專利名稱：用作抗增殖藥物及garft抑制劑的化合物的制作方法
背景技術：
本發明涉及如下定義的結構式I的化合物，該化合物可以抑制甘氨酰胺核苷酸甲酰轉移酶(GARFT)。本發明還涉及制備這些化合物的中間體、含有這些化合物的藥物組合物、它們抑制GARFT的用途及它們抑制高等生物細胞或微生物(例如細菌、酵母和真菌)的生長及增殖的用途。這些化合物具有抗腫瘤、抗炎、治療牛皮癬和/或免疫抑制活性。本發明還涉及所述這些化合物的制備。
在抗增殖藥物的大類中包括抗代謝化合物。被稱為抗葉酸藥物的一類特殊的抗代謝藥物是維生素葉酸的拮抗劑。一般地，抗葉酸藥物與葉酸的結構非常相似并能摻入葉酸的特征性的對苯甲酰谷氨酸部分。葉酸的谷氨酸部分在生理性pH條件下帶有兩個負電荷。因此，該化合物及其類似物具有激活的能量驅動轉運系統以穿過細胞膜并產生代謝作用。
GARFT是嘌呤的從頭生物合成途徑中的葉酸依賴性酶。該途徑對細胞的分裂和增殖非常重要。已知切斷該途徑具有抗增殖的效果，具體地講是抗腫瘤的效果。因此，已經合成了大量的葉酸類似物并對其抑制GARFT的能力進行了研究。據報道，典型的特異性牢固結合的GARFT抑制劑5，10-二去氮雜四氫葉酸具有抗腫瘤活性。參見F.M.Muggia，“嘌呤從頭合成的葉酸抗代謝物抑制劑”，癌癥化療中的新藥、概念和結果，KluwerAcademic Publishers，Boston(1992)，65-87。
最近，在由本申請人于1994年1月18日遞交的國際申請PCT/US94/00418中公開了用作抗增殖藥物或GARFT抑制劑的稠合雜環狀谷氨酸衍生物。本申請通過對更有用的抗增殖藥物和GARFT抑制劑的發展繼續該領域內的進展。
發明概述本發明涉及如下定義的結構式I的化合物。這些化合物對抑制甘氨酰胺核苷酸甲酰轉移酶(GARFT)和高等生物細胞或微生物(例如細菌、酵母和真菌)的生長及增殖有效。本發明進一步涉及含有這些化合物或其適當的鹽的藥物組合物以及這些化合物作為GARFT酶抑制劑的用途。
如上所述，本發明的化合物具有抗增殖活性，該特性可表現為抗腫瘤活性。本發明的化合物可以是活性成分本身，或是作為可在體內轉變為活性化合物的前體。本發明的優選化合物對抑制GARFT酶特別有效。特別優選的化合物對抑制L1210細胞系(一種可以在組織培養液中生長的小鼠白血病細胞系)有效。本發明的化合物還對抑制細菌(例如可在培養液中生長的革蘭氏陰性大腸桿菌)的生長有效。
可以將本發明的化合物及其可藥用的鹽制成方便的劑型，例如膠囊、片劑和可注射制劑。還可以使用固體或液體的可藥用載體、稀釋劑或賦性劑。
固體載體包括淀粉、乳糖、二水硫酸鈣、石膏粉、蔗糖、滑石、明膠、瓊脂、果膠、阿拉伯膠、硬脂酸鎂和硬脂酸。液體載體包括糖漿、花生油、橄欖油、鹽溶液和水。
載體和稀釋劑包括任何延長釋放的材料，例如甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯，單獨使用或與蠟一起使用。當使用液體載體時，制劑可以是糖漿、酏劑、乳劑、軟明膠膠囊、無菌注射液(例如溶液)或者非水性或水性液體懸浮液的形式。
藥物制劑按照藥劑師的常規技術制備，當需要片劑劑型時包括例如混合、制粒和壓片等步驟，或者包括混合、裝灌和溶解成分等步驟以制得用于口服、胃腸外、局部、陰道內、鼻內、支氣管內、眼內、耳內或直腸內給藥的所需產品。
本發明的組合物還可以進一步含有一種或多種其它的藥物活性化合物。例如，可以在組合物中含有一種如下的抗腫瘤藥物有絲分裂抑制劑(例如長春花堿)；烷化劑；二氫葉酸還原酶抑制劑或TS抑制劑；抗代謝物(例如5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷)；嵌入型抗生素(例如阿霉素、博來霉素)；酶(例如天冬酰胺酶)；拓撲異構酶抑制劑(例如鬼臼乙叉甙)；和生物反應調節劑(例如干擾素)。本發明的組合物還可以含有其它的GARFT抑制劑或抗增殖藥物，例如國際公開號WO 94/13295(1994年6月23日公開)或國際公開號WO 92/05153(1992年4月2日公開)中所記載的化合物，在此引入其公開的內容作為參考。本發明的組合物還可以含有一種或多種抗菌、抗真菌、抗寄生蟲、抗病毒、抗牛皮癬或抗球蟲藥物。抗病毒藥物的例子包括磺胺，例如磺胺甲基異惡唑、磺胺嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶和磺胺鄰二甲氧嘧啶；二氫葉酸還原酶抑制劑，例如甲氧芐氨嘧啶、bromodiaprim和三甲曲沙；青霉素；頭孢菌素；喹諾酮羧酸及其稠合的異噻唑類似物。
本發明的另一方面涉及抑制高等生物細胞或微生物的生長或增殖的治療方法，該方法包括向宿主施用有效量的本發明的化合物。本發明的化合物對治療哺乳動物宿主(例如人類宿主)和鳥類宿主特別有用。一個特別優選的治療方法包括向宿主施用可有效抑制GARFT的劑量的本發明的化合物。
在此記載的許多抗增殖化合物及其可藥用的鹽可以用于本發明的治療方法。這些化合物可以以含有上述稀釋劑或載體的可藥用組合物的形式進行給藥。
組合物的劑量至少含有有效量的活性化合物，并且優選由一個或多個藥物劑量單位組成。“有效量”是足以抑制葉酸的代謝途徑并由此產生有益效果的量，例如通過施用一個或多個藥物劑量單位。
用于脊椎動物宿主的示范性每日劑量包括每公斤宿主至多1克活性化合物的劑量，優選每公斤宿主體重0.5克，更為優選100毫克，最為優選大約50毫克或更少。選定的劑量可以通過任何適當的給藥方法，包括局部給藥，例如膏或霜；口服；直腸給藥，例如栓劑；通過注射的胃腸外給藥；或通過陰道內、鼻內、支氣管內、耳內或眼內浸出的持續給藥，向溫血動物或哺乳動物(例如需要通過抑制葉酸代謝途徑進行治療的病人)進行給藥。
本發明的化合物可以產生抗增殖、抗菌、抗寄生蟲、抗牛皮癬、抗原生動物、抗球蟲、抗炎、免疫抑制及抗真菌效果中的一種或多種效果。該化合物對于患有腫瘤的脊椎動物產生抗腫瘤效果特別有用。
發明詳述具體地講，本發明涉及結構式I的抗增殖化合物
其中A是O、S或Se；X是取代或未取代的C1-C3烷基、取代或未取代的C2-C3烯基、取代或未取代的C2-C3炔基、取代或未取代的氨基、硫或氧；Y是O、S或NH；B是氫或鹵素(F、Cl、Br或I)；C是氫、鹵素或取代或未取代的C1-C6烷基；并且R1和R2彼此獨立的是氫或與相連的CO2一起形成易于水解的酯基的基團，例如C1-C6烷基。本發明進一步涉及結構式I的化合物的可藥用的鹽。本發明還涉及制備這些化合物的中間體。
盡管結構式I的化合物是以4-氧代的形式表示的，并且在整個說明書中也是以這種形式提到該化合物，但該羰基基團與相應的4-羥基基團以互變異構的平衡存在。因此，應當理解術語“結構式I的化合物”意味著以結構描述的4-氧代以及互變異構的4-羥基形式。因此，本發明還涉及結構式I所描述的4-羥基互變異構體的可藥用的鹽。
當X或C是取代的基團時，優選的取代基包括C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、芳基、鹵素、氨基、羥基、硝基、巰基、單環的碳環、單環的雜環、稠合及非稠合的多環碳環、稠合及非稠合的多環雜環、羥基C1-C6烷基及C1-C6烷氧基C1-C6烷基。
