專利名稱：修飾的α乳白蛋白的制作方法
技術領域：
本發明涉及在高苯丙氨酸血病人飲食中有用的修飾蛋白質。
由于遺傳原因引起的人高苯丙氨酸血病是在苯丙氨酸羥化酶PAHE.C.1.99.1.2)基因座，編碼DHPR(二氫蝶啶還原酶)的基因座和在BH4(四氫生物蝶吟)合成途徑的兩個基因座發生突變的結果。在所有高苯丙氨酸病人中，不在PHA基因座發生突變的低于3％且在高加索病人中可能近似于1％。由于PAH突變引起的高苯丙氨酸血病人中過半數的病人具有嚴重的PAH缺陷(典型的苯丙酮尿或“PKU”)。這種肝臟酶負責將苯丙氨酸轉變成酪氨酸。 如上面圖解所示，PAH缺陷導致苯丙氨酸和其有機酸代謝物在組織和血液中積累，如果不進行控制，將在嬰兒和兒童中引起嚴重的和不可逆的智力遲鈍。
全世界的PKU發病率范圍從愛爾蘭的每5,000個中1個到日本的大約1000,000人中1個。對世界范圍PKU發病率的一個保守的平均估計為每百萬生命中有50例。美國的PKU發病率大約為在所有抽查的新生兒中每10,000個中有1個。
患病的嬰兒一旦確診，在早期開始飲食治療以降低血液苯丙氨酸水平是關鍵的。治療的一般目的是使血液苯丙氨酸水平保持在1000μmol/l(16.5mg/dl)以下且優選在600μmol/l以下。最近的神經學和行為學證據表明將來的治療目標會更低苯丙氨酸值維持在盡可能接近正常值(＜120μmol/l，或＜1.98mg/dl)。
理論上，經過頻繁的血液監測和堅持使用苯丙氨酸限制性飲食可達到理想地生化控制PKU(Trahms，"Nutritional Care in MetabolicDisorders/in Food，Nutrition and Diet Therapy.8th Edition(1992)，Mahan& Arlin，eds.，W.B.Sanders Co.，Philadelphia，Pennsylvania；Kitagawaet al，Enzyme 38 321—327(1987)；and Owada et al.Acta Paediatr.Jpn.30 405—409(1988))，但實際上不常獲得這種理想的結果。特別是營養治療的設計圍繞使用減少苯丙氨酸含量的配方。通常可獲得的用于患有PKU的嬰兒和兒童的配方是95或100％無苯丙氨酸蛋白質水解產物或者是加入少量或不加苯丙氨酸的自由氨基酸混合物。酪氨酸通常是一種補充氨基酸，因為擔心會使在治療的苯丙酮尿病人中酪氨酸水平保持低于正常平均值。
飲食的順應性不僅在生命的早期阻止患病的嬰兒和兒童智力遲鈍中是重要的，而且在后期的成年人特別是患高苯丙氨酸病的孕婦中也是重要的。實際上未治療的孕婦后代都得并發癥如智力遲鈍和小頭畸形。少數還有先天性心臟病和出生時體重低。這些后果非常不幸，因為在大多數情況下嬰兒本身并不患有高苯丙氨酸血病。也有報道隨著年齡的增長且很少治療或無苯丙氨酸飲食控制的高苯丙氨酸大兒童，青少年和成年人智商逐漸降低，學習困難且行為有障礙。因此，尤其從最近的報道，很明顯PKU代表了一種終身的和跨代的疾病，需要連續地且終身地進行飲食控制(Scriver et al.，TheMetabolic Basis of Inherited Disease，Scriver，C.R.，Beaudet.A.，Sly.W.，Valle.D.，(eds)，Tth edit.McGrawo Hill，in press，Chapter 27；Joint PAO/ WHO/UNU Expert Consulltation，Energy and Protein Re-quirements，WHO Tech.Rept.Ser.No.724，WHO，Geneva，Switzerland(1985)；Levy H.L.Treatment of genetic diseases，Ed.，R.J.Desnick，Churchill—Livingston，NY，(1991))。
PUK病人的飲食方案有3套。首先，提供除苯丙氨酸外的所有必需氨基酸使嬰兒和兒童正常生長和發育，如果是成人，則用于維持。通常在限定配方形式的氨基酸成份中加入維生素和無機物。對于嬰兒，基線氨基酸圖應與人乳汁相匹配(Nayman et al.32 1279—1289(1979)t和Joint PAo/WHO/UNU Expert Consultation，Energy andProtein Requirements，WHO Tech.Rept.ser.No.724，WHO，Genera，Switzerland(1985))，但苯丙氨酸含量例外，它相對于人乳汁而言應較低或完全不存在。對于兒童和成人，除苯丙氨酸外，最小配方氨基酸圖應適應PAO/WHO/UNU建議的這些組病人需要的形式。
其次，將限定苯丙氨酸含量的食物作為天然添加劑加入氨基酸配方基本飲食中。由于這些食物含有不同水平的苯丙氨酸，食物的選擇和消費的多少給綜合飲食提供或多或少的靈活性和可口性。所允許的苯丙氨酸水平僅僅是適于生長和/或維持所需要的。例如，全部童年攝入的苯丙氨酸最大耐受水平是500mg/天，可接受的范圍是200—500mg/天。
根據Young & Pellett(Am.J.Clin.Nutr.45 1323(1987)和美國兒科研究院營養委員會(Pediatrics 57 783(1976))估計人類的絕對苯丙氨酸需要如下面表1所示表1 mg/天mg/kg/天 mg/g蛋白質嬰兒25—90學前兒童*200—500 69 63較大的兒童*200—500 22 22年青的成年人14 19*從PAH活性幾乎完全缺乏的PKU病人估計出。
PKU飲食的第三種成份是在滿足了必需氨基酸和苯丙氨酸的需要后，必須保證足夠的熱值食物。這可用低蛋白質、高碳水化合物的食物如水果、蔬菜、脂肪和油來獲得。
盡管上面提及的通用的治療配方理論上在提供必需氨基酸，限制苯丙氨酸攝入和獲得足夠的生化控制方面是有效的，但對于一些維生素，無機物和氨基酸而言，其營養充分性和/或生物利用度是令人懷疑的(Acosta et al.J.Inher.Metab.Dis.5 107(1982))。而且使他們遭受口味和氣味平淡及高滲透負擔的痛苦并導致應變性差。對一生中飲食應變性和調控的需要強調了對含較低或不含苯丙氨酸的更易于接受的食物產品的需要。
理想的是，這些產品應口感好，氣味好，并且當使用它們時，食物的選擇和菜單的設計有最大的靈活性。理想的產品或配方應具有高度可口性和低(優選無)苯丙氨酸這些是產生應變性和使含低蛋白苯丙氨酸的食物及更正常的飲食最大量攝入的關鍵品質。苯丙氨酸含量低或完全缺乏的具有高生物學價值的食物將是一種非常有價值的飲食成份，因為更多種類和體積的含苯丙氨酸的天然食物可以被接受。
現在提供了以新的且更有效的方法研究這一問題的技術。使用定點誘變，蛋白質工程和重組DNA技術的組合，可經過使有關DNA密碼子突變來改變特定的已知蛋白質以減少或消除苯丙氨酸殘基。
最近幾年，我們對重組DNA和遺傳技術，蛋白質工程的認識有了相當大的擴展。這一知識體系使我們能夠選擇特定的蛋白質，根據其已知序列，結構和功能進行突變。然后，編碼這種蛋白質的DNA可從適當的來源克隆，突度成所需的成分，測序以證實其改變并克隆到合適的載體上進行表達。
最近幾年克隆了編碼各種各樣的藥用上和營養上重要的蛋白質之DNA序列。這些包括胰島素，纖溶酶原激活物，α1—抗胰蛋白酶，血因子VIII和IX，溶菌酶，α—乳白蛋白和乳鐵蛋白。從這些DNA序列可推導出其蛋白質序列并以多肽圖譜和Edman降解法來證實。
利用蛋白質X—射線晶體學和多維核磁共振波譜學可測定許多蛋白質的三維結構。這一技術已與高功能計算機和先進的程序耦聯，用它能摸擬氨基酸殘基的改變對蛋白質結構和功能可能產生的影響(Nilsson et al，Curr.Opin.in Strus.Biol.2 569—575(1992)；Presta，L.G.，Curr.Opin.iro Struc.Biol.2 593—596(1992)；Cech，T.R.，Curr.Opin.in Struc.Biol.2 605—609(1992)；Pickersgill andGoodenough，Trends in Food Sci.and Tech.5 122—126(1991))。
