降低呼吸道病理性粘液樣內(nèi)含物的粘滯度的方法

專利名稱：降低呼吸道病理性粘液樣內(nèi)含物的粘滯度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及呼吸道疾病的治療，旨在治療中對(duì)呼吸道粘液里的肌動(dòng)蛋白起解聚作用和促進(jìn)粘液中的DNA降解，尤其對(duì)阻塞呼吸道的粘液物溶解清除。本發(fā)明在方法上過把肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白加入呼吸道而降低粘液的粘滯度，也通過阻斷肌動(dòng)蛋白與DNA酶I的結(jié)合或降低粘液中肌動(dòng)蛋白的含量而強(qiáng)化呼吸道DNA酶I的溶解作用活性。該方法包括對(duì)有治療必要的病人需給與足量的活性肌動(dòng)蛋白結(jié)合物或其片段或其衍生物。氣道阻塞由炎癥滲出引起的氣道阻塞是發(fā)病和致死的主要原因，粘液的淤積阻塞是慢性支氣管炎、支氣管哮喘、大葉性肺炎及囊狀纖維變性等疾病的一個(gè)特征，并且與肺實(shí)質(zhì)的破壞有關(guān)。粘液還能促進(jìn)急慢性鼻竇炎甚至感冒的發(fā)生。
呼吸系統(tǒng)的粘液阻塞原因很多，其中之一是在感染或刺激條件下產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)引起粘液合成并釋放增加。囊狀纖維變性中粘液的粘滯度增加，可能由于異常的上皮離子轉(zhuǎn)運(yùn)影響了形成粘液的離子多聚物的電荷或水合作用。在囊狀纖維變性中厚厚的粘液阻礙了纖毛擺動(dòng)對(duì)細(xì)菌的排除，并且有利于細(xì)菌的生長(zhǎng)，尤其是綠膿桿菌。這些細(xì)菌或諸如吸煙等其他刺激，產(chǎn)生化學(xué)趨化物使循環(huán)中白細(xì)胞進(jìn)入氣道。當(dāng)白細(xì)胞吞噬細(xì)菌或其他刺激物后，細(xì)胞死亡裂解或碎片，影響器官內(nèi)容物的粘滯度。
對(duì)病理狀態(tài)下的器官內(nèi)粘液樣內(nèi)容物的研究主要集中于DNA，因?yàn)镈NA是由肺中原始分離出來的。也研究粘液中的粘液多糖成分及二硫化物鍵合的作用(Roberts，G.P.，Arch.Biochem，Biophys.173528—537 1976；Robert，G.P.，Eur.J.Biochem.50265—280 1974；Charman，J.，et al.，Brit.J.Dis.Chest 68215，1974；Bhaskar，K.R.，et al.，Exp.Lung Res.10401—422 1986；Lethem，M.I.，et al.，Eur.Respir.J.319—23 1990)。膿性粘液含有10—13mg/ml的DNA，一種離子聚合物被廣泛認(rèn)為可以影響氣道流體的流動(dòng)特性。牛胰DNA酶I，這種酶可溶解DNA，多年前就已被作為一種粘液溶解劑。但一直未應(yīng)用于臨床，這是由于它的抗原性或污染后的副作用所致。于是人DNA酶I的CDNA被克隆和表達(dá)，以溶劑為目的的重組人DNA酶I付諸了試驗(yàn)，在體外它表現(xiàn)出能降低囊性纖維變性中的粘液的粘滯度。(Shak，S.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，879188—9192，1990)。最近在美國(guó)，人類DNA酶I已允許用于臨床治療囊性纖維變性的患者(年齡大于五歲)。胞外肌動(dòng)蛋白肌動(dòng)蛋白是有核動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)含量最為豐富的蛋白質(zhì)，在很多有核細(xì)胞中它占蛋白質(zhì)含量的10—20％，在肌細(xì)胞中占30％。每一個(gè)肌動(dòng)蛋白結(jié)合一個(gè)ATP或ADP分子，并且在ATP水化為ADP時(shí)自身集合成長(zhǎng)絲狀。
動(dòng)物組織損傷時(shí)可導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白釋放到胞外區(qū)域。盡管接近一半的非肌細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白屬于F—肌動(dòng)蛋白(雙螺旋—棒狀—絲狀肌動(dòng)蛋白，它是由G—肌動(dòng)蛋白的單體集合而成)。胞外液體的離子條件有利于肌動(dòng)蛋白的聚合，因此事實(shí)上所有從死細(xì)胞釋放的肌動(dòng)蛋白只要在足夠濃度(大于每毫升幾個(gè)微克)的條件下都會(huì)聚合絲狀(Lind，S.E.，et al，Am Rev Respir Dis.138429—434，1990)。肌動(dòng)蛋白集合成棒一樣的長(zhǎng)絲狀物能相對(duì)地具有抵制蛋白水解酶的降解作用。在沒有短絲狀蛋白的純化溶液中肌動(dòng)蛋白絲很容易達(dá)到幾個(gè)微米的長(zhǎng)度。