優選X是CH2、CH2CH2、NH、氧、硫、CH(CH2OH)、或NCH3。優選Y是S或O。優選B是氫。優選C是氫或CH3。優選R1和R2是彼此獨立地選自氫、C1-C6烷基、羥烷基、烷芳基和芳烷基，最為優選的是選自氫和C1-C2烷基。當A和Y均是硫并且X是CH2時特別優選。
結構式I的化合物可用作GARFT抑制劑。其中的R1和R2均是氫的結構式I的化合物是特別有效的抗腫瘤或抗增殖藥物。其中的R1和R2均是與相連的CO2形成易于水解的酯基的基團(優選為乙基)的結構式I的化合物，是可以形成該化合物的游離谷氨酸形式的有用的中間體，可以在體內水解從而起到前藥的作用。
本發明的可藥用的鹽包括，例如本發明的谷氨酸化合物的堿金屬鹽、堿土金屬鹽、其它無毒的金屬鹽、以及銨鹽和取代的銨鹽。鹽的例子包括，游離酸化合物的鈉、鉀、鋰、鈣、鎂、吡啶和取代吡啶鹽。
本發明的化合物可以如下進行制備。制備結構式I的化合物(其中X是CH2)的一個有用的起始原料是結構式II的化合物
其中B、C和X如上結構式I所定義；D是Cl、Br或I；R6是氫或與相連的CO2一起形成易于水解的酯基的基團。優選D是溴或碘。優選R6是氫、C1-C6烷基、羥烷基、烷芳基或芳烷基，更為優選氫或C1-C2烷基。
將結構式II的化合物與結構式III的化合物反應
其中R3是取代或未取代的C1-C6烷基、或三取代的甲硅烷基。優選R3是CH2OH或三甲基甲硅烷基。
結構式II和III的化合物的反應在適當的過渡金屬催化劑(優選鈀或鎳)和非親核性輔助堿(優選取代的胺)的存在下、在溶劑中進行，在所述溶劑中，至少一種反應物在反應條件下是至少部分可溶的，足以生成結構式IV的化合物
其中B、C和Y如上結構式I所定義；R6如上結構式II所定義；R3如上結構式III所定義。
當R3是三取代的甲硅烷基時，優選用親核性的堿(例如碳酸鉀的甲醇或乙醇溶液)或氟化物鹽(例如氟化鉀、氟化銫或四丁基氟化銨)，在對至少一種反應物是至少部分可溶的溶劑中(例如甲醇、二甲基甲酰胺、乙醇、二甲基乙酰胺、二甲基亞砜或異丙醇)將硅烷基脫除，生成結構式V的化合物
其中B、C和Y如上結構式I所定義；R6如上結構式II所定義。
將結構式V的化合物與親核試劑(優選為N-保護的甘氨酸(glycinal)，更為優選N-叔丁氧羰酰基甘氨酸或二-N-叔丁氧羰酰基甘氨酸)，在堿性條件下用非親核性的堿(優選二-三甲基甲硅烷基氨基鋰、二-三甲基甲硅烷基氨基鉀、二-三甲基甲硅烷基氨基鈉或二異丙基氨基鋰)在低溫下(優選從-90℃至25℃)、在對至少一種反應物是至少部分可溶的適當溶劑(優選四氫呋喃、乙醚或二噁烷)中反應，生成結構式VI的化合物
其中B、C和Y如上結構式I所定義；R6如上結構式II所定義；R4和R5彼此獨立的是氫或易于脫除的氮-保護基。優選R4和R5是氫、叔丁氧羰基、芐氧羰基或芐基。
然后將結構式VI的化合物還原，優選用氫氣在適當的金屬催化劑的存在下還原，制得結構式VII的化合物
其中B、C和Y如上結構式I所定義；R6如上結構式II所定義；R4和R5如上結構式VI所定義。
然后將結構式VII的化合物與酰化或磺酰化試劑(優選甲磺酰氯或對甲苯磺酰氯)在非親核性堿(優選三乙胺或二異丙基乙基胺)的存在下、在對至少一種反應物是至少部分可溶的適當溶劑中反應，產生活化的羥基。將該活化的羥基用適當的親核試劑(優選硫代乙酸鹽，更為優選硫代乙酸鉀)取代，生成結構式VIII的化合物
其中A、B、C和Y如上結構式I所定義；R6如上結構式II所定義；R4和R5如上結構式VI所定義；Ac是酰基，優選乙酰基。
或者，將結構式VII的化合物用三苯膦、氮雜二羧酸二乙酯或二甲酯、和酸性親核試劑(優選硫代乙酸)，在適當的溶劑中經一步化學反應轉變成結構式VIII的化合物。
將結構式VIII的化合物用親核性的堿(優選碳酸鉀、碳酸鈉、氫氧化鈉或氫氧化鉀)在醇性溶劑(優選甲醇、乙醇或異丙醇)中，在烷基化試劑(優選氯代丙二酸二甲酯或二乙酯)的存在下處理，制得結構式IX的化合物
其中A、B、C和Y如上結構式I所定義；R6如上結構式II所定義；R4和R5如上結構式VI所定義。
將結構式IX的化合物在適當的條件下處理以部分或全部脫除R4和R5保護基，制得結構式X的化合物
其中A、B、C和Y如上結構式I所定義；R6如上結構式II所定義。當保護基是叔丁氧羰基(t-BOC)時，脫除該基團的條件優選是用三氟乙酸處理，然后中和以制備結構式X的化合物。
將結構式X的化合物與烷基化試劑(優選氧鎓四氟硼酸三甲酯或三乙酯)在適當的溶劑(優選二氯甲烷)中反應，生成內酰亞胺醚中間體。將該內酰亞胺醚中間體與胍在醇性溶劑(優選甲醇、乙醇或異丙醇)中反應，生成結構式XI的化合物
其中A、B、C和Y如上結構式I所定義；R6如上結構式II所定義。
或者，通過將結構式X的化合物與硫醇化試劑(優選P2S5或2，4-二(4-甲氧苯基)-1，3-二硫代-2，4-二磷烷(phosphetane)-2，4-二硫醚)反應生成硫代內酰胺中間體，然后用烷基化試劑(優選碘甲烷或氧鎓四氟硼酸三甲酯或三乙酯)將其烷基化，然后與胍在醇性溶劑(優選甲醇、乙醇或異丙醇)中反應，生成結構式XI的化合物。
將結構式XI的化合物在堿性條件下水解，生成結構式XII的化合物
其中A、B、C和Y如上結構式I所定義。當結構式XI的化合物中的R6是氫時，則無需進行水解反應，結構式XI的化合物如下所述進行肽的偶聯。
結構式XII的化合物(或結構式XI的化合物，其中R6是氫)為游離的羧酸形式，可以通過本領域技術人員公知的方法與谷氨酸二酯的鹽酸鹽進行肽的偶聯，生成結構式XIII的二酯
其中A、B、C和Y如上結構式I所定義；R1和R2彼此獨立的是與相連的CO2形成易于水解的酯基的基團，例如C1-C6烷基、羥烷基、烷芳基或芳烷基。
最后，如需要，將結構式XIII的化合物水解為結構式I的游離的谷氨酸形式(R1和R2均是氫)。
結構式I的化合物(其中X是除CH2之外的基團)可以用結構式XIV的烯制備
其中B、C和Y如上結構式I所定義，X是如上結構式I所定義的除CH2之外的基團，R6如上結構式II所定義。
當X是硫、氧、取代或未取代的氨基時，結構式XIV的化合物通過將結構式XV的化合物烷基化來制備
其中B、C和Y如通式I定義；X是硫、氧或者取代或未取代氨基；R6如通式II定義。可用烯丙基鹵完成烷基化反應，優選烯丙基溴在非親核性堿(優選三乙胺或二異丙基乙胺)存在下而得通式XIV化合物。
當X是取代或未取代的C1-C2烷基(CH2除外)、取代或未取代的C2-C3鏈烯基或取代或未取代的C2-C3炔基時，通式XIV化合物是通過下式XVI醛的烯化作用而制備的
其中B、C和Y如通式I定義；X是取代或未取代的C1-C2烷基(CH2除外)、取代或未取代的C2-C3鏈烯基或取代或未取代的C2-C3炔基。通過ChuanShih等在藥物化學雜志第35卷(1992)，1109-1116中描述的類似方法制備通式XVI醛。用亞甲基轉移劑(優選亞甲基-三苯基正膦)完成該醛的烯化作用。
