS5 cDNA被克隆入載體pcDL-SRα296(Takebe等分子細胞生物學8466-472，1988)并在100mm平皿中轉染COS-7細胞，轉染方法為DEAE-dextran法(Sambrook等分子克隆實驗指南，第二版，CSH實驗室NY，1989)。轉染后培養3或4天收獲瞬時表達的COS細胞的裂解液或條件培養基。為了制備細胞裂解產物，單層細胞用PBS洗滌，從培養皿中刮下，然后加150ul 0.25M Tris -hclPH8.0緩沖液，凍融三次而裂解，離心沉淀細胞裂解碎片，回收上清。收集到上層限制培養液上清7ml，濃縮并依使用說明(Amicon，Beverly，MA)利用Centiprep-10和Centricon-10將緩沖系統換為10mM Tris-Hcl PH7.4。取自大鼠神經的施旺細胞被用于DNA合成前體的摻入實驗如實施例3所描述。限制培養液和細胞裂解物樣品被用于施旺細胞增殖實驗如實施例3描述。促有絲分裂活性數據列于圖46。編碼GGF2的cDNA GGF2HBS5指導蛋白質產物分泌于培養基中。利用細胞裂解物進行的分析確定，細胞內有可檢的微量總活性。GGF2HFB1和GGFBPP5 cDNA沒有指導產物分泌到胞外培養液中，只在其細胞裂解物中檢測到這些克隆的GGF活性(圖46)。
重組GGF2也在CHO細胞中得到表達。編碼GGF2的GGF2HBS5cDNA克隆到pcdhfrpoly A(圖54)的EcorI位點并轉染到無DHFR產生的CHO細胞株(DG44)，轉染方法為磷酸鈣共沉淀法(Graham&Van Der Eb.病毒學52456-467(1973))。在96孔板在無核苷和核苷酸的α培養基(Gibco)中選擇克隆。3周后，來自單個克隆的細胞培養液用施旺細胞增殖活性測試(如實施例3描述)篩查其表達的GGF，選擇在培養基中大量分泌GGF的穩定克隆。以取自不同體積CHO細胞培養液得到的施旺細胞增殖活性數據而制備如圖47所示劑量反應曲線(Graham&Van Der Eb，Virology52456，1973)。用Western印跡分析該物質，探針是抗GGF2特異肽的多克隆抗血清。在約69-90Kd較寬范圍內的譜帶被特異標記(垂體來源的GGF2到較高分子量的糖蛋白形式)。(圖49，Lane12)利用桿狀病毒表達體系在昆蟲細胞中也可表達重組GGF2。用攜帶GGF2HBS5 cDNA克隆的桿狀病毒(baculovirus)感染以3-5的多重感染性(106細胞/毫升)后培養于Sf900-II培養基(Gibco)。刺激施旺細胞的促有絲分裂活性物質被分泌到胞外培養液中(圖48)。在無forskolin條件下，不同體積的昆蟲細胞培養液被用于施旺細胞增殖實驗。數據制成劑量反應曲線如圖48所示。
用Western所述分析該物質(圖47)，探針是上述的GGFII特異性抗體。去糖基化形式的GGF-II的大小，45kd處條帶被觀察到(見實施例16)在此實施例中所用的方法如下重組人和牛神經膠質細胞生長因子刺激施旺細胞增殖的有絲分裂促進劑活性按如下決定培養的施旺細胞的對促有絲分裂劑的反應是在5μM forskolin存在下進行的。所用的是來源于哺乳動物細胞瞬間表達實驗的粗制重組GGF制品。與從轉染的或假轉染的COS細胞獲得的物質的曝光18-24小時之后測定[125I]-尿嘧啶的摻入，四套數據的均數和標準差如示。對部分純化的天然牛垂體GGF(羧甲基纖維素組分；Goodearl等人，submitted)促有絲分裂反應作為百分之百活性標準。
cDNA(圖53)被克隆入pcDL-SRα296載體(Takebe，et al.，Mol.Cell Biol.8466-472(1982))，并在100mm平皿中轉染COS7細胞。所用方法為DEAE-dextran法(Sambrook et al，In MolecularCloning.A Loboratory Mannual，2nd.ed，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)在轉染后3-4天收集細胞裂解液或限制性培養液。為了制備細胞裂解物，首先用PBS洗滌單層細胞，從培養皿刮出，加入150μl 0.25M Tris-Hcll PH8.0，凍融三次裂解細胞。沉淀細胞碎片并回收上清培養液，收集限制性培養液(7ml)，濃縮并利用制造商描述Centriprep-10和Centricon-10單位(Amicon，Beverly，MA)換緩沖系統為10mM Tris-Hcl PH7.4。取自大鼠神經的施旺細胞被用于DNA合成摻入實驗(Davis&Stroobant，細胞生物學雜志110135)-1360 1960；Brockes等，大腦研究，165105-118；1979)重組CHO細胞限制性培養液的Western印跡分析如下，重組CHO克隆培養于7ml MCDB302無蛋白限制培養基中，培養3天，取2ml限制性培養液濃縮并換緩沖系統為10mM Tris-HCL PH7.4，冷干。沉淀重懸浮于SDS-PAGE樣品緩沖液，進行還原性SDS-凝膠電泳，用GGF肽抗體進行Western印跡分析。CHO培養液對照用未經轉染的CHO-DG44宿主的限制性培養液。用重組克隆細胞的限制培養液分析CHOHBS5。實施例8 有關牛GGF的其他人序列的分離實施例5和6的結果顯示人GGF相關序列能很容易地用牛GGF序列衍生的DNA探針分離。另一種方法可用Holmes描述的方法(科學2561205，1992)。在本例中結合并活化P185erbB2受體(和與GGF相關)的人蛋白(heregulinα)是從一株腫瘤細胞系中得到并純化。可用其衍生的肽序列設計寡核苷酸探針，用于克隆編碼heregulin的cDNA。P185erbB2受體的活化的生化試驗有別于施旺細胞的增殖實驗。它類似于實施例1-4中從垂體cDNA中克隆GGF序列，heregulin蛋白和對應的cDNA按下列方法從腫瘤細胞系中分離出來。heregulin的分離是從生長于Percell Biolytica微載體珠(Hyclone Labs)上的MDA-MB-231乳癌細胞(ATCC#HTB26)的限制性培養液中得到的。10升培養液通過膜(10KD截止值)(Millipore公司)過濾濃縮25倍，并通過離心和過濾(0.22um)而澄清，濾過液加到肝素sepharose親合柱(Phamacia)。蛋白洗脫用0.3，0.6，0.9M的用磷酸鹽緩沖液溶解的NaCl逐級洗脫。各層析組分的活性由MCF-7乳腺癌細胞(ATCC#HTB22)上P185erB2受體酪氨酸磷酸化的程度計算。MCF-7細胞被置于24孔Costar板中的F12(50％)Dulbecco’s最低基本培養基(50％)(該培養基包含10％血清)(105細胞/孔)中培養并使其結合至少24小時。實驗前，首先將細胞轉移到沒有血清的培養液中培養至少1小時。過柱樣品(10到100μl)37℃培養30分鐘。吸出上清液，加入SDS-PAGE樣品緩沖液100μl停止反應。