專利名稱：來自棒狀桿菌屬細菌的新基因及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及棒狀桿菌屬細菌的培育和利用及其用途，該菌用于L-氨基酸如L-谷氨酸和L-賴氨酸及其他物質的發酵生產。
現有技術說明當棒狀桿菌屬細菌在含限量生物素的培養基中培養時，它們生產大量的L-谷氨酸。另一方面，當棒狀桿菌屬細菌在含過量生物素的培養基中培養時，它們不產生L-谷氨酸。然而，如果在此培養條件下向培養基中加入表面活性劑或青霉素時培養基中該菌生長受到抑制并且該菌在其中產生大量的L-谷氨酸。
為使棒狀桿菌屬細菌生產L-谷氨酸，以下任一方法均有效。
1.培養基中生物素濃度置于最適度以下。參見S.Okumura，T.Tsugawa，T.Tsunoda和A.Kitai，Nippon Nogeikagaku Kaishi，36，197-203(1962)。
2.在足量生物素存在下，向培養基中加入一種表面活性劑。參見I.Shiio，H.Otsuka和N.Atsuya，，J.Biochem.，53，333-340(1963)；K，Takinami，H.Okada和T.Tsunoda，Agr.Biol.Chem.，27，853-863(1963)。
3.在足量生物素存在下，向培養基中加入青霉素。參見U.S.Patent 3，080，297；Japanese Patent Publication No.37-1695(1962)；M.Shibui，T.Kurima，S.Okabe和T.Osawa，Amino Acid and NucleicAcid，17，61-65(1968)。
認為這些方法的機理如下。
由限量生物素生產L-谷氨酸，認為有關的主要因素如下生物素成為脂肪酸合成中乙酰輔酶A(CoA)羧化酶的輔酶，以及，對于不飽和脂肪酸，如油酸及其衍生物具有生物素替代效應。因此，生物素會影響構成細胞膜的脂肪酸組成，從而改變L-谷氨酸穿過細胞膜的通透性(I.Shiio，S.Otsuka和M.Takahashi，J.Biochem.，51，56-62(1962)；I.Shiio，K.Narui，N.Yahaba和M.Takahashi，J.Biochem.，51，109-111(1962))。
由添加表面活性劑或青霉素生產L-谷氨酸也被認為與因細胞表面結構變化所致L-谷氨酸穿過細胞質膜的通透性變化有關(Shiio，S.Otsuka.和N，Katsuya，J.Biochem.，53，333-340(1963))。
如上所述，L-谷氨酸生產與其穿過細胞膜的通透性有關，但尚未發現可以直接證實其間關系的論據。
也就是，關于限量生物素或者添加表面活性劑或青霉素由何機制提高棒狀桿菌屬細菌生產L-谷氨酸的能力，還有許多不明之處。
另外，尚無基因水平上的信息，這將是闡明這些機制的重要的關鍵因素。
發明內容
本發明的目的是要闡明棒狀桿菌屬細菌生產L-谷氨酸的機制，特別是添加的表面活性劑在棒狀桿菌屬細菌生產L-谷氨酸機制中的作用，并在如此得到的信息的基礎上培育和改進棒狀桿菌屬細菌生產L-谷氨酸等。
具體地，本發明的目的是要在基因水平上闡明棒狀桿菌屬細菌生產L-谷氨酸的機制，分離棒狀桿菌屬細菌參與表面活性劑抗性的基因，并將如此得到的基因應用于產L-谷氨酸的棒狀桿菌屬細菌的培育和由棒狀桿菌屬細菌生產L-谷氨酸等。
為達成上述目的，本發明人深入研究，結果發現存在一種基因參與棒狀桿菌屬細菌的L-谷氨酸生產(該基因此后稱為dtsR基因，該基因編碼的蛋白質稱為DTSR蛋白)。另外，我們發現了該基因的很有價值的用途。基于這些發現，我們完成了本發明。
本發明包括以下內容(1)一種基因，來自棒狀桿菌屬細菌并編碼賦予該菌對表面活性劑抗性的一種蛋白。(2)根據(1)的基因，其中蛋白質包含序列表中SEQ ID NO2所示氨基酸序列中，由序號37至543的一段氨基酸序列，或者其上含有替代、缺失或插入的一段氨基酸序列，而基本上不影響賦予棒狀桿菌屬細菌對表面活性劑抗性的活性。(3)根據(1)所述的基因，含有序列表中SEQ ID NO1所示的堿基序列第467至1987個的序列，或者基本具有與此相同的一段堿基序列。(4)一種重組DNA，可通過將在棒狀桿菌屬細菌中起作用的一種載體與定義于(1)、(2)或(3)的基因連接而得到。(5) 一種棒狀桿菌屬細菌，含有上述(4)所述的重組DNA。(6) 一種生產L-賴氨酸的方法，包括培養一種棒狀桿菌屬細菌和收集L-賴氨酸，該菌含有定義于(4)的重組DNA且能在液體培養基中生產L-賴氨酸，從而在培養物中產生和積累L-賴氨酸。(7) 一種基因，包括含有定義于(1)、(2)或(3)基因的一段堿基序列上的一個或二個以上堿基替代、缺失、插入、增加或倒位的一段堿基序列，以致由該堿基序列編碼的蛋白質就賦予棒狀桿菌屬對表面活性劑抗性的活性不能正常作用。(8) 一種重組DNA，可通過將在棒狀桿菌屬細菌中起作用的一種載體連接到定義于(7)的基因上而得到。(9) 一種棒狀桿菌屬細菌，通過存在于染色體上的含有定義于(1)、(2)或(3)的基因或者它的一個啟動子的堿基序列中的一個或多個堿基替代、缺失、插入、增加或倒位，以致使具有賦予棒狀桿菌屬細菌對表面活性劑抗性之活性的蛋白質不能正常起作用。(10)一種生產L-谷氨酸的方法，包括培養一種棒狀桿菌屬細菌和收集L-谷氨酸，通過存在于染色體上含有(1)、(2)或(3)所述基因或者它的一個啟動子的堿基序列中的一個或多個堿基的替代、缺失、插入、增加或倒位，以致使具有賦予棒狀桿菌屬細菌對表面活性劑抗性之活性的蛋白質不能正常起作用，并能在液體培養基中生產L-谷氨酸，從而在培養物中產生和積累L-谷氨酸。
以下詳細敘述本發明。
此處所指的棒狀桿菌屬細菌是定義于《伯杰氏細菌鑒定手冊》，8thEd.，p.599(1974)的一類微生物。該菌是需氧，革蘭氏陽性，非抗酸，不具孢子形成能力桿菌。包括以往歸類于短桿菌屬，但現在并入棒狀桿菌屬[見Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1981)]的細菌；還包括短桿菌屬和微桿菌屬中與棒狀桿菌屬密切相關的細菌。這些棒狀桿菌屬細菌中，以下提及的作為生產L-谷氨酸的已知細菌，最適用于本發明。
嗜乙酰乙酸棒狀桿菌醋谷棒狀桿菌美棒狀桿菌谷氨酸棒狀桿菌百合棒狀桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)Corynebacterium melassecola叉開短桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)乳酸發酵短桿菌解糖短桿菌Brevibacterium immariophilium玫瑰色短桿菌黃色短桿菌生硫短桿菌具體地，可以這此細菌的下列菌株為例嗜乙酰乙酸棒狀桿菌ATCC 13870醋谷棒狀桿菌 ATCC 15806美棒狀桿菌ATCC 15991谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13060叉開短桿菌ATCC 14020乳酸發酵短桿菌ATCC 13869百合棒狀桿菌 ATCC 15990Corynebacterium melassecola ATCC 17965解糖短桿菌ATCC 14066Brevibacterium immariophilium ATCC 14068玫瑰色短桿菌 ATCC 13825黃色短桿菌ATCC 13826生硫短桿菌ATCC 19240這些菌株可從美國典型培養物保藏中心(ATCC)得到。每一菌株有一個登記號。根據登記號，任何人都能從ATCC得到相應的菌株。收藏于ATCC的菌株的登記號記述于ATCC目錄中。
本發明中所指的表面活性劑在含足夠量生物素的條件下與青霉素同樣地，起到促進棒狀桿菌屬細菌生產L-谷氨酸的作用，這包括各種非離子表面活性劑，陽離子表面活性劑和陰離子表面活性劑[見K.Yamada，J.Takahashi和J.Nakamura，the Hakkokogaku kaishi，20，348-350(1962)；K.Udagawa，S.Abe和I.Kinoshita，Hakkokogaku Kaishi，40，614-619(1962)]。非離子表面活性劑中，Tween 60(聚氧乙烯山梨糖醇酐單硬脂酸酯)和Tween 40(聚氧乙烯山梨糖醇酐甘油單棕櫚酸酯)具有類青霉素效應[見I.Shiio，S.Otsuka和N.Katsuya，J.Biochem.，53，333-340(1963)]。另外，C3至C18的游離飽和脂肪酸本身就具有同樣效應[見K.Takinami，H.Okada和T.Tsunoda，Agr.Biol.Chem.，28，114-118(1964)]。Tween 40用于本發明示例中。<1>分離來自棒狀桿菌屬細菌中對表面活性劑抗性的基因分離來自棒狀桿菌屬細菌中對參與表面活性劑抗性的基因，可采用以下方法。