由于細(xì)胞中有大量的肌動(dòng)蛋白，從死細(xì)胞中釋放的肌動(dòng)蛋白是可以通過增強(qiáng)胞外流體粘滯度，象粘蛋白樣捕捉細(xì)胞或其它方式對(duì)微環(huán)境產(chǎn)生重大影響。但它的毒性作用至今還沒有確定。大量注入胞外游離肌動(dòng)蛋白對(duì)動(dòng)物組織是有毒性作用的(Harper，K.D.，et al，Clin Res 36625 A 1988；Haddad，J.G.，et al.，ProcNatl Acad Sci USA 871381—1395，1990)。正如下文所述，從損傷細(xì)胞釋放出來的肌動(dòng)蛋白若與肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白結(jié)合，這種肌動(dòng)蛋白將保留為單體或寡聚體。肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白有很多與肌動(dòng)蛋白相關(guān)的天然蛋白質(zhì)，可參閱一篇關(guān)于肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的綜述，見Stossel，T.P.，et al.，Am Res Cell Biol.1353—402(1985)；Pollar，T.D.et al.，Ann.Rev.Biochem，55987—1035(1986)。然而，其中有兩種蛋白質(zhì)凝膠溶素(gelsolin)和DBP(維生素D結(jié)合蛋白)，被認(rèn)為是主要的胞外肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白(Janmey，P.A.，et al.，Blood 70529—530，1987)。
血漿凝膠溶素(有時(shí)稱為短桿菌素)和DBP(也稱為Gc球蛋白)是血漿中兩種親和力的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白。高親和力的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白以小于10-8Kd的分子與肌動(dòng)蛋白結(jié)合。血清中凝膠溶素和DBP與肌動(dòng)蛋白結(jié)合并有使之解聚合的活性。DBP易于結(jié)合單體肌動(dòng)蛋白，而凝膠溶素易于結(jié)合肌動(dòng)蛋白絲。
凝膠溶素是一種從哺乳動(dòng)物細(xì)胞漿和胞外液體中得到的多功能的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白。血漿凝膠溶素不同于胞內(nèi)凝膠溶素，因其分子的氨基末端多了25個(gè)氨基酸，而這兩種凝膠溶素是一個(gè)基因的產(chǎn)物。血漿凝膠溶素有三個(gè)肌動(dòng)蛋白結(jié)合位點(diǎn)，并與G—肌動(dòng)蛋白、F—肌動(dòng)蛋白都有高親和力。
血漿凝膠溶素在結(jié)合第二個(gè)肌動(dòng)蛋白分子時(shí)具有比結(jié)合第一個(gè)肌動(dòng)蛋白分子更高的親和性。因此，它易于形成2∶1而不是1∶1的混合物，而且易與多聚體而不是單聚體結(jié)合。當(dāng)加入F—肌動(dòng)蛋白時(shí)，血漿凝膠溶素以非蛋白水解方式解離多聚體，并且保持與新形成的絲狀物一個(gè)末端結(jié)合。假如有有利的凝膠溶素分子存在，它們可以連續(xù)地分離肌動(dòng)蛋白直至形成2∶1的肌動(dòng)蛋白與凝膠溶素結(jié)合物。從而迅速地解聚肌動(dòng)蛋白絲。
游離的和結(jié)合狀態(tài)(與肌動(dòng)蛋白)的凝膠溶素分子功能特性不同。盡管有利凝膠溶素可以解離肌動(dòng)蛋白絲，但肌動(dòng)蛋白—凝膠溶素?zé)o此作用。
凝膠溶素在血漿和其它胞外液體中的功能是解離肌動(dòng)蛋白絲。假如凝膠溶素多于肌動(dòng)蛋白，則只有凝膠溶素—肌動(dòng)蛋白結(jié)合物形成。而肌動(dòng)蛋白過剩時(shí)就會(huì)有游離的肌動(dòng)蛋白寡聚體和凝膠溶素—肌動(dòng)蛋白結(jié)合物存在。肌動(dòng)蛋多聚體的分離是通過非蛋白水解方式斷裂兩個(gè)相鄰肌動(dòng)蛋白分子間非共價(jià)鍵。凝膠溶素的解離活性的激活需要微克分子以上濃度的Ca+和PH大于6的環(huán)境，其活性可被PIP2(磷脂酰肌醇—4—5—雙磷酸鹽)和PIP(磷脂酰肌醇—4—單磷酸鹽)抑制。胞外液體中Ca+濃度正常情況下為毫克分子水平，且不含PIP2及PIP，故血漿凝膠溶素是胞外液體中的活性成分。
人的胞外(血漿)凝膠溶素的cDNA已被克隆和測(cè)序(Kwiatkowski，D.J.，et al.，Nature 323455—488 1986；Kwiatkowski，D.J.，et al，J Cell Biol.106375—384 1988)。有與肌動(dòng)蛋白結(jié)合能力的天然片段已被確定(Bryan，J.，J Cell Biol106465a 1988 abst.No.2616；Kwiatkowski，D.J.，et al，J CellBiol.1081717—1726 1989；Way M.，et al，J cell Biol 109593—605 1989)。沒有證據(jù)表明存在遺傳多態(tài)性(不常見的Finnish—型淀粉樣變性遺傳病中血漿凝膠溶素單個(gè)氨基酸的突變除外)。這一特點(diǎn)表明使用人重組蛋白不會(huì)導(dǎo)致免疫反應(yīng)或其它毒性作用。血漿凝膠溶素已在很多體液中發(fā)現(xiàn)，提示凝膠溶素可能是氣道液體里的正常組分，至少在炎癥狀態(tài)如此。
DBP也已克隆(Cooke，N.E.，et al.，J clin Invest.762420—2424 1985；Yang，F(xiàn).，et al，Proc Natl.Acad Sci USA 827994—7998 1985)。DBP有一個(gè)肌動(dòng)蛋白結(jié)合點(diǎn)，主要與肌動(dòng)蛋白單體而不是F—肌動(dòng)蛋白結(jié)合。肌動(dòng)蛋白和DNA酶I肌動(dòng)蛋白和DNA酶I的緊密結(jié)合抑制了DNA酶I的催化活性(Lindberg，u.，Biochem.Biophys.Acta.82237—248 1964；Lazarides and Lindberg，Proc Natl.Acad.Sci USA 714742—4746 1974)。在白細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白占蛋白總量的10％，因此，同DNA多聚體一樣在氣道膿液里存在大量肌動(dòng)蛋白。只要肌動(dòng)蛋白在氣道內(nèi)含物出現(xiàn)，DNA酶I對(duì)DNA的降解效率將因?yàn)楸患?dòng)蛋白的結(jié)合而降低。