各樣品在100℃加熱5分鐘后，一部分(10-15μl)上樣到Tris-甘氨酸凝膠(4-20％)(Novex)，電泳之后，將疑膠上的蛋白電轉換至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，然后用溶于Tris緩沖鹽溶液并加有Tween-20(0.05％)(TBST)的牛血清蛋白(5％)封閉。室溫，稀釋于磷酸酪氨酸(高層次生物技術公司(Upstate Biotechnology)的單克隆抗體(1∶1000稀釋)作探針標記印跡，至少1小時。室溫條件下，用TBST洗膜。用結合有堿性磷酸酶(Promega公司)(1∶7500稀釋)的小鼠免疫球蛋白G抗體進行探測，至少30分鐘。雜交條帶在5-溴-4-氯-3-吲哚-1-磷酸溶液和氮藍四唑中顯色觀察。免疫印跡可通過Scan Jer Plus光密度計掃描。未刺激的MCF-7細胞信號強度有20-30單位。全刺激的的P185erbB2產生的信號強度為180-200單位。具有最大活性的0.6M NaCl加到事先經含30％乙醇的17mM磷酸納溶液(PH6.8)平衡過的聚天冬氨酸(PolyLC)柱子。溶于平衡緩沖液中的濃度從0.3M到0.6M的NaCl線性梯度用于洗脫結合蛋白。活性峰值樣品(NaCl為0.45M)再進一步用經含0.1％TFA和15％乙腈的緩沖液平衡過的C4反相柱分餾(Syn Chropak RP-4)分餾。經過60多分鐘，用25-40％梯度濃度的乙腈將蛋白從柱中洗脫下來。收集樣品(1ml)，檢測活性。在Tris-甘氨酸凝膠(4-20％Novex)上的SDS-PAGE進行分析。
HPLC-純化的HRG-α用含有賴氨酸C的0.1％SDS，10mM二硫蘇糖醇，0.1碳酸氫銨(PH8.0)溶液37℃消化20小時，消化片段經Synchrom C4柱(4000A°，0.2×10cm)溶解。該柱經0.1％TFA平衡，用含有梯度濃度1-丙醇的0.1％TFA溶液(W.J.Henzel，J.T.Stults，C.Hsu，D.W.Aswad，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)264.15905(1989))洗脫。色譜測得的峰值樣品真空干燥，測序。其中一個肽(-24％1-丙醇洗脫)的序列為[A]AEKEKTF[c]VNGGEXFMVKDLXNP(SEQ ID No.162)。括號中的殘基尚未確定，X表示不可能確定其中氨基酸的循環。初產量為8.5pmol，測出的序列與現已知的蛋白序列不一致。殘基1，9，15和22后來在cDNA序列分析中被確定為半胱氨酸。對經超載凝膠電泳并轉膜到VDF膜上的45KD條帶直接測序顯示，由于初產量低(0.2pmol)，所以只顯示低豐度序列被測出XEXKE[G][R]GK[G]K[G]KKKEXGXG[K](SEQ ID No.30)。這與heregulin-α(圖31)2到22位氨基酸殘基相對應，提示絲氨酸2是proHRG-α的氨基端。盡管氨基端被封閉。但可看到偶有少量常規封閉的蛋白不是轉譯后修飾的。氨基端序列排布是通過光譜儀測定被溴化氰消化的蛋白而確定的。分離蛋白的羧基端還沒有明確確定；可是，對蛋白裂解的混合物測序后發現成熟序列不超過241個殘基。氨基酸殘基如下A，Ala；C，Cys；D，Asp；E，Glu；F，Phe；G，Gly；H，His；I，Ile；K，Lys；L，Leu；M，Met；N，Asn；P，Pro；Q，Gln；R，Arg；S，Ser；T，Thr；V，Val；W，Trp；Y，Tyr.作為cDNA克隆的起源，用MDA-MB-231細胞中純化的mRNA(J.M.Chirwin，A.E.Przbyla，R.J.Mac Donald，W.J.Rutter，生物化學(Biochemistry)18，5294(1979)構建了寡(dT)-引物-λgt10(T.V.Huynn，R.A.Young，R.W.Davis，λgt10和λgt11DNA克隆技術一種實驗方法，D.Glover主編(IRC印刷，牛津，(1984))的cDNA文庫(U.Gubler和B.J.Hoffman，基因(Gene)25，263(1983))。在人類密碼子最高出現頻率的基礎上設計了編碼13-氨基酸序列AEKEKTFCVNGGE(SEQ ID No.31)(13)的如下八個簡并反義脫氧寡核苷酸(R.Lathe，分子生物學雜志(J.Mol，Biol)183，1(1985))并進行了化學合成5′-CTCGCC(G或T)CC(A或G)TTCAC(A或G)CAGAAGGTCTTCTCCTTCTCAGC-3′(SEQ ID No.40)。為了設計探針，將半胱氨酸放入該氨基酸序列的未知殘基上。磷酸化作用標記探針并在低嚴格度條件下與cDNA文庫進行雜交。在該文庫中，proHRG-α蛋白得以確定。HRB-β1的cDNA是通過用proHRG-α5′端和3′端衍生的序列對一個第二個寡(dT)-引物引導的λgt10文庫進行探針檢測而確定的，所述文庫是從MDA-MB-231細胞的mRNA中制備。克隆13(圖2A)是通過用5′HRG-α序列對并引發的(5′-CCTCGCTCTTCTTCTTGCCCTTC-3′引物(SEQ ID No，41)；proHRG-α反義核苷酸33到56)MDA-MB-231λgt10文庫篩選產生的。對應于克隆13的5′端的序列作為探針用于鑒定來源于MDA-MB-231細胞mRNA的第三個寡(dT) -引物引導的λtg10文庫中的proHRGβ2和proHRGβ3。編碼四個HRGs中每一個HRG的二個cDNA克隆已被測序(F.Sanger，S.Milken，A.R.Coulson，美國科學院科學進展(Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.)74，5463 1977)。另一個命名為克隆84的cDNA具有與proHRGβ2至第420氨基酸之間相同的氨基酸序列。421位終止密碼子之后緊跟著一個不同的3′-未翻譯序列。實施例9分離再剪切變異體實施例6中的方法產生四個緊密相關的序列(heregulinα，β1，β2，β3)，這四個序列的產生是剪切變異的結果。Peles等(細胞(Cell)69，205(1992))和Wen等(細胞(Cell)69，559(1992))已經分離出另一個剪切變異體(從大鼠中)，他們使用了相似于實施例1-4及6中敘述的用于與P185erbB2結合的蛋白純化和克隆方法。cDNA克隆通過如下方法獲得(通過對來源于轉化大鼠成纖維細胞系的P185erbB2結合蛋白純化并測序獲得)。