對于所要修飾的蛋白質和所要進行的修飾，已建立的方案可用于分離編碼該蛋白質的DNA，和產生編碼所需氨基酸改變的突變DNA序列。這類方案包括對含有所要改變的氨基酸的基因區域進行亞克隆。然后將亞克隆的片段用于定點誘變。對于精確的靶位點和所需的修飾類型可使用這種技術。以用于誘變DNA序列的寡聚核苷引物的方法可在最精確的位點將DNA序列中的單個堿基變成其它3種堿基中的任一種。于是，該DNA可編碼完全不同的氨基酸(McPherson，M.J.，Directed Mutagenesis，Oxford Univ.Press，NY(1991)；Carter，P.，Biochem.J.237 1—7(1986)；Nickoloff and Deng，Anal.Biochem.220 81—88(1992))。
當選擇合適的蛋白質用于苯丙氨酸取代時，應考慮到幾個方面。首先，用作食物的蛋白質必須能大量獲得。因此，必須獲得高水平的表達，并且如果產品容易獲得和易于純化將會具有優勢。其次，盡管蛋白質模擬變得越來越精致，但多個氨基酸改變后的結構和功能結果仍是推測的。由于較大的多肽含更多的氨基酸，大小的增大通常反映出苯丙苯酸殘基的數目更大，因而需要更多的誘變來取代它們。首先，較小的多肽是更好操作的目標。原則上，可選擇細胞內或分泌型蛋白質。然而這一選擇受到表達系統選擇的限制。
當考慮修飾何種蛋白質時，必須考慮到各種因素，包括蛋白質的結構，生理學和營養學的問題，以及是不是易于從宿主合成細胞中提取該蛋白質。
至于結構方面，蛋白質中氨基酸的相對位置和氨基酸的物理和化學特征控制蛋白質諸如活性，特異性和穩定性的特征。蛋白質的結構與其功能密切相關。一般來說，當使蛋白質的氨基酸及其構象發生改變時，重要是不改變其功能并確保其正確地進行加工以及如果必要話從細胞中分泌出來。
生理學方面取決于所選擇的蛋白質特征以及它是一種酶還是一種結構、調節、運輸或食物蛋白。一個潛在的問題是突變影響蛋白質的結構和功能特征，以致使宿主細胞或其功能以某種方式遭受損害。
從營養學上來說，蛋白質在化學上需要盡可能完全平衡。因此，在對可能的突變提出任何設想前，必須分析天然蛋白質，根據氨基酸含量，消化率和過敏性評價其營養潛力。
提取的容易性在一定程度上取決于生產方法。這將決定存在何種污染物質并因此使用何種提取方法。
本發明最主要的方面是選擇α—乳白蛋白作為修飾對象，充分闡述所有這些變化及其相抵觸的考慮來實現本發明。
根據本發明的第一個方面，提供了一個修飾的α—乳白蛋白，與野生型α—乳白蛋白相比，不包含苯丙氨酸殘基或包含更少的苯丙氨酸殘基。不同于人α—乳白蛋白變異體，其中的Phe—80被賴氨酸取代。
在人乳汁中，α—乳白蛋白是主要的乳清蛋白質，以～2.5g/l的水平存在(占總蛋白質的29％—Heine et al，J.Nutr.121 277—283(1991))。這是一種球形的鈣結合蛋白質，相對分子量為14,200，在幾乎所有哺乳動物乳汁中都有發現。
α—乳白蛋白營養價值高，其必需氨基酸占總數的63％。牛(Vilotte et al，Biochimic 69 609—620(1987))和人α乳白蛋白(Hallet al，Biochem，J.242 735—742(1987))都含123個氨基酸殘基，每個單體僅有4個苯丙氨酸和4個酪氨酸殘基。幾千年來α乳白蛋白以人、母牛、綿羊、山羊和駱駝乳汁的形式成為我們飲食的一部分。α乳白蛋白的功能是雙重的。其主要作用是作為乳糖合成酶系統的一種成份。這一合成酶在泌乳乳腺中合成乳糖。α乳白蛋白以修飾UDP β1，4—半乳糖基轉移酶(E.C.2.4.1.22)的底物特異性充當一種更特異性的蛋白酶系統的第二組分。其次，α—乳白蛋白充當一種營養來源。
9種α乳白蛋白序列已被完全測定(Mackenzie and White，adv.in Prot.Chem.41 173—315(1991)；Vilotte et al，Gene 112 251—255(1992))，13種α—乳白蛋白的氨基酸成份已被公開(Mackenzie andWhite，adv，in Prot.Chem.41 173—315(1991))。Acharya等(J.Mol.Biol.208 99—127(1989))于1989年公開了狒狒α—乳白蛋白在1.7下的晶體結構，最近，在1.7下人α—乳白蛋白的晶體結構也已公開(Acharya et al，J.Mol.Biol.221 571—581(1991))。
α—乳白蛋白和C—型溶菌酶從一個共同的前體分化而成，這已被普遍接受(Hall and Campbell，Essays in Biochem.22 1—26(1986)The Biochemical Soc)。
α乳白蛋白是一個相當小的分泌蛋白，它具有4個苯丙氨酸殘基。由于它是一種乳潮蛋白質，所以它較理想地適合于在轉基因哺乳動物乳腺中表達，正如在下面所描述的，選這種乳腺作為表達系統。α—乳白蛋白完全適合于滿足上面討論的結構，生理，營養和可收獲性方面的需要。
在結構上，人和牛成熟蛋白質4個苯丙氨酸殘基分別在3，31，53和80位置及9，31，53和80位置。對這兩種蛋白質的蛋白質工程研究表明根據其大小和空間，原則上幾乎任一殘基都可用來代替苯丙氨酸。然而，Phe—31和80位置分別涉及乳糖合成酶反應和鈣結合環，因此當考慮對這些位置進行合適的取代時必須更加小心。
已知α—乳白蛋白可與其它種類的半乳糖基轉移酶一起發揮功能(Khatra et al，Eur.J.Biochem 44 537—560(1974)；Powell andBrew，Biochem.J.142 203—209(1974))。
在營養學上，在選擇合適的蛋白質進行修飾時應考慮3個方面氨基酸含量、可消化性和抗原性。由于這種食物將供嬰兒及成年人食用，所以其營養質量和必需氨基酸水平必須盡可能高。一般來說在乳汁蛋白質中，必需氨基酸占酪蛋白的51.4％，占全中乳汁蛋白質的52.5％及占牛乳清蛋白質的58.8％。然而，在α—乳白蛋白中，必需氨基酸占總數的63.2％(Heine et al，J.Ntr.，121 277—283(1991))。更重要的是，α—乳白蛋白具有高含量的賴氨酸和半胱氨酸和特別高含量的色氨酸(占總氨基酸的5.9％)。測量體內的真實可消化性存在一些問題，然而通常可進行的研究表明α—乳白蛋白的可消化性與酪蛋白一樣高且比β—乳球蛋白(BLG)更好。主要的牛乳清蛋白質BLG在人乳汁中沒有發現，并且認為在易感性人群中它是一種潛在的抗原。牛α—乳白蛋白與人α—乳白蛋白非常相似且這些相似性預期可能減少牛α乳白蛋白的抗原性。與其它乳汁蛋白質相比，這似乎是正確的(Goldman，A.S.，Pediatrics 32 425—443(1963)；Strobel，S.，Hum.Nutr.Appli.Nutri.40A(1)45—54(1986))。
苯丙氨酸減少的或無苯丙氨酸的α—乳白蛋白產品可優選在泌乳的轉基因動物乳腺中生產，其中的天然蛋白質可能仍然存在。這可能使純化變得困難，除非氨基酸的取代本身改變了蛋白質的特性。然而，在泌乳動物乳汁中，修飾的α乳白蛋白及其表達的特殊優勢是如果泌乳動物天然α—乳白蛋白的表達相對于修飾過的α乳白蛋白表達而言非常低，或者天然或野生型形式的表達被阻止或抑制時，從天然α—乳白蛋白中純化可能是不必要的。通過使用胚干細胞使泌乳動物轉基因可達到阻止或抑制天然形式表達的效果。如果需要純化且為了維持蛋白質的結構必須進行保守的改變時，一種可能性是附加額外的氨基酸序列、如在C末端加一個尾巴(Smith et al，Gene 32 321—327(1984))以利于純化。額外的氨基酸序列應具有1種或多種導致蛋白質更易于分離的特征；例如，額外的氨基酸序列可以使蛋白質根據電荷被分開。Poly—Arg或poly—Arg/Lys尾巴可改變電荷并足以獲得更有效和更廉價的提取。
考慮到其它乳汁蛋白質(如酪蛋白)的苯丙氨酸含量，在實際操作中很可能與對天然α乳白蛋白的例子一樣，優選從這類蛋白質中至少部分純化出修飾的α—乳白蛋白。