肌動(dòng)蛋白只要產(chǎn)生高彈性的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)并當(dāng)滲入粘液形成DNA多聚體時(shí)，就會(huì)形成象其纖維樣的很硬的膠(Janmey，P.A.，Blood 80928—936 1992)。介紹應(yīng)用肌動(dòng)蛋白結(jié)合物解離肌動(dòng)蛋白，尤其是解離肌動(dòng)蛋白絲(Janmey.P.A.，Curr，Opinion CellBiology 34—11 1991)是一個(gè)十分有吸引力的方法，以此降低氣道粘液尤其是膿性粘液的稠度。
由于肌動(dòng)蛋白抑制了DNA酶I的水解活性，所以肌動(dòng)蛋白結(jié)合分子通過溶解肌動(dòng)蛋白并使它在含有DNA的氣道粘液中易于排除而提高了DNA酶I的功效。
本發(fā)明基于申請(qǐng)人這樣的看法，由于白細(xì)胞是膿性粘液的主要成分且肌動(dòng)蛋白占白細(xì)胞內(nèi)蛋白總量的10％，故大量肌動(dòng)蛋白可能存在于氣道膿性粘液里。本發(fā)明也考慮到由于DNA酶I在膿液中與肌動(dòng)蛋白結(jié)合使之降解膿性粘液中DNA多聚體的效率下降，包括內(nèi)源性DNA酶I和以治療為目的而加入的DNA酶I的作用都會(huì)下降。
因此，本發(fā)明申請(qǐng)人考慮以肌動(dòng)蛋白結(jié)合物，片段或衍生物用于含有病理性粘液樣氣道分泌物的患者，給他們提供治療并保護(hù)他們的呼吸道免遭損害。故本發(fā)明是一項(xiàng)旨在提供降低粘液粘滯度或溶解粘液樣氣道內(nèi)容物的方法，保證了患者的氣道通暢，呼吸正常，尤其是患有氣道炎癥性疾病的患者。本發(fā)明在方法上通過加入肌動(dòng)蛋白結(jié)合物，特別是肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，實(shí)現(xiàn)1)解聚合，多聚體、片段成分解離，或阻止從細(xì)胞中釋放的肌動(dòng)蛋白絲聚合或固化，和/或2)，阻止肌動(dòng)蛋白抑制DNA酶I降解那些增強(qiáng)粘液粘性的DNA多聚體活性。DNA酶I可以是內(nèi)源性的，也可以是因治療而霧化吸入或其它方式給入的。
因此，這項(xiàng)發(fā)明的再一個(gè)目的就是通過在呼吸道使用結(jié)合肌動(dòng)蛋白的化合物，尤其是肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，降低了肌動(dòng)蛋白與DNA酶I的結(jié)合力，促進(jìn)了呼吸道病理性粘液樣物質(zhì)中DNA的降解。
本發(fā)明的所有目的于下文中很容易看出，這些目的是在一定劑量無規(guī)則條件下使用一種多多種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白、片段或功能性衍生物，治療因肌動(dòng)蛋白和/或DNA釋放所致的氣道阻塞。


圖1，囊性纖維變性病人痰液的動(dòng)力切變系數(shù)。將含有凝膠溶素或不含凝膠溶素的痰液樣品放在兩個(gè)平行的搖擺圓盤之間(ferry J.D.Viscoelastic Properties of Polymners 3rd Ed.，JohnWiley & sons，New York 1980)，并對(duì)附著在樣品下的臂作一短暫的移位，動(dòng)力切變系數(shù)G從頻率和自由擺動(dòng)的衰減中求出。含有肌動(dòng)蛋白多聚體的溶液的切變系數(shù)G直接取決于該肌動(dòng)蛋白絲的平均長(zhǎng)度(Janmey，et al.，Biochemistry 278218—8226 1988)。圖1A囊性纖維變性患者痰液切變系數(shù)；圖1B囊性纖維變性痰液加凝膠溶素的切變系數(shù)；圖C囊性纖維變性痰液加凝膠溶素氨基酸片段1—260的切變系數(shù)。
圖2，囊性纖維變性痰液的切變力的攀升和回落。把含有凝膠溶素和不含凝膠溶素的痰液樣品放在搖擺圓盤之間，給予持續(xù)的切變壓力。隨后的變形看成是切變順應(yīng)性，即切變強(qiáng)度與外加壓力之比。以前的研究表明，F(xiàn)—肌動(dòng)蛋白的順應(yīng)性隨著肌動(dòng)蛋白絲平均長(zhǎng)度的下降而迅速提高(Janmey et al.，Biochemistry 278218—8226 1988)。切變強(qiáng)度的突然下降表示外加壓力的解除。
圖3，凝膠溶素和DNA酶I的劑量效應(yīng)曲線。含有凝膠溶素或DNA酶I的痰液樣品放置搖擺圓盤中培養(yǎng)60分鐘后測(cè)粘滯度變化，粘滯度的變化是隨濃度增加而改變，粘滯度的變化用占初始粘滯度的百分?jǐn)?shù)表示。
圖4，DNA酶I和凝膠溶素聯(lián)合使用對(duì)痰液粘滯度的影響。含有凝膠溶素、DNA酶I的樣品放置搖擺盤中培養(yǎng)60分鐘。結(jié)果以所占初始粘滯度的百分?jǐn)?shù)表示。