P185erbB2結合蛋白通過如下方法從限制性培養液中純化出來。從三個500nl離心瓶中得到的混合限制性培養液(共120升)經過0.2μ濾膜過濾澄清并通過用20kd截止分子大小的膜，用Pelicon超濾系統對樣品濃縮30倍。所有的純化步驟都使用Pharmacia的快速蛋白液體色譜分離系統進行。濃縮后的樣品直接上樣到肝素-Sepharose柱子(150ml，先用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)預平衡)。用含0.2M NaCl的PBS溶液沖洗柱子直到280nm波長吸收值為零時。用連續NaCl梯度濃度梯度(從0.2M到1.0M)洗脫被結合蛋白，收集5ml樣品。合并樣品，0.01ml收集的組分，用于定量檢測激酶激活活性，將三個柱子(總體積360ml)所得的活性樣品混合，用YM10超濾膜(Amicon，Danvers，MA)濃縮至25ml并加入硫酸銨至終濃度為1.7M。離心澄清之后(10,000xg，15分鐘)將混合樣品上樣到苯基-Superose柱上(HR，10/10，Pharmacia)。用溶于0.1MNa2PO4(PH7.4)溶液中的45ml(NH4)2SO4梯度濃度(從1.7M到0)溶液，展開柱子，收集2ml樣品，測定(0.002ml/樣品)激酶激活性性(實施例6中所用方法)。收集活性主要峰值樣品并混合，用50mM磷酸鈉緩沖液(PH7.3)透析。Mono-S陽離子交換柱(HR5/5，Pharmacia)用50mM磷酸鈉預先平衡。活性物(0.884mg蛋白，35ml)上樣后，用起始緩沖液沖洗，然后以1ml/分鐘流速，用NaCl濃度梯度展開。激酶激活活性在0.45-0.55M鹽濃度時恢復，按2ml一份收集到的樣品中有4份有活性。將這些樣品混合，直接上樣到Cu2+螯合柱上(1.6ml，HR2/5螫合Superose，Pharmacia)。絕大多數蛋白被吸附在樹脂上，但他們逐步被約30ml氯化銨(0-1M)線性梯度濃度的溶液洗脫下來。蛋白單峰值洗脫下的活性物對應在0.05到0.2MNH4Cl處。從各純化步驟收集的樣品進行凝膠電泳分析，之后用ICN(Costa Meta，CA)試劑盒銀染，蛋白含量通過使用Bio-Rad公司(Richmond，CA)試劑盒進行考馬斯亮蘭結合試驗測定。
在200μl 0.1M碳酸氫銨緩沖液(PH7.8)中，重新構建p44蛋白(10ug)。在酶∶樣品量為1∶10比例，37℃條件下，用L-1-甲苯磺酰胺-2-苯乙基氯甲基酮處理過的胰蛋白酶(Serva公司)消化18小時。消化后的肽混合物通過反相HPLC柱分離并使用Vydac C4微型柱(2.1mm i.d.x15cm，300A°)及經裝有二極管裝置檢測器和工作站的HP1090液相色譜系統監測215nm處光吸收值。柱子先用0.1％的三氟乙酸(流動相A)平衡，用線性梯度濃度0％-55％流動相B(90％乙腈于0.1％三氟乙酸中)洗脫70分鐘。洗脫流速為0.2ml/分鐘，柱子的溫度控制在25℃。從HPLC系統手工收集到的肽峰樣品的1/3通過Edman降解分析N-端序列進行檢測。27.7分鐘后(T27.7)洗脫的樣品含有混合氨基酸序列，在還原之后按下述方法再進行色譜測定肽組分的70％真空干燥并重溶于100μl 0.2M碳酸氫鈉緩沖液(PH7.8)中。向溶液中加入DTT(終濃度2mM)，并在37℃保溫30分鐘。減少了的肽混合液由Vydac柱(2.1mm i.d.x15cm)的反相HPLC分離。洗脫條件及液相流速同前所述。用Model 477蛋白測序儀(Applied Biosystems，Inc.Foster City，CA)對肽進行氨基酸序列分析，該分析儀裝有在線乙內酰苯硫脲(PTH)氨基酸分析設備和Model900資料分析系統(Hunkapiller等(1986)發表于蛋白微量檢測方法(Methods of ProteinMicrocharacterization)，J.E.Shively編輯，Clifton，New JerseyHuman PressP.233-247)。將蛋白上樣到三氟乙酸處理過的，事先經poly-brene和NaCl循環過的波動纖維盤上。用微量色譜系統(Model 120)分析PTH-氨基酸，該系統采用雙注射泵和反相(C-18)狹孔柱(Applied Biosystems.2.1mm×250mm)。
用標準程序從Ratl-EJ細胞中分離RNA(Maniatis等，分子克隆實驗手冊(Molecular CloningA Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor，NewYork(1982))并使用mRNA分離試劑盒(Clontech Lab.Inc.Palo Alto.CA)篩選出poly(A)+。用Superscript試劑盒(BRL Life Technologies，Inc.，Bethesda，MD)合成cDNA。從柱中洗脫的雙鏈cDNA連接到SalI和NotI消化過的pJT-2質粒載體中(該載體來源于pCD-X載體(Okayama和Berg，分子細胞生物學(Mol.Cell Biol3280(1983))并通過電穿孔將載體轉入DH10BE.coli中(Dower等，核酸研究(Nucl Acids Res)166127(1988))。用來源于NDF(殘基5-24)和T40.4胰蛋白肽(殘基7-12)N-端的蛋白序列作為二個寡核苷酸探針，篩選出將近5×105的初始轉化物。它們對應的序列如下(N表示全部4nt)(1)5′-ATA GGG AAG GGC GGG GGA AGG GTC NCC CTC NGCATAGG GCC GGG CTT GCC TCT GGA GCC TCT-3′(2)5′-TTT ACA CAT ATA TTC NCC-3′C G G C(1SEQ ID No.167；2SEQ ID No.168)用T4聚核苷酸激酶對合成寡核苷酸末端用[r32-P]ATP標記。用該探針篩選重復的硝酸纖維素膜。雜交液含有6×SSC，50mM磷酸鈉(pH6.8)，0.1％焦磷酸鈉，2×Denhard’s液，50μg/ml鮭魚精DNA，20％甲酰胺(用于探針1)或無甲酰胺(用于探針2)。50℃用0.5×SCC，0.2％SDS，2mM EDTA(用于探針1)洗膜或37℃用2×SSC，0.2％SDS，2mMEDTA洗膜(用于探針2)。膜上的放射自顯影信號表明有10個克隆與兩個探針都雜交。這些克隆通過上述再培養和探針雜交而純化。使用Applied Biosystems373A自動DNA測序儀和Appled Biosystems Taq Dye DeoxyTMTerminator循環測序試劑盒，按廠家說明進行cDNA克隆測序。有些實驗使用[35S]dATP(Amersham)和美國Biochemicals公司的SequenaseTM試劑盒按制造商的說明獲得序列。克隆44cDNA的兩條鏈都是以合成的寡核苷酸為引物而測定的。最大的5’350nt序列是在七個互無關系的cDNA克隆中測定的。得到的克隆證實了圖30(NDF)中方式。實施例10 檢測其它可能的剪切變異體的策略推測的牛的cDNA克隆的氨基酸的序列及其PCR產物和已發表的人(圖31)及大鼠的序列顯示了高度相似性，表明這些序列來源于三種生物的同源基因。在cDNA/PCR產物水平上測定的信使RNA轉錄數量上的差異可能是由于廣泛的組織特異剪切引起的。圖30所顯示和獲得的方式提示有另外的剪切變異體存在。可能的剪切變異體列于圖37中。這其中的許多變異體可通過來源于不同組織的cDNA文庫中特異探針編碼片段和針對特殊編碼片段的引物引導的PCR而獲得的。另外，可利用已知的剪切技術在特異cDNA克隆，PCR產物或基因組DNA區域制備變異體。