本發明在改善PKU患者飲食中蛋白質成份的可口性及其應變性方面特別有用。這可通過選擇合適的，命名為α—乳白蛋白的蛋白質來實現，它能達到具有高度營養價值及能解決上面所討論的所有問題的標準。然后克隆編碼該蛋白質的DNA，突變以去掉至少一些(但優選全部的)苯丙氨酸殘基，在能大量生產使足以供應世界市場的系統中表達。
用作修飾基礎的α—乳蛋白分可來源于任何合適的動物。優選人和泌乳動物，如母牛，綿羊，山羊和駱駝。起源于人或牛的α—乳白蛋白很可能是最佳的。兩者都具有相似的營養價值且人類利用它們已有幾千年。
牛或人α乳白蛋白特別適合于用作突變修飾的起點，因為人們類習慣于吃這兩種蛋白質，并且它們非常相似，在氨基酸水平上有72％的同源性。依賴于結構和/或營養方面的考慮，用一種或幾種氨基酸取代一些或全部苯丙氨酸殘基。可進行選擇的優選的氨基酸如表2所示。在4個苯丙氨酸位置中的任何一個上，可用這些氨基酸的任何一種組合進行取代。優選在所有這些位置進行取代，盡管本發明也覆蓋在一個位置進行的取代，但在其中3個或2個位置上失敗。
表2優選的苯丙氨酸取代人類牛Phe 3/9 Tyr，Leu，Arg，Met，TrpTyr，Ser，LeuPhe 31Leu，Ile，Trp，Tyr Leu，Ile，Trp，TyrPhe 53Tyr，Leu，Met，Trp Tyr，Leu，Met，TrpPhe 80Tyr，Met，Trp，Leu Tyr，Met，Trp，Leu如果取代氨基酸的選擇僅僅是根據能量最小化和結構方面的考慮，那么Tyr3—Leu31—Tyr53—Tyr80人α乳白蛋白和Tyr9—Leu31—Tyr53—Tyr53—Tyr80牛α乳白蛋的是優選的(或具有比四位取代更少的取代突變體)。如果也考慮到營養需要，那么Tyr3/9—Tyr31—Tyr53—Tyr80人和牛α—乳白蛋白(或具有比四位取代更少的取代突變體)是選定的突變體。決定最佳取代的進一步的方法是看在其它種類α—乳白蛋白和在脊椎動物溶酶體中占據相應位置的氨基酸，因為檢查公眾可進入的數據庫表明α乳白蛋白和脊椎動物種類的溶菌酶具有非常相似的結構并認為它們起源于相同的祖先基因，根據這些資料，優選Tyr3-Tyr31-Leu53-Leu80人α乳白蛋白(或具有比四位取代更少的取代突變體)。
可以取代一些或全部苯丙氨酸，為了結構的目的，可優選它們中的一個或多個不變。如果不進行任何結構方面的考慮，可取代至少一個、2個，3個或4個天然苯丙氨酸殘基，取代數越多越優選。已知存在Phe80被賴氨酸取代的人α乳白蛋白的天然變異體(May-nard，F.，J.Dairy Res.59 425—429(1992))；這一變異體本身不是本發明的一部分，盡管它可用于下面將討論的本發明的配方和方法中。
為了幫助純化，可對α—乳白蛋白進行進一步的修飾，例如，可在該蛋白質的C—末端加上一個poly—Ary或Arg/Lys尾巴。這將改變該蛋白質的電荷并可對它進行相當廉價的大量純化。它還具有改進該蛋白質營養品質的優勢。
可以經重組DNA技術，使用現在稱作蛋白質工程的一套技術來生產本發明的修飾的α乳白蛋白。
從Brookhaven數據庫可獲得狒狒α—乳白蛋白的等同物(co-ordinates)(Acharya et al，J.Mol.Biol.208 99—127(1989))。人蛋白質和母牛蛋白質的等同物目前還不能得到，但認為狒狒蛋白質的三維結構可給人和牛野生型和突變型α—乳白蛋白的模擬提供可接受的模板。
首先可在氨基酸類型水平考慮置換一個氨基酸的影響。因此，芳香族化合物應代替芳香族化合物，電荷代替電荷，形狀代替形狀等等。
第一步是測定在天然假定的三維結構中4個Phe殘基中每個殘基的狀態。它們是Phe—3(人)或Phe—9(牛)在分子表面；Phe—31暴露于表面；Phe—53在分子內部腔中，Phe—80大部分被包埋。方便的是這4個殘基完全分離，以致有理由假定如果導入的改變大部分保守，那么在這些位點間的相互作用可能很小。
建立的模型表明，基本上任一殘基都可取代Phe—3/9和31，因為兩者都在分子表面。兩個包埋的Phe殘基可用使周圍蛋白質活動很小的殘基代替。而且，Leu和Met可用于代替Phe，但極性或帶電基團很可能破壞基結構，因此優越性較差。
可從文獻得到一些指導，但它們并不是專用于α—乳白蛋白或本發明的目的(如Bordo和Argos(J.Mol.Biol.217 721—729(1991))，Lesk和Bosevell(Curr.Opih.Struct.Biol.2242(1992))，Singh和Thornton("Atlas of Protein Side—Chain Interactions".Vols 1and 2，IRZ Press.Oxford，England(1992))，和計算機程序(例如TriposAssociates的程序SYBYLTM))，這些指導在評價可能需要進行的任一其它修飾時可能是有用的。
下面的描述對該位置進行了小結3位是表面殘基，可接納大多數殘基Tyr，Leu，Arg.Met.Trp(按相對能量逐步增加的順序)，最優選的是Tyr。
9位是表面殘基，可接納大多數殘基。大多數α—乳白蛋白在這一位置有一個Ser.選用的殘基為Tyr.Ser.Ile。
31位暴露于表面，因此可接納任一殘基。然而，這一區域對乳糖合成酶反應是重要的且疏水相互作用可能是重要的。因此，如果保留活性較重要的話，此處最優選Leu和可能是Ile，然后是Trp。
53位大部分被包埋，Tyr.Leu，Met.Trp是按能量逐步增加的順序。
80位完全被包埋。Tyr，Met，Trp，Leu是此處的順序。此處是鈣結合環區域，因此，此處的改變可能很重要。Tyr是最相近的同形態殘基。
C端位于表面，因此相當暴露。在此處加入一些殘基可能對其結構沒有明顯的影響，但能改進其分離特征。
可以在人、牛或其它α—乳白蛋白中使用這些所建議的取代的任一組合。
盡管在原則上根據本發明的修飾的α—乳白蛋白可以用任何方法(包括化學合成)制備，但一般選擇的方法包含重組DNA技術的使用，其中蛋白質從相應的核酸序列表達。
根據本發明的第二個方面，提供了一種制備上面所述的修飾的α—乳白蛋白的方法，該方法包含將連續的氨基酸耦聯在一起，和/或連接寡—和/或多—肽。為了優選，正如上面所預示的，將連續的氨基酸耦聯到一起優選以核糖體進行介導。現在，許多表達方法學在本領域的技術人員充分掌握的一般知識范圍之內。特別是Sambrook等的《分子克隆》第2版，冷泉港實驗室出版(1989)可提供參考。
在這類表達中有用的核酸本身形成本發明的一部分。根據本發明的第3個方面，提供了一種分離的或重組的核酸，它編碼與野生型α—乳白蛋白相比不包含苯丙氨酸殘基或苯丙氨酸殘基較少的修飾的α—乳白蛋白。
考慮到遺傳密碼子的簡并性，許多不同的核酸序列可編碼本發明的任一特定的蛋白質。所有這些序列都包含在本發明的范圍內，盡管在實際上優選下列核酸序列(a)其密碼子盡可能與野生型基因的密碼子相對應；(b)其密碼子的選擇與表達宿主的優選密碼子一致；或(c)其密碼子根據標準(a)和(b)折衷進行選擇。
根據本發明的編碼修飾的α—乳白蛋白的重組DNA既不局限于cDNAs也不局限于編碼修飾的蛋白質的天然基因組序列，盡管這些序列可能是優選的。可以使用WO—A—9005188的“小基因”方法，其中存在于天然基因的一些(但不是全部)內含子存在于構建體中，并將它導入宿主細胞。
根據本發明的這一方面，重組DNA常是一種載體形式。本發明并不局限于任一特定的載體形式，例如，它可以是質粒，粘性質粒或噬菌體。含有與編碼修飾的α—乳白蛋白序列有效耦聯的足夠的調節序列(包括啟動子)的載體在作為表達載體時是有用的。不包含有效耦聯的調節序列的載體在作為克隆載體時是有用的。
根據本發明的重組DNA也可以是適用于制備轉基因動物的構建體形式，例如經微注射或經同源重組導入動物的構建體。
本發明的第4個方面是將連續的核苷酸耦聯到一起和/或將寡—和/或多聚核苷連接起來制備本發明的核酸，該方法完全在本領域的技術人員知識范圍內。