將通式XIV化合物與二羥基化試劑(優選四氧化鋨)在適當氧化劑(優選甲基嗎啉-N-氧化物)存在下反應而得通式XVII化合物
其中B、C和Y如通式I定義；X如通式I定義，只是不為CH2；R6如通式II定義。
將通式XVII化合物與磺酰化試劑(優選對苯甲磺酰氯或甲磺酰氯)在非親核堿(優選三乙胺或二異丙基乙胺)存在下反應制備中間體單磺酰化合物。將該中間體與強堿(優選氫化鈉)反應而得通式XVIII化合物
其中B、C、X、Y和R6如通式XVII定義。
將通式XVIII的環氧化物與含氮親核試劑(優選疊氮化鈉)在中度Lewis酸催化劑(優選高氯酸鋰或高氯酸鎂)存在下反應而得中間體疊氮化醇。優選將此中間體與氫氣在金屬催化劑存在下還原，然后用適當氮保護基(優選叔丁氧羰基、芐氧羰基或芐基)保護而得通式VII’化合物
其中B、C、X、Y和R6如通式XVII定義；R4和R5如通式VI定義。
然后將通式VII’化合物與酰化劑或磺酰化劑(優選甲磺酰氯或對甲苯磺酰氯)在非親核堿(優選三乙胺或二異丙基乙胺)存在下于適當溶劑(至少一種反應物至少是部分可溶于其中)中反應而得活化羥基。用適當親核試劑(優選硫代酸鹽，更優選硫代乙酸鹽)取代活化羥基而得通式VIII’化合物
其中A如通式I定義；B、C、X、Y和R6如通式XVII定義；Ac是酰基，優選乙酰基。
另外，可用三苯膦、氮雜二羧酸二乙酯或二甲酯和酸性親核試劑(優選硫代乙酸)在適當溶劑中將通式VII’化合物一步轉化為通式VIII’化合物。
用親核堿(優選碳酸鉀、碳酸鈉、氫氧化鈉或氫氧化鉀)在適當醇溶劑(優選甲醇、乙醇或異丙醇)中在烷基化試劑(優選氯代丙二酸二甲酯或二乙酯)存在下處理通式VIII’化物而得通式IX’化合物
其中A如通式I定義；B、C、X、Y和R6如通式XVII定義；R4和R5如通式VI定義。
在適于除去R4和R5保護基其一或兩者的條件下處理通式IX’化合物而
其中A如通式I定義；B、C、X、Y和R6如通式XVII定義。當保護基為叔丁氧羰基時，除去該基團的條件優選是先用三氟乙酸處理，然后中和而得X’化合物。
將通式X’化合物與烷化劑(優選四氟硼酸三甲基氧鎓或四氟硼酸三乙基氧鎓)在適當溶劑(優選二氯甲烷)中反應而形成中間體內酰亞胺醚。將該中間體內酰亞胺醚與胍在醇溶劑(優選甲醇、乙醇或異丙醇)中反應而形成XI’化合物
其中A如通式I定義；B、C、X、Y和R6如通式XVII定義。
另外，將通式X’化合物與硫醇試劑(優選P2S5或2，4-二(4-甲氧基苯基)-1，3-二硫-2，4-二膦烷-2，4-二硫化物)反應形成硫內酰胺中間體而使通式X’化合物轉化為通式XI’化合物。然后將其先用烷化劑(優選甲基碘或四氟硼酸三甲基氧鎓或四氟硼酸三乙基氧鎓)然后用胍在醇溶劑(優選甲醇、乙醇或異丙醇)中烷化而得通式XI’化合物。
在堿性條件下將通式XI’化合物水解而形成通式XII’化合物
其中A如通式I定義；B、C、X、Y和R6如通式XVII定義。當通式XI’化合物中R6是氫時，則不必進行水解反應，然后將通式XI’化合物如下進行肽連接。
通過本領域專業人員熟知的方法用谷氨酸二酯鹽酸鹽將游離羧酸形式的通式XII’化合物(或者其中R6是氫的通式XI’化合物)進行肽連接而形成通式XIII’二酯
其中A如通式I定義；B、C、X和Y如通式XVII定義；R1和R2各自獨立地與所連接的CO2形成易于水解的酯基，其可為如C1-C6烷基、羥基烷基、烷基芳基或芳基烷基。
最后，如果需要游離酸形式，可將通式XIII’化合物水解而得R1和R2為H的通式I化合物。
通式I優選的化合物包括(4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氫-3H-嘧啶并[5，4-6][1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-噻吩基氨基-L-谷氨酸)二乙酯；4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氫-3H-嘧啶并[5，4-6][1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-噻吩基氨基-L-谷氨酸；4-[3-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氫-3H-嘧啶并[5，4-6][1，4]噻嗪-6-基)-丙基]-2，5-噻吩基氨基-L-谷氨酸；4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氫-3H-嘧啶并[5，4-6l[1，4l噻嗪-6-基)-乙基]-3-甲基-2，5-噻吩基氨基-L-谷氨酸；以及4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氫-3H-嘧啶并[5，4-6][ 1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-呋喃基氨基-L-谷氨酸。
本發明化合物含有一個或多個手性中心。本發明包括了外消旋混合物和非對映體以及光學活性化合物，例如基本上不含其它光學異構體的化合物，所述光學活性化合物可通過本領域專業人員已知的方法獲得。
通式I優選化合物的詳細合成方法如下實施例所述。實施例4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氫-3H-嘧啶并[5，4-6][1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-噻吩基氨基-L-谷氨酸(化合物1)
5-溴代-2-噻吩甲酸甲酯2的制備
按照S.Gronowitz在Ark.Kemi 8，1995，87和S.O.Lawesson在Ark.Kemi 11，1957，337中描述的方法制備化合物2(CAS Reg.No.[62224-19-5])。
5-乙炔基-2-甲酸甲酯基噻吩3的制備
在攪拌下的5克(22.7毫摩爾)溴化物3、160毫克(0.23毫摩爾)氯化三苯膦鈀(II)和65毫克(0.34毫摩爾)碘化亞銅的75毫升二乙胺溶液中加入4.8毫升(34毫摩爾)三甲基甲硅烷乙炔。于25℃攪拌所得溶液。18小時后，減壓除去溶劑，將粗殘余物溶于300毫升乙醚中，用100毫升1N鹽酸和100毫升飽和碳酸氫鹽溶液提取。干燥(硫酸鈉)有機層，減壓除去溶劑。將粗殘余物在硅膠上進行閃式色譜，用5％乙醚/己烷洗脫而得4.4克(81％產率)的黃色固體狀甲硅烷基保護的產物。將該產物直接用于下一步驟。
在4.4克(18.5毫摩爾)上述甲硅烷基保護的乙炔50毫升二甲基甲酰胺(DMF)溶液中加入3.3克(35.2毫摩爾)一水氟化鉀。在25℃15分鐘后，將混合物倒入500毫升乙醚中，用100毫升水提取四次(4×100毫升水)。干燥(硫酸鈉)有機溶液，減壓除去溶劑。將粗殘余物在硅膠上進行閃式色譜，用10％乙醚/己烷洗脫而得2.65克(86％產率)的橙色固體狀所需產物3。 NMR(CDCl3)δ3.45(s，1H)，3.88(s，3H)，7.22(d，1H，J＝3.5Hz)，7.65(d，1H，J＝3.5Hz).