例如，用一個共同編碼片段(e.g.A)的稀有限制酶切位點可將GGF2BPP5的FBA氨基末端與GGF2BPP1，GGFBPP2，GGFBPP3，GGFBPP4的羧基端序列連接。不管編碼片段E和/或G存在與否，為基因提供益處，這些編碼片段都包括在表達結構中。這些突變序列可在重組體系統中表達，并且重組體產物可用于檢測施旺細胞促有絲分裂活性水平及該細胞結合和激活P185erB2受體的能力。實施例11 GGF功能因子的檢測推測的GGF序列家族結構表明最長的組成(以GGF2BPP4為代表部分編碼跨膜蛋白，其中，細胞外的部分區域)含有裝配表皮生長因子(參看Carpenter和Wall的肽生長因子和它們的受體I(Peptide Growth Factors and Their Receptors I)69-133頁，Springer-Velag，NY1991)的一個區域。編碼片段C和C/D或C/D肽序列中的半胱氨酸殘基保留著與表皮生長因子(EGF)肽序列中類似殘基(見圖35，SEQ ID NOs.151-153)。這就提示胞外功能是作為受體識別和生物激活位點。少數突變體缺少H、K和L編碼片段，這可能被表達為分泌的傳導生物活性的蛋白。編碼包含EGF-Like區(EGFL)的多肽的GGFDNA序列具有激活神經膠質細胞促有絲分裂活性的全部生物學活性。蛋白的膜結合形式可包括施旺細胞的增生是在胚胎期還是在神經再生期于神經元表面表達(神經元表面最初與再生施旺細胞接觸的地方)。
分泌的(與膜不結合)GGFS具有典型的可擴散因子的作用，該因子能夠在距分泌處一定距離內與施旺細胞發生作用。由于組織損傷和細胞破裂，另一些形式的GGFs可從細胞內釋放出來。被分泌的GGF的一個例子是被GGF2HBS5編碼的蛋白(見實施例6)；這是人們所知道的被直接分泌到細胞外的唯一GGF(見實施例7)。通過E區域發現的N-末端疏水序列對分泌進行調節，該疏水序列位于GGF2HBS5編碼的重組體的N-末端區域。
另一些GGF’s看起來是非分泌(見實施例6)。這些GGFs可能是損傷應答形式，它們只有組織遭到破壞時才釋放。
GGF-II(由GGF2HBS5編碼)的預測蛋白結構的其它區域和含有B和A區域的其它蛋白與人類基底膜硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白相似(參考)。ADSGEY肽在GGF’s中緊挨C2免疫球蛋白折皺的第二個半胱氨酸，在層狀蛋白底層出現C-2重復的概率為9/22。這些結果強有力地說明，這些蛋白可能與基體蛋白例如與神經元和神經膠質有關的蛋白相連，同時提出了在靶位點分離神經膠質生長因子的方法。實施例12 從重組細胞中純化GGFs為了獲得全長或部分GGFs以測定其生物活性，使用克隆的DNA可制備過量蛋白。可使用的方法有幾種。可構建含有上述序列的重組大腸桿菌細胞。按照廠商提供的程序，表達系統例如pHN8a或pHH16a(Stratagene Inc.)可用于此目的。另外這些序列可插入哺乳動物的表達載體并建立高產細胞系。例如，為此目的編碼一個GGF的DNA，克隆GGF2BPP5已在COS細胞和中國倉鼠卵巢細胞(見實施例7)中表達(生物化學雜志(J.Biol.Chem.263，3521-3527，(1981))。用已有的方法可將含有GGFDNA序列的載體轉入宿主細胞。
瞬間表達可被檢測出，或者在氨甲蝶呤存在時，培養G418-抗性克隆用于篩選擴增dhfr基因(存在于pMS XND載體上)的細胞，在此過程中可同時一起擴增相鄰的GGF蛋白的編碼序列。因為CHO細胞可在完全無血清，無蛋白的培養液中存活(Hamilton和Ham，體外(In Vitro)13，537-547(1977)，所需的蛋白可直接從培養液中純化出來。使用實施例9中產生的抗血清進行Western雜交分析，可檢測細胞過度生長的限制性培養液中存在的所要蛋白。
按如下方法所說，從瞬時表達型COS細胞的限制性培養液中純化所要蛋白(rGGF-II)。從限制性培養液中收取rGGF-II蛋白，用陽離子交換層析(POROS-HS)進行部分純化。用PH6.0的33.3mM MES平衡柱子。以10ml/分鐘的流速度上樣于限制性培養液。含有施旺細胞增殖活性和免疫反應活性(使用按上述的GGFII肽的多克隆抗血清)的峰值樣品是用50mM Tris，1M Nacl PH8.0溶液洗脫下來的(分別對應于圖50A和50B)。
rGGF-II也在穩定的中國倉鼠卵巢細胞系中表達。從收集的限制性培養液得到的rGGF-II經陽離子交換層析(POROS-HS)得到部分純化。用PH7.4PBS平衡柱子。以10ml/分鐘上樣于限制性培養液。含有施旺細胞增強活性和免疫反應活性(用GGFII多克隆抗血清)的峰值樣品是用50mM Hepes，500mM Nacl PH8.0洗脫下來的。另一個峰是用500mM Hepes，1M Nacl PH8.0洗脫下來的，該峰值樣品同樣具有增殖和免疫反應活性(圖51)。
rGGF-II可進一步用作為一個高分辨力步驟的疏水反應色譜分析法；陽離子交換/反相色譜法(如有必要作為第二個高分辨力步驟)；病毒失活法和DNA切割法例如陰離子交換色譜法進行純化。
操作步驟詳細描述如下從陽離子交換柱上洗脫下的重組GGF-II峰的促施旺細胞增殖活性用如下方法測定在5M Forskolin存在下，用5mM Tris，1M Nacl PH8.0洗脫的峰對培養的施旺細胞促有絲分裂反應進行測定。在201，101(1∶10)101和(1∶100)101時加入洗脫峰。18-24小時接觸后可測定摻入的125I-尿苷并表示為(CPM)。
GGF-II肽的多克隆抗體免疫雜交方法如下10μl不同的樣品在4-12％梯度凝膠上電泳。將疑膠轉移到硝酸纖維素膜上，用5％BSA封閉硝酸纖維膜印跡，用GGF-II-特異抗體(1∶250稀釋)探針檢測。125I蛋白A(1∶500稀釋，比活性＝9.0/Ci/g)用作第二抗體。免疫雜交在Kodak X-光膠片上曝光6小時。1M Nacl洗脫峰樣品在65-90Kd處顯示了一個寬厚的免疫反應條帶，這正預期大小范圍的GGFII和較高分子量的糖原。
GGF-II在陽離子交換柱上純化過程如下表達rGGFII的CHO細胞的限制培養液以10ml/分鐘的流速上樣到陽離子交換柱上。柱子用PH7.4PBS平衡。用50mM Hepes)500mM Nacl及50mM Hepes，1M NaCl pH8.0分別進行洗脫。用這里敘述的測定施旺細胞增生的方法(CPM)對所有洗脫樣品進行分析。用BSA作標準由布來得福特(Bradford)方法測定蛋白濃度(mg/ml)。
從各樣品中取10μl進行Western雜交，正如圖51A和51B指出的免疫反應活性和施旺細胞活性一起遷移。
這里所敘的施旺細胞促有絲分裂分析可用于檢測全長克隆或其任何具有生物活性的部分的表達產物。全長克隆GGF2BPP5已在OCS細胞中瞬間表達。采用實施例1中所描述的施旺細胞增殖對轉染的COS細胞內抽提物進行檢測，抽提物顯示生物活性。另外，編碼GGF2HBS5的全長克隆已在CHO和昆蟲(實施例7)細胞中瞬間表達。這時，兩種細胞的抽提物和限制性培養液都對在實施例1中所述的施旺細胞增殖試驗中顯示生物活性。從GGF基因(包括Heregulins)衍生出的剪切變異體互補DNA的家族的任何成員都能以這種方式表達，并由熟悉這一技術的人員進行施旺細胞增殖活性檢測。