(1)取得屬于棒狀桿菌屬細菌的表面活性劑敏感突變株，該突變株對表面活性劑表現出較高的敏感性；(2)將野生型棒狀桿菌屬細菌的染色體DNA的各種片段，連接到在棒狀桿菌屬細菌中起作用的一種載體上，作成各種重組DNA；(3)將各重組DNA導入屬于棒狀桿菌屬細菌的表面活性劑敏感突變株細胞中進行轉化；(4)從轉化產物中，篩選丟失表面活性劑敏感性的菌株；(5)從如此篩選的表面活性劑不敏感的轉化產物中回收重組DNA；(6)分析連接到載體上的棒狀桿菌屬細菌野生型菌株染色體DNA片段的結構。
如此得到的棒狀桿菌屬細菌野生型菌株染色體DNA片段含有來自棒狀桿菌屬細菌參與表面活性劑抗性的一種基因。該基因至少參與了在含表面活性劑的培養基中棒狀桿菌屬細菌累積L-谷氨酸的機制。另外，該基因還參與了在含青霉素或含限量生物素的培養基中L-谷氨酸的生產。
對表面活性劑表現出較高敏感性的棒狀桿菌屬細菌表面活性劑敏感突變株，是指棒狀桿菌屬細菌的一種突變株，它在含一定濃度表面活性劑的培養基中生長不良，而該濃度不影響在此培養基中棒狀桿菌屬細菌野生型菌株的生長。就表面活性劑聚氧乙烯山梨糖醇酐甘油單棕櫚酸酯而言，在含表面活性劑濃度為0.1至1mg/dl的培養基中，棒狀桿菌屬細菌表面活性劑敏感突變株比相應的野生型菌株生長較差。相反，棒狀桿菌屬細菌野生型菌株的生長不受培養基中濃度為0.1至1mg/dl的表面活性劑的影響。當這樣一種突變株培養于含過量生物素的培養基中，通過添加表面活性劑來生產L-谷氨酸時，加入培養基中的表面活性劑的必需濃度可以低于通常情況。認為表面活性劑敏感突變株的細胞狀態接近于野生株的細胞暴露于表面活性劑時的狀態。
為得到棒狀桿菌屬細菌的表面活性劑敏感突變株，可采用記述于日本專利申請公開No.50-126877(1975)(日本專利申請No.52-24593(1977))的方法。
棒狀桿菌屬細菌表面活性劑敏感突變株之一例，是乳酸發酵短桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)AJ 11060。該突變株保藏于the National Institute ofBioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Scienceand Technology，Ministry of International Trade and Industry，保藏號FERM P-3678。
制備棒狀桿菌屬細菌野生型菌株染色體DNA的各種片段，可采用以下方法，亦即，棒狀桿菌屬細菌野生型菌株培養于液體培養基，收集其中生長的細胞，根據Saito等[見H.Saito和K.Miura，Biochem.Biophys.，Acta72，619(1963)]的方法從收集細胞中回收染色體DNA。如此回收的染色體DNA用限制酶部分裂解。識別四個堿基的酶用作限制酶，在DNA不完全分解的條件下進行裂解，制備各種DNA片段。
此處所指的在棒狀桿菌屬細菌中起作用的載體，例如在棒狀桿菌屬細菌中自主復制的一種質粒。下面列出載體的具體實例。pAM 330 參見日本專利申請公開No.58-67699(1983)pHM 1519 參見日本專利申請公開No.58-77895(1983)pAJ 655 參見日本專利申請公開No.58-192900(1983)pAJ 611 參見日本專利申請公開No.58-192900(1983)pAJ 1844 參見日本專利申請公開No.58-192900(1983)pCG 1 參見日本專利申請公開No.57-134500(1982)pCG 2 參見日本專利申請公開No.58-35197(1983)pCG 4 參見日本專利申請公開No.57-183799(1982)pCG 11參見日本專利申請公開No.57-183799(1982)通過連接在棒狀桿菌屬細菌中起作用的載體與棒狀桿菌屬細菌野生型菌株染色體DNA的各種片段來制備各種重組DNA時，可采用以下方法。載體首先以限制酶裂解。用于裂解載體的限制酶與用于裂解染色體DNA的相同，或者是裂解載體給出的末端與染色體DNA片段的末端互補。載體與DNA片段的連接通常由連接酶，如T4 DNA連接酶等實現。
將各重組DNA導入棒狀桿菌屬細菌表面活性劑敏感突變株時，可采用任何已知的轉化方法。例如，可采用的有報道于大腸桿菌K-12[見Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970)]，以氯化鈣處理受體細胞來提高DNA通透性的方法；和報道于枯草芽孢桿菌[見Duncan，C.H.，Wilson，G.A.和Yong，F.E，Gene 1，153(1977)]，由向處于生長相的細胞導入DNA來制備感受態細胞的方法。除此以外，還可采用的方法是將DNA受體細胞制成易于吸收重組DNA的原生質體或原生質球，然后向細胞中導入重組DNA，該法已知應用于枯草芽孢桿菌，放線菌和酵母[見Chang，S.和Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.和Hopwood，O.A.，Nature，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.和Fink，G.R.，Proc.Natl.Sci.，USA，75,1929(1978)]。
上述適于枯草芽孢桿菌的原生質體方法在本發明中用來得到足夠高水平的頻率。除此以外，還可采用的方法是向置于聚乙二醇或聚乙烯醇和二價金屬離子的棒狀桿菌屬細菌細胞原生質體中導入DNA，該法記述于日本專利申請公開No.57-183799(1982)。羧甲基纖維素，葡聚糖，Ficoll，Pluronic F68(Serva公司產品)等還可用來代替聚乙二醇和聚乙烯醇，促進DNA導入原生質體細胞。在本發明實施例中，通過一種電脈沖方法(見日本專利申請公開2-207791(1990))進行轉化。
下面敘述從轉化株中篩選失去表面活性劑敏感性菌株的方法。
棒狀桿菌屬細菌野生型菌株染色體DNA限制酶Sau 3AI部分消化得到的大小約4至6kbp的DNA片段，連接到在大腸桿菌和棒狀桿菌屬細菌中均能自主復制的一種質粒載體上，構建重組DNA，這些重組DNA導入大腸桿菌DH5(Takara Shuzo公司產品)感受態細胞。培養轉化產物，制備棒狀桿菌屬細菌野生型菌株的基因文庫。
用該基因文庫中的重組DNA轉化乳酸發酵短桿菌AJ 11060。轉化產物接種于無表面活性劑的M-CM2G瓊脂平板上(每升水中含5g葡萄糖，10g多聚胨，(polypeptone)，10g酵母提取物，5g NaCl，0.2g DL-甲硫氨酸，15g瓊脂和4mg氯霉素，pH7.2)，其上形成約40，000菌落。這些菌落復制到含30mg/liter表面活性劑Tween 40的M-CM2G平板上，并收集在此含表面活性劑的M-CM2G平板上生長良好的菌落。于是，得到了失去表面活性劑敏感性的轉化株。
從如此得到的丟失表面活性劑敏感性的轉化株中回收重組DNA，可采用與制備棒狀桿菌屬細菌野生型菌株染色體DNA同樣的方法。也就是，轉化株在液體培養基中培養，從培養株中收集細胞，根據Saito等[見H.Saito和K.Miura，Biochem.Biophys.，Acta 72，619(1963)]的方法從中回收重組DNA。
下面分析連接到載體上的棒狀桿菌屬細菌野生型菌株染色體DNA片段的結構。通過雙脫氧法，一種常規的堿基序列測定法，測定染色體DNA片段的全部堿基序列，并分析該DNA的結構，確定增強子，啟動子，操縱基因，SD序列，前導肽，衰減子，起始密碼子，終止密碼子，開放閱讀框等的位置。
從棒狀桿菌屬細菌得到的參與表面活性劑抗性的基因為dts R基因，它含有序列表中SEQ ID NO1所示位于第467至第469堿基(ATG)和第1985至第1987堿基(CTG)之間的一段序列。可能由該基因編碼的氨基酸序列示于序列表中SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。另一個ATG(核苷酸序號359-361)存在于同一閱讀框第467至第469核苷酸ATG的上游，不能排除該ATG為起始密碼子的可能性。然而，由該基因上游區同源序列的解析，推測第467至第469 ATG為起始密碼子。即，推測SEQ ID NO2所示序號37至543的氨基酸序列為DTSR蛋白的氨基酸序列。當DTSR蛋白的氨基酸序列和dts R基因的堿基序列出現于本說明和權利要求中時，這是將第467至第469的ATG作為起始密碼子。然而，應當考慮第359至第361的ATG為起始密碼子的可能性。例如，如果dts R基因導入棒狀桿菌屬細菌來增強表達，SEQ ID NO1所示核苷酸序號467至1987的序列的表達就被認為是足夠的了。然而，本領域的技術人員易于理解，當SEQ ID NO1所示核苷酸序列包含核苷酸序號359-466的編碼區和上游區導入棒狀桿菌屬細菌時，不管哪一個ATG是起始密碼子，DTSR蛋白均能正確表達。無論哪一種情形，起始密碼子編碼的N-末端甲硫氨酸均能被細胞內dts R基因表達的氨肽酶裂解。