元素分析C8H6SO2理論值C，57.81；H，3.64；S，19.29實測值C，57.91；H，3.71；S，19.18。
也可用另一方法如下除去甲硅烷基。在攪拌下的3.7克(0.02摩爾)無水碳酸鉀的700毫升甲醇懸浮液中加入如上制備的59.7克甲硅烷基乙炔固體。于35℃攪拌該懸浮液2小時，然后蒸發掉甲醇。將殘余物加到50毫升水中，用3×150毫升乙醚提取，干燥(硫酸鈉)合并的有機部分并蒸發。將粗殘余物在硅膠上進行閃式色譜，用7％乙醚/己烷洗脫而得98％產率(38.72克)的所需產物3。
N-(叔丁氧羰基)-甘氨酸4的制備
于-78℃在攪拌下的2克(12.4毫摩爾)N-(叔丁氧羰基)-2-羥基-乙胺(從Sigma Chemicals獲得)的80毫升二氯甲烷溶液中加入1.3毫升(18.6毫摩爾)二甲基亞砜(DMSO)和1.2毫升(13.7毫摩爾)草酰氯。5分鐘后，加入5.4毫升(38.4毫摩爾)三乙胺，使溶液升溫至25℃。將該混合物倒入200毫升乙醚中，用100毫升水、100毫升0.5N HCl和100毫升飽和碳酸氫鹽溶液提取。干燥(硫酸鈉)有機部分，減壓除去溶劑。將粗醛溶于100毫升苯中，于減壓下再次除去溶劑。將此不穩定的粗產物立即用于下一步驟。
4-N-(叔丁氧羰基)-3-羥基-1-(2-甲酯基-5-噻吩)-丁炔5的制備
-78℃時，在1.7克(10.2毫摩爾)乙炔3的10毫升無水四氫呋喃(THF)溶液中加入14.3毫升(14.0毫摩爾)1M的二-三甲基甲硅烷酰胺的THF溶液。10分鐘后，滴加入上述粗醛4的5毫升無水THF溶液。與-78℃攪拌反應10分鐘，經20分鐘升溫至0℃。向其中加入5毫升飽和氯化銨水溶液。將該混合物倒入200毫升乙醚中，用100毫升水和50毫升飽和氯化鈉溶液洗滌。干燥(硫酸鈉)有機層，減壓除去溶劑。將粗殘余物在硅膠上進行閃式色譜，用10-40％乙酸乙酯/己烷洗脫而得0.96克(29％)淡黃色油狀所需醇5。
NMR(CDCl3)δ1.46(s，9H)，3.38 and 3.58(AB，2H，J＝3，7Hz)，3.88(s，3H)，4.71(dt，1H，J＝2.9，5.2Hz)，5.05(brs，1H)，7.15(d，1H，J＝3.9Hz)，7.64(d，1H，J＝3.9Hz).IR(neat)2978.3，1729.5，1685，1523，1452，1368，1286，1167，1098，959，822，750.4cm-1.高分辨率質譜，計算值C15H19NO5SM+Cs+，458.0038.實測值458.0051.
5-[(4-N-(叔丁氧羰基)-氨基-3-羥基)-丁基]-噻吩基-2-甲酸甲酯6的制備
在攪拌下的940毫克(2.89毫摩爾)上述乙炔5的50毫升乙酸乙酯溶液中加入320毫克5％Pd/C。將該混合物置于40psi下的氫氣中，于25℃攪拌17小時。通過硅藻土過濾混合物，減壓除去溶劑。將粗殘余物在硅膠上進行閃式色譜，用20％乙酸乙酯/二氯甲烷洗脫而得800毫克(84％產率)黃色油狀所需醇。NMR(CDCl3)δ1.44(s，9H)，1.81(m，2H)，2.28(brs，1H)，2.99(m，2H)，3.10 and 3.29(AB，2H，J＝3，6.9Hz)，3.74(m，1H)，3.86(s，3H)，4.89(brs，1H)，6.82(d，1H，J＝3.7Hz)，7.63(d，1H，J＝3.7Hz).計算值C15H23NO5SC，54.69；H，7.04；N，4.25；S，9.73.實測值C，54.79；H，7.02；N，4.29；S，9.63.
另一制備醇6的方法使用如下二-叔丁氧羰基烯丙胺14。
二-叔丁氧羰基烯丙胺14的制備
在57.10克(1.0摩爾)的烯丙胺和1.2克(0.01摩爾)的二甲基氨基吡啶(DMAP)的500毫升乙腈溶液中加入220克(1摩爾)(t-BOC)2O的100毫升乙腈溶液，將所得混合物攪拌6小時。用甲苯(100毫升)稀釋反應混合物，于60℃減壓蒸發溶劑。將所得油再次溶于乙腈(40毫升)中，加入1.2克(0.01摩爾)DMAP，在此溶液中緩慢加入220克(1摩爾)(t-BOC)2O的100毫升乙腈溶液。于60℃攪拌反應混合物12小時，與60℃減壓蒸發溶劑，加入稀碳酸氫鈉(100毫升)。將其用3×150毫升二氯甲烷提取，合并的有機層用鹽水洗滌，干燥(硫酸鈉)并蒸發。將粗殘余物在硅膠上進行閃式色譜，用5-20％乙酸乙酯/己烷梯度洗脫而得156.9克(63％產率)澄清晶狀固體所需產物14。(m.p.43-44℃)1H NMR(CDCl3)δ(ppm)1.5(s，18H)，4.18(dd，2H，J＝15Hz，J＝1Hz)，5.14(ddd，2H，J＝15Hz，J＝10Hz，J＝1Hz)，5.85(ddt，2H，J＝10Hz，J＝5Hz，J＝1Hz).IR(KBr)2978，2935，2860，1724，1689，1342，1130cm-1.計算值C13H23NO4C，60.68；H，9.01；N，5.44.實測值C，60.78；H，9.04；N，5.50.1-(二叔丁氧羰基氨基)-2-乙醛15的制備
在-78℃將0.60克(2.34毫摩爾)二-叔丁氧羰基烯丙胺14的20毫升二氯甲烷溶液臭氧化(40伏特，500安培，1.01/分鐘，氧氣@3psi)直至藍色穩定，加入10毫升二甲硫醚，于25℃攪拌該混合物14小時。將該混合物加到稀鹽水中，用二氯甲烷提取(3×50毫升)，干燥(硫酸鈉)有機部分并蒸發。閃式硅膠色譜后得到603毫克(99％產率)的澄清晶狀固體所需產物15(熔點37-39℃)。
1H NMR(CDCl3)δ(ppm)1.50(s，18H)，4.38(s，2H)，9.55(s，1H).IR(KBr)2984，2935，2724，1792，1734，1699，1362，1153cm-1.計算值C12H21NO5C，55.58；H，8.16；N，5.40.實測值C，55.20；H，8.19；N，5.19.