根據本發明的第5個方面，提供了一種含有上面所述重組DNA的宿主。該宿主可以是一種克隆宿主，其中通常是一種細菌，如大腸桿菌，或者也可以是一種表達宿主。在表達宿主中，編碼修飾的α乳白蛋白的DNA可以有效地與用于表達的足夠的調節序列(包括啟動子)耦聯而且該宿主允許以組成型或在調節條件下進行表達。在本發明中可使用大范圍的表達宿主，包括細菌(特別是E.coli)，酵母(如Saccharomyces cerevisiae，Hansenula polymorpha和Pischia pas-toris)，昆蟲細胞(如Spodoptera frugiperda)和哺乳動物細胞系(如BHK和CHO細胞系)。盡管如此，最優選的表達宿主是動物，特別是非人類的胎盤哺乳動物，其種系中包含編碼修飾的α乳白蛋白的DNA，該種系的成年雌性能在乳腺中表達修飾的α—乳白蛋白以便在其乳汁中積累修飾的α—乳白蛋白。如果修飾的α—乳白蛋白來自與宿主動物不同的種類，該轉化的宿主嚴格地說是轉基因動物；例如攜帶編碼修飾的人α—乳白蛋白的DNA的母牛或公牛是人基因的轉基因動物。盡管如此，根據本發明，并不是所有宿主動物都是轉基因動物，由于它完全在本發明的可能性范圍內并且在某些情況下，優選提供一種給定種類的宿主動物(例如牛)，它攜帶編碼相同種類的修飾的α—乳白蛋白(在該例子中是牛α乳白蛋白)的DNA。經過對已經形成的并將繼續發展的用于制備轉基因動物的技術進行常規修改或經過基因治療技術(該技術的形成用于以另一基因版本取代或補充一個基因版本)可制備這類“類似轉基因”動物。
乳腺表達系統具有高表達水平，低花費，正確加工和易獲得的優點。一些工作者已從泌乳的轉基因動物中生產出牛和人α—乳白蛋白(Vilotte et al，Eur.J.Biochem.186 43—48(1989)；Hochi etal，Mol.Reprod and Devel.33 160—164(1992)；Sozdier et al，FEBSLetters 297(1，2)13—18(1992))并已顯示出生產高水平的蛋白質。對于泌乳的乳腺(WO—A—8801648)而言，α—乳白蛋白啟動子能指導異源基因的表面(Stinnakre et al，FEBS Letters 284(1)19—22(1991))。
其它的轉基因動物，包括在成年雌性乳汁中表達異源性蛋白質的轉基因哺乳動物已在文獻中描述。例如，WO—A—8800239和WO—A—9005188描述了轉基因哺乳動物的生產，如綿羊、它能表達藥用上有價值的蛋白質，包括因子IX和α—抗胰蛋白酶。所有上面列出的方法學和其它出版物都可進行修改以生產根據本發明的轉基因或類似轉基因的動物。在本發明中優選使用已知的泌乳動物(例如母牛，綿羊，山羊或甚至是駱駝或豬)作為宿主，但宿主的選擇首先取決于是否便利，而不取決于本發明本身的任一要求。
根據本發明的轉基因動物或其它宿主可用任一便利的方法來制備。因此，本發明并不局限于用于其制備的任一特定的方法。例如，可按上面WO—A—8800239和WO—A—9005188所述以微注射制備轉基因動物、或以胚干細胞技術制備它們(如在WO—A—9003432中所述)。
宿主中野生型α乳白蛋白基因的表達應進行阻止或至少使減弱，以便簡化純化。
根據本發明的第6個方面，提供了一種適用于高苯丙氨酸血患者的食品，該食品包含至少一種與野生型α—乳白蛋白相比不含苯丙氨酸殘基或苯丙氨酸殘基更少的修飾的α—乳白蛋白。
修飾的α—乳白蛋白優選的特征如上所述。
該食品可以(且通常是)包含其它成份。修飾的蛋白質單獨或與L—氨基酸和/或其它低或不含苯丙氨酸的蛋白質或多肽組合將適用于患PKU的嬰兒，兒童和成年人。對于嬰兒和非常年幼的兒童，以低或無苯丙氨酸的α—乳白蛋白作為蛋白質基礎的配方看起來和嘗起來應更象正常完全蛋白質的嬰兒配方，并且因此應比通用的蛋白水解產物或氨基酸混合物的特殊飲食配方更易耐受。
根據本發明用于嬰兒和非常年幼的兒童的含修飾的α—乳白蛋白的特殊飲食食品或補充物可含其它成份，如脂肪源，碳水化合物源和適出水平的維生素，無機物以及其它營養因子。除了修飾的α乳白蛋白外，額外的氮源還可以時任何L—氨基酸(如L—酪氨酸)，加入后可改進產品總的必須氨基酸質量，使其營養充足。在任何情況下，終產品總的苯丙氨酸含量一般不超過80mg，優選不超過25mg/100g粉米等價物，或者無苯丙氨酸。任一低Phe或無Phe多肽，如為源于酪蛋白的多肽(CDP)(來自干酪加工過程，凝乳酶(粗制凝乳酶)分解乳升蛋白質(α—酪蛋白)并將CDP釋放到乳清部分中)也適合于作為額外的氮源以提高得到的氨基酸圖譜總的品質。也可以加入L—酪氨酸和非必需氨基酸，加入的量達到在人乳汁和正常兒童飲食中的量和/或比這一量更高以保證營養充分。
含修飾的α乳白蛋白用于嬰兒和年幼兒童的特殊飲食食品或添加物可以是可立即食用的液體，或以粉末或濃縮液體的形式，經加水和攪拌變成立即食用的形式。每100ml(60—75kcal/ml)立即食用的液體配方或重配粉末一般含1.2到3.0g，優選大約1.3到1.5g蛋白質；2.2到4.0g，優選大約3.6g，脂肪或脂肪混合物；以及6到9g碳水化合物。
對于大多數嬰兒，乳糖一般是優選的碳水化合物源，但玉米固體糖漿，蔗糖或其它糖也可用于患PKU的嬰兒和年幼兒童的特殊飲食食物中。
另外，含修飾的α—乳白蛋白作為低Phe或無Phe蛋白質源的特殊飲食食品一般含無機物以提供營養學上可接受量的鈣，磷，鉀，鈉，氯，鎂，鐵，銅，鋅，錳，鉬，硒，鉻，氟和碘，并加上足夠量的維生素，如維生素A，D，E，B1，B2，B6，B12，C，尼克酰胺，泛酸，葉酸，維生素K，生物素和胞堿。還應加入其它的營養因子如胡蘿卜素，中磺酸，肌醇，肉毒堿和核苷酸。
包含在特殊飲食食品中的上述每種營養成分量和其可接受的化學形式在下列法典中提供美國聯邦管理法規(181—184部分)和1980年的美國嬰兒配方條例，美國聯邦食品、藥物和化妝品條例第2部分，第IV章，第192部分，1980年9月26日制定的，1985年10月7日修訂的公眾法96—359。
由EC委員會對嬰兒配方和其它配方的指令(歐洲共同體官方雜志，No.L 175/35，1991)和營養藥典委員會建議的嬰兒和兒童食物國際標準提供了相似但不精確的建議。結合FAO/WHO食品標準綱要，CAC/RS，72/74，1967。表了顯示了建議的最小值、最大值和優選值。
表3
表3
表3(續)<
<p>*根據66.67 Kcal/100ml計算因此，對于嬰兒和非常年幼的兒童，理想的特殊飲食補充還應類似于人乳汁，除了其苯丙氨酸含量應不超過80mg/100g配方或固態物。在整個嬰兒期，兒童期和青春期堅持低苯丙氨酸飲食治療是絕對必要的。日需求量如下面表4所示表4
表4
*所有已知的必需氨基酸(除苯丙氨酸外)，必需脂肪酸，無機物和維生素應供給足夠量。
**取自健康與疾病的現代營養M.Shils，V.Young編輯；1988年，第7版，Lea和Febiger費城。
大齡兒童、青少年和孕婦的飲食，特別是患PKU的食譜應含有低Phe或無Phe配方，其加入量應超過低苯丙氨酸食物總熱量值的50％。這一配方可特別設計成適用于每個年齡組，即考慮具有建議的日攝入量，或形成一種通用的配方并附有特別用途說明且對每個生物類別稀釋度不同。這種配方不同于嬰兒和非常年幼兒童的配方，在大約500—1000kcal或500—1000ml中含有下列RDI水平(近似值)的營養成分，如表5所示。
表5
表5
對于兒童和成年人(包括孕婦)而言，特別飲食補充配方的目標是使配方具有可口性且是飲食中令人回味的高質量成份。這一配方應含有所有必需氨基酸(除苯丙氨酸外)和維生素及無機物，特別是那些在低蛋白食物(如水果和蔬菜)中一般含量不高的維生素和無機物。這些營養成份(除蛋白質外)是鈣，鐵，葉酸，鎂和微量無機物。
用于患PKU的兒童，成年人和孕婦的典型配方含有但不局限于下列優選的營養成份范圍，如表6所示。
表6
表6<
<p>低苯丙氨酸或無苯丙氨酸的α—乳白蛋白也非常適合于加入乳汁飲料中，供PAH缺陷的大齡兒童，孕婦，青少年和成年人使用。
作為選擇，這種修飾的α—乳白蛋白或含修飾的α乳白蛋白的飲食食物補充可用于食物中如面包、冰淇淋和糖霜混合物，作為功能性蛋白來源，它們還可以不含苯丙氨酸，或至少是苯丙氨酸含量減少。
上面所述的轉基因動物或類似轉基因宿主動物的乳汁根據本發明經過進一步修飾或不修飾可適用于作為食品，尤其是當宿主野生型α—乳白蛋白基因的表達減弱或受阻止時的乳汁。對修飾的蛋白質的進一步加工包括去掉用于調節或其它用途的氨基酸尾巴，例如，在其加入配方中前進行加工。