根據數據庫檢索，確證含SEQ ID NO1所示堿基序列的dts R基因和該序列編碼的DTSR蛋白質都是新發現。發現該蛋白與記述于Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83，8049-8053(1986)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83，4864-4869(1986)；和Gene，122，199-202(1992)的蛋白質，丙酰輔酶A羧化酶(PCC)β亞基蛋白同源。然而，這些文獻并沒暗示該蛋白參與谷氨酸生產。
丙酰輔酶A羧化酶是將α-酮戊二酸通過2-羥戊二酸，丙酰輔酶A，D-甲基丙二酰輔酶A和L-甲基丙二酰輔酶A轉變為琥珀酰輔酶A的代謝途徑中的一個反應催化酶，似乎該代謝途徑是TCA循環中α-酮戊二酸脫氫酶催化反應的旁路。在此通路中，特別應當指出，丙酰輔酶A羧化酶需要生物素為輔酶，表明添加表面活性劑方法中的谷氨酸生產與限量生物素方法中的谷氨酸生產有關。<2>制備含重組DNA的棒狀桿菌屬細菌含前項<1>中得到的，來自棒狀桿菌屬細菌參與表面活性劑抗性的dts R基因的重組DNA，體外制備，導入棒狀桿菌屬細菌。通過導入，就能制備DTSR蛋白細胞內濃度提高的棒狀桿菌屬細菌。達此目的的一般方法是增強dts R基因的細胞內表達或增加細胞內dts R基因的拷貝數。
為增強細胞內dts R基因的表達，dts R基因被連接于一個強啟動子的下游。作為dts R基因可舉出由編碼SEQ ID NO2所示序號37至543的氨基酸序列的一段堿基序列。特別是所示堿基序列中核苷酸號467～1987構成的堿基序列或基本上與此相同的一段堿基序列。在此所述的“基本相同的堿基序列”意指編碼的蛋白質與用序號467至1987的核苷酸序列編碼的蛋白質就賦予棒狀桿菌屬細菌表面活性劑抗性之活性基本相同。這些堿基序列中編碼的DTSR蛋白質可以含氨基酸的替代、缺失或插入，而基本上不影響賦予棒狀桿菌屬細菌對表面活性劑抗性之活性。
棒狀桿菌屬細菌細胞內起作用的強啟動子，已知有來自大腸桿菌的乳糖啟動子，tac啟動子和色氨酸啟動子[見Y.Morinaga，M.Tsuchiya，K.Miwa和K.Sano，J.Biotech.，5，305-312(1987)]。另外，優選的是來自棒狀桿菌屬細菌的色氨酸啟動子(見日本專利申請公開No.62-195294(1987))。
分別制備含dts R基因的DNA和含啟動子的DNA，并于體外連接。裂解和連接DNA，分別使用限制酶和連接酶。連接得到的重組DNA再導入棒狀桿菌屬細菌細胞。導入方法可采用前項<1>所引用的同樣方法。
為將含強啟動子和dts R基因的重組DNA導入棒狀桿菌屬細菌細胞，必須使用在棒狀桿菌屬細菌細胞內起作用的一種載體。當<1>項中的載體用于此步時，重組DNA駐留于染色體外。為使重組DNA駐留在染色體DNA上，如記述于日本專利申請公開No.5-7491(1993)的一種溫度敏感質粒被用作載體，在非許可溫度下培養細胞來形成同源重組。
如此得到了攜含強啟動子和dts R基因的重組DNA的棒狀桿菌屬細菌，其dts R基因表達得到增強，且細胞內DTSR蛋白濃度得到提高。
為使含dts R基因的拷貝數上升，將含該基因的DNA連接在多拷貝的質粒上后，并將其導入棒狀桿菌屬細菌細胞中。這種多拷貝質粒的例子，可參見<1>項所述。
形成同源重組還可以采用的方法是用大量存在于棒狀桿菌屬細菌染色體DNA上的一段序列作為靶標。大量存在于棒狀桿菌屬細菌染色體DNA上的序列的一例，是位于棒狀桿菌屬細菌轉位因子兩端的一段插入序列。該序列和由該序列形成同源重組的方法公開于國際公開No.WO93/18151。
如此得到的其中dts R基因拷貝數增加了的棒狀桿菌屬細菌細胞，dtsR基因表達得到增強，DTSR蛋白細胞內濃度得到提高。<3>由含重組DNA的棒狀桿菌屬細菌生產L-賴氨酸迄今多種人工突變株已被用作產L-賴氨酸細菌。以這些為宿主，通過保有本發明的重組DNA來改進其L-賴氨酸產力。這些人工突變株如下S-(2-氨乙基)-半胱氨酸(此后稱為“AEC”)-抗性突變株；生長需要氨基酸如L-高絲氨酸的突變株(見日本專利公開Nos.48-28078(1973)和56-6499(1981))；抗AEC且需要L-亮氨酸，L-高絲氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸等氨基酸的突變株(見美國專利Nos.3,708,395和3,825,472)；對DL-α-氨基-∈-己內酰胺，α-氨基-月桂基-內酰胺，天冬氨酸類似物，磺胺類藥物，醌及N-月桂酰-亮氨酸顯示抗性的L-賴氨酸的生產的突變株，和對草酰乙酸脫羧酶抑制劑或呼吸系統酶抑制劑顯示抗性的L-賴氨酸生產的突變株(見日本專利申請公開Nos.50-53588(1975)，50-31093(1975)，52-102498(1977)、53-9394(1978)，53-86089(1978)，55-9783(1980)，55-9759(1980)，56-32995(1981)，56-39778(1981)，日本專利公開Nos.53-43591(1978)和53-1833(1978)；生產L-賴氨酸需肌醇或乙酸的突變株(見日本專利申請公開Nos.55-9784(1980)和56-8692(1981))；對氟丙酮酸或者34℃或更高溫度敏感的L-賴氨酸生產突變株(見日本專利申請公開No.53-86090(1978))；生產L-賴氨酸的短桿菌屬或棒狀桿菌屬抗1，2-亞乙基二醇的突變株(見U.S.Patent No.4,411,997)。
具體例子參見下列菌株。
乳酸發酵短桿菌AJ 12031(FERM BP-277)；參見日本專利申請公開No.60-62994(1985)。
乳酸發酵短桿菌ATCC 39134；參見日本專利申請公開No.60-62994(1985)。
谷氨酸棒狀桿菌AJ 3463(FERM P-1987)；參見日本專利公開No.51-34477(1976)。
乳酸發酵短桿菌AJ 12435(FERM BP-2294)；參見美國專利No.5,304,476。
乳酸發酵短桿菌AJ 12592(FERM BP-3239)；參見美國專利No.5,304,476。
谷氨酸棒狀桿菌AJ 12596(FERM BP-3242)；參見美國專利No.5,304,476。
根據前項<2>的方法，由將本發明的重組DNA導入產L-賴氨酸細菌得到的棒狀桿菌屬細菌，細胞內DTSR蛋白的濃度提高，產物菌具有生產大量L-賴氨酸的能力。
用于L-賴氨酸生產的培養基可以是含碳源，氮源和無機離子的普通培養基，必要時添加其他次要的有機微量營養素。
可使用淀粉水解物等的糖類；醇類如乙醇，肌醇等；有機酸如乙酸，富馬酸，檸檬酸，琥珀酸等。
可用的氮源有無機銨鹽如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨等；有機氮化合物如大豆水解物等；還有氨氣，氨水等。
添加的無機離子有少量的磷酸鉀，硫酸鎂，鐵離子，錳離子等。合適量的有機微量營養素更好，必要時含有如維生素B1等或酵母提取物等。
建議在有氧條件下，30至45℃培養16至72小時，其間培養基pH控制于5到7。調節pH，可用無機的或有機的，酸性或堿性物質，氨氣等。
從發酵液中收集L-賴氨酸可組合使用常規的離子交換法，沉淀法和其他已知方法。<4>制備DTSR蛋白不正常起作用的棒狀桿菌屬細菌如前項<1>所述，所得dts R基因是賦予棒狀桿菌屬細菌對表面活性劑抗性的一種基因。因此，預期攜此擴增dts R基因的菌株在加入一定濃度表面活性劑的培養基中不再生產L-谷氨酸，即使在此濃度，有過量生物素存在下，棒狀桿菌屬細菌野生型菌株卻能生產L-谷氨酸。考慮及此，根據以下實施例的方法，調查了dts R基因擴增在由添加表面活性劑生產L-谷氨酸中的作用，并如期觀測到對L-谷氨酸生產的明顯抑制。另外，確認了dts R基因擴增還導致在生物素限量方法中和在過量生物素存在下添加青霉素方法中，L-谷氨酸生產的抑制。這些結果表明，dts R基因不僅付與該菌株對表面活性劑的抗性，而且在L-谷氨酸生產中發揮重要作用。
由此，與上相反，由于dts R基因引起突變，且細胞內DTSR蛋白濃度或活性降低，生產L-谷氨酸的能力可能會提高，尤其在過量生物素存在條件下，而不加任何抑制生物素活性物質如表面活性劑或抗生素類物質，可以生產L-谷氨酸。考慮及此，制備了一種菌株，其中野生型菌株的dts R基因已被破壞，并檢查了如此修飾的菌株生產L-谷氨酸的能力，確認該dts R基因破裂的突變菌株即使在高濃度生物素存在下也生產大量的L-谷氨酸，而此濃度下野生型菌株幾乎不生產L-谷氨酸，如以下實施例所示。
dts R基因突變菌株可由使用化學試劑的誘變方法或由使用重組DNA技術的雜交方法得到。當該基因已得到時，可用重組DNA技術，從而該基因易被同源重組破裂。由同源重組破裂基因的方法業已建立。為此，可采用使用線型DNA的方法和使用溫度敏感質粒的方法。
具體地，通過位點特異突變[見Kramer，W.和Faits，H.J.，Methods inEnzymology，154，350(1987)]或用化學物質如連二亞硫酸鈉，羥胺等處理[見Shorthe，D.和Nathans，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75,270(1978)]，在dts R基因編碼區或啟動子區堿基序列上制造一個或多個堿基的替換，缺失，插入，增加或倒位。如此修飾或破裂的基因替代染色體上的正常基因，從而降低或消除遺傳產物DTSR蛋白活性，或者降低或消除基因轉錄。