圖5，聯(lián)合使用肌動(dòng)蛋白結(jié)合物對(duì)痰液粘滯度的影響。加入凝膠溶素和Gc球蛋白(維生素D結(jié)合蛋白)的痰液樣品放在搖擺圓盤中培養(yǎng)60分鐘測(cè)粘滯度的變化。結(jié)果始終用所占初始粘滯的百分?jǐn)?shù)表示。
本發(fā)明考慮到呼吸道內(nèi)容物中存在肌動(dòng)蛋白絲和DNA多聚體，它們可以增加這些內(nèi)含物的粘稠度，并以此作用方式阻礙呼吸道的正常清潔作用而導(dǎo)致病理變化。因此，本發(fā)明的目的在于通過解離肌動(dòng)蛋白絲，抑制肌動(dòng)蛋白多聚體的形成，降低肌動(dòng)蛋白的含量和降解DNA多聚體，從而降低病理狀態(tài)下氣道內(nèi)含物的粘滯度。本發(fā)明的一個(gè)具體應(yīng)用是一種結(jié)合了肌動(dòng)蛋白的化合物或幾種化合物應(yīng)用于患有呼吸道疾病的人。而這些疾病是由于氣道內(nèi)存在肌動(dòng)蛋白絲及DNA多聚體所致。肌動(dòng)蛋白結(jié)合物則可解聚肌動(dòng)蛋白，阻止或降低游離肌動(dòng)蛋白單體的聚合，阻止肌動(dòng)蛋白絲或單體與DNA酶I的結(jié)合。本發(fā)明通常的實(shí)施方案是一種溶解或降低病理性呼吸道內(nèi)含物粘滯度的方法，而這些氣道內(nèi)含物是各種患者飽經(jīng)痛苦的原因。
本發(fā)明還考慮到氣道粘液存在肌動(dòng)蛋白絲和DNA多聚體，它們可以增加粘液的稠度或粘滯度并阻礙氣道空氣的正常流通和氣道內(nèi)含物的清除，故本發(fā)明的目的是要通過在含粘液的呼吸道中使用肌動(dòng)蛋白結(jié)合化合物來降低這些粘液的粘滯度。該化合物可解離肌動(dòng)蛋白絲為肌動(dòng)蛋白單體，或與肌動(dòng)蛋白結(jié)合而阻止肌動(dòng)蛋白與DNA酶I的結(jié)合。該化合物也可以阻止肌動(dòng)蛋白單體聚合成肌動(dòng)蛋白絲。通過提高粘液的清除率，該化合物可最佳減少肌動(dòng)蛋白在內(nèi)容物中含量。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是一提供了一種方法，即通過將肌動(dòng)蛋白結(jié)合物或幾種結(jié)合物引入到含所述粘液的單體呼吸道中來降低氣道粘液的粘滯度或?qū)φ骋旱娜芙?，考慮到呼吸道膿性分泌液中白細(xì)胞所致的DNA多聚體會(huì)增加粘液的稠度，膿性粘液中還可能大量存在肌動(dòng)蛋白絲致使粘液阻塞氣道，減少痰液的咳出，并誘發(fā)其它類型的呼吸道疾病。因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是解離肌動(dòng)蛋白絲的同時(shí)對(duì)DNA多聚體的解聚以降低膿性粘液的粘滯度。本發(fā)明的最佳應(yīng)用是給呼吸道內(nèi)存在這種粘液的患者使用肌動(dòng)蛋白結(jié)合物或幾種結(jié)合物的混合物，降低膿性粘液的粘滯度。肌動(dòng)蛋白結(jié)合物而已通過解聚肌動(dòng)蛋白絲為肌動(dòng)蛋白單體或與肌動(dòng)蛋白絲、單體結(jié)合從而阻止它們與DNA酶I結(jié)合，這些化合物還可阻止肌動(dòng)蛋白單體聚合成肌動(dòng)蛋白絲。最終，由于增強(qiáng)了對(duì)粘液的清除而減少了呼吸道內(nèi)肌動(dòng)蛋白的含量。
在本發(fā)明付諸于治療時(shí)，DNA酶I的應(yīng)用可以是單獨(dú)也可以與肌動(dòng)蛋白結(jié)合物聯(lián)合使用。
本發(fā)明的進(jìn)一步應(yīng)用是給存在病理性粘液或膿性粘液的呼吸道使用肌動(dòng)蛋白結(jié)合物的功能性衍生物或片段以防止呼吸道阻塞和減少痰液。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于它可以直接降低需要這方面治療的病人氣道內(nèi)特殊內(nèi)容物的稠度。肌動(dòng)蛋白結(jié)合物可以(1)解聚、分離來自壞死細(xì)胞或其它細(xì)胞能增加粘稠度的肌動(dòng)蛋白絲，或阻止肌動(dòng)蛋白單體、寡聚體聚合為多聚體，(2)通過阻止肌動(dòng)蛋白與DNA酶I結(jié)合從而解除肌動(dòng)蛋白對(duì)DNA酶I的抑制作用。DNA酶I可以對(duì)DNA多聚體起解聚作用，(3)最終通過對(duì)氣道內(nèi)容物的清除來減低氣道粘液中肌動(dòng)蛋白的含量?；诒景l(fā)明的目的可以理解為氣道內(nèi)存在的肌動(dòng)蛋白是游離單體或絲狀物形成的胞外肌動(dòng)蛋白。
本發(fā)明的突出之處是使用凝膠溶素蛋白活性片段或功能衍生物。凝膠溶素可以象以往呼吸道疾病患者使用DNA酶I一樣常規(guī)地使用。凝膠溶素還可與其它肌動(dòng)蛋白結(jié)合物(尤其是維生素D結(jié)合蛋白)或DNA酶I聯(lián)合使用。另一方面，應(yīng)用肌動(dòng)蛋白結(jié)合物(特別是凝膠溶素)可以通過靜脈給藥而到達(dá)氣管、支氣管和肺泡，有效地解決呼吸道給藥會(huì)因?yàn)闅獾雷枞芟拗频膯栴}。靜脈給藥在呼吸道有炎癥和伴隨血?dú)馔ㄍ感栽黾拥那闆r下效果更好。
眾所周知，血漿蛋白是可以進(jìn)入呼吸道的，α—1抗胰蛋白酶治療遺傳性肺氣腫就是一個(gè)顯著的例子。估計(jì)血液向組織輸送血漿蛋白是一個(gè)直接的功能。因此，可以通過測(cè)定血中凝膠溶素含量來確定氣道是否對(duì)肌動(dòng)蛋白結(jié)合物利用了。
