專利名稱：用親合色譜法提純水蛭素的方法
技術領域：
本發明涉及的是水蛭素的提純方法，更具體地說涉及的是用親合色譜法提純水蛭素的方法。
由水蛭、醫用水蛭中分離出的水蛭素是一種凝血酶抑制劑，它由65-66個氨基酸組成。已公知有約11種水蛭素變體，根據N-末端氨基酸序列將它們分成兩組N-末端氨基酸為Val-Val(Bagdy等，Meth.Enzymol.45，669(1976))的HV1和N-末端氨基酸為Ile-Thr(Walsmann & Markwardt，Thromb.Res.40，563(1985))的HV2。HV1和HV2兩者都已用于治療血栓形成。水蛭素表現的凝血酶抑制常數(Ki)為10-11M至10-14M，這表明水蛭素能以很低的濃度抑制血液凝結(Mao等，Anal.Biochem.161，514(1987))。特別是，臨床試驗證明水蛭素沒有如過敏、免疫反應、循環機能變常的副作用(Markwardt等，Thromb.Haemostas，52，160(1984))。
由一個醫用水蛭中可獲得的水蛭素的量少至20μg(Markwardt，Meth.，Enzymol.，19，924，1970)。因而，已有許多償試以通過培養遺傳工程微生物來大量生產水蛭素(作為綜述，可參見Fareed等，Blood coagulation and Fibrinolysis，2，135(1991))。
Riehl-Bellon等采用陰離子交換色譜法和反相HPLC來提純通過基因克隆技術生產的水蛭素(Riehl-Bellon等，Biochem.，28，2941(1989))。Misawa等在DEAE-Cellulofine、Butyl-Toyopearl、Sephadex G-25和Q-Sepharose上依次進行柱色譜法來從重組體E.coli培養物中提純HV2(Misawa等，Proceeding of ApBiochEC.P.62(1992))。
然而，開發出的這些方法僅用來檢測宿主細胞中產生的水蛭素，不適合應用于水蛭素的定量提純。
采用注射劑型的醫用重組體蛋白質應是高度純化的，從制品的安全性和經濟方面來看提純是很重要的。
為提純醫用蛋白質，使用抗原-抗體反應的免疫親合色譜法已被采用。但免疫親合色譜法具有一些缺點它易于失活且昂貴。因而，它的應用局限于提純方法的最終步驟。
在這些情況下，本發明人為提供更方便且更經濟地提純水蛭素的方法進行了廣泛的研究，其結果發現，使用金屬離子親合色譜法，其中以銅離子(Cu++)用作親合吸附劑(金屬離子)并以磷酸鹽緩沖劑用作洗脫液，可以實現所述的目的。
因而，本發明的目的之一是提供以低的費用提純水蛭素的方法。
本發明的另一目的是提供應用金屬離子親合色譜法提純水蛭素的方法，其中銅離子(Cu++)用作親合吸附劑(金屬離子)，磷酸鹽緩沖劑用作洗脫液。
本發明的再一目的是提供從含有水蛭素和其它物質的溶液中提純水蛭素的方法，該方法包括以下步驟使銅化合物溶液流經裝有配位體的柱以使銅離子(Cu++)吸附于所述配位體上；向所述的柱上裝填含有水蛭素和其它物質的溶液以使水蛭素與銅離子結合；從銅離子上除去水蛭素并使用磷酸鹽緩沖劑作為洗脫液從柱中洗脫水蛭素。
從以下的說明中本領域的普通技術人員可以清楚看出本發明的其它目的、特點和用途。
1975年首次開發了其中以金屬離子用作親合吸附劑的金屬離子親合色譜法用來分離人血清蛋白(Porath等，Nature，258，598(1975))。Porath等人的方法是，依靠氨基酸與金屬離子的親合性，使一些具有咪唑結構的氨基酸結合于金屬離子上，所述的金屬離子吸附在裝填于色譜柱內的配位體上，然后通過使用洗脫液降低所述氨基酸與金屬離子間的親合性從金屬離子上脫除氨基酸。所述金屬離子的實例可以是如Cu++、Ni++和Zn++的二價金屬離子。從工業的角度看金屬離子色譜法具有的優點是，用來吸附金屬離子的配位體易于制備且其穩定性極好，固定基質(或載體)可以循環。
目前還沒有人償試過應用金屬離子親合色譜法來分離或提純水蛭素。本發明人首次提出應用金屬離子親合色譜法技術來提純水蛭素并確定了其最佳操作條件。
按照本發明的使用金屬離子親合色譜法的提純方法包括的步驟為，使銅化合物溶液流經裝有配位體的柱，將銅離子(Cu++)吸附于所述配位體上；在所述的柱上裝填要提純的含有水蛭素的溶液以將水蛭素結合于銅離子上；使用磷酸鹽緩沖劑作為洗脫液使水蛭素從銅離子上脫除并從所述柱中洗脫水蛭素。