5-[(4-N-(叔丁氧羰基)-氨基-3-羥基)-丁基]-噻吩基-2-甲酸甲酯6的制備-78℃下在9.64克(59毫摩爾)5-乙炔基-2-甲酯基噻吩3的THF(250毫升)溶液中加入65.6毫升(60毫摩爾)六甲基二硅烷疊氮化鋰(LiHMDS)，于-78℃攪拌該混合物2小時。將15.6克(60毫摩爾)1-(二叔丁氧羰基氨基)-2-乙醛15的THF(40毫升)溶液加到反應混合物中，將反應混合物于-78℃攪拌8小時。加入3.4毫升(60毫摩爾)乙酸的甲醇(10毫升)溶液驟冷，攪拌混合物10分鐘升溫至0℃，加入水(60毫升)。用乙酸乙酯提取(3×100毫升)，有機提取物用稀碳酸氫鈉洗滌并干燥(硫酸鈉)。減壓除去溶劑得約50毫升。在此所得殘余物中加入乙酸乙酯(125毫升)，將該溶液加到含有7.38克(30重量％的乙炔起始物)5％披鈀碳的Parr瓶中，于55psi氫氣中氫化24小時。通過硅藻土過濾粗氫化產物，濾餅用甲醇(100毫升)和乙酸乙酯(100毫升)洗滌。減壓蒸發溶劑，通過硅膠過濾粗殘余物，用50％乙酸乙酯的己烷溶液洗脫，蒸發溶劑。將殘余物溶于20毫升甲醇-苯(50毫升)共沸物中，再溶于無水甲醇(20毫升)中。將該混合物加到新制的60毫升(2M)甲醇鈉的甲醇溶液中。攪拌反應混合物45分鐘，加入稀鹽酸(0.1M，50毫升)，用乙酸乙酯提取(3×75毫升)。合并有機部分，用pH 7的緩沖液(1M)洗滌，干燥(硫酸鈉)并蒸發。將粗殘余物在閃式硅膠上進行色譜，用40％乙酸乙酯/己烷洗脫而得9.32克(48％產率)的所需產物6。
5-[(4-N-(叔丁氧羰基)-氨基-3-乙酰硫代)-丁基]-2-噻吩甲酸甲酯7的制備
0℃在攪拌下的9.26克(28.1毫摩爾)醇6的100毫升THF溶液中加入5.9毫升(42毫摩爾)三乙胺(TEA)和2.4毫升(31毫摩爾)甲磺酰氯。20分鐘后，加入100毫升DMF和12.8克(110毫摩爾)硫代乙酸鉀，將所得溶液升溫至25℃。3天后，將混合物倒入500毫升水中，用800毫升乙醚提取。有機層用200毫升水、200毫升1N鹽酸、200毫升飽和碳酸氫鹽溶液和100毫升飽和氯化鈉溶液洗滌。干燥(硫酸鎂)有機層，減壓除去溶劑。將粗殘余物在硅膠上進行閃式色譜，用25％乙酸乙酯/己烷洗脫后而得10.3克(95％產率)黃色油狀所需硫代乙酸鹽7。
NMR(CDCl3)δ1.44(s，9H)，1.91 and 2.04(ABm，2H)，2.37(s，3H)，2.96(m，2H)，3.36(m，2H)，3.61(m，1H)，3.86(s，3H)，4.74(brs，1H)，6.79(d，1H，J＝3.6Hz)，7.62(d，1H，J＝3.6Hz).IR(neat)3366，2976.4，1713，1520，1462.1，1366，1290.5，1267.3，1169，1098，752，631cm-1.高分辨率質譜，計算值C17H25NO5S2M+Cs+，520.0229.實測值520.0240.
5-[(4-N-(叔丁氧羰基)-氨基-3-(二甲基丙二酰基)硫代)-丁基]-2-噻吩甲酸甲酯8的制備
0℃在10.2克(26毫摩爾)攪拌下的上述硫代乙酸鹽7的200毫升無水甲醇溶液中加入7.2克(52毫摩爾)碳酸鉀和3.7毫升(29毫摩爾)氯代丙二酸二甲酯。3小時后，將混合物倒入500毫升水中，用乙醚提取(3×500毫升)。合并的有機層用500毫升水和200毫升飽和氯化鈉溶液洗滌，干燥(硫酸鎂)。減壓除去溶劑，將粗殘余物在硅膠上進行閃式色譜，用30％乙酸乙酯/己烷洗脫而得11.46克(93％產率)淡黃色油狀所需硫醚8。
NMR，(CDCl3)δ1.44(s，9H)，1.85 and 2.00(ABm，2H)，3.03 (m，3H)3.30(m，2H)，3.80(s，6H)，3.86(s，3H)，5.10(brs，1H)，6.82(d，1H，J＝3.8Hz)，7.63(d，1H，J＝3.8Hz).IR(neat)3442，2974，2955，1734，1713，1512，1460，1435，1366，1291，1267，1167，1098，1022，752cm-1.高分辨率質譜，計算值C20H29NO8S2M+Cs+，608.0389.實測值608.0370.
6-[(5-甲酯基噻吩-2-基)-乙基]-2-甲酯基-3-氧代-3，4，5，6-四氫-[1，4]-噻嗪9的制備
0℃在攪拌下的470毫克(0.99毫摩爾)上述硫醚8的12毫升二氯甲烷溶液中加入4毫升三氟乙酸(TFA)。1.5小時后，將混合物倒入50毫升飽和碳酸氫鈉溶液中并用二氯甲烷提取(4×100毫升)。減壓除去溶劑，將粗殘余物溶于10毫升甲醇中。于25℃攪拌1.5小時后，減壓除去溶劑，將粗殘余物在硅膠上進行閃式色譜，用40％乙酸乙酯/二氯甲烷洗脫而得298毫克(88％產率)無色油狀所需內酰胺9。
NMR(CDCl3)δ1.94(m，2H)，3.01(m，2H)，3.4-3.7(m，4H)，3.80 and 3.82(s，3H)，3.87(s，3H)，6.25(brs，1H，)，6.83(d，1H，J＝3.7Hz)，7.64(d，1H，J＝3.7Hz).IR(KBr)2951，1732，1669，1462，1294，1267，1194，1157，1098，1005，752cm-1.計算值C14H17NO5S2C，48.96；H，4.99；N，4.08；S，18.67.實測值C，49.06；H，4.93；N，4.09；S，18.60.[1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-噻吩甲酸甲酯10的制備
在攪拌下的上述內酰胺9的150毫升無水二氯甲烷溶液中即刻加入1.06克(7.2毫摩爾)四氟硼酸三甲基氧鎓。于25℃攪拌該溶液6小時。將所得混合物倒入50毫升10％碳酸鉀水溶液中，用二氯甲烷提取(3×200毫升)。干燥(硫酸鎂)合并的有機層，減壓除去溶劑。將所得產物直接用于下一步驟。
將1.58克(16.6毫摩爾)無水鹽酸胍置于分液瓶中。向其中加入600毫升無水甲醇。將干燥氬氣通入溶液中10分鐘，然后加入926毫克(17.1毫摩爾)無水甲醇鈉。將上述制備的粗內酰胺醚的20毫升甲醇溶液經套管加到所得混合物中。在氬氣下回流溶液20小時。用1N鹽酸調節PH值至4，減壓除去溶劑。將粗殘余物溶于500毫升氯仿中，用2×100毫升水洗滌。干燥(硫酸鎂)合并的有機層，減壓除去溶劑。將粗殘余物在硅膠上進行閃式色譜，用5-10％甲醇/二氯甲烷洗脫而得413毫克灰白色固體。然后將此產物溶于25毫升熱甲醇中，經18小時緩慢冷卻至4℃。過濾收集固體而得180毫克(9％產率)淡黃色固體狀所需嘧啶酮。
NMR(d6-DMSO)δ1.72(m，1H)，1.88(m，1H)，2.8-3.22(m，4H)，3.50(dt，1H，J＝2，8Hz)，5.99(brs，2H)，6.64(brs，1H)，6.98(d，1H，J＝3.8Hz)7.62(d，1H，J＝3.8Hz)，10.02(brs，1H).高分辨率質譜，計算值C14H16N4O3S2M+Na+，375.0562.實測值375.0550.