已知(Am J.Path.130261—267 1988 and Am.Rev.Resp.Dis.138429—434 1988)血漿凝膠素含量在實(shí)驗(yàn)性肺損傷及臨床ARDS(成人肺呼吸綜合癥)疾病中會(huì)減少。另外一些實(shí)驗(yàn)表明在肌肉和血漿凝膠溶素濃度之間存在某種聯(lián)系(Yamamoto，H.，Osaka Gas Group Foundation Publication Volume 5145—1471992)。因?yàn)榧∪馐茄獫{凝膠溶素的主要來源，患者隨著慢性炎癥和缺氧對(duì)其的消耗，血漿凝膠溶素也將隨之下降。
本發(fā)明的所有實(shí)施方案中，DNA酶I的有效性被增強(qiáng)，最終使病理狀態(tài)下呼吸道內(nèi)容物尤其是粘液或膿性粘液中DNA被解聚合。
經(jīng)驗(yàn)證明，本發(fā)明可用語(yǔ)治療疾病不只限于囊性纖維變性，它包括慢性支氣管炎，膿性粘液或單純粘液膿性變壞的支氣管炎，支氣管粘液溢，支氣管肺炎，廣泛的細(xì)支氣管炎，膿性肺炎，肺炎樣肺泡硬化，哮喘，伴有或不伴哮喘的支氣管擴(kuò)張粘液阻塞，急性或慢性膿性竇炎，膿胸，支氣管擴(kuò)張，支氣管囊腫，成人呼吸道綜合癥(ARDS)，移植后的管腔閉合，細(xì)支氣管炎及過敏性細(xì)支氣管炎(肺泡纖維化)。
為了對(duì)這份說明書、權(quán)利要求書和所給專業(yè)術(shù)語(yǔ)的范圍有一個(gè)清晰、連貫的理解，下面給出一些定義。
術(shù)語(yǔ)“呼吸道”或“氣道”專業(yè)上認(rèn)為是管狀、多孔的器官和結(jié)構(gòu)，通過肺換氣體交換發(fā)生在外界空氣與血液之間。這就使理解上包括，特別是鼻腔和鼻甲，咽，喉，器官，支氣管和肺。本發(fā)明是直接用于治療氣道任何部位，尤其是氣管以下部位的粘液、膿性粘液等內(nèi)容物的溶解與清除。一般專業(yè)上認(rèn)為“呼吸道內(nèi)容物”或“氣道內(nèi)容物”在正常情況下是由氣道內(nèi)細(xì)胞產(chǎn)生的物質(zhì)(例如，通過分泌)，或者細(xì)胞自身的殘留物構(gòu)成。因此，在理解病理狀態(tài)(粘液樣)氣道內(nèi)容物時(shí)，是指可以導(dǎo)致結(jié)構(gòu)和功能改變的那種成分，存在與氣道內(nèi)容物中(比如，過量的肌動(dòng)蛋白)可引起呼吸道功能異?；蚣膊　＿@些成分不只是粘液、膿性粘液，比如在囊性纖維變形的厚粘液中還有細(xì)菌等。故這些成分也可能是粘液中的生物成分，它能改變粘液中的特性并引起疾病或紊亂。這些成分也可能是疾病本身引起的。在疾病狀態(tài)下可以使正常呼吸道內(nèi)容物的量增加，或使正常成分的類型發(fā)生改變。例如，正常狀態(tài)下的一些氣道內(nèi)容物失去平衡或某種成分比例失調(diào)(如過量的肌動(dòng)蛋白)。術(shù)語(yǔ)“呼吸道疾病”是指出現(xiàn)了病理性氣道內(nèi)容物之后所引起的一系列變化，包括氣流減少，氣道阻塞、呼吸道纖毛的清除功能下降、呼吸道肌肉運(yùn)動(dòng)能力減弱，如咳嗽、打噴嚏。呼吸道長(zhǎng)時(shí)間與這些滯留的細(xì)胞，溶解酶，炎性介質(zhì)、真菌、支原體、細(xì)菌或其它微生物接觸而受刺激。術(shù)語(yǔ)“粘液”一般理解為在粘液膜層游離存在的粘性物質(zhì)，由腺體分泌而成，還包括各種無機(jī)鹽、脫落細(xì)胞及白細(xì)胞?！澳撔哉骋骸笔潜景l(fā)明主要的應(yīng)用對(duì)象，一般認(rèn)為它具有高粘滯性，來源于白細(xì)胞或脫落細(xì)胞及破碎的內(nèi)源性氣道細(xì)胞的DNA多聚體使其粘滯度相對(duì)增加。
術(shù)語(yǔ)“溶解的氣道內(nèi)容物”(粘液樣)，“溶解的粘液”，或“溶解的膿性粘液”是指這些內(nèi)容物的力學(xué)特性發(fā)生了變化，使得粘液或膿性粘液更象液體，或者說固狀性能減弱，順應(yīng)性加強(qiáng)(對(duì)應(yīng)變壓力有更好的流動(dòng)反映性)。多聚體的解離對(duì)這些內(nèi)容物粘滯度的改變起了作用，使內(nèi)容物/粘液/膿性粘液的結(jié)構(gòu)間隙中的蛋白或分子析出，降低這些物質(zhì)的粘滯度或稠度。術(shù)語(yǔ)“降低粘滯度”或降低“稠度”，可以理解為改變其力學(xué)特征。正如前面所述。粘滯度是表示物質(zhì)的一個(gè)物理特征，它依據(jù)物質(zhì)組成分子在相互運(yùn)動(dòng)時(shí)的摩擦情況而定。粘性高的溶液表明其組成分子間的摩擦力大，而降低粘滯度就是降低組成分子之間的摩擦力。
術(shù)語(yǔ)″外源性DNA酶″是指病人由于呼吸道內(nèi)DNA多聚體所致呼吸道疾病需要使用DNA酶時(shí)，臨床給予的DNA酶。
術(shù)語(yǔ)“內(nèi)源性DNA酶”是指患者呼吸道內(nèi)存在的DNA酶，尤其是這類病人呼吸道粘液中存在DNA酶。
術(shù)語(yǔ)″增強(qiáng)DNA降解″是本發(fā)明的一個(gè)目的。引入一定量的肌動(dòng)蛋白結(jié)合物，它們則與病理狀態(tài)下氣道內(nèi)容物中的肌動(dòng)蛋白結(jié)合。如果粘液或膿性粘液中的肌動(dòng)蛋白未與肌動(dòng)蛋白結(jié)合物結(jié)合，肌動(dòng)蛋白就會(huì)和這些液體中的DNA酶結(jié)合，降低了DNA多聚體的降解，肌動(dòng)蛋白與肌動(dòng)蛋白結(jié)合物結(jié)合之后可以降低粘滯度，增強(qiáng)呼吸的氣流量，痰液易咳出并使其它一些由于氣道內(nèi)容物所致的呼吸道疾病得以緩解。