在位點特異誘變法中，在使用合成的低聚核糖核苷酸，根據此法，可能只對任意限定的堿基對上引入任何期望的替代、缺失、插入、增加或倒位。利用此方法，首先克隆化將含目的基因的質粒變性來制備單鏈DNA，接著，制備與突變位點互補的合成低聚核苷酸。合成低聚核苷酸不應含有完全互補序列，但可能含有任何期望的核苷酸替代，缺失，插入，增加或倒位。此后，將具有與單鏈DNA任意的堿基替代，缺失，插入，增加或倒位的合成低聚核苷酸退火。進而，使用DNA聚合酶I的Klenow片段和T4連接酶形成完整的雙鏈質粒。產物質粒然后導入大腸桿菌感受態細胞。如此得到的一些轉化產物具有一種質粒，其所含基因具有固定的期望核苷酸替代，缺失，插入，增加或倒位。類似的由引入突變修飾或破裂基因(genedisrupting)的方法，已知有重組PCR方法[見PCR Technology，StocktonPress(1989)]。
另外化學處理法直接以連二亞硫酸鈉，羥胺等處理含目的基因的DNA片段，從而隨機引入堿基替代，缺失，插入，增加或倒位突變。
期望突變是否引入，可通過已經突變處理的DNA片段轉化表面活化劑敏感突變株和測定轉化產物對表面活性劑抗性來確認。此時，通過檢查棒狀桿菌屬細菌通常生長溫度范圍內高溫和低溫下表面活性劑存在下的生長，篩選能在低溫生長而在高溫生長被抑制的轉化產物，就能得到溫度敏感的突變基因。
以如此得到的已被引入突變修飾或破裂的基因替代棒狀桿菌屬細菌染色體上的正常基因的方法，可采用同源重組的方法[見Experiments inMolecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1972)；Matsuyama，S.和Mizushima，S.，J.Bacteriol.，162，1196(1985)]。根據同源重組，當所含序列與染色體序列同源的質粒等導入細胞時，在同源序列位點以一定頻率發生重組，從而導入的完整質粒整合進染色體。此后，當染色體上同源序列位點發生進一步突變時，質粒被從染色體移除。通過后一種重組，引入突變的基因固定在染色體上，原來的正常基因可能與質粒一起被從染色體移除。篩選這種菌株，可能得到經引入突變修飾或破裂的基因替代了染色體上正常基因的一種菌株，該突變含核苷酸替代，缺失，插入，增加或倒位。<5>由DTSR蛋白不能正常作用的棒狀桿菌屬細菌生產L-谷氨酸。
如上所述，生產L-谷氨酸棒狀桿菌屬細菌且其中細胞內DTSR蛋白濃度或活性降低的菌株，即DTSR蛋白不正常起作用的菌株，L-谷氨酸產力提高了。尤其是，即使存在過量生物素而不添加生物素活性抑制物如表面活性劑或抗生素，該菌株也能生產L-谷氨酸。
為通過培育有生產L-谷氨酸能力的棒狀桿菌屬細菌來得到DTSR蛋白不正常起作用的菌株時，作為起始菌株可以舉出，棒狀桿菌屬細菌生產L-谷氨酸野生型菌株及其突變株。突變株的例子列于下乳酸發酵短桿菌AJ 12745(FERM-BP 2922)參見美國專利No.5,272,067，乳酸發酵短桿菌AJ 12746(FERM-BP 2923)參見美國專利No.5,272,067，黃色短桿菌AJ 12747(FERM-BP 2924)參見美國專利No.5,272,067，谷氨酸棒狀桿菌AJ 12478(FERM-BP 2925)參見美國專利No.5,272,067，谷氨酸棒狀桿菌ATCC 21492。
用于L-谷氨酸生產的培養基可以是含碳源，氮源和無機離子的普通培養基，必要時添加其他次要的有機微量營養素。
供用的碳源有糖類如葡萄糖，乳糖，半乳糖，果糖，淀粉水解物等；醇類如乙醇，肌醇等；有機酸如乙酸，富馬酸，檸檬酸，琥珀酸等。
供用的氮源有無機銨鹽如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨等；有機氮化合物如大豆水解物等；還有氨氣，氨水等。
作為無機離子，可添加少量的磷酸鉀，硫酸鎂，鐵離子，錳離子等。含有有機微量營養素更好，如維生素B1等；還有酵母提取物等。
建議在有氧條件下，30至45℃培養16至72小時，其間培養基pH保持在5到8。可用無機的或有機的，酸性或堿性物質，氨氣等調節pH。
表面活性劑或青霉素可添加到dtsR基因-受干擾的菌株的培養基中，或限制培養基中生物素濃度。這樣可以進一步提高培養基中生產的L-谷氨酸的產量。
從發酵液中收集L-谷氨酸可組合使用常規離子交換法，沉淀法和其他已知方法。
附圖簡述
圖1表示在無表面活性劑或有表面活性劑培養基中AJ11060/pDTR6(dtsR基因擴增菌株)和AJ 11060/pSAC4(對照)的生長。○pDTR6導入菌株，無表面活性劑□pSAC4導入菌株，無表面活性劑●pDTR6導入菌株，有表面活性劑■pSAC4導入菌株，有表面活性劑圖2表示改變添加的培養基中表面活性劑濃度時，ATCC13869/pHSGX-KΔE(缺失突變型dts R基因擴增菌株)，ATCC13869/pDTR6(dts R基因擴增菌株)和ATCC 13869/pSAC4(對照)的生長狀況。○pSAC4導入菌株△pHSGX-KΔE導入菌株▲pDTR6導入菌株圖3表示在含300或3μg/liter生物素的培養其中AJ 11060/DTR6和AJ 11060/pSAC4的生長曲線。AJ 11060/pDTR6(dtsR基因擴增株)的生物素要求量下降。○pDTR6導入菌株，300μg/liter生物素□pSAC4導入菌株，300μg/liter生物素●pDTR6導入菌株，3μg/liter生物素■pSAC4導入菌株，3μg/liter生物素優選實施方案說明本發明將在下例中詳細說明實施例1(制備乳酸發酵短桿菌ATCC 13869(一種棒狀桿菌屬細菌野生型菌株)的染色體DNA乳酸發酵短桿菌ATCC 13869接種于100ml T-Y培養基[含1％細菌胰蛋白胨(Difco產品)，0.5％細菌酵母提取物(Difco產品)和0.5％NaCl；pH 7.2]，31.5℃培養8小時，得到培養物。該培養物3,000r.p.m.離心15分鐘，得到0.5g濕細胞。根據Saito & Miura方法(見Biochem.Biophys。Acta.72，619，(1963))從濕細胞中得到染色體DNA。接著，60μg染色體DNA和3單位限制Sau 3AI混合于10mM Tris-HCl緩沖液(含50mM NaCl，10mM MgSO4和1mM二硫蘇糖醇；pH7.4)，37℃反應30分鐘。反應后，反應混合物經常規苯酚抽提和乙醇沉淀，得到50μg以Sau 3AI消化的乳酸發酵短桿菌ATCC 13869染色體DNA片段。實施例2(用質粒載體DNA制備乳酸發酵短桿菌ATCC 13869的基因文庫)在大腸桿菌和棒狀桿菌屬細菌均能自主復制的質粒載體DNA(pSAC4)20μg與200單位限制酶Bam HI混合于50mM Tris-HCl緩沖液(含100mM NaCl和10mM硫酸鎂；pH7.4)，37℃反應2小時得到消化液，消化液經常規酚抽提和乙醇沉淀。此后，根據記述于MolecularCloning，2nd Edition[J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，ColdSpring Harbor Laboratory Press，p.1.56(1989)]的方法，DNA片段以細菌堿性磷酸酶脫磷酸化以防止來自質粒載體的DNA片段重新結合，然后脫磷酸化的DNA片段經常規酚抽提和乙醇沉淀。
以Bam HI消化的pSAC41μg，在實施例1中得到的以Sau 3AI消化的乳酸發酵短桿菌ATCC 13869染色體DNA片段，和2單位T4 DNA連接酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.產品)加入含66mM氯化鎂，10mM二硫蘇糖醇和10mM ATP的66mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中，16℃反應16小時進行DNA連接。接著，由常規方法以該DNA混合物轉化大腸桿菌DH5細胞，轉化產物細胞接種于含170μg/ml氯霉素的L-瓊脂培養基，得到約20,000菌落構成的基因文庫。實施例3(轉化乳酸發酵短桿菌AJ 11060)從上述約20,000菌落中，根據上述Saito和Miura方法回收重組DNA。