根據本發明的第7個方面，提供了供高苯丙氨酸血患者取食的方法，該方法包含給高苯丙氨酸血患者提供一種或多種食品，該食品中含有比野生型α乳白蛋白苯丙氨酸殘基更少的修飾的α乳白蛋白。
而且，修飾的α乳白蛋白優選的特征如上面本發明的第一個方面有關內容所述。
該食品優選的特征如上面本發明的第二個方面有關部分所述。更普遍地，本發明每個方面的特征按其它各方面的需要，并在細節上已作必要的修正。
服用的劑量和時間由患者自己斟酌處理，但一般遵照醫生，營養學家或其它醫學顧問的指導。
本發明用下面非限制性的實施例來說明。在實施例中提到了一些附圖，其中
圖1在實施例1中討論，顯示了人α乳白蛋白基因的2個重迭的基因組λ克隆的限制性圖譜。
圖2在實施例1中討論，顯示了人α乳白蛋白轉基因構建體。
圖3在實施例1中討論，顯示了人α乳白蛋白轉基因小鼠與非轉基因小鼠脫脂乳的SDS—PAGE分析。
圖4在實施例1中討論，顯示了人α乳白蛋白轉基因小鼠乳汁與人α乳白蛋白標準品的蛋白印跡。
圖5在實施例2中討論，顯示了牛α—乳白蛋白PCR引物的序列。
圖6在實施例2中討論，顯示了牛α乳白蛋白PCR引物和產物的位置。
圖7在實施例3中討論，顯示了用于誘變的牛α乳白蛋白PCR引物的序列。
圖8在實施例4和5中討論，顯示了用于Phe取代的PCR方案和用于轉基因構建體PKU1到4的克隆方案。
圖9在實施例4中討論，顯示了PKU1到4轉基因小鼠乳汁與對照小鼠乳汁及牛α乳白蛋白標準品的Western分析。
圖10在實施例4中討論，顯示了以Western印跡分析2個PKU1轉基因小鼠品系的乳汁與牛α—乳白蛋白標準品稀釋液來進行定量。
圖11在實施例5中討論，顯示了Phe取代的PCR方案和轉基因構建體PKU5和PKU1K的克隆方案。
圖12在實施例6中討論，顯示了用于牛α—乳白蛋白和在COS細胞中表達的PKU5到10構建體的克隆方案；
圖13在實施例6中討論、顯示了用pC—BOVA和pC—PKU5至10構建體轉染的COS細胞上清液的免疫沉淀物質的放射自顯影。
實施例1人α乳白蛋白在轉基因小鼠中的克隆和表達人α乳白蛋白基因的克隆人α乳白蛋白的DNA序列已公開(Hall et al.，Biochem.J.242735—742(1987))。使用人的序列，設計PCR引物，從人基因組DNA中克隆出2個小片段，一個在該基因的5’端，另一個在其3’端。將它們亞克隆到pUC18載體上并用作探針篩選商品(Stratagene)λ基因組文庫。用已建立的方法分離出2個含α乳白蛋白基因的重組噬菌體(4a和5b.l)(Sambrook et al.，《分子克隆》第二版，冷泉港實驗室(1989))。限制性圖譜表明兩個克隆都含有α乳白蛋白基因的全部編碼序列，但區別在于存在的5’和3’序列量不同(圖1)。
對克隆5b.1處顯子的序列分析和克隆4a的部分測序表明這些克隆與公開的序列相同。
轉基因構建體(圖2)pHA—1由人α乳白蛋白編碼區，來自以7kb EcoRI/SalI片段克隆到pUC18上產生的1克隆5b.1的～1.8kb的5’側翼和3kb的3’側翼組成。
poBHA(綿羊β—乳球蛋白，人α乳白蛋白)由4個DNA片段構建(1)4.2kg SalI/EcoRV片段，含有綿羊β—乳球蛋白啟動子(WO A—9005188)；
(2)74bp合成的寡聚核苷酸，與8bp的BclI連接物和人α乳白蛋白的序列的堿基15—77相對應，用作平頭BglI片段；(3)來自1克隆4a的6.2kg BglI/PstI人α—乳白蛋白的片段，包含堿基77處的BglI位點與3’側翼XhoI位點之間的區域；(4)用PstI和SalI剪切的pSL1180(Pharmacia)人α乳白蛋白在轉基因小鼠中的表達命名為pHA—1(含人α乳白蛋白基因和側翼區)和pOBHA(含有由綿羊β乳球蛋白啟動子控制的人α乳白蛋白基因)的兩個構建體注射到小鼠胚中，并養育成轉基因動物。
人α—乳白蛋白在這些小鼠乳汁中的表達水平范圍從不可檢測到～3mg/ml。表7列出了轉基因蛋白質相對量的小結。使用以考馬斯藍染色的SDS—PAGE，等電聚焦，以商品抗人α乳白蛋白的抗體(Sigma)觀察Western印跡和層折聚焦分析取自這些動物的脫脂乳。這些分析的結果表明與人α—乳白蛋白標準品(Sigma)相比，轉基因蛋白質具有恰當的大小，pI和抗原性。
圖3和4顯示了幾只小鼠的結果。圖3顯示了脫脂的轉基因小鼠乳汁與未轉基因對照小鼠乳汁的SDS—PAGE分析。圖4顯示了這些乳汁與人α乳白蛋白標準品的Western印跡。
表7轉基因小鼠汁分析小鼠 考馬斯藍 Western印跡205.19 pHA1 - -204.10 pHA1 ++++204.7pHA1 +++ +++230.15.3 pHA1 +++ n.d.230.15.5 pHA1 +++ n.d.230.15.6 pHA1 +++ n.d.230.21.5 pHA1 +++ n.d.230.21.1 pHA1 ++n.d.235.15 OBHA - n.d.235.19 OBHA ++++236.6OBHA ++++234.1OBHA + +234.4OBHA ++++234.14 OBHA + +(表7顯示了經過在考馬斯凝膠和Western印跡上與蛋白質標準品進行比較估計出的在轉基因小鼠乳汁中人α—乳白蛋白的相對水平。
-＝＜0.5mg/ml+＝～0.5-1mg/ml++ ＝～1-2mg/ml+++ ＝～2-3mg/mln.d.＝未檢測)實施例2牛α乳白蛋白在小鼠中的克隆和表達克隆中α乳白蛋白在牛α乳白蛋白中有3種已知的變異體，其中B型是最普遍的一種。來自Bos(Bos)nomadicus f.d.indicus的A變異體與B變異體的區別在殘基10上A中的Glu取代成B中的Arg。與來自Bos(Bibos)javanicus 的C變異體的序列區域尚未獲得(McKenzie &White，Advances in Protein Chemistry 41 173—315(1991))。
使用圖5所示的PCR引物從基因組DNA中克隆牛α—乳白蛋白基因(編碼N型)>下面SEQ ID NOs列出了這些引物。
Ba-2SEQ ID NO1Ba-7SEQ ID NO2Ba-8SEQ ID NO3Ba-9SEQ ID NO4在所有PCR反應中，DNA來源是Holstein—Friesian母牛血液。
使用引物Ba—7與引物Ba一8結合擴增的啟動子區長度是2.05kb。將這一BamHI/EcoR片段克隆到Bluescript(pBA—P2)上。
使用引物Ba—9與引物Ba—2結合擴增包含300bp3’側翼區的全部牛α乳白蛋白基因。這些引物包含BamHI限制性酶識別位點，該位點允許將擴增的3kb片段直接亞克隆到pUC18的BamHI位點上，產生構建體pBA—G3。
將來自克隆pBA—P2的BamHI/EcoRV片段連接到BA—G3的EcoRV/BamHI片段上，產生構建體pBA(圖6)。
由于Taz聚合酶缺乏校正活性，因此保證擴增的牛α乳白蛋白DNA與公開的牛α乳白蛋白基因相同必要的。對所有外顯子和2個啟動子片段進行了序列分析。比較牛α乳白蛋白外顯示子與Vilotte所公開的序列顯示出3處改變(1)在外顯子I的＋759位C變為A；5’非編碼區。這一改變已有報道(Hoehi et al.，Mol.Reprod.and Devel.33 160—164(1992))。
(2)在外顯子I的＋792位CTA變為CTG；兩者都是亮氨酸的密碼子。
(3)在外顯子II的＋1231位GCG變為ACG；由丙氨酸變成蘇氨酸。這是該蛋白質更普遍的B形式的象征。
盡管在PCR擴增過程中不能排除序列的錯讀，但上面的錯配序列很可能是由于牛DNA的來源不同而產生的。牛α乳白蛋白在轉基因小鼠中的表達將pBA構建體(圖6)注射入小鼠胚胎并養育出9只轉基因動物。按實施例1所述進行乳汁分析。經考馬斯藍染色的SDS—PAGE凝膠分析并與α乳白蛋白標準量進行比較表明表達水平范圍從檢測不出到～0.5—1，g/ml。