術(shù)語(yǔ)“結(jié)合肌動(dòng)蛋白的化合物”指能與肌動(dòng)蛋白結(jié)合的任何物質(zhì)，尤其是蛋白質(zhì)(或多肽)類，通過與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合，調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的許多功能，包括抑制肌動(dòng)蛋白單體變成多聚體直至絲狀，對(duì)以前存在的絲狀物解離成碎片和結(jié)合DNA酶I。本發(fā)明介紹的肌動(dòng)蛋白結(jié)合物實(shí)際上不含體內(nèi)外的污染物，如體內(nèi)的原核或真核細(xì)胞，體外的化學(xué)合成物質(zhì)。這些結(jié)合物有來源于細(xì)胞外的凝膠溶素，DBP和來源于細(xì)胞內(nèi)的肌漿球蛋白，肌球蛋白，抑聚合蛋白(profilin)和抑聚合蛋白(cofilin)，非肌細(xì)胞內(nèi)含量豐富。本發(fā)明介紹的肌幼蛋白結(jié)合物不只限于a)，肌動(dòng)蛋白結(jié)合物主要是分離肌動(dòng)蛋白單體，也就是說，與單體結(jié)合為復(fù)合物阻止它形成多聚體(如，DBP，凝膠溶素，β4—肌球蛋白和cofilin)；b)，肌動(dòng)蛋白結(jié)合物解離單體和有解離多聚體的強(qiáng)烈活性(如凝膠溶素，裂解蛋白(villin)，片段和裂解蛋白(severin)；c)，肌動(dòng)蛋白結(jié)合物主要阻斷肌動(dòng)蛋白多聚體末端，阻止在此末端進(jìn)行單體交換(如阻斷蛋白(tropomodulin)，capz，cap100，ASP—56)；d)，結(jié)合肌動(dòng)蛋白的非蛋白質(zhì)分子對(duì)肌動(dòng)蛋白有同樣作用(如細(xì)胞松弛可有生物活性的衍生物產(chǎn)生，從而阻斷肌動(dòng)蛋白絲末端，調(diào)節(jié)胞外的殘留物)。專家認(rèn)為有效的化合物將存留在胞外，為了阻止任何與胞內(nèi)功能肌動(dòng)蛋白相互作用引起的毒性，肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白片段具有將存留的肌動(dòng)蛋白或其單體分離的活性。這一點(diǎn)也是本發(fā)明的目的范圍。如果需要的話，這種化合物以易接受的給藥形式給動(dòng)物。
這里“動(dòng)物”一詞是包括所有痰液中有游離肌動(dòng)蛋白或肌動(dòng)蛋白絲的動(dòng)物，這樣的痰液對(duì)動(dòng)物的正常生理是有害的。這些動(dòng)物中最重要的是人。但是，這項(xiàng)發(fā)明并不只希望于人類，在考慮到這項(xiàng)發(fā)明對(duì)所有動(dòng)物治療作用時(shí)，可以看到所有動(dòng)物受惠于本發(fā)明。
肌動(dòng)蛋白結(jié)合物的″有效量″是指以降低或排除肌動(dòng)蛋白在呼吸道的毒性作用的劑量。本發(fā)明中，化合物使用量能有效溶解或降低病理狀態(tài)氣道內(nèi)容物粘滯度或稠度，阻止這些液體中的肌動(dòng)蛋白與DNA酶I結(jié)合，從而增強(qiáng)DNA降解，或降低液體粘滯度以治療不同類型的呼吸道疾病。有效治療量也是這個(gè)劑量，即它可以減少臨床細(xì)菌感染的發(fā)病率，降低炎性介質(zhì)或細(xì)胞毒性酶，細(xì)胞毒性酶可由呼吸道病變本身產(chǎn)生或前者是后者的誘因。
肌動(dòng)蛋白結(jié)合分子的用量及治療時(shí)間是根據(jù)病變程度及其檢測(cè)指標(biāo)來決定，如痰液量、粘滯度、肺功能FEV、血O2、PH、PCO2肺通量、氣流殘余量、感染部位等。有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)生是熟悉這些常規(guī)檢測(cè)技術(shù)。
霧化肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的用量可以根據(jù)以往用DNA酶I治療病人的有效吸入量決定。比如參看Atiken，M.L.，et al.，J AmMed.Assoc.2671947—1951(1992)，特別在1948頁(yè)，“研究方案”。體內(nèi)有效劑量與體外已明確的有效量相關(guān)，如在體外劑量據(jù)說明上注明能夠溶解痰液的劑量為2—10μg/ml，則用于體內(nèi)時(shí)應(yīng)增加到是體外的一千倍的劑量(2—10mg/ml)。當(dāng)然，準(zhǔn)確使用肌動(dòng)蛋白結(jié)合物的劑量和規(guī)則也要根據(jù)治療呼吸道疾病的常規(guī)方案而定。一般而言，使用肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的劑量將不同程度依賴于化合物的類型，病人年齡，疾病嚴(yán)重程度，目前的治療措施，組織損傷程度，病人性別，癥狀持續(xù)時(shí)間等。正確有效的劑量可以根據(jù)檢測(cè)氣道內(nèi)容物而定。
如果一種物質(zhì)是從一些物質(zhì)中純化得來的，而這種物質(zhì)在純化前就已被發(fā)現(xiàn)，那么這種物質(zhì)被認(rèn)為是事實(shí)上的未被自然污染的，如肌動(dòng)蛋白結(jié)合物的自然污染物或許是非肌動(dòng)蛋白結(jié)合肽，碳?xì)浠衔铮腔嚯模?，膜等。如果那些污染物從本來自然存在體內(nèi)外某種物質(zhì)樣品中未被發(fā)現(xiàn)，那么，這種物質(zhì)樣品實(shí)際被認(rèn)為是未被發(fā)現(xiàn)，那么，這種物質(zhì)樣品實(shí)際被認(rèn)為是未被自然污染。“實(shí)際上不存在”是指這類污染物完全沒有或僅有微量。故(1)不會(huì)干擾活性試劑的理想療效(如以上述方法制備的肌動(dòng)蛋白結(jié)合物)，(2)也不會(huì)傷害被給予的動(dòng)物。