重組DNA混合物分成50份，通過常規的電脈沖轉化法(見日本專利申請公開No.2-207791(1990))，導入AJ 11060菌株，該菌株是一種對表面活性劑敏感的突變株細胞。轉化產物細胞接種于添加葡萄糖的L-瓊脂培養基，31.5℃靜置培養，從而在培養基上形成約20,000轉化菌落。接著，這些轉化菌落復制到同樣的但含30mg/liter表面活性劑的平板培養基上，從中得到一些抗表面活性劑且能生長于該平板培養基上的菌株。實施例4(測量含多拷貝dts R基因菌株的表面活性劑抗性)從長出的若干菌株中分別提取重組DNA，以此DNA再轉化乳酸發酵短桿菌AJ 11060。從轉化產物中篩選對表面活性劑抗性菌株。該菌株的重組DNA命名為pDTR6，該質粒攜載的且有能力使菌株抗表面活性劑的基因命名為dts R。導入該質粒的AJ 11060菌，在添加表面活性劑(3g/liter)的液體培養基中，生長抑制被削弱了(見圖1)實施例5(制備DNA)由常規方法，從上面得到的含重組DNA的AJ 11060/pDTR6中制備質粒，并導入大腸桿菌JM 109。得到的大腸桿菌JM 109/pDTR6在含1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物和0.5％NaCl的20ml培養基中，37℃培養24小時，將得到的20ml培養物接種于一升組成同上的培養基11中，37℃培養3小時。然后加入0.2g氯霉素，進而，同樣溫度下繼續培養20小時。接著，得到的培養物以3,000r.p.m.離心10分鐘，得到2g濕細胞。得到的細胞懸浮于含25％蔗糖的20ml 350mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)然后加入10mg溶菌酶(Sigma Co.產品)8ml 0.25M EDTA溶液(pH8.0)和8ml 20％十二烷基硫酸鈉溶液。然后得到的懸浮液于60℃加熱30分鐘，得到溶菌產物。將13ml 5M NaCl溶液加入溶菌產物中，然后4℃處理16小時。處理后，15,000r.p.m.離心30分鐘。如此得到的上清液經常規酚抽提和乙醇沉淀，得到DNA沉淀物。
沉淀物減壓干燥，然后溶解于含1mM EDTA的6ml10mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)，進而加入6g氯化銫和0.2ml溴化乙錠(19mg/ml)。然后用39000 r.p.m.超速離心機進行平衡密度梯度分離42小時，分離DNA。接著，用正丁醇除去溴化乙錠，此后經含1mM EDTA的10mMTris-HCl(pH7.5)透析，得到約500μg純化的重組DNA，pDTR6。對大腸桿菌JM 109/pDTR6付與專用編號AJ 12967。該菌株于1994年2月22日保藏于National Institute of Bioscience and Human-Technology，Ageney of Industrial Science and Technology，Ministryof Interntional Trade and Industry，保藏號FERM P-14168，并于1995年2月9日按照布達佩斯條約轉至國際保藏，保藏號為FERM BP-4994。實施例6(分析含dts R基因的DNA的堿基序列)測定例5得到的重組DNA的堿基序列。測序依據Sanger方法，使用TaqDyeDeoxyTerminatorCycleSequencingKit(AppliedBiochemical Co.產品)。如此得到的DNA的堿基序列表示于序列表中SEQID NO1。盡管該序列最長的開放閱讀框是SEQ ID NO1所示第359A至第1987 G的堿基序列，由分析該基因上游區同源序列推斷，第467至第469的ATG為起始密碼子。由開放閱讀框第359A至第1987G編碼的氨基酸序列與該核苷酸序列一同示于序列表中SEQ ID NO1。另外，氨基酸序列單獨示于序列表中SEQ ID NO2。由第467至第1987堿基序列編碼的蛋白質命名為DTSR蛋白。
眾所周知，蛋白質N-末端甲硫氨酸殘基翻譯后經肽酶作用缺失。這是因為N-末端甲硫氨酸來自翻譯起始密碼子ATG，因此大多數情況下與蛋白質固有功能無關。本發明的DTSR蛋白，也有可能甲硫氨酸殘基被缺失。
堿基序列和氨基酸序列就同源性方面與已知序列比較。用于比較的數據庫是EMBL和SWISS-PROT。結果確認，序列表中SEQ ID NO1所示基因與其編碼的蛋白質都是新發現。實施例7(確認dts R基因參與表面活性劑抗性)由核苷酸測序鑒定開放閱讀框，暗示存在DTSR蛋白。為進一步確證賦予棒狀桿菌屬細菌表面活性劑抗性的基因位于此區，開放閱讀框此區基因的一部分以框內方式從序列表中SEQ ID NO1所示基因片段中缺失，并調查該基因片段是否具有賦予棒狀桿菌屬細菌表面活性劑抗性之活性。
具體地，以XbaI和KpnI消化pDTR6得到含dts R基因的片段。用T4DNA連接酶(Takara Shuzo公司產品)將該基因片段連接到經XbaI和KpnI處理過的質粒pHSG398片段上(Takara Shuzo公司產品)，制備質粒pHSGX-K。以Eco52I消化的dtsR基因有兩個位點，在SEQ ID NO1的766和1366核苷酸處。pHSGX-K以Eco52I完全消化，然后自我連接制備質粒pHSGX-KΔE，從中缺失600堿基對的Eco52I片段。在此pHSGX-KΔE上dts R基因的結構使中心部分被以框內方式缺失。
接看，為使pHSGX-KΔE能在棒狀桿菌屬細菌自主復制，將來自能在棒狀桿菌屬細菌自我擴增(見Miwa，K.等Agric.Biol.Chem.48，2901-2903(1984)；日本專利申請公開No.5-7491 1993))的一種已知質粒pHM1519的復制起點，引入存在于pHSGX-KΔE上的唯一KpnI裂解位點。具體地，以限制酶BamHI和KpnI消化pHM1519，得到含復制起點的基因片段，用Takara Shuzo公司生產的致鈍試劑盒將產物片段制成平滑端，然后用KpnI接頭(Takara Shuzo公司產品)插入pHSGX-KΔE的KpnI位點，得到pKCX-KΔE。作為對照，pHM1519的復制起點用SalI接頭(Takara Shuzo公司產品)插入pHSG399的SalI位點，制備pSAC4。使用上述電脈沖方法，此處制備的pKCX-KΔE和pSAC4分別導入棒狀桿菌屬細菌野生型菌株和乳酸發酵短桿菌ATCC 13869細胞，并檢查轉化產物的表面活性劑抗性程度。檢查時，細胞培養于加入0至10mg/dl聚氧乙烯山梨糖醇酐甘油單棕櫚酸酯的M-CM2G液體培養基，測量培養物中細胞生長狀況。
結果證明，缺失型dts R基因丟失了賦予表面活性劑抗性的功能。實施例8(由生物素限量方法用dtsR基因擴增菌株生產L-谷氨酸)如下所述，根據生物素限量方法，培養菌株AJ 11060/pDTR6來生產L-谷氨酸。具體地，菌株AJ 11060/pDTR6分別培養于含4mg/liter氯霉素的M-CM2G平板培養基上。然后，生長細胞接種于一升純水中含80g葡萄糖，1g KH2PO4，0.4g MgSO4·7H2O，30g(NH4)2SO4，0.01gFeSO4·7H2O，0.01g MnSO4·7H2O，15ml大豆水解物溶液，200μg鹽酸硫胺素，60μg生物素，4mg氯霉素和50g CaCl2的培養基(培養基pH用KOH調至7.0)并于31.5℃培養20小時。培養物接種于同樣但不含生物素的培養基(該培養基此后稱為“生物素限量培養基”)，體積濃度為5％，31.5℃培養20小時。
在生物素限量培養基中培養菌株AJ 11060/pDTR6時，測量培養基中生長的單位重量細胞所需生物素的量(見圖3)。作為對照，同上培養菌株AJ 11060/pSAC4。
菌株AJ 11060/pDTR6生長細胞的量大于對照。因此，菌株AJ11060/pDTR6單位重量生長細胞所需生物素低于菌株AJ 11060/pSAC4。實施例9(由dts R基因擴增菌株生產L-賴氨酸)通過電脈沖方法，將pDTR6導入棒狀桿菌屬細菌產L-賴氨酸菌株，乳酸發酵短桿菌AJ 12435(FERM BP-2294)。下述培養基培養，來生產L-賴氨酸。
具體地，用含有4mg/liter氯霉素的M-CM2G平板培養基上培養將如此得到的細胞接種一升純水中含100g葡萄糖，1g KH2PO4，0.4gMgSO4，30g(NH4)2SO4，0.01gFeSO4·7H2O，0.01g MnSO4·7H2O，15ml大豆水解物溶液，200μg鹽酸硫胺素，300μg生物素，4mg氯霉素和50gCaCO3的培養基中(培養基pH用KOH調至7.0)培養32℃40小時。作為對照，使用以同樣方式導入pSAC4而不是pDTR6的菌株。結果表示于表5。
表5菌株 L-賴氨酸(g/l)AJ 12435/pSAC4 15AJ 12435/pDTR6 25參考例1(由添加表面活性劑方法用dts R基因擴增菌株生產L-谷氨酸)通過添加表面活性劑作為生物素活性抑制劑，即使在高濃度生物素存在下，菌株AJ 11060也能生產大量的L-谷氨酸。然而，因為dts R基因擴增菌株提高了表面活性劑抗性，認為即使添加表面活性劑，這些菌株的谷氨酸生成也會被抑制。因此，根據下述添加表面活性劑的方法，使用菌株AJ 11060/pSAC4和AJ 11060/pDTR6來生產L-谷氨酸。具體地，菌株分別培養于含4mg/liter氯霉素的M-CM2G平板培養基上。然后，菌株接種于1升純水中含80g葡萄糖，1g KH2PO4，0.4g MgSO4·7H2O，30g(NH4)2SO4，0.01gFeSO4·7H2O，0.01gMnSO4·7H2O，15ml大豆水解物溶液，200μg鹽酸硫胺素，300μg生物素，4mg氯霉素，3.0g聚氧乙烯山梨糖醇酐甘油單棕櫚酸酯和50g CaCO3的培養基中(培養基pH用KOH調至8.0)并于31.5℃培養20小時。