實施例3定點誘變PCR引物的SEQ ID NOs設計下列SEQ ID NOs作為PCR引物，用于本實施例和隨后的實施例中PKU-1SEQ ID NO5PKU-2SEQ ID NO6PKU-2L SEQ ID NO7PKU-3SEQ ID NO8PKU-4SEQ ID NO9PKU-5SEQ ID NO10PKU-6SEQ ID NO11PKU-7SEQ ID NO12PKU-8SEQ ID NO13PKU-9SEQ ID NO14PKU-10 SEQ ID NO15取代Phe殘基牛α乳白蛋白的4個苯丙氨酸(Phe)殘基出現在該基因的前3個外顯子中。
根據蛋白質模擬，營養學方面，存在于不同種類的天然α乳白蛋白或溶菌酶基因的氨基酸變異體設計用于Phe取代的一套7個寡核苷酸(PKU—PCR引物1，2，2L，3，4，7和8)。這些引物的序列(與編碼鏈或非編碼鏈互補)，預期的氨基酸變化和每個誘變點如圖7所示。這些寡核苷酸充當PCR引物和誘變引物。PKU引物1與2或2L結合使用，7與8結合使用，產生含前2個Phe取代的435bp擴增片段(A)。PKU引物3和4或者9和10產生含后2個Phe取代的601bp的PCR產物(B)(見圖8)。
分別使用位點EcoRI/BamHI和BamHI/XbaI亞克隆PCR產物進行測序。PvuI位點(已被改造成PKU引物2，2L，3，7和8)在氨基酸31和氨基酸53之間產生單一的限制性位點而不改變該區編碼的氨基酸。C末端的氨基酸尾巴在α乳白蛋白基因C端加入額外的氨基酸能壽命從由源性α乳白蛋白蛋白蛋白質中進行分離。目的在于測定增加的氨基酸是否影響轉基因的表達。Poly—Arg尾巴引物PKU—5和6(見圖7和8)用于擴增牛α乳白蛋白基因的3’端以產生0.44kb的PCR產物C。引物PKU6含6一個Arg殘基的編碼區，緊接牛α乳白蛋白序列最后一個天然的Leu氨基酸之后并產生單一的SalI和SnaBI位點。單一的SalI/SnaBI位點可被消化并插入連接物以產生所需任意長度的poly—Arg或poly—Arg/Lys尾巴。天然的終止密碼子隨后是～30bps的3’序列，并以BspMI限制性酶位點結尾。
實施例4牛α乳白蛋白構建體在體內的組裝和表達在轉基因動物乳腺中表達的構建體共制備了5個構建體具有poly—Arg尾巴的天然牛α乳白蛋白基因(pNARG—H)和2個帶有和不含poly—Arg尾巴的突變的牛α乳白蛋白基因(PKU—1至PKU—4)。在這些構建體中的Phe突變體以蛋白質模擬和營養學方面為基礎。構建體的設計在圖8中列出。
從5個DNA片段構建pBARG—H(1)來自pBA，SstI到HpaI的2.04kg的片段；(2)來自pBA，HpaI到HindIIII的1.25kg的片段；(3)來自PCR產物C HindIII到BspMI的0.44kb的片段；(4)來自pNA BspMI到BglII的0.51kb的片段；(5)用SstI和Bg1II消化的載體pSL 1180。
從6個DNA片段構建PKU—1(1)來自pBA SstI到HpaI的2.04kg的片段；(2)來自PCR產物A(PKU引物對1和2)HpaI到PvuI的0.46kb的片段。
(3)來自PCR產物B(引物對3和4)PvuI到BsaBI的0.60Kb的片段；(4)來自pBA BsaBI到HindIII的0.22kb的片段；(5)來自pBA HindIII到BglII的0.95kb的片段；(6)用SstI和BglII消化的載體PSL 1180；
PKU—2以與PKU—1相同的方式構建，除了其中的片段5來自pBARG—H并含有poly—Arg尾巴。
PKU—3以與PKU—1相同的方式構建，除了片段(2)(PCP產物A)使用PKU引物1結合2L進行擴增。
PKU—4以與PKU—3相同的方式構建，除了片段(5)來自pBARG—H并含有poly—Arg尾巴。
上述誘變產生的氨基酸取代及其質粒PKU—1到PKU—4在表8中顯示。
人α乳白蛋白3’側翼區來自λ克隆4a(圖1)的9.3kb BamHI片段含人α乳白蛋白基因的3’側翼區并在所有PKU構建體中都包括，它作為轉基因胚植入前篩選的合適的靶。該9.3kb的片段插入到在所有上述構建體中都存在的單一BglII位點上(見圖8)。
經過用BamHI剪切從載體序列上消化出用于顯微注射的DNA。用于顯微注射的DNA的制備和轉基因小鼠的生產按公開的方法進行(Hogan et al.，"Manipulating the Mouse EmbryoA Laboratary Man-Hal"，Cold Spring Harbor laboratory Press(1986))。表8在轉基因構建體中出現的氨基酸取代取代 Arg尾巴 人3’側翼質粒位置 930 53 80Tyr，Tyr，Tyr，Tyr- + pPKU-1Tyr，Tyr，Tyr，Tyr+ + pPKU-2Tyr，Leu，Tyr，Tyr- + pPKU-3Tyr，Leu，Tyr，Tyr+ + pPKU-4Wild type + + pBARGh無苯丙氨酸的牛α乳白蛋白在轉基因小鼠中的表達轉基因建立者動物在產后第10天分泌乳汁，并對其乳汁進行Western Blots分析(見圖9)。全部構建體(野生型牛α乳白蛋白pBARG—H和4個誘變的牛α乳白蛋白構建體(KU1—4))都能在乳汁中表達并分泌中α乳白蛋白蛋白質。上面較強的帶(見圖9)很可能是糖基化變異體形成的，它也存在于pBARG—H中(資料未顯示)。表9顯示了這些轉基因小鼠乳汁中無苯丙氨酸牛α乳白蛋白蛋白質的相對量。為進行蛋白質定量，對乳汁樣品的系列稀釋液進行Western Blots并與牛α—乳白蛋白標準品進行比較。圖10顯示了對PKU—1轉基因小鼠樣品使用這一程序。
結合已建立的技術(如ELISA、PI、測序和圓二色性)對蛋白質進行進一步的分析。用這些方法試圖了解該蛋白質的大小和電荷及折疊情況。
表9PKU1—4在轉基因小鼠乳汁中的表達構建體 在轉基因乳汁中的α乳白蛋白蛋白質pBARG-H0-0.50mg/mlPKU-1 0-0.25mg/mlPKU-2 0-0.50mg/mlPKU-3 0-0.10mg/mlPKU-4 0-0.50mg/mlRNA分析
使用牛α乳白蛋白的特異性探針對轉基因乳腺總RNA進行Northern印跡分析。正如所預期的，全部具有可檢測的重組蛋白質水平的動物樣品都表現出牛α乳白蛋白mRNA表達。在mRNA量與存在的轉基因蛋白質之間沒有明確的相關性。
為了證實表達的蛋白質來自于突變的α乳白蛋白基因，以RT—PCR方法克隆提取RNA中存在的牛α乳白蛋白mRNA并測序。結果證實從PKU1—4構建體中轉錄出mRNA，因此翻譯的蛋白質應是無苯丙氨酸的。
實施例5在人α乳白蛋白啟動子控制下誘變的牛α乳白蛋白在體內的表達實施例1，2和4的資料表明人α乳白蛋白轉基因的表達與天然牛α乳白蛋白轉基因相比相當高，這反映了內源性中和人基因表達水平的差異。由于這可能歸因于5’控制區的差異。因此用人α乳白蛋白基因的序列取代牛α乳白蛋白的轉錄起始位點的5’區。
制備了2個構建體，命名為PKU—5和PKU—1H，其中摻入的氨基酸取代如表10所示。構建體的設計在圖11中列出。
PKU—5在第一克隆步驟中，將3個片段亞克隆到pUC18的EcoRI/BamHI位點上(1)使用PKU引物7結合8經PCR擴增得到的EcoRI到PvuI片段(片段A、圖11)；(2)使用PKU引物9和10經PCR擴增得到的PvuI到BsaBI的片段(片段B，圖11)。
(3)來自pBA的BsaBI到HindIII的片段。
最終構建體包含6個DNA片段(1)來自N克隆4a(圖1)含人α乳白蛋白啟動子的SalI到KpnI的3.7kb的片段；(2)合成的152bp的寡核苷酸，包含從KpnI位點到AVG的人α乳白蛋白序列和從AUG到HapI位點的牛α乳白蛋白序列；(3)來自第一亞克隆步驟的HpaI到HindIII的1.25kb片段；(4)來自pBA從HindIII到BglII的0.95kb片段；(5)來自λ克隆4a(圖1)的人α乳白蛋白基因3’側翼從BamHI到XhoI的3.7kb片段；(6)用SalI和BamHI剪切的Bluescript KS—載體。
PKU—1H以與PKU與相同的方式構建，除了片段(3)來自PKU—1(實施例4)。