也可如下制備嘧啶酮10。在攪拌下的500毫克(1.46毫摩爾)內酰胺9的20毫升無水THF溶液中加入648毫克(1.60毫摩爾)Lawesson’s試劑(2，4-二(4-甲氧基苯基)-1，3-二硫-2，4-二磷烷-2，4-二硫醚)。于25℃攪拌混合物20小時后，將其倒入50毫升飽和碳酸氫鹽溶液中，用2×200毫升乙酸乙酯提取。合并的有機層用50毫升飽和氯化鈉溶液洗滌，干燥(硫酸鎂)，減壓除去溶劑。將粗硫內酰胺在硅膠上進行閃式色譜，用8％乙酸乙酯/二氯甲烷洗脫而得525毫克相應的硫內酰胺11
將該產物直接用于下一步驟。
在525毫克硫內酰胺11的10毫升無水THF和10毫升無水甲醇混合物中加入1.6毫升1N氫氧化鈉。向其中加入0.1毫升(1.6毫摩爾)甲基碘而得甲基化的硫內酰胺，不必純化而將其用于下步。將1.39克(14.6毫摩爾)無水鹽酸胍置于分液瓶中。向其中加入300毫升無水甲醇。將干燥氬氣通入溶液10分鐘，然后加入796毫克(14.7毫摩爾)無水甲醇鈉。經套管向所得混合物中加入如上制備的粗甲基化硫內酰胺。在氬氣下回流溶液48小時。用1N鹽酸調節PH值至4，減壓除去溶劑。將粗殘余物溶于500毫升氯仿中，用2×100毫升水洗滌。干燥(硫酸鎂)有機層，減壓除去溶劑。將粗殘余物在硅膠上進行閃式色譜，用5-10％甲醇/二氯甲烷洗脫。然后將產物溶于20毫升熱甲醇中，經18小時冷卻至4℃。過濾收集得131毫克(9％產率)所需嘧啶酮10。[1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-噻吩甲酸12的制備
在180毫克(0.51毫摩爾)嘧啶酮10中加入5毫升1N氫氧化鈉水溶液。于25℃攪拌所得溶液20小時。冷卻至0℃后，用1N鹽酸調節PH值至2。濾除褐色固體，用水洗滌，真空干燥得111毫克(64％產率)淡褐色固體狀所需酸12。NMR(d6-DMSO)δ1.72(m，1H)，1.92(m，1H)，2.78-3.68(m)，6.07(brs，2H)，6.68(brs，1H)，6.92(d，1H，J＝3.7Hz)，7.52(d，1H，J＝3.7Hz)，10.12(brs，1H)，12.8 9(brs，1H).高分辨率質譜，計算值C13H14N4O3S2M+，338.0507.實測值338.0517.
4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氫-3H-嘧啶并[5，4-6][1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-噻吩基氨基-L-谷氨酸二乙酯13的制備
在攪拌下的110毫克(0.33毫摩爾)上述酸12的5毫升無水DMF溶液中加入48毫克(0.36毫摩爾)1-羥基苯并三唑水合物、62微升(0.36毫摩爾)二異丙基乙胺、86毫克(0.36毫摩爾)谷氨酸二乙酯鹽酸鹽和106毫克(0.36毫摩爾)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺甲基碘化物。于25℃氬氣下攪拌所得溶液20小時，然后倒入50毫升水。用2×150毫升乙酸乙酯提取水層。合并的有機層用3×50毫升水和10毫升飽和氯化鈉溶液反萃取，然后干燥(硫酸鎂)。減壓除去溶劑，將粗殘余物在硅膠上進行閃式色譜，用0-10％甲醇/二氯甲烷洗脫而得120毫克(71％產率)淡黃色無定形固體狀的所需酰胺13。
NMR(d6-Acetone)δ1.20(m，6H)，2.2(m，1H)，2.46(t.1H，J＝7.6Hz)，2.78(s，1H)，2.82(s，1H)，2.92-3.1(m，2H)，3.41(m，1H)，3.72(dt，1H，J＝3.0，12.7Hz)，4.02-4.2(m，4H)，4.58(m，1H)，5.90(brs，1H)，6.05(brs，1H)，6.90(d，1H，8。J＝3.8Hz)，7.58(d，1H，J＝3.8Hz)，7.78(d，1H，J＝8Hz).高分辨率質譜，計算值C22H29N5O6S2M+H+，524.1638.實測值524.1650.
4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氫-3H-嘧啶并[5，4-6][1，41噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-噻吩基氨基-L-谷氨酸1的制備在上述115毫克(0.22毫摩爾)二乙酯13中加入3毫升1N氫氧化鈉水溶液。將所得混合物于25℃攪拌14小時。冷卻至0℃后，用鹽酸水溶液調節PH值至3.5。過濾固體，用水洗滌，真空干燥而得82毫克(80％產率)灰白色固體狀的所需酸。
NMR(d6-DMSO)δ1.62-2.02(m，4H)，2.27(m，2H)，2.78-3.00(m，3H)，4.27(dd，1H，J＝6，6.8Hz)，6.00(brs，2H)，6.63(brs，1H)，6.88(d，1H，J＝3.7Hz)，7.63(d，1H，J＝3.7Hz)，8.37(d，1H，J＝7.4Hz)，10.05(brs，1H)，12.85(brs，2H).IR(KBr)3371，1700，1643，1543，1345cm-1.