培養后，測定培養物中生產和積累的L-谷氨酸的量。得到的產量示于表1。
表1菌株 L-谷氨酸產量(％)AJ 11060/pSAC4 29.6AJ 11060/pDTR6 9.0通過擴增dts R基因，L-谷氨酸產量顯著減少。這表明DTSR蛋白密切參與了由添加表面活性劑方法的L-谷氨酸生產。參考例2(由添加青霉素方法用dts R基因擴增菌株生產L-谷氨酸)除了培養基中加入30單位青霉素G替代聚氧乙烯山梨糖醇酐甘油單棕櫚酸酯以外，與參考例1同樣方式使用AJ 11060/pSAC4和AJ11060/pDTR6進行由添加青霉素方法培養菌株來生產L-谷氨酸。結果示于表2。
表2菌株 L-谷氨酸產量(％)AJ 11060/pSAC427.6AJ 11060/pDTR612.8通過擴增dts R基因，L-谷氨酸產量顯著減少。這表明DTSR蛋白除參與由添加表面活性劑方法的L-谷氨酸生產外，還參與了由添加青霉素方法的L-谷氨酸生產。實施例10(生產dts R基因破裂(dtsR gene-disrupted)菌株)因為發現L-谷氨酸生產被dts R基因擴增降低，預期dts R基因破裂(dtsR gene-disrupted)將導致L-谷氨酸產量增加。通過公開于日本專利申請公開No.5-7491(1993)的同源重組方法，用溫度敏感質粒得到基因破裂(dtsR gene-disrupted)菌株。
具體地，從能在棒狀桿菌屬細菌自主復制且自主復制已變為溫度敏感的一種質粒中得到復制起點，引入例7中pHSGX-KΔE的KpnI識別位點，形成質粒pKTCX-KΔE。
通過電脈沖方法，將pKTCX-KΔE導入野生型菌株乳酸發酵短桿菌ATCC 13869中，使用日本專利申請公開No.5-7491(1993)的方法，將染色體上dts R基因替換成缺失型，具體地ATCC 13869/pKTCX-KΔE在含50μg/ml油酸的M-CMZG液體培養基中25℃振蕩培養6小時，培養物接種于含5μg/ml氯霉素和50μg/ml油酸的M-CM2G培養基。插入質粒的菌株于34℃形成菌落，收集起來。從如此得到的菌株中，由復制方法篩選那些34℃對氯霉素敏感的菌株。由常規方法得到這些敏感菌株的染色體，由Southern雜交方法分析每一染色體的dts R基因。這樣，確認了dts R基因缺失型dts R基因替代的菌株，并命名為菌株ΔE。實施例11(評估菌株ΔE的L-谷氨酸生產力)以下述方式培養菌株ATCC 13869，AJ 11060和ΔE來生產L-谷氨酸。這些菌株各自培養于M-CM2G平板培養基上復壯。復壯的菌株接種于一升純水中含80g葡萄糖，1gKH2PO4，0.4gMgSO4，30g(NH4)2SO4，0.01gFeSO4·7H2O，0.01gMnSO4·7H2O，15ml大豆水解物，20μg鹽酸硫胺素，300μg生物素，1gTween 80(聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸鹽)和50gCaCO3(培養基pH用KOH調至8.0)的培養基中，31.5℃培養20小時。結果示于表4。
表4菌株 L-谷氨酸(g/l)ATCC138690AJ 11060 0ΔE 34由于培養基中存在過量生物素，未觀測到野生型菌株和菌株AJ11060累積L-谷氨酸。相反，菌株ΔE生產和積累L-谷氨酸良好。產業應用性本發明的dts R基因是在棒狀桿菌屬細菌的L-谷氨酸生產中發揮重要作用的一種基因，該菌用于L-谷氨酸的發酵生產。當該基因擴增于產L-賴氨酸棒狀桿菌屬細菌時，L-賴氨酸產力提高。當該基因在產L-谷氨酸棒狀桿菌屬細菌中被干擾時，L-谷氨酸產力提高。
序列表SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長度2855(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線型(ii)分子類別基因組DNA(ix)特點(A)命名/檢索CDS(B)位置359..1987(xi)序列描述SEQ ID NO1GATCTTGGAA CTCGACAGTT TTCACCGTCC AGTTTGGAGC GCCTGAGCTT GCAAGCTCCA 60GCAAGTCAGC ATTAGTGGAG CCTGTCACTT TTTCGTAAAT GACCTGGCCA AAGTCACCGT 120TTTGGAGCAA TTTTTCCTTC AGGAGCTCAA CGTTTAGCGG CTCTCTGGAT CGTGAAATGT 180CAACGTTCAT GGAAGCCAAT GTAGTGGGGT CGCGTCGAAA AGCGCGCTTT AAGGGCGACA 240CGCCCAAAAA GTTTTACCTT TAAAAACTAC CCGCACGCAG CACGAACCTG TTCAGTGATG 300TAAATCACCG CGGAAATATT GTGGACGTTA CCCCCGCCTA CCGCTACGAT TTCAAAAC 358ATG ACC ATT TCC TCA CCT TTG ATT GAC GTC GCC AAC CTT CCA GAC ATC 406Met Thr Ile Ser Ser Pro Leu Ile Asp Val Ala Asn Leu Pro Asp Ile1 5 10 15AAC ACC ACT GCC GGC AAG ATC GCC GAC CTT AAG GCT CGC CGC GCG GAA 454Asn Thr Thr Ala Gly Lys Ile Ala Asp Leu Lys Ala Arg Arg Ala Glu20 25 30GCC CAT TTC CCC ATG GGT GAA AAG GCA GTA GAG AAG GTC CAC GCT GCT 502Ala His Phe Pro Met Gly Glu Lys Ala Val Glu Lys Val His Ala Ala35 40 45GGA CGC CTC ACT GCC CGT GAG CGC TTG GAT TAC TTA CTC GAT GAG GGC 550Gly Arg Leu Thr Ala Arg Glu Arg Leu Asp Tyr Leu Leu Asp Glu Gly50 55 60TCC TTC ATC GAG ACC GAT CAG CTG GCT CGC CAC CGC ACC ACC GCT TTC 598Ser Phe Ile Glu Thr Asp Gln Leu Ala Arg His Arg Thr Thr Ala Phe65 70 75 80GGC CTG GGC GCT AAG CGT CCT GCA ACC GAC GGC ATC GTG ACC GGC TGG 646Gly Leu Gly Ala Lys Arg Pro Ala Thr Asp Gly Ile Val Thr Gly Trp85 90 95GGC ACC ATT GAT GGA CGC GAA GTC TGC ATC TTC TCG CAG GAC GGC ACC 694Gly Thr Ile Asp Gly Arg Glu Val Cys Ile Phe Ser Gln Asp Gly Thr100 105 110GTA TTC GGT GGC GCG CTT GGT GAG GTG TAC GGC GAA AAG ATG ATC AAG 742Val Phe Gly Gly Ala Leu Gly Glu Val Tyr Gly Glu Lys Met Ile Lys115 120 125ATC ATG GAG CTG GCA ATC GAC ACC GGC CGC CCA TTG ATC GGT CTT TAC 790Ile Met Glu Leu Ala Ile Asp Thr Gly Arg Pro Leu Ile Gly Leu Tyr130 135 140GAA GGC GCT GGC GCT CGC ATT CAG GAC GGC GCT GTC TCC CTG GAC TTC 838Glu Gly Ala Gly Ala Arg Ile Gln Asp Gly Ala Val Ser Leu Asp Phe145 150 155 160ATT TCC CAG ACC TTC TAC CAA AAC ATT CAG GCT TCT GGC GTT ATC CCA 886Ile Ser Gln Thr Phe Tyr Gln Asn Ile Gln Ala Ser Gly Val Ile Pro165 170 175CAG ATC TCC GTC ATC ATG GGC GCA TGT GCA GGT GGC AAC GCT TAC GGC 934Gln Ile Ser Val Ile Met Gly Ala Cys Ala Gly Gly Asn Ala Tyr Gly180 185 190CCA GCC