除此之外，重組物質可以按照Wen等的方法(細胞，69，559，(1992))與其它變異體分開。Wen等在COS-7細胞中表達了剪切突變體Neu分化因子(NDF)。插入pJT2真核質粒載體的cDNA克隆受到SV40早期啟動子的控制，并在3′端一側與SV40的終止多聚腺苷酸信號相連。通過如下電穿孔方法將pJT-2質粒DNA轉染進COS-7細胞6×106個細胞(懸于0.8ml的DMEM和10％FEBS)轉移到一個0.4厘米的小杯中，與溶于10μlTE溶液(10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA)的20μg質粒DNA混合，用一脈沖控制系統設定為200歐姆的Bio-Rad基因脈沖裝置，在室溫下以1600V和25uF進行電穿孔。隨后，細胞用20mlDEME，10％FBS稀釋，并轉移到一個T75瓶中(Falcon)。于37℃孵育14小時后，用DMEM，1％FBS替換培養基，繼續孵育48小時。收集該細胞的含有重組蛋白的限制性培養基，證明表達該蛋白受體的細胞系中有生物活性。這一細胞系(培養的人乳癌細胞系AU565)用重組物質處理。處理的細胞顯示出標志erbB2受體活性特征的形態變化。這類限制性培養液也可用施旺細胞增殖試驗進行檢測。實施例13 結合于p185erbB2受體的其它蛋白的純化和分析I、gp30和p70的純化Lupu等(科學，249，1552(1990))及Lippman和Lupu(專利申請號PCT/US91/03443(1990))，已從人乳癌細胞系MDA-MB-231限制性培養液中純化出一種蛋白，在此特將該參考文獻引入本文，方法如下采用眾所周知的程序收集限制性培養液，用一個Amicon超濾膜過濾細胞(YM5膜)(Amicon，Danvers，MA)將培養基濃縮100倍。一旦澄清并濃縮，就把培養基保存在-20℃，同時在接下來的幾天里進行連續收集。利用Spectra/porR管道系統(Spectrum Medical Industries，洛杉璣，加州)，在4℃下于100倍體積的0.1M乙醇透析濃縮培養液兩天以上。透析過程中沉淀下來的物質在4℃以4000rpm離心30分鐘除去，加入蛋白酶抑制劑。將澄清的樣品凍干。
凍干的培養基重新溶于1M乙酸中，終濃度達到總蛋白量約25mg/ml。不溶物質經10000rpm離心15分鐘除去。樣品上樣SephadexG-100柱(XK16，Phamacia Piscataway，NJ)，用1M乙酸平衡并在4℃以30ml/小時的流速用1M乙酸進行洗脫。從4ml濃縮100倍的培養基中得到100ng的蛋白。3ml的洗脫液部分凍干后重懸于300μl PBS用于分析，并作進一步純化。
經Sephadex G-100純化后的 物質上樣反相高壓液相色譜(HPLC)。第一步中包含一個陡的乙腈梯度，較陡的乙腈梯度處理和所有其綜HPLC步驟都于室溫下，在經水相(HPLC級)的0.05％TFA(三氟乙酸)平衡的C3-反相柱上進行。樣品上樣后以流速1ml/min用線性梯度(0.05％TFA中含0-45％的乙腈)洗脫30分鐘。在280nm測光吸收值，以1ml部分收集并凍干，然后分析EGF受體競爭活性。
第二個HPLC步驟包含一個平緩的乙腈梯度，上一步驟HPLC處理的活性組分重新過同一根柱進行層析，采用0.05％TFA中含0-18％的乙腈洗脫5分鐘，接著用0.05％TFA中含18-45％乙腈的線性梯度洗脫30分鐘，流速為1.0ml/min，以每組分1ml部分收集。人TGFα類似因子在30-32％乙腈濃度處洗脫RRA可檢測的單峰。
Lupu等(Proc.Natl，Acad，Sci，89，2287(1992))純化了結合在p185erbB2受體上的另一種蛋白。這一特殊蛋白為p75，是從用于 SKBr-3(一種人乳癌細胞系)生長的限制性培養基中純化得到的，所述培養液是由SKBr-3在補充有10％胎牛血清(GIBCO)的改良Eagle培養基(IMEMGIBCO) 中繁殖。采用p185erbB2受體親和柱從濃縮(100x)的限制性培養基中純化出p75。94千道爾頓的p185erbB2受體(結合p75)胞外區的產生是經重組表達，并與多聚丙烯酰胺肼-Sepharose親和層析基質偶聯，偶聯后的基質用冰預冷的1.0M HCl充分洗滌，再用0.5M NaNO2活化珠，0℃保持20分鐘，然后過濾并用冰預冷的1.0M HCl洗滌。500ml濃縮的限制性培養液自然流過基質，柱上用pH從4.0到2.0的1.0M檸檬酸洗滌并逐級洗脫(使得erbB2和p75解離)。所有部分都在Pharmacia PD10柱上脫鹽，純化過程在pH3.0到3.5的洗脫范圍產生一75KD的同源多肽(通過SDS/PAGE銀染分析確定)。
II.gp30與p185erbB2的結合純化的gp30蛋白用一試驗測試其是否結合在p185erbB2上。該試驗為抗p185erbB2的單克隆抗體進行的競爭試驗。gp30蛋白代替抗體結合在SK-BR-3和MDA-MB-453細胞(表達p185erbB2受體的人乳腺瘤細胞系)的p185erbB2。gp30的施旺細胞增殖活性也可以通過用實施例1-3所述的分析程序用純化的gp30處理施旺細胞細胞培養物而加以證明。
III.p75與p185erbB2的結合為了確定從SKBr-3限制性培養液所得的75KD的多肽(p75)是否確實是SKBr-3細胞的erbB2癌蛋白的配體，采用了上述gp30的競爭試驗。結果發現p75顯示出結合活性，而來自其它層析部分的物質沒有顯示出該活性(數據未顯示)。流出物顯示出一些結合活性，這可能是流出的erbB2ECD造成的。
IV.其它p185erbB2配體Peles等(“細胞”，Cell69，205(1992))也已從大鼠細胞中純化出一種刺激p185erbB2的配體(NDF，方法見實施例8)。Helmes(“科學”Science，256，1205(1992))已從人細胞中純化出能結合并激活p185erbB2的Heregulinα(見實施例6)。Tarakovsky等(“癌基因”，Oncogene6218，(1991))證明從活化的巨噬細胞分離出的25KD多肽結合于Neu受體(一種p185erbB2同源物)特此該參考文獻引入本文。