固定在固定基質或載體上用來吸附作為親合吸附劑的銅離子的配位體可以是在金屬離子親合色譜法中采用的任何一種。配位體的實例可包括但非限于亞氨基二乙酸(IDA)、三(羧甲基)乙二胺(TED)或次氮基三乙酸(NTA)。優選采用亞氨基二乙酸。
作為固定基質或載體，可采用瓊脂糖或右旋糖凝膠，例如瓊脂糖凝膠(Sepharose)(Pharmacia)、交聯葡聚糖凝膠(Sephadex)(Pharmacia)、Cellufine(Amicon)、Toyopearl(Tosoh)及類似物。
固定配位體的固定基質可以通過本領域普通技術人員公知的技術來制備或者可從市場購得。
本發明采用的金屬離子是二價離子，優選銅離子(Cu++)。使銅化合物溶液流經裝有配位體的柱可以將銅離子吸附于所述配位體上。銅化合物優選硫酸銅。如鋅或鎳的任何其它二價金屬離子對水蛭素不具有親合性，因而不能用來提純水蛭素。
使用緩沖劑可將水蛭素從金屬離子上脫除，所述的緩沖劑例如磷酸鹽、咪唑濃度梯度洗脫液、PH值梯度洗脫液、或絡合劑如乙二胺四乙酸或乙二醇四乙酸。考慮到水蛭素的產率，優選采用磷酸鹽緩沖劑，特別是50-500mM磷酸鹽、更特別是高達約為100mM的磷酸鹽。磷酸鹽緩沖液中可含有高達20mM的咪唑，因為當偶和作用很強時，添加咪唑會使得水蛭素從銅離子上的去偶合作用易于進行。
可使用本發明的方法提純的水蛭素包括由醫用水蛭中分離的天然水蛭素、通過培養含有編碼水蛭素的重組DNA的酵母或細菌得到的含水蛭素的培養液、市售未提純的(粗制)水蛭素制品及類似物。通過重組DNA技術可以制得的水蛭素包括HV2水蛭素、LYS47-HV2(它是其中氨基酸47被LYS所取代的HV2水蛭素)、或HV1水蛭素。
可通過本領域技術人員廣知的通用培養技術培養載有編碼水蛭素的重組DNA的酵母或細菌來生產水蛭素。使用本領域普通技術人員公知的方法從酵母或細菌的培養液中將水蛭素粗分離，例如對培養液進行離心并將所得到的上清液進行超速離心。另外，培養液也可以經過離子色譜法、使用乙醇或丙酮沉淀法進行分離。
對于本發明，在申請中采用的“含有水蛭素的粗溶液”詞語意義是含有水蛭素以及其它物質的溶液，它的使用等價于“含有水蛭素和其它物質的溶液”詞語。含有水蛭素的粗溶液可包括但非僅限于上述培養液、或由培養液中分離出的粗水蛭素、市售未提純的水蛭素制品及類似物。
水蛭素通過福林(Folin)方法定量分析，其純度通過Sohn方法(Sohn等人，J.Microbiol.Biotechnol.，1，266(1991))來確定，在Sohn方法中是使用15-30％梯度乙腈-水在C-8柱(4.6mmX250mm，Phenomenex)上進行高效 液相色譜法(HPLC；Bechman，Model System Gold)。
水蛭素的抗凝血酶滴定度以抗凝血酶單位(ATU)來表示。凝血酶活性標準為NIH-U，1ATU的水蛭素活性定義為完全抑制1NIH-U凝血酶活性的水蛭素的量。
水蛭素的抗凝血酶滴定度可以按照Nadine等人的方法(Nadine等，Biochem.，28，2941(1989))來確定。
也就是說，向50μl凝血酶反應溶液(0.1 M Tris-Cl，PH 8.0，0.12M Nacl，0.01％疊氮化鈉，0.1％牛血清清蛋白)中添加0.005、0.01、0.015、0.02、0.025或0.03 ATU真實水蛭素(Accurate Chem.& Scientific)、或本發明實施例中制備的提純了的水蛭素，然后向其中添加0.03NIH-U/50μl的人凝血酶(Sigma)。隨后向其中添加100μl的200μM Chromozym TH(Boehringer Mannheim)，一種凝血酶的合成底物，在37℃下培養所得到的混合物5分鐘，使用微量培養板讀數器來測量在405nm下，Chromozym TH的顏色顯示(Color development)。通過測量在405nm下的每種真實和提純了的水蛭素，就可計算出實施例中獲得的提純了的水蛭素的滴定值。
以下通過非限定性的實施例對本發明進行更詳細的敘述。
實施例1在30℃下，在混合培養基(4％酵母提取液、0.5％酪蛋白氨基酸、1％丁二酸、0.4％氫氧化鈉、和4％作為碳源的半乳糖)中培養酵母釀酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)KCTC 8519P 52小時。培養以間歇添加培養方法來進行，其中間歇添加半乳糖以保持其濃度在2-4％。
培養結束后，將培養液離心得到上清液，并使之經過截止分子量為3,000的YM3超濾膜(Amicon)過濾。如此得到的濾液稱為“含有水蛭素的粗溶液”并用于隨后提純方法中。