表10轉基因構建體中的氨基酸取代取 代 人啟動子 質粒位置 930 53 80Tyr，Tyr，Tyr，Tyr+pPKU—1HSer，Tyr，Leu，Leu+pPKU—5在轉基因小鼠中的表達將兩個構建體KU—1H和PKU—5注射到小鼠胚中。到目前為止得到了PKU—5構建體的轉基因動物。養育這些動物用于繁殖以分析其乳汁。
實施例6誘變的牛α乳白蛋白在體內的表達瞬時表達構建體為了分析α乳白蛋白基因的大范圍突變，建立了一個體外表達試驗。其中，將天然牛的和突變牛的α乳白蛋白基基編碼區(實施例2，3，4和5序列位置756到3030；Vilotte et al.，Biochemie 69，609—620(1987))克隆到COS細胞表達載體pcDNA 3(Invitrogen)中以產生pC—BOVA和pC—PKU—5到—10。
參考圖12，詳細列出其構建如下(1)將含牛α乳白蛋白序列從位置756到位置831的HpaI位點之間的合成的寡核苷酸克隆到載體pCDNA3的HindIII/BamHI位點上；(2)將牛α乳白蛋白基因的編碼區以HpaI到BamHI之間的片段插入，產生構建體pC—BOVA；(3)將pC—BOVA中的HpaI到HindIII的1.25kb片段換成含Phe取代的HpaI到HindIII的1.25kb片段(圖11)以產生構建體pC—PKU—5到—10。
氨基酸9和30之間的限制性位點PpmMI和氨基酸53和80之間的AvrII的存在(圖11)允許產生4個苯丙氨酸中的1個或2個被取代的PKU構建體，如表11所述。
表11存在于COS細胞構建體中的氨基酸取代取代 質粒930 53 80Phe，Phe，Phe，PhepC-BOVASer，Tyr，Leu，LeupC-PKU-5Phe，Tyr，Leu，PhepC-PKU-6Tyr，Phe，Phe，TyrpC-PKU-7Phe，Phe，Phe，TyrpC-PKU-8Phe，Phe，Phe，LeupC-PKU-9Ser，Phe，Phe，PhepC-PKU-10在COS細胞中的表達用10μg質粒轉染細胞，72小時后，蛋白質標記上35S—甲硫氨酸和35S—半胱氨酸。收集上清液并經免疫沉淀后在聚丙烯酰胺凝膠上分析α乳白蛋白。
圖13顯示了在COS細胞中的瞬時表達導致天然的和突變的牛α乳白蛋白分泌。由Phe9變成Ser的氨基酸取代(pC—PKU 10)產生的表達水平與野生型牛α乳白蛋白相等。Phe30被Tyr取代且Phe53被Leu取代(pC—PKU6)，Phe90被Tyr取代(pC—PKU8)后，表達水平下降。pC—PKU5，7，和9的表達在本試驗系統檢測水平之下。這一系統可定義在轉基因動物中最高表達的氨基酸取代。
實施例7如何使用含修飾的蛋白質的乳汁對于患苯丙酮尿的兒童，需要一種無苯丙氨酸的特殊食品補充。由于在早些年飲食的順應性是關鍵的，因此優選味道好且飲食順應性增強的任一治療配方。
在設計苯丙酮尿兒童的飲食時，必須確定每天的蛋白質，熱量值和氨基酸需要(包括苯丙氨酸)以維持壽命和生長的需要，計算由特殊飲食補充提供的蛋白質和熱量值，然后決定需要什么天然食品來滿足但不超出苯丙氨酸需要。正常情況下這種苯丙氨酸的供應經過加入測定量的乳汁和其它常規食品來實現。
苯丙酮尿兒童曲型的每日飲食應包含3份/天的特殊補充物，該補充物含修飾的α乳白蛋白和前面描述的表3中的其它營養成份。通用的建議是限制性的苯丙氨酸飲食，將它進行有規律的調整以滿足年齡，生長和維持的需要，使生使得以延續。
實施例8從乳汁中制備/分離修飾的蛋白質對于大多數(如果不是全部)特殊配方制品，需要從修飾的α乳白蛋白質中分離和純化正常α乳白蛋白。例如，對于兒童，青少年和孕婦，零或最少量Phe的配方應具有最大飲食靈活性并很可能終自以飲食治療PKU。
因此設計在C端加上poly—Arg或Arg/Lys尾巴，以便能夠更有效和更廉價地分離。這一設計能改變修飾的蛋白質的電荷以便從正常α乳白蛋白的中將它分離出來。這種分離應可用實驗室和工業量的乳清分離并接著進行液相色譜技術來實現，后一分離可能以分子電荷差異的基礎。液相色譜已表現出允許從乳汁的乳清中分離和純化蛋白質和其它成份。
其它技術也可使用，特別是用于實驗室或桌面規模鑒定。這些技術包括但不局限于SDS—PAGE色譜和放射免疫試驗。
實施例9修飾蛋白質的配方根據本發明可配制一些特殊飲食配方用于治療高苯丙氨酸血。這些配方是所有用配方中獨一無二的，因為其中一種完全的蛋白質(修飾的α乳白蛋白)是占優勢的蛋白質和無Phe的氨基酸源，而在通用配方中，N源全部以L—氨基酸的形式或是廣泛水解的酪蛋白蛋白質。
這些新治療配方中占優勢的完全蛋白質特性增強了飲食順應性，因為其味道和可口性有了極大的改進，純的L—氨基酸和肽混合物典型地味道很差且難以忍受。因此修飾的蛋白質在生產一系列配方用于從嬰兒期開始持續到懷孕期和成年期的整個生命歷程中的飲食治療具有優勢。
含有相同修飾的α乳白蛋白源的這些配方可改變總共的蛋白質含量，加入L—氨基酸以改進營養價值，加入非蛋白質源提供能量，如加入糖，玉米漿和/或脂肪，以及維生素，無機物和調味品(如果合適的話)。很明顯，用于嬰兒的特殊飲食配方應試圖與人乳汁的成份或其生理效力相匹配，并由此應含高百分數的脂肪熱值。用于兒童和成年人的配方應含更多的總蛋白質和較少的脂肪，如果有的話，應加入與年幼兒童和嬰兒所需比例不同的維生素和無機物。取天然食品與這些非嬰兒組的配方進行組合以設計成具有相同苯丙氨酸水平的食物組，因此可變換使用不同的食物組來進一步增加飲食多樣性，因而增強了其順應性。
序列描述(1)一般資料(A)用于除US外的所有指定國的申請人(A)名稱藥用蛋白質有限公司(B)街道Orchard Brae House 30 Queesferry Road(C)城市Edinburgh(E)國家英國(F)郵編(號碼)EH4 2HG(i)僅限于US的發明人/申請人(A)姓名Colman、Alan(B)街道65 Cromwell Lane(C)城市Coventry(E)國家英國(F)郵編(號碼)CN4 8AQ(A)姓名Wright，Gordon(B)街道168 ESKhill(C)城市Penicuik(D)州Midlothian(E)國家英國
(F)郵編(號碼)EH26 8DQ(A)姓名SAWYER，Lindsey(B)街道14 MORNINGSIDE PARK(C)城市EDINBURGH(E)國家英國(F)郵編(號碼)EH10 5HB(A)姓名Rigden，Daniel John(B)街道38 Denver Avenue(C)fdymCrewe(D)州Cheshire(E)國家United Kindom(F)郵編(號碼)CW2 7PX(ii)發明題目修飾的α—乳白蛋白(ii)序列號15(iv)計算機可讀形式(A)媒介類型Floppy disk(B)計算機IBM PC兼容性(C)操作系統PC—DOS/MS—DOS
(D)軟件Patent In Releose#1.0，Version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1資料(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1GCGGATCCAC AACTGAAGTG ACTTAGC27(2)SEQ ID NO2資料(i)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO2GATGGATCCT GGGTGGTCAT TGAAAGGACT GATGC 35(2)SEQ ID NO3資料(i)序列特征(A)長度43個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO3GCAGGCGAAT TCCTCAAGAT TCTGAAATGG GGTCACCACA CTG 43(2)SEQ ID NO4資料(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO4GAGGATCCAA TGTGGTATCT GGCTATTTAG TGG33(2)SEQ ID NO5資料(i)序列特征(A)長度46個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO5GCTGAATTCG TTAACAAAAT GTGAGGTGTA TCGGGAGCTG AAAGAC46(2)SEQ ID NO6資料(i)序列特征(A)長度58個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO.6GCGGATCCGA TCGCTTGTGT GTCATAACCA CTGGTATGGT ACGCGGTACA GACCCCTG 58(2)SEQ ID NO7資料(i)序列特征