VI.DNF分離Yarden和Peles(“生物化學”Biochemistry30，3543(1991))已確定一種能刺激p185erbB2受體的35KD的糖蛋白。按如下程序在限制性培養基中鑒定這一蛋白。大鼠I-EJ細胞在175平方厘米的培養瓶(Palcon)中長至粘合，單層細胞用PBS洗滌，并在無血清的培養基中保留10-16小時。棄去該培養基，換用從培養3天的培養物收集的新鮮的無血清培養基，該限制性培養基經低速離心去沉淀，用帶YM2膜(截留分子量2000)的Amicon超濾器濃縮100倍。限制性培養基中neu刺激活性的生化分析表明配基是一熱穩定但易降解35KD糖蛋白。這一因子用高鹽濃度或酸性乙醇可沉降下來。通過選擇性沉降，肝素-瓊脂糖層析和稀酸中的凝膠過濾部分純化該分子產生一個活性配體，它可以刺激原致癌受體，但對有組成型活性的neu蛋白無效。然而這一純化部分保留了同時刺激EGF相關受體的能力，這提示此兩種受體通過雙向機制功能性地偶聯在一起。或者，假定的配體同時和此兩種受體相互作用。利用這一因子具有的生化特性，可能可以得到該因子的完全純化產物，并用以研究上述的可能性。
在其他出版物，Davis等(“生物化學生物物理研究通訊”Biochem Biophys.Res.Commun，179，1536(1991)，“美國國家科學進展”88，8582(1991)和Greene，PCT專利申請PCT/US91/02331(1990)描述了從人T-細胞系(ATL-2)的限制性培養液純化了一種蛋白。
ATL-2細胞系為一種IL-2-非依賴型的HTLV-1(+)T-細胞系。無菌質的AT-2細胞在含10％FCB的RPMI1640培養基(10％FCS-RPMI1640)中，于37℃和5％CO2濕潤空氣中培養。
為純化該蛋白類物質，ATL-2細胞用1×PBS洗滌兩次，以3×105ml在無血清的RPMI1640培養基12mML-谷氨酰胺中培養72小時，接著收集細胞沉淀，如此得到的培養物上清稱之為“限制性培養液”(C.M)。
用一截留1000D的YM-2Diafol膜(Amicon Boston，MA)將C.M.濃縮100倍，即從1000ml到10ml。為了用于一些測試，含有大于1000MW的濃縮C.M重新用PRMI培養基稀釋至原體積。將來自一升制備液的這兩個柱的一些純化物質經聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳(Integrated Separation Systems，Hyde Park，MD或Phorecast System by Amersham，Arlington Heights，IL)及銀染顯現出至少4至5條帶，其中10KD和20KD帶為這一物質所特有。含有小于1000MW的組分的過濾膜C.M.不需稀釋直接應用。
濃縮的限制性培養液用0.45μ的uniflo濾器(Schleicher和Schuell，Keene，NH)過濾除菌，采用一個經10mMTris-HCl pH8.1濃縮的C.M.預平衡的DEAE-SW陰離子交換柱(Waters，Inc.，Milford，MA)進一步純化。每次HPLC相當于1升的原ATL-2限制性培養液的蛋白，該蛋白吸附到柱子上后，用0mM-40mM NaCl的線性梯度以4ml/min的流速洗脫，用體外免疫復合物激酶試驗分析10％DEAE組分(一個柱子純化的樣品)，或用1％C18組分(兩個柱子純化的樣品)的體外收集組分。用此方法測得的以劑量依賴方式增加p185c-neu的酪氨酸激酶活性的活性峰洗脫為在220-240nm NaCl附近，橫跨4-5個組分(36-40)的一主峰neu。HPLC-DEAE純化之后，有活性部分的蛋白被濃縮和集中，用C18 (Million Matrix)反相柱層析(Waters，Inc.，Milford，MA)(稱為C18#1步驟或雙柱純化物)處理。以含有0.1％TFA的異丙醇線性梯度洗脫。所有收集物在RPMI1640培養基中透析以除去異丙醇，并在下文用體外免疫復合物激酶試驗，和1％濃度的合適組分進行分析。增加了的p185c-neu的酪氨酸激酶活性在兩個峰中洗脫。一個洗脫于11-13組分，而另一個活性較弱的峰洗脫于20-23組分。這兩個峰合各自相應于5-7％的異丙醇和11-14％異丙醇的濃度。C18#1產生的11-13組分用于特性研究。從第二個層析步驟得到的活性組分集中后作為蛋白類物質樣品。
用這一純化策略處理20升制備液，35-41的DEAE活性組分集中后進行上述C18層析。C18#1的11-13和20-23組分都有劑量依賴活性。11-13組分集中液再進行一次C18層析(稱為C18#2步驟或三柱純化物)。再一次，11-13和20-23組分都有活性。組分23的劑量應答通過實施例8所述的體外免疫復合物激酶試驗，通過加入0.005％體積的23組分和0.05％體積的23組分得到確定，這表明已達到最高純度。
根據凝膠過濾層析和超濾膜分析確定分子量范圍。保留了幾乎相等量的酪氨酸激酶活性，并通過10,000分子量截留濾膜。幾乎所有活性都通過了30000D的截留濾膜。通過采用相同的條件，對含劑量依賴性neu激活活性的組分與一系列蛋白分子量標準品(sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的洗脫曲線輪廓加以比較，確定層析活性部分的分子量范圍。活性的低分子量范圍確定在7000-14000D之間。活性的第二個范圍為14000-24000D之間。
經聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳(Integrated Separation Systems，Hyde Park，MD或Phorecase System by Amersham，Arlington Heights，IL)之后，三柱純化(C18#2)用商品化銀染色試劑盒(BioRad，Rochkville Centre，NY)銀染。來自20升制備液的C18#2純化收集的21、22、23和24組分與標準品同時電泳，22和23組分顯示出對185erbB2(neu)激酶試驗(見下文)最強的劑量效應能力，選擇的分子量部分與185erbB2的相互作用由免疫復合物激酶試驗加以證實。
Huang等(1992，“生物化學雜志”J.Biol.Chem，25711508-11512)已從牛腎中分離了另一種neu/erbB2配體生長因子，在此作為參考文獻。25KD的多肽因子用柱分步分離，接著在DEAE/纖維素(DE52)、Sulfadex(硫酸化的Sephadex G-50)、肝素-Sepharose 4B和Superdex 75(快速蛋白液相層析)進行一系列柱層析。NEL-GF這一因子刺激neu/erbB2基因產物的酪氨酸特異性自磷酸化。VII、結合于p185erbB2的配體的免疫復合物試驗NDF該試驗反映了通過用不同用量的ATL-2限制性培養液(C.M.)或蛋白類物質進行PN-NR6細胞的預孵育而導致的免疫沉淀p185的自磷酸化活性的差別。下文中將此活性稱為neu-激活活性。
用于免疫復合物激酶檢測的細胞系按Kokai等(“細胞”Cell，55，287-292(July28，1989))公布的方法獲得、制備和培養，特此引入參考文獻，其中有完整的說明，同時并上美國申請序列號386，820，申請日1989-7-27，以Mark I.Green的名義，題為“治療含抗受體的抗體的癌細胞的方法”。
細胞系于37℃含5％CO2的濕潤環境下保存于含5％FCS的DMEM培養基中。