實施例2從Sigma購得IDA-Sepharose 6B Fast Flow，它是固定有亞氨基二乙酸(IDA)的瓊脂糖凝膠。將IDA-Sepharose 6B裝填在1.5×30cm的色譜柱中，并使20mM的硫酸銅流經該柱。
實施例3以1ml/分鐘的流速使實施例1中制備的1ml含有水蛭素的粗溶液流過實施例2中制備的IDA-Sepharose 6B Fast Flow柱，使水蛭素與銅離子結合，然后用1mM的磷酸鹽緩沖劑(PH6.2)洗滌該柱以除去除水蛭素外未結合的蛋白質。之后，用100mM磷酸鹽緩沖劑(PH6.2)將水蛭素洗脫。收集含有水蛭素的No.38至54餾份并使之經過截止分子量為3000的膜超濾。在濾液中所含的蛋白質總量和水蛭素的活性分別為1.75mg和4000ATU/mg，而含有水蛭素的起始粗溶液的對應值分別為120.8mg和68.6ATU/mg。水蛭素的產率和純度分別為85.6％和90％或更高。
比較實施例1-2進行實施例1至3所述的方法，不同之處為以20mM鎳離子(比較實施例1)或鋅離子(比較實施例2)溶液來取代硫酸銅溶液。
在流經所述柱之前和之后所述溶液中含有的蛋白質總量和水蛭素活性沒有改變。
實施例4從Sigma購得目錄號為H7016的未提純的天然水蛭素，按照實施例3的方法對其提純。
流經所述柱之前蛋白質總量和水蛭素的活性分別為0.08mg和1720ATU/mg，流過該柱后，對應值分別為0.01179mg和10500ATU/mg。水蛭素的產率和純度分別為90％和97％或更高。
實施例5從CalBioChem購得目錄號為377855的未提純的HV1并按照實施例3的方法提純。使用含有20mM咪唑的100mM磷酸鹽緩沖劑(PH6.2)從銅離子上脫除水蛭素。
在流經所述柱之前蛋白質總量和水蛭素的活性分別為0.93mg和215ATU/mg，而流過該柱后，對應值分別為0.215mg和890ATU/mg。水蛭素的產率和純度分別為96％和90％或更高。
實施例6從Sigma購得目錄號為HO393的重組體水蛭素LYS47-HV2并按實施例3的方法提純。
在流經所述柱之前蛋白質總量和水蛭素的活性分別為0.01mg和9900ATU/mg，而流經該柱后對應值分別為0.0095mg和12000ATU/mg。水蛭素的產率和純度分別為90％和99％或更高。
比較實施例3進行實施例1至3所述的方法，不同之處是以含有1M NaCl的乙酸鈉緩沖劑(20mM)形成6至4的PH梯度來從所述的柱中洗脫水蛭素。
水蛭素從銅離子上的脫除不完全，水蛭素的產率為約60％。
實施例7進行實施例1至3所述的方法，不同之處是以三羧甲基乙二胺代替亞氨基二乙酸用作配位體。水蛭素的產率和純度分別為86.3％和90％。
本發明在不偏離其實質和基本特征的條件下還可以按其它方式來實施或體現。因而這里所述的優選實施例只是說明性的而非限制性的，本發明的范圍由所附權利要求書指明，權利要求書的意義范圍內的各種變形都應為該范圍所覆蓋。
權利要求
1.一種從含有水蛭素和其它物質的溶液中提純水蛭素的方法，其特征在于所述方法包括使所述溶液經過金屬離子親合色譜法處理的步驟，其中所述金屬離子為銅離子(Cu++)并以磷酸鹽緩沖劑用作洗脫液。
2.如權利要求1所述的方法，它包括以下步驟使銅化合物溶液流過裝有配位體的柱以將銅離子(Cu++)吸附在所述配位體上；向所述的柱上裝填含有水蛭素和其它物質的溶液以使水蛭素結合在銅離子上；使用磷酸鹽緩沖劑作為洗脫液使水蛭素從銅離子上脫除并從所述的柱中洗脫水蛭素。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中水蛭素是天然水蛭素、HV1、HV2、或LYS47-HV2。
4.如權利要求1或2所述的方法，其中所述銅化合物溶液是硫酸銅溶液。
5.如權利要求1或2所述的方法，其中所述磷酸鹽緩沖劑的濃度低于100mM。
6.如權利要求5所述的方法，其中所述磷酸鹽緩沖劑含有多達20mM的咪唑。
7.如權利要求2所述的方法，其中所述配位體為亞氨基二乙酸。
全文摘要
本發明公開了一種從含有水蛭素和其它物質的溶液中提純水蛭素的方法，其特征在于該方法包括使所述溶液經過金屬離子親合色譜法處理的步驟，其中銅離子(Cu
文檔編號C07K1/22GK1127260SQ9511770
公開日1996年7月24日 申請日期1995年9月7日 優先權日1994年9月7日
發明者李尚基, 鄭鳳鉉, 崔毅星, 孫廷熏, 尹悳重, 金明國, 李海敦 申請人:東國制藥株式會社, 財團法人, 韓國科學技術研究院