CTG ACC GAC TTC GTG GTC ATG GTG GAC AAG ACC TCC AAG ATG 982Pro Ala Leu Thr Asp Phe Val Val Met Val Asp Lys Thr Ser Lys Met195 200 205TTC GTT ACC GGC CCA GAC GTG ATC AAG ACC GTC ACC GGC GAG GAA ATC 1030Phe Val Thr Gly Pro Asp Val Ile Lys Thr Val Thr Gly Glu Glu Ile210 215 220ACC CAG GAA GAG CTT GGC GGA GCA ACC ACC CAC ATG GTG ACC GCT GGC 1078Thr Gln Glu Glu Leu Gly Gly Ala Thr Thr His Met Val Thr Ala Gly225 230 235 240AAC TCC CAC TAC ACC GCT GCG ACC GAT GAG GAA GCA CTG GAT TGG GTA 1126Asn Ser His Tyr Thr Ala Ala Thr Asp Glu Glu Ala Leu Asp Trp Val245 250 255CAG GAC CTG GTG TCC TTC CTC CCA TCC AAC AAT CGC TCT TAC ACA CCA 1174Gln Asp Leu Val Ser Phe Leu Pro Ser Asn Asn Arg Ser Tyr Thr Pro260 265 270CTG GAA GAC TTC GAC GAG GAA GAA GGC GGC GTT GAA GAA AAC ATC ACC 1222Leu Glu Asp Phe Asp Glu Glu Glu Gly Gly Val Glu Glu Asn Ile Thr275 280 285GCT GAC GAT CTG AAG CTC GAC GAG ATC ATC CCA GAT TCC GCG ACC GTT 1270Ala Asp Asp Leu Lys Leu Asp Glu Ile Ile Pro Asp Ser Ala Thr Val290 295 300CCT TAC GAC GTC CGC GAT GTC ATC GAA TGC CTC ACC GAC GAT GGC GAA 1318Pro Tyr Asp Val Arg Asp Val Ile Glu Cys Leu Thr Asp Asp Gly Glu305 310 315 320TAC CTG GAA ATC CAG GCA GAC CGC GCA GAA AAC GTT GTT ATT GCA TTC 1366Tyr Leu Glu Ile Gln Ala Asp Arg Ala Glu Asn Val Val Ile Ala Phe325 330 335GGC CGC ATC GAA GGC CAG TCC GTT GGA TTT GTT GCC AAC CAG CCA ACC 1414Gly Arg Ile Glu Gly Gln Ser Val Gly Phe Val Ala Asn Gln Pro Thr340 345 350CAG TTC GCT GGC TGC CTG GAC ATC GAC TCC TCT GAG AAG GCA GCT CGC 1462Gln Phe Ala Gly Cys Leu Asp Ile Asp Ser Ser Glu Lys Ala Ala Arg355 360 365TTC GTC CGC ACC TGC GAC GCG TTT AAC ATC CCA ATC GTC ATG CTT GTC 1510Phe Val Arg Thr Cys Asp Ala Phe Asn Ile Pro Ile Val Met Leu Val370 375 380GAC GTC CCC GGC TTC CTT CCA GGC GCA GGC CAG GAG TAT GGT GGC ATC 1558Asp Val Pro Gly Phe Leu Pro Gly Ala Gly Gln Glu Tyr Gly Gly Ile385 390 395 400CTG CGT CGT GGC GCA AAG CTG CTC TAC GCA TAC GGC GAA GCA ACC GTT 1606Leu Arg Arg Gly Ala Lys Leu Leu Tyr Ala Tyr Gly Glu Ala Thr Val405 410 415CCA AAG ATT ACC GTC ACC ATG CGT AAG GCT TAC GGC GGA GCG TAC TGC 1654Pro Lys Ile Thr Val Thr Met Arg Lys Ala Tyr Gly Gly Ala Tyr Cys420 425 430GTG ATG GGT TCC AAG GGC TTG GGC TCT GAC ATC AAC CTT GCA TGG CCA 1702Val Met Gly Ser Lys Gly Leu Gly Ser Asp Ile Asn Leu Ala Trp Pro435 440 445ACC GCA CAG ATC GCC GTC ATG GGC GCT GCT GGC GCA GTC GGA TTC ATC 1750Thr Ala Gln Ile Ala Val Met Gly Ala Ala Gly Ala Val Gly Phe Ile450 455 460TAC CGC AAG GAG CTC ATG GCA GCT GAT GCC AAG GGC CTC GAT ACC GTA 1798Tyr Arg Lys Glu Leu Met Ala Ala Asp Ala Lys Gly Leu Asp Thr Val465 470 475 480GCT CTG GCT AAG TCC TTC GAG CGC GAG TAC GAA GAC CAC ATG CTC AAC 1846Ala Leu Ala Lys Ser Phe Glu Arg Glu Tyr Glu Asp His Met Leu Asn485 490 495CCG TAC CAC GCT GCA GAA CGT GGC CTG ATC GAC GGC GTG ATC CTG CCA 1894Pro Tyr His Ala Ala Glu Arg Gly Leu Ile Asp Ala Val Ile Leu Pro500 505 510AGC GAA ACC CGC GGA CAG ATT TCC CGC AAC CTT CGC CTG CTC AAG CAC 1942Ser Glu Thr Arg Gly Gln Ile Ser Arg Asn Leu Arg Leu Leu Lys His515 520 525AAG AAC GTC ACT CGC CCT GCT CGC AAG CAC GGC AAC ATG CCA CTG 1987Lys Asn Val Thr Arg Pro Ala Arg Lys His Gly Asn Met Pro Leu530 535 540TAAATCGGCG AATCCATAAA GGTTCAAAAG AATTCAATAA GGATTCGATA AGGGTTCGAT2047AAGGGTTCGA TAAGGGCCGA CTTAAATGAT TGGATGTAAA GAAATACCAA TGAAAATTGG2107CAACTCTTTA CACCCAATCT TTAAGACATG GGGGGTGGCG CTGGGCTAAT ATAACCGGTT2167AGCGAAACGA TTAGTCCCTT GTTAGGGGGA TTAACCCTCG AAGTGGGTCG TATTTTGGCG2227TTTGTATGTT CACACAAGAA CCCTGCACAA CGCCTTCAAA GTACGTCGAC CACGACCAAG2287CGCATTATTC ACTCTCACCC TTCAGGATTT AGACTAAGAA ACCATGACTG CAGCACAGAC2347CAAACCTGAC CTCACCACCA CGGCTGGAAA GCTGTCCGAT CTTCGCTCCC GTCTTGCAGA2407AGCTCAAGCT CCAATGGGCG AAGCAACTGT AGAAAAAGTG CACGCTGCTG GCAGGAAGAC2467TGCCCGCGAA CGTATCGAGT ATTTGCTCGA TGAGGGCTCT TTCGTAGAGA TCGATGCTCT2527TGCTCGTCAC CGTTCCAAGA ACTTCGGCCT GGATGCCAAG CGTCCAGCTA CTGACGGTGT2587TGTGACTGGT TACGGCACCA TCGATGGCCG TAAGGTCTGT GTGTTCTCCC AGGACGGCGC2647TGTATTCGGT GGCGCTTTGG