高分辨率質譜C18H21N5O6S2理論值M＋H+，468.1012，實測值468.1025。元素分析C18H21N5O6S2·1.5H2O理論值C，43.71；H，4.89；N14.16；S，12.97實測值C，43.50；H4.67；N14.07；S，12.72生物學和生物化學評價GAR轉甲酰酶抑制常數的確定將Young等在生物化學23(1984)，3979-3986中的GAR-轉甲酰酶(GARFT)分析方法修飾后用于如下。反應混合物含有人GARFT催化區、0-250nM化合物1、20uM甘氨酰胺核糖核苷酸(GAR)、10或20uMN10-甲酰基-5，8-脫氮雜葉酸(FDDF)、50mMHEPES-KOH(PH 7.5)和50mMKCl。加入酶使終濃度為11nM而啟動反應，然后監測20℃在294nm的吸收增加(e294＝18.9mM-1cm-1)。
GARFT抑制常數(Ki)是由穩態催化率對抑制劑和底物濃度的依賴性所決定的。表觀Ki(Ki，app)對FDDF濃度的依賴決定了抑制類型為對FDDF競爭性抑制，由下式描述Ki，app＝Ki+(Ki/Km)[FDDF]。FDDF的Michaelis常數，即Km，獨立地由催化率對FDDF濃度的依賴性決定。Km和Ki數據符合非線性方法的Michaelis等式，或者競爭性抑制Michaelis等式。分析從緊密結合抑制中得到的數據，將數據代入非線性方法Morrison緊密結合等式(Biochem Biophys Acta 185(1969)，269-286)而得Ki。
細胞系使用的細胞系及其起源列于表1中。每一細胞系的生長狀況和培養基要求如表2所示。將所有的培養基保持在37℃，5％空氣-二氧化碳的潮濕保溫箱中。
體外生長抑制在10mM碳酸氫鈉水溶液中制備抑制劑儲備液，于-20℃以1毫升等分試樣保存以用于細胞培養實驗。通過修飾后的Mosmann方法(J.Immuol.Methods 65(1983))測量細胞生長抑制。
在含有滲析后小牛血清(Hyclone Laboratories Inc.，Logan，UT)的新制RPMI生長培養基(Mediatech，washington，DC)中將每個細胞系的對數中期相細胞稀釋至18500細胞/毫升，然后等分成96孔微滴定板的2至12組。第1組填充有等體積(135毫升)的無細胞新制培養基以用作空白。然后將板置于37℃、5％空氣-二氧化碳的保溫箱中。1至4小時后，取出板，然后在12至4組中加入化合物1(10×終濃度，15毫升/孔，二等分稀釋法)。在逆向實驗中，所有的藥物溶液(終濃度175mM)中都含有次黃嘌呤(1.75mM)或AICA(1.75mM)。在每板上制備四份含有化合物1每個濃度的孔。將15毫升不含化合物1的培養基加到板1組的孔中。然后將細胞放入保溫箱中，直至完成培養期。L1210和L1210/CI920細胞的第3天或CCRF-CEM細胞的第5天，將溶于組織培養基中的50毫升0.8mg/ml MTT((4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑；Sigma catalog no.M2128)加到所有板的每個孔中，然后再放到保溫箱中。4小時后，取出板，在1200rpm離心7分鐘。吸掉培養基，將150毫升DMSO加到所有板中的孔中。然后于室溫暗處在渦旋混合器中緩慢混合板。于540nm在Molecular DevicesVmax動力學微板讀數器上用分光光度法測量被代謝的MTT量。通過MTT代謝測定的50％抑制細胞生長所需藥物的濃度通過內推法在對照O.D.(減空白)上及低于50％O.D.(減空白)確定。
表1用于體外研究的細胞系的組織起源和根源細胞系 根源 起源L1210 ATCC#小鼠，淋巴細胞白血病CCRF-CEMATCC#人，急性成淋巴細胞白血病#ATCC＝美國典型培養物中心表2微滴定分析中使用的培養基狀況、板密度和培養時間細胞系 培養基 DFCS 板密度培養時間濃度(％)*(細胞/孔) (天)L1210 RPMI-1640 5 2500 3CCRF-CEM RPMI-1640 102500 5DFCS濃度*＝滲析后小牛血清濃度。
表3連續(72小時)接觸后化合物1生長抑制數據化合物 GARFTKiIC50細胞培養IC50細胞培養(nM) L1210(nM)aL1210(nM)a14.5 16 4.3a平均IC50±標準偏差體內抗腫瘤活性第零天時，將6C3HED淋巴肉瘤的2mm2套針片段于腋部皮下植入到6C3H/He雌性大鼠各組。第一天開始，將試驗化合物的40％Encapsin溶液每日一次腹膜內給藥9天。對照組動物接受相同處理，只是沒有試驗化合物。下表4所示的抑制百分數是通過比較第11天對照組(僅接受稀釋劑)與接受測試化合物組的腫瘤質量計算而得的。
表4化合物劑量(mg/kg) 抑制百分數存活數1 12.5100 6/61 25 100 3/61 50 毒性0/6在第零天，將C3H/BA乳腺癌的2mm2套針片段經腋部皮下植入到6C3H/He雌性大鼠各組。從第一天開始，將試驗化合物的40％Encapsin溶液每日一次腹膜內給藥九天。除不使用試驗化合物外，對照組動物接受同樣的處理。抑制百分數是通過比較第14天對照組(僅接受稀釋劑)與接受試驗化合物組的腫瘤重量計算而得。
結果概述于表5。
表5化合物劑量(mg/kg) 抑制百分率存活數1 5 16 5/61 10 84 6/61 20 100 3/6可以對本發明的方法和產品作出各種修飾和改變，這對于本領域技術人員是顯而易見的。
如可能，本文列舉的化學基團可以被取代。在一些情況下，這種可能性通過列舉例如取代或未取代的C1-C3烷基而變得明確。
當本文的任何結構式中列舉了一個以上的R6基團時，每一個R6均可以彼此獨立地選自以上給出的可能基團。
40.根據權利要求39的化合物，其中A是硫；X’是CH2；Y是硫。
41.根據權利要求39的化合物[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氫-3H-嘧啶并[5，4-6][1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-噻吩酸。
42.如下結構式的化合物
43.根據權利要求42的光學活性的化合物。
44.根據權利要求43的化合物，具有如下結構
45.根據權利要求43的化合物，具有如下結構
權利要求
1.一種結構式I的化合物或其可藥用的鹽
其中A是氧、硫或硒；X是取代或未取代的C1-C3烷基、取代或未取代的C2-C3烯基、取代或未取代的C2-C3炔基、取代或未取代的氨基、硫或氧；Y是氧、硫或NH；B是氫或鹵素；C是氫、鹵素或取代或未取代的C1-C6烷基；并且R1和R2彼此獨立的是氫或與相連的CO2形成易于水解的酯基的基團。
2.根據權利要求1的化合物或鹽，其中X是CH2、CH2CH2、NH、氧、硫、CH(CH2OH)或NCH3。
3.根據權利要求1的化合物或鹽，其中Y是硫或氧，B是氫，C是氫或CH3。
4.根據權利要求3的化合物或鹽，其中A是硫，Y是硫，R1和R2均是氫。
5.根據權利要求4的化合物或鹽，其中X是CH2。
6.根據權利要求1的化合物或鹽，其中R1和R2彼此獨立地選自氫、C1-C6烷基、羥烷基、烷芳基和芳烷基。
7.根據權利要求6的化合物或鹽，其中R1和R2彼此獨立地選自氫或C1-C2烷基。
8.根據權利要求7的化合物或鹽，其中A是硫，Y是硫，X是CH2。
9.根據權利要求8的化合物或鹽，其中B是氫，C是氫，R1和R2均是氫。