在150mm皿培養的細胞中用冷PBS洗滌兩次，刮至10ml凍融的緩沖液(150mM NaCL，1mM MgCl2，20mM Hepes，pH7.2，10％甘油，1mM EDTA 1％ Aprotinin)，離心(600×6，10分鐘)。細胞沉淀重懸于1ml裂解緩沖液(50mMHepes，pH7.5，150mM NaCl，3％Brij35，1mM EDTA，1.5mM MgCl2，1％ Aprotinin，1mMEGTA，20μM Na3VO4，10％甘油)，于4℃旋轉30分鐘。除非特指，所有的化學試劑都來Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO。不溶物質通過40,000×g離心30分鐘除去。清亮的上清作為細胞裂解液留用。
細胞裂解液與50μ的50％(體積比)蛋白A-Sepharose(Sigma Chemical Co.，St，Louis，MO)共同孵育15分鐘，離心2分鐘使裂解液清亮，50μl液相的預清亮的細胞裂解液與限制性培養液、蛋白類物質或其特殊因子(終體積至1ml)在冰上孵育15分鐘。樣品與5μg的識別p185neu和p185c-neu的胞外區的7.16.4單克隆抗體或其它相應抗體一起保溫于冰上20分鐘。加入50μl 50％(V/V)A-Sepharose，4℃振蕩20分鐘，離心收集免疫復合物，用500μl漂洗緩沖液150mM Hepes pH7.5，3％Brij35，150mM NaCl，2mM EDTA，1％Aprotinin，30μMNa3VO4)洗滌2次，于27℃孵育樣品20分鐘，若樣品的純度高，也可于4℃孵育25分鐘。終止反應時加入3×SDS樣品緩沖液(含2mM ATP，2mM EDTA)并于100℃孵育5分鐘。上樣于10％丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE分析。之后，取凝膠染色、干燥，借助增感屏使凝膠曝光于Kodak XAR或XRP膠片。VIII、誘導乙酰膽堿受體的活性物(ARIA)的純化ARIA是一種能刺激乙酰膽堿受體合成的分子量為42KD的蛋白質，已在Gerald Fischbach實驗室得到分離。(Fall等“細胞”Cell 72801-805(1993)。ARIA能誘導分子量為185KD的肌細胞跨膜蛋白的酪氨酸磷酸化，而該跨膜蛋白與p185erbB2結構相類似。并且，ARIA還能刺激培養的胚胎肌小管的乙酰膽堿受體的合成。對編碼ARIA的cDNA克隆進行測序分析，表明ARIA是該蛋白質的GGF/erbB2配體家族中的一員，它可用于刺激神經膠質細胞的有絲分裂，在其它應用方面與本文所述的GGF2相類似。實施例14 在施旺細胞中GGF介導的蛋白酪氨酸磷酸化作用大鼠施旺細胞用足量的神經膠質細胞生長因子誘導增殖處理后，顯現出能刺激蛋白質酪氨酸磷酸化(圖36)。按照實施例3所述的程序將不同量的部分純化的GGF加入大鼠施旺細胞的初級培養物中，施旺細胞培養于覆有多聚D-賴氨酸的24孔板的DMEM/10％胎牛血清/5μM forskolin/每ml0.5μg GGF-CM(每孔0.5ml)培養液。一旦粘合，每孔細胞加入0.5ml DMEM/10％胎牛血清，培養過夜至靜止期。第二天，給細胞加入0.2ml的DMEM/10％胎牛血清，孵育1小時。接著將測試樣品按要求以不同的濃度加入培養液中并作用不同的時間。細胞隨后在沸騰的裂解緩沖液(5mM磷酸鈉，pH6.8，2％SDS，5％β-巰基乙醇，0.1M二硫蘇糖醇，10％甘油，0.4％溴酚藍，10mM礬酸鈉sodiumvanadate)中裂解，沸水浴10分鐘后直接分析或于-70℃凍存。樣品經7.5％SDS-PAGE凝膠電泳分析，按照Towbin等(“美國國家科學進展”Proc.Natl.Acad.Sci.764350-4354，1979)描述的標準方法電轉移到硝酸纖維素膜。將轉移后的硝酸纖維素用抗磷酸化酪氨酸抗體探測。Kamps和Selton(1989)(癌基因Oncogene2305-315)描述的標準方法結合探針的斑點過夜曝光于放射自顯影膠片，采用標準的實驗室程序沖洗膠片。用Ultrascan XL激光增強密度計(LKB)測密度，對照前面染色的高分子量標準(Sigma)確定分子量。蛋白磷酸化與施旺細胞增殖的劑量效應非常相似(圖36)。磷酸化后的條帶的分子量與p185erbB2的分子量非常接近。用來自帶有GGF2HBS5克隆的COS細胞限制性培養液處理施旺細胞，也得到相似的結果。這些結果與預期的GGF的作用和p185erbB2的活化很好地吻合。
該實驗用重組GGF-II重復。來自GGF-II克隆(GGF-2HBS5)穩定轉化的CHO細胞系的限制性培養液，用上述試驗方法可刺激蛋白酪氨酸磷酸化。無效轉染的CHO細胞沒有這種刺激活性(圖52)。實施例15 來自MDA-MB-231細胞系的蛋白質因子對施旺細胞增殖的測試施旺細胞的增殖是由來自人乳腺癌細胞系MDA-MB-231的限制培養液介導的。在測試的第一天，將104個初級大鼠施旺細胞鋪于96孔板的每孔的100μl添加了5％胎牛血漿的Dulbecco’s ModifiedEagle’s培養基。第二天，每孔加入10μl限制性培養液(來自人乳腺癌細胞系MDA-MB-231，按實施例6所述培養)。第六天，用酸性磷酸酶測定每板施旺細胞數(按Connolly等程序，“分析化學”Anal.Biochem.152”136(1986)。用100μl磷酸緩沖液(PBS)洗板后，每孔加入100μl的反應緩沖液(0.1M乙酸鈉pH5.5，0.1％ Triton X-100，10mM對硝基苯磷酸鹽)。板置于37℃孵育2小時，加入10μl 1N NaOH終止反應。測每個樣品在410nm的光密度值。發現其施旺細胞數是用來自對照細胞系(HS-294T，不產生erbB2配體)的限制性培養液處理后的細胞數的38％。此結果表明，MDA-MB-231細胞系分泌的蛋白(分泌p185erbB2結合活性)刺激施旺細胞的增殖。實施例16 GGF的N-糖基化從GGF-II候選克隆GGF2BPP1，2和3的cDNA序列預測的蛋白序列包括一些N-糖基化同感基序。在GGFII02的多肽序列中一個缺口恰好和其中一個基序中的天冬酰胺殘基相吻合，表明糖類可能結合在這一位點。
通過觀察與N-糖解酶一起孵育后SDS-PAGE的遷移變化來研究GGF的N-糖基化，N-糖解酶切割蛋白中糖與天冬酰胺的共價鍵。
GGF-II經N-糖解酶處理后產生一條分子量為40-42KD的主帶和一條分子量為45-482KD的弱帶。非還原下的活性洗脫實驗顯示在約45-50KD有一單獨的活性去糖基化特異帶。
用GGF-I進行的活性洗脫實驗也證明用N-糖解酶處理后增加了其電泳遷移率，產生一分子量為26-28KD的活性特異帶。盡管由于所用樣品背景著色而無法指出N-去糖基化的條帶，但是銀染能證實其遷移率的改變。實施例17一旦蛋白GGF2從轉染細胞表達并分泌出來，為測定此成熟蛋白進行了進一步的實驗。