GTGAAGTTTA TGGTGAAAAG ATCGTTAAGG TTATGGATCT2707TGCGATCAAG ACCGGTGTGC CTTTGATCGG AATCAATGAG GGTGCTGGTG CGCGTATCCA2767GGAAGGTGTT GTGTCTCTGG GTCTGTACTC ACAGATTTTC TACCGCAACA CCCAGGCGTC2827TGGCGTTATC CCACAGATCT CTTTGATC 2855SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長度543(B)類型氨基酸(D)拓撲學線型(ii)分子類別蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Thr Ile Ser Ser Pro Leu Ile Asp Val Ala Asn Leu Pro Asp Ile1 5 10 15Asn Thr Thr Ala Gly Lys Ile Ala Asp Leu Lys Ala Arg Arg Ala Glu20 25 30Ala His Phe Pro Met Gly Glu Lys Ala Val Glu Lys Val His Ala Ala35 40 45Gly Arg Leu Thr Ala Arg Glu Arg Leu Asp Tyr Leu Leu Asp Glu Gly50 55 60Ser Phe Ile Glu Thr Asp Gln Leu Ala Arg His Arg Thr Thr Ala Phe65 70 75 80Gly Leu Gly Ala Lys Arg Pro Ala Thr Asp Gly Ile Val Thr Gly Trp85 90 95Gly Thr Ile Asp Gly Arg Glu Val Cys Ile Phe Ser Gln Asp Gly Thr100 105 110Val Phe Gly Gly Ala Leu Gly Glu Val Tyr Gly Glu Lys Met Ile Lys115 120 125Ile Met Glu Leu Ala Ile Asp Thr Gly Arg Pro Leu Ile Gly Leu Tyr130 135 140Glu Gly Ala Gly Ala Arg Ile Gln Asp Gly Ala Val Ser Leu Asp Phe145 150 155 160Ile Ser Gln Thr Phe Tyr Gln Asn Ile Gln Ala Ser Gly Val Ile Pro165 170 175Gln Ile Ser Val Ile Met Gly Ala Cys Ala Gly Gly Asn Ala Tyr Gly180 185 190Pro Ala Leu Thr Asp Phe Val Val Met Val Asp Lys Thr Ser Lys Met195 200 205Phe Val Thr Gly Pro Asp Val Ile Lys Thr Val Thr Gly Glu Glu Ile210 215 220Thr Gln Glu Glu Leu Gly Gly Ala Thr Thr His Met Val Thr Ala Gly225 230 235 240Asn Ser His Tyr Thr Ala Ala Thr Asp Glu Glu Ala Leu Asp Trp Val245 250 255Gln Asp Leu Val Ser Phe Leu Pro Ser Asn Asn Arg Ser Tyr Thr Pro260 265 270Leu Glu Asp Phe Asp Glu Glu Glu Gly Gly Val Glu Glu Asn Ile Thr275 280 285Ala Asp Asp Leu Lys Leu Asp Glu Ile Ile Pro Asp Ser Ala Thr Val290 295 300Pro Tyr Asp Val Arg Asp Val Ile Glu Cys Leu Thr Asp Asp Gly Glu305 310 315 320Tyr Leu Glu Ile Gln Ala Asp Arg Ala Glu Asn Val Val Ile Ala Phe325 330 335Gly Arg Ile Glu Gly Gln Ser Val Gly Phe Val Ala Asn Gln Pro Thr340 345 350Gln Phe Ala Gly Cys Leu Asp Ile Asp Ser Ser Glu Lys Ala Ala Arg355 360 365Phe Val Arg Thr Cys Asp Ala Phe Asn Ile Pro Ile Val Met Leu Val370 375 380Asp Val Pro Gly Phe Leu Pro Gly Ala Gly Gln Glu Tyr Gly Gly Ile385 390 395 400Leu Arg Arg Gly Ala Lys Leu Leu Tyr Ala Tyr Gly Glu Ala Thr Val405 410 415Pro Lys Ile Thr Val Thr Met Arg Lys Ala Tyr Gly Gly Ala Tyr Cys420 425 430Val Met Gly Ser Lys Gly Leu Gly Ser Asp Ile Asn Leu Ala Trp Pro435 440 445Thr Ala Gln Ile Ala Val Met Gly Ala Ala Gly Ala Val Gly Phe Ile450 455 460Tyr Arg Lys Glu Leu Met Ala Ala Asp Ala Lys Gly Leu Asp Thr Val465 470 475 480Ala Leu Ala Lys Ser Phe Glu Arg Glu Tyr Glu Asp His Met Leu Asn485 490 495Pro Tyr His Ala Ala Glu Arg Gly Leu Ile Asp Ala Val Ile Leu Pro500 505 510Ser Glu Thr Arg Gly Gln Ile Ser Arg Asn Leu Arg Leu Leu Lys His515 520 525Lys Asn Val Thr Arg Pro Ala Arg Lys His Gly Asn Met Pro Leu530 535 540
權利要求
1.一種來自棒狀桿菌屬細菌，并用于編碼賦予該菌對表面活性劑抗性的一種蛋白質的基因。
2.根據權利要求1的基因，其中蛋白質的氨基酸序列包含序列表中的SEQ ID NO2所示氨基酸序號37至543的一段氨基酸序列，或者替代、缺失或插入的一段氨基酸序列，而基本上不影響賦予棒狀桿菌屬細菌對表面活性劑抗性的活性。
3.根據權利要求1所述的基因，其包含序列表中，SEQ ID NO1所示第467至第1987的一段序列，或者一段基本上與此相同的堿基序列。
4.一種可由在棒狀桿菌屬細菌中起作用的一種載體連接到定義于權利要求1的基因上得到的重組DNA。
5.一種駐留有定義于權利要求4所述的重組DNA的棒狀桿菌屬細菌。
6.一種生產L-賴氨酸的方法，包括培養棒狀桿菌屬細菌和收集L-賴氨酸，該菌駐留有權利要求4所述的重組DNA，并能在液體培養基中生產L-賴氨酸，從而在培養物中生產和積累L-賴氨酸。
7.一種基因，包括在權利要求1所述的基因的一段堿基序列上產生一個或二個以上堿基替代、缺失、插入、增加或倒位的一段堿基序列，以致使由該堿基序列編碼的蛋白質就賦予棒狀桿菌屬細菌對表面活性劑抗性之活性不能正常起作用。
8.一種由棒狀桿菌屬細菌中起作用的一種載體連接到權利要求7所述的基因上得到的重組DNA。
9.一種棒狀桿菌屬細菌，它在其染色體上的權利要求1所述的基因或啟動子堿基序列中具有一個或二個以上堿基的替代、缺失、插入、增加或倒位，以致使具有賦予棒狀桿菌屬細菌對表面活性劑抗性之活性的一種蛋白質不能正常起作用。
10.一種生產L-谷氨酸的方法，包括培養棒狀桿菌屬細菌和收集L-谷氨酸，該菌在權利要求1所述的基因或啟動子堿基序列中具有一個或二個以上堿基替代、缺失、插入、增加或倒位，以致使具有賦予棒狀桿菌屬細菌對表面活性劑抗性之活性的一種蛋白質不能正常起作用，該菌并能在液體培養基中生產L-谷氨酸，從而在培養物中生產和積累L-谷氨酸。
全文摘要
通過擴增來自棒狀桿菌屬細菌并參與L-谷氨酸生產的一種新基因，產L-賴氨酸棒狀桿菌屬細菌L-賴氨酸產力得到增強，同時通過抑制該基因功能，產L-谷氨酸棒狀桿菌屬細菌L-谷氨酸產力得到增強。
文檔編號C07K14/195GK1146216SQ9519267
公開日1997年3月26日 申請日期1995年2月23日 優先權日1994年2月24日
發明者木村英一郎, 阿部知津, 河原義雄, 吉原康彥, 中松亙 申請人:味之素株式會社