10.根據權利要求1的化合物，該化合物選自(4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8，-四氫-3H-嘧啶并[5，4-6]-[1，4]噻嗪-6-基)-乙基]2，5-噻吩氨基-L-谷氨酸)二乙酯；4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8，-四氫-3H-嘧啶并[5，4-6]-[1，4]噻嗪-6-基)-乙基]2，5-噻吩氨基-L-谷氨酸；4-[3-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8，-四氫-3H-嘧啶并[5，4-6]-[1，4]噻嗪-6-基)-丙基]2，5-噻吩氨基-L-谷氨酸；4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8，-四氫-3H-嘧啶并[5，4-6]-[1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-3-甲基-2，5-噻吩氨基-L-谷氨酸；和4-[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8，-四氫-3H-嘧啶并[5，4-6]-[1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-呋喃氨基-L-谷氨酸。
11.一種藥物組合物，含有(i)有效量的結構式I的化合物或其藥用鹽
其中A是氧、硫或硒；X是取代或未取代的C1-C3烷基、取代或未取代的C2-C3烯基、取代或未取代的C2-C3炔基、取代或未取代的氨基、硫或氧；Y是氧、硫或NH；B是氫或鹵素；C是氫、鹵素或取代或未取代的C1-C6烷基；并且R1和R2的每一個是氫或與相連的CO2形成易于水解的酯基的基團；和(ii)可藥用的載體、賦性劑或稀釋劑。
12.根據權利要求11的藥物組合物，其中X是CH2、CH2CH2、NH、氧、硫、CH(CH2OH)或NCH3。
13.根據權利要求11的藥物組合物，其中Y是硫或氧，B是氫，C是氫或CH3。
14.根據權利要求13的藥物組合物，其中A是硫，Y是硫，X是CH2。
15.根據權利要求14的藥物組合物，其中C是氫，R1和R2均是氫。
16.一種抑制微生物或高等生物細胞的生長或增殖的方法，包括向哺乳動物或鳥類宿主施用有效量的結構式I的化合物或其藥用鹽
其中A是氧、硫或硒；X是取代或未取代的C1-C3烷基、取代或未取代的C2-C3烯基、取代或未取代的C2-C3炔基、取代或未取代的氨基、硫或氧；Y是氧、硫或NH；B是氫或鹵素；C是氫、鹵素或取代或未取代的C1-C6烷基；并且R1和R2的每一個是氫或與相連的CO2形成易于水解的酯基的基團。
17.根據權利要求16的方法，其中X是CH2、CH2CH2、NH、氧、硫、CH(CH2OH)或NCH3。
18.根據權利要求16的方法，其中Y是硫或氧，B是氫，C是氫或CH3。
19.根據權利要求18的方法，其中A是硫，Y是硫，X是CH2。
20.根據權利要求19的方法，其中C是氫，R1和R2均是氫。
21.結構式VI的化合物
其中Y是氧、硫或NH；B是氫或鹵素；C是氫、鹵素或取代或未取代的C1-C6烷基；并且R6是氫或與相連的CO2形成易于水解的酯基的基團；并且R4和R5彼此獨立的是氫或易脫除的氮保護基。
22.根據權利要求21的化合物，其中Y是硫；B是氫；C是氫；R6是氫、C1-C6烷基、羥烷基、烷芳基或芳烷基；R4和R5彼此獨立的是氫、叔丁氧羰基、芐氧羰基或芐基。
23.根據權利要求21的化合物其為4-N-(叔丁氧羰基)-3-羥基-1-(2-甲酯基-5-噻吩)-丁炔。
24.結構式VII″的化合物
其中X’是取代或未取代的C1-C3烷基、取代或未取代的C2-C3烯基、取代或未取代的C2-C3炔基、取代或未取代的氨基、硫或氧；A是氧、硫或硒；Y是氧、硫或NH；B是氫或鹵素；C是氫、鹵素或取代或未取代的C1-C6烷基；R6是氫或與相連的CO2形成易于水解的酯基的基團；并且R4和R5彼此獨立的是氫或易脫除的氮保護基。
25.根據權利要求24的化合物，其中X’是CH2；Y是硫；B是氫；C是氫；R6是氫、C1-C6烷基、羥烷基、烷芳基或芳烷基；R4和R5彼此獨立的是氫、叔丁氧羰基、芐氧羰基或芐基。
26.根據權利要求24的化合物，其為5-[(4-N-(叔丁氧羰基)-氨基-3-羥基)-丁基]-噻吩基-2-甲酸甲酯。
27.結構式VIII″的化合物
其中X’是取代或未取代的C1-C3烷基、取代或未取代的C2-C3烯基、取代或未取代的C2-C3炔基、取代或未取代的氨基、硫或氧；Y是氧、硫或NH；B是氫或鹵素；C是氫、鹵素或取代或未取代的C1-C6烷基；R6是氫或與相連的CO2形成易于水解的酯基的基團；R4和R5彼此獨立的是氫或易脫除的氮保護基；并且Ac是酰基。
28.根據權利要求27的化合物，其中X’是CH2；Y是硫；B是氫；C是氫；R6是氫、C1-C6烷基、羥烷基、烷芳基或芳烷基；R4和R5彼此獨立的是氫、叔丁氧羰基、芐氧羰基或芐基。
29.根據權利要求27的化合物，其為5-[(4-N-(叔丁氧羰酰基)-氨基-3-乙酰基硫代)-丁基]-2-噻吩甲酸甲酯。
30.結構式IX″的化合物
其中A是氧、硫或硒；X’是取代或未取代的C1-C3烷基、取代或未取代的C2-C3烯基、取代或未取代的C2-C3炔基、取代或未取代的氨基、硫或氧；Y是氧、硫或NH；B是氫或鹵素；C是氫、鹵素或取代或未取代的C1-C6烷基；每一個R6彼此獨立的是氫或與相連的CO2形成易于水解的酯基的基團；并且R4和R5彼此獨立的是氫或易脫除的氮保護基。
31.根據權利要求30的化合物，其中A是硫；X’是CH2；Y是硫；B是氫；C是氫；R6是氫、C1-C6烷基、羥烷基、烷芳基或芳烷基；R4和R5彼此獨立的是氫、叔丁氧羰基、芐氧羰基或芐基。
32.根據權利要求30的化合物其為5-[(4-N-(叔丁氧羰基)-氨基-3-(二甲基丙二酰基)硫代)-丁基]-2-噻吩甲酸甲酯。33.結構式X″的化合物
其中A是氧、硫或硒；X’是取代或未取代的C1-C3烷基、取代或未取代的C2-C3烯基、取代或未取代的C2-C3炔基、取代或未取代的氨基、硫或氧；Y是氧、硫或NH；B是氫或鹵素；C是氫、鹵素或取代或未取代的C1-C6烷基；并且每一個R6彼此獨立的是氫或與相連的CO2形成易于水解的酯基的基團。
34.根據權利要求33的化合物，其中A是硫；X’是CH2；Y是硫；B是氫；C是氫；每一個R6彼此獨立的是氫、C1-C6烷基、羥烷基、烷芳基或芳烷基。
35.根據權利要求33的化合物，其為6-[(5-甲酯基噻吩-2-基)-乙基]-2-甲酯基-3-氧代-3，4，5，6-四氫-[ 1，4]-噻嗪。
36.結構式XI″的化合物
其中A是氧、硫或硒；X’是取代或未取代的C1-C3烷基、取代或未取代的C2-C3烯基、取代或未取代的C2-C3炔基、取代或未取代的氨基、硫或氧；Y是氧、硫或NH；B是氫或鹵素；C是氫、鹵素或取代或未取代的C1-C6烷基；并且R6是氫或與相連的CO2形成易于水解的酯基的基團。
37.根據權利要求36的化合物，其中A是硫；X’是CH2；Y是硫；B是氫；C是氫；R6是氫、C1-C6烷基、羥烷基、烷芳基或芳烷基。
38.根據權利要求36的化合物，其為[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氫-3H-嘧啶并[5，4-6][1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-噻吩甲酸甲酯。
39.結構式XII″的化合物
其中A是氧、硫或硒；X’是取代或未取代的C1-C3烷基、取代或未取代的C2-C3烯基、取代或未取代的C2-C3炔基、取代或未取代的氨基、硫或氧；Y是氧、硫或NH；B是氫或鹵素；C是氫、鹵素或取代或未取代的C1-C6烷基。
40.根據權利要求39的化合物，其中A是硫；X’是CH2；Y是硫。
41.根據權利要求39的化合物，其為[2-(2-氨基-4-氧代-4，6，7，8-四氫-3H-嘧啶并[5，4-6][1，4]噻嗪-6-基)-乙基]-2，5-噻吩酸。
全文摘要
本發明涉及化合物，例如與其4-羥基互變異構體處于平衡的化合物(1)，及其可藥用的鹽。這些化合物可用作甘氨酰胺核苷酸甲酰轉移酶(GARFT)抑制劑或抗增殖藥物。本發明還涉及應用這些化合物作為GARFT抑制劑或抗增殖藥物的藥物組合物及方法。本發明還涉及用于制備這些化合物的中間體化合物。
文檔編號C07D417/06GK1159193SQ94195172
公開日1997年9月10日 申請日期1994年7月28日 優先權日1994年7月28日
發明者M·D·瓦尼, W·H·洛米尼斯, C·L·帕爾默 申請人:阿格羅尼制藥公司