編碼人GGF2的cDNA被克隆到一個擴增載體pcdhfrpoly A上并轉染到CHO-DG44細胞中穩定地表達rhGGF2被分泌到限制性培養基之中。重組GGF2的被分泌能力通過氨基末端疏水片段如信號序列所介導。根據信號假說，生成著的蛋白鏈一旦開始穿過粗面內質網轉運出來，信號序列在特異位點被從成熟蛋白上切割下來。表達和純化的rhGGF2氨基末端的分析表明切割位點在50位的丙氨酸和51位的甘氨酸之間，前50位的氨基酸殘基被從成熟蛋白上切割下來，這樣rhGGF2由373個氨基酸所組成，cDNA編碼的hGGF2的氨基酸序列見圖55。
該蛋白質氨基末端的前15個氨基酸殘基經氨基末端序列分析確定，如表1所示表1rhGGF2的氨基末端序列分析循環數# 一級序列 pMoles1 GLY(G)210.62 Asn(N)1633 Glu(E)1494 Ala(A)2205 Ala(A)1806 Pro(P)1737 Ala(A)1778 Gly(G)154.99 Ala(A)l62.410 Ser(S)65.411 Val(V)132.712 Val(V) (Cys)*11.713 Tyr(Y)112.714 Ser(S)47.615 Ser(S)27.1氨基末端的分析采用Edman降解法，半胱氨酸殘基在此法中降解，不能被檢查到。保藏編碼GGF-II蛋白(實施例6)的核酸(cDNA，GGF2HBS5)在質粒pBluescript 5K中，處于T7啟動子控制之下，它于1992年7月2日被保藏在馬里蘭，美國典型培養物收集中心。ATCC No.75298。申請者必須接受如下責任從專利頒發時起到它的有效期結束之前，他有義務在質粒不能傳代存活時更換新的質粒并通知ATCC有關此專利的的發布情況，那時，此品種將向大眾提供.在此之前，按照37CFR§1.14和USC S112有關條例，此存品將提供給專利委員會。
關于微生物保藏的說明(細則13之二)
PCT/RO/124表(1992年7月)
權利要求
1.一種堿性的具有促進神經細胞有絲分裂活性的多肽因子，其中所述的多肽因子缺失氨基末端信號序列。
2.權利要求1所述的堿性多肽因子，其中所述的多肽因子具有如圖55(SEQ ID NO.179)所示從氨基酸序列的51位到422位的氨基酸序列。
3.分離的編碼具有促進神經細胞有絲分裂活性因子的脫氧核糖核酸序列，其中所述DNA序列缺失氨基末端信號肽的序列。
4.一種分離的DNA序列，編碼權利要求2所述的多肽因子。
5.一種促進神經膠質細胞有絲分裂的方法，所述方法包括將所述的神經膠質細胞和有效劑量的權利要求1中所述的多肽接觸。
6.一種預防或治療哺乳類動物的神經系統處于病理狀態的方法，此狀態包括一種對權利要求1所述多肽敏感或易感的細胞類型，所說的方法包括給上述哺乳動物以有效劑量的上述多肽。
7.一種具有促進神經膠質細胞有絲分裂活性的多肽，其中所述多肽由權利要求3的DNA序列編碼，所述的多肽可以用一種方法獲得，這種方法包括在允許上述DNA序列表達的條件下，培養修飾過的宿主細胞。
8.一種鑒定樣品中是否存在權利要求1所述多肽受體的方法，包括將所述樣品與所述多肽相混合并確定它們的結合，這種結合即可表明受體的存在。
9.一種預防或治療患者的神經膠質細胞瘤的方法，此方法包括給患者施用有效劑量的抑制權利要求1所述的多肽和受體結合的藥物。
10.一種藥用或獸用的制劑，包括權利要求1所述的多肽和一些合適的稀釋劑，載體或賦形劑一起配制和/或以劑量單位形式使用。
11.一種治療哺乳類動物的外周神經損傷的方法，此方法包括把有效劑量的權利要求1所述多肽和外周神經相接觸。
12.一種預防或治療哺乳類動物的神經膠質細胞脫髓損傷或損失的方法，此方法包括將上述神經細胞與效量的權利要求1所述蛋白接觸。
13.權利要求12方法，其中中所說的哺乳動物的疾病狀態是指運動神經纖維或者感受器的神經疾病。
14.一種預防或治療哺乳類動物的神經變性紊亂的方法，此方法包括將哺乳類動物神經膠質細胞與有效劑量的權利要求1所述的多肽接觸。
15.一種誘發哺乳類動物的神經再生或神經修復的方法，此方法包括給予哺乳類動物神經以有效劑量的權利要求1所述的多肽。
16.一種誘發成纖維細胞繁殖的方法，此方法包括給予成纖維細胞以有效劑量的權利要求1所述的多肽。
17.一種修復哺乳類動物傷口的方法，此方法包括給予傷口以權利要求1所述的多肽。
18.一種藥劑的配制方法，此方法包括將權利要求1所述的多肽和藥理上一種適當的載體相混合。
19.一種產生抗體的方法，次方法包括用權利要求1所述的多肽免疫哺乳動物。
20.一種監測能和權利要求1所述的多肽結合的受體的方法，此方法包括以所述多肽作為親合配體對樣品進行親合分離。
21.一種預防或治療患者神經瘤的方法，此方法包括給予患者以有效劑量的物質，該物質可以抑制權利要求1所述的蛋白和受體的結合。
22.一種檢查，分離或制備一種促神經細胞有絲分裂素或其編碼基因的方法，此方法包括將按權利要求19制備的抗體與組織制備物或樣品相混合。
23.一種用于分離編碼具有促神經膠原細胞有絲分裂活性的分子的核酸的方法，此方法包括將細胞的樣品與神經膠質細胞促有絲分裂劑特異抗體混合以測定該促有絲分裂劑在樣品中的表達并從有表達活性的細胞中分離該核酸序列。
24.一種誘發神經細胞髓鞘化的方法，所述方法包括把神經細胞和權利要求1所述多肽相接觸。
25.一種在細胞中誘導合成乙酰膽堿受體的方法，所述方法包括將權利要求1所述多肽與細胞相接觸。
26.一種權利要求1中所定義的多肽的抗體。
27.一種純化具有促神經膠原細胞有絲分裂能力的蛋白質的方法，所述方法包括將權利要求26所述抗體與細胞抽提物相接觸。
28.一種治療哺乳動物所患神經膠質細胞增生疾病的方法，此方法包括將權利要求26所述的抗體施用給哺乳動物。
29.一種包含權利要求3所述DNA序列的載體。
30.一種包含權利要求3的分離DNA的宿主細胞。
31.一種制備神經膠質細胞促分裂因子的方法，此方法包括在允許所述DNA序列表達的條件下，培養權利要求30所述宿主細胞。
32.權利要求1所述多肽用作為神經膠質細胞的促有絲分裂素。
33.一種預防或治療患者多種硬化的方法，此方法包括給患者施用有效劑量的能抑制權利要求1所述多肽和其受體結合的物質。
34.一種作為促神經細胞分裂素的多肽.其由權利要求3所述的DNA序列編碼，其制備方法由制備一種促神經膠質細胞分裂因子方法所組成，此方法即在允許所述DNA序列表達的條件下培養修飾的宿主細胞。
全文摘要
本發明公開了對編碼若干多肽的DNA的鑒定與純化，這些多肽用于刺激神經膠質細胞(尤其是施旺細胞)的有絲分裂和治療神經膠質細胞瘤。本發明還公開了這些DNA的序列，其編碼的新型多肽可用于刺激神經膠質細胞的有絲分裂和治療神經膠質細胞瘤。本發明提供了用于神經膠質細胞相關疾病治療和診斷目的的已知和新型多肽的合成、純化和檢測的方法。本發明還提供了利用這些多肽制備用于治療和診斷神經膠質細胞相關疾病的抗體探針的方法。
文檔編號C07K14/82GK1150390SQ95193290
公開日1997年5月21日 申請日期1995年5月25日 優先權日1994年5月26日
發明者安德魯·大衛·古德爾, 保羅·斯特魯本特, 路易莎·明蓋蒂, 邁克爾·沃特菲爾德, 馬克·馬爾基翁尼, 陳麥蘇, 伊恩·希爾斯 申請人:路德維格癌癥研究所, 坎布里奇神經科學