(A)長度58個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO7GCGGATCCGA TCGCTTGTGT GTCATAACCA CTGGTATGGA GCGCGGTACA GACCCCTG58(2)SEQ ID NO8資料(i)序列特征(A)長度69個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型cDNA(xi)SEQ ID NO8序列描述GCGGATCCGA TCGTACAAAA CAATGACAGC ACAGAATATG GACTCTACCA GATAAATAAT 60AAAATTTGG 69(2)SEQ ID NO9資料(i)序列特征(A)長度34個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲線型(ii)分子類型cDNA(vi)序列描述SEQ ID NO9GCTCTAGATC ATCATCCAGG TACTCTGGCA GGAG 34(2)SEQ ID NO10資料(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO10GCTGAAGCTT CACTTACTTC ACTC 24(2)SEQ ID NO11資料(i)序列特征(A)長度65個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型 cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO11GCGGATCCAA AGACAGCAGG TGTTCACCGT CGACGACGCC TACGTAACTT CTCACAGAGC 60CACTG 65(2)SEQ ID NO12資料(i)序列特征(A)長度46個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO12GCTGAATTCG TTACAAAAT GTGAGGTGAG CCGGGAGCTG AAAGAC 46(2)SEQ ID NO13資料(i)序列特征(A)長度54個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型cDN A(xi)序列描述SEQ ID NO13GCGGATCCGA TCGCTTGTGT GTCATAACCA CTGGTATGAT ACGCGGTACA GACC54(2)SEQ ID NO14資料(i)序列特征(A)長度69個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲學線型(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO14GCGGATCCGA TCGTACAAAA CAATGACAGC ACAGAATATG GACTCCTCCA GATAAATAAT60AAAATTTGG69(2)SEQ ID NO15資料(i)序列特征(A)長度34個堿基對(A)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型cDNA(vi)序列描述SEQ ID NO15GCTCTAGATC ATCATCCAGC AGCTCTGGCA GGAG3
權利要求
1.一種修飾的α乳白蛋白，它與野生型α乳白蛋白相比不含苯丙氨酸殘基或更少的苯丙氨酸殘基，它不同于Phe-80被賴氨酸取代的人α乳白蛋白變異體。
2.根據權利要求1的修飾的α乳白蛋白，在其C端含有一個氨基酸尾巴以利于純化。
3.根據權利要求2的修飾的α乳白蛋白，其中的C端尾巴是poly-Arg或Arg/Lys。
4.根據權利要求1、2或3的修飾的α乳白蛋白，它是修飾的牛α乳白蛋白。
5.根據權利要求4的修飾的牛α乳白蛋白，其中Phe9被Tyr，Ser或Leu取代。
6.根據權利要求4或5的修飾的牛α乳白蛋白，其中Phe31被Leu，Ile，Trp或Tyr取代。
7.根據權利要求4，5或6的修飾的牛α乳白蛋白，其中的Phe53被Tyr，Leu，Met或Trp取代。
8.根據權利要求4到7任一項的修飾的牛α乳白蛋白，其中Phe80被Tyr，Met，Trp或Leu取代。
9.根據權利要求1、2或3要求的修飾的α乳白蛋白，它是修飾的人α乳白蛋白。
10.根據權利要求9要求的修飾的人α乳白蛋白，其中Phe3被Tyr，Leu，Arg，Met或Trp取代。
11.根據權利要求9或10要求的修飾的人α乳白蛋白，其中的Phe31被Leu，Ile，Trp或Tyr取代。
12.根據權利要求9，10或11要求的修飾的人α乳白蛋白，其中Phe53被Tyr，Leu，Met或Trp取代。
13.根據權利要求9到12任一項要求的修飾的人α乳白蛋白，其中Phe80被Tyr，Met，Trp或Leu取代。
14.一種制備根據權利要求1到13任一項要求的修飾的α乳白蛋白的方法，該方法包含將連續的氨基酸耦聯到一起和/或連接寡—和/或多—肽。
15.一種編碼不含苯丙氨酸殘基或苯丙氨酸殘基比野生型α乳白蛋白更少的修飾的α乳白蛋白的分離的或重組的核酸。
16.一種編碼在權利要求1到13中任一項要求的修飾的α乳白蛋白的分離的或重組的核酸。
17.在權利要求15或16中要求的重組DNA，它是一種載體形式。
18.一種制備根據權利要求15或16要求的核酸的方法，該方法包含將連續的核苷酸耦聯到一起和/或連接寡—和/或多—核苷酸。
19.一種宿主，它含有權利要求15、16或17要求的重組DNA。
20.權利要求19中要求的宿主，它是一種非人類的胎生哺乳動物，其種系中含有編碼修飾的α乳白蛋白的DNA，該種系的成年雌性能在乳腺中表達修飾的α乳白蛋白，使修飾的α乳白蛋白在乳汁中積累。
21.權利要求20中要求的宿主哺乳動物，它是母牛(或公牛)、綿羊、山羊，駱駝或豬。
22.權利要求19、20或21中要求的宿主，其中宿主野生型α乳白蛋白基因的表達受阻或減弱。
23.一種適用于高苯丙氨酸血患者的食品，該食品不含苯丙氨酸殘基，或含有至少一種修飾的α乳白蛋白，該α乳白蛋白包含的苯丙氨酸殘基比野生型α乳白蛋白更少。
24.根據權利要求23的食品，其中修飾的α乳白蛋白，或至少一種修飾的α乳白蛋白是權利要求2到13中任一項所要求的。
25.根據權利要求23或24所要求的食品，它是一種適用于嬰兒或兒童高苯丙氨酸血患者的食譜被充或配方。
26.根據權利要求23或24的食品，它是根據權利要求19、20或21所要求的雌性哺乳動物的乳汁。
27.一種給苯丙酮尿患者進食的方法，該方法包含給患者服用1種或多種含有修飾的α乳白蛋白的食品，該α乳白蛋白不含苯丙含酸殘基，或苯的氨酸殘基化野生型α乳白蛋白更少。
28.根據權利要求27的方法，其中的食品是權利要求23到26任一項所要求的。
全文摘要
包含比野生型α乳白蛋白苯丙氨酸殘基更少的修飾的α-乳白蛋白蛋白，例如來源于牛和人的α乳白蛋白可用作高苯丙氨酸血患者的食譜成分。優選全部苯丙氨酸殘基被取代。修飾的α-乳白蛋白可在非人類的宿主動物乳腺中表達，以便在其乳汁中積累，且如果需要的話可從其中分離。
文檔編號C07K14/76GK1127528SQ94192790
公開日1996年7月24日 申請日期1994年7月13日 優先權日1993年7月16日
發明者A·考爾曼, G·瑞特, L·薩葉, D·J·里頓 申請人:Ppl治療(蘇格蘭)有限公司