“給予”是指通過各種途徑經(jīng)將肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白引入動(dòng)物呼吸道的方法，包括除霧化吸入，支氣管鏡導(dǎo)入和靜脈注射以外的方法途徑。
本發(fā)明介紹的肌動(dòng)蛋白結(jié)合物可以和DNA酶或其它肌動(dòng)蛋白結(jié)合物聯(lián)合使用。“聯(lián)合使用”指每次用藥給予兩種以上成分，它們的生物活性有重疊，這個(gè)詞的意思包括連續(xù)，廣泛使用這類結(jié)合物或與DNA酶I共同應(yīng)用。
“可接受的藥劑媒介物”包括溶劑、載體、稀釋劑等，它們可以作為制備肌動(dòng)蛋白化合物的添加劑，是為了給這類化合物提供載體或劑。
“碎片”是指分子的任何部分，這一部分能結(jié)合肌動(dòng)蛋白和單體，或解聚多聚體。該詞的意思還包括任何來源的肌動(dòng)蛋白結(jié)合片段，如天然多肽序列、合成多肽序列和基因工程多肽序列。進(jìn)一步說，如果這種片段是一個(gè)肽，一個(gè)肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的肽的片段，那么這種“碎片”還包括了各種肌動(dòng)蛋白。
肌動(dòng)蛋白結(jié)合物的″功能衍生物″是指這種衍生物具有大量與肌動(dòng)蛋白相似的生物活性?！迨聦?shí)上相似″的意思是說活性程度不同但活性作用相同。比如，本發(fā)明的肌動(dòng)蛋白結(jié)合物的一個(gè)功能衍生物，它有與肌動(dòng)蛋白結(jié)合物相同的氨基酸鏈，包括依據(jù)診斷、治療需要所要的修飾，如翻譯后的修飾，結(jié)合磷酸酯或共價(jià)結(jié)合碳?xì)浠衔?糖)。這個(gè)詞也包括肌動(dòng)蛋白結(jié)合物的化學(xué)衍生物，這類衍生物可提高化合物的滲透性、吸收性、生物半衰期等。這類衍生物也可降低分子毒性，排除或減弱不必要的付作用等。衍生物和特殊化學(xué)部分是有這方面作用，可在Remington′s Pharmaceutical Science(1980)中見到。把這些部分和分子結(jié)合是眾所周知過程?！肮δ苎苌铩币辉~包括化學(xué)衍生物變異體，相似物或肌動(dòng)蛋白結(jié)合物的藥劑溶液。
“變異體”是指結(jié)構(gòu)和生物活性事實(shí)上與天然結(jié)合物或片段相似的物質(zhì)。
“同功物”只室功能上與天然肌動(dòng)蛋白結(jié)合相似的化合物，如肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的同功物的氨基酸序列不同于肌動(dòng)蛋白，但它與肌動(dòng)蛋白有同源性，表現(xiàn)為只具有肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的生物活性。
“可接受的藥用性鹽”是指這項(xiàng)發(fā)明中肌動(dòng)蛋白結(jié)合物的鹽。這類鹽可以從藥用性酸或堿中得到，酸硫酸鹽、鹽酸鹽、含氮鹽、磷酸鹽等；堿強(qiáng)堿、堿金屬氧化物，銨氫氧化物、烷基胺氫氧化物等。
“生物活性”是它們與肌動(dòng)蛋白結(jié)合及修飾它變?yōu)榱硪环N形式的能力，而這種形式相對(duì)于未經(jīng)修飾的肌動(dòng)蛋白而言，對(duì)動(dòng)物的毒性較弱。這種修飾可能只是與化合物結(jié)合或者有這種結(jié)合導(dǎo)致化學(xué)及酶反映所致。
本發(fā)明中主要的成分是肌動(dòng)蛋白結(jié)合分子，來源于經(jīng)純化的天然和重組肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)。此外，還有其它非蛋白類肌動(dòng)蛋白結(jié)合分子和生物活性片段，有獨(dú)特的肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)，這部分具有生物活性，它能將肌動(dòng)蛋白分裂為單體形式或迅速解離肌動(dòng)蛋白或覆蓋對(duì)宿主細(xì)胞有毒的游離肌動(dòng)蛋白位點(diǎn)，肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)所具有的這些生物活性也可通過合成、酶催化、蛋白分解，化學(xué)或重組DNA方法得以實(shí)現(xiàn)。
給需要這方面治療的病人提供凝膠溶素或肌動(dòng)蛋白結(jié)合片段和DBP時(shí)，另外一些非常好的肌動(dòng)蛋白結(jié)合物也可使用，包括β4胸腺素和ASP—56。另一個(gè)具體應(yīng)用是給需要這方面治療的病人用凝膠溶素或肌動(dòng)蛋白結(jié)合片段，或以上兩種與DBP及DNA酶I聯(lián)合使用。
本發(fā)明中的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的非腸道給藥制劑，包括無菌水或非水溶劑，懸浮液和乳劑。非水溶劑如丙二醇、聚乙二醇、植物油、魚油和可注射用的有機(jī)酯。水性載體包括水、水—乙醇溶液；乳劑或懸浮液包括鹽和醫(yī)用非腸道途徑的載體緩沖液，有氯化鈉溶液、格林葡萄糖溶液、葡萄糖加氧化鈉溶液。格林溶液包括乳糖或混合油。靜脈用載體包括流質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)再生劑量、電解液，它們都以格林葡萄糖基礎(chǔ)成分。發(fā)明中的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白也可以用泵的方式使之持續(xù)釋放，尤其適用于慢性損傷而非急性病。用持續(xù)釋放的方法給藥對(duì)需要長(zhǎng)時(shí)期反復(fù)注射的病人更方便。比如，對(duì)患有遺傳性或慢性與肌動(dòng)蛋白相關(guān)疾病的患者用持續(xù)釋放的方式給入肌動(dòng)蛋白結(jié)合物是一個(gè)十分理想的用藥方法。
肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白可以使用多種形式的劑型，如片劑、膠囊，粉劑或水溶液，口服。只要這種生物蛋白不會(huì)被消化過程破壞并且該化合物能通過腸道組織的吸收就行。
本發(fā)明提供的藥劑組成是依據(jù)已知的那些技術(shù)，如傳統(tǒng)的混合，制粒，糖錠，溶解，凍干或相類似的過程。發(fā)明中的組成成分對(duì)控制由肌動(dòng)蛋白引起的急慢性損傷有用。發(fā)明中的成分直接針對(duì)機(jī)體自身處理血流或胞外組織的肌動(dòng)蛋白。本發(fā)明的靜脈用劑型賦予足夠快的生效，對(duì)組織急性損傷潛在時(shí)期開始生效。
肌動(dòng)蛋白可以從它們自然的或重組資源中通過分離純化得到從而使之免于自然污染。這只是根據(jù)傳統(tǒng)條件和以往分離蛋白的技術(shù)而定，比如提取法，沉淀法，色譜法及親和層析法，電泳等。鑒別肌動(dòng)蛋白化合物的結(jié)合區(qū)可使用無須繁重實(shí)驗(yàn)的技術(shù)，況且檢測(cè)肌動(dòng)蛋白結(jié)合物的結(jié)合區(qū)是本發(fā)明中務(wù)須實(shí)施的一項(xiàng)工作。例如，天然肌動(dòng)蛋白結(jié)合物的衍生物或重組的肌動(dòng)蛋白結(jié)合物的衍生物可以用蛋白酶水解肌動(dòng)蛋白結(jié)合物而獲得，如胰蛋白酶、糜蛋酶、枯草桿菌蛋白酶。用肌動(dòng)蛋白衍生物樹脂可以分析這些片段結(jié)合肌動(dòng)蛋白的能力。
確定化合物或片段是否具有分離肌動(dòng)蛋白活性是大家所關(guān)心的，這些化合物的功能可以通過普通的技術(shù)確定，如通過解離范標(biāo)記的F—肌動(dòng)蛋白的速率確定。
此外，這些碎片也可以根據(jù)它們與已知的肌動(dòng)蛋白結(jié)合物或裂解肌動(dòng)蛋白功能區(qū)是否有同源性而確定它們功能的同源性。如肌割蛋白、凝膠溶素和絨毛蛋白，尤其是肌割蛋白的40—351位氨基酸殘基和凝膠溶素的63—383位氨基酸殘基存在廣泛的同源性，這些區(qū)域是裂解F—肌動(dòng)蛋白的主要功能區(qū)。
例如，凝膠溶素的N—末端和tryptic(胰蛋白的)碎片N—末端知道為CT45，CT45有解離F—肌動(dòng)蛋白的能力并且有兩個(gè)肌動(dòng)蛋白結(jié)合位點(diǎn)，因此有效量的純化CT45可以給患者使用。這些殘基位點(diǎn)之一是在胰凝乳蛋白片段(chymotryptic fragment)。CT15N(人類凝膠溶素殘基24—150)它可與F—肌動(dòng)蛋白單體、多聚體末端結(jié)合，且具有很高的親和力；另一位點(diǎn)在鄰近片段CT28N(殘基151—406)，它與F—肌動(dòng)蛋白側(cè)鏈結(jié)合，以多磷酸肌醇位點(diǎn)調(diào)節(jié)方式(in a polyphosphoinositide—regulated manner)。任何片段自身都不可能解聚肌動(dòng)蛋白絲。最小的具有解離F—肌動(dòng)蛋白能力的凝膠多肽是在血漿凝膠溶素25—165個(gè)殘基位點(diǎn)完成的。
另外，象肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白這類化合物存在于多種動(dòng)物體內(nèi)且很容易從非人類(牛、豬)血漿和肌肉組織中分離得到，而且這些蛋白片段也可通過化學(xué)或酶的方法得到。在這種情況下給需要這種治療的患者使用肌動(dòng)蛋白結(jié)合物不會(huì)引起嚴(yán)重的免疫反應(yīng)。
在這部申請(qǐng)書中引用的所有參考書目都是查閱得來的?，F(xiàn)已對(duì)這項(xiàng)成果進(jìn)行了一段表述，下面將進(jìn)一步講述完成這項(xiàng)用到的材料、方法的實(shí)例。但例子不只是限于本發(fā)明。
例1囊性纖維變性患者咳出的痰液標(biāo)本，其中一些是接受了霧化DNA酶I治療的。把它融解并分成幾個(gè)部分。這個(gè)實(shí)驗(yàn)過程有shat等人描述過(proc.Natl Acad Sci USA 879188—9192 1990)，因?yàn)橐呀?jīng)明確了DNA酶I對(duì)痰液粘滯度的影響，用純化的血漿凝膠溶素代替DNA酶I，這種蛋白非共價(jià)鍵地裂解肌動(dòng)蛋白多聚體。在E.colin內(nèi)產(chǎn)生的重組凝膠溶素片段包括了凝膠溶素的1—260個(gè)氨基酸殘基(凝膠溶素2601)，同樣有與肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合的能力，可用于治療。這些蛋白對(duì)DNA的作用還不知道。shak等在囊性纖維變性痰液的流動(dòng)性實(shí)驗(yàn)中得到了相同的結(jié)果(Proc.Natl.Acad，Sci USA 879188—9192 1990)。盡管凝膠溶素片段仍比凝膠溶素更有效(表1)。
150mg的痰液樣品用剃胡刀分割并放入試管中，這些為50ml容量的試管包含有已被標(biāo)記的添加物，樣品在使館中的37℃環(huán)境中孵育，按下表隔一段時(shí)間把試管顛倒，把痰液沿帶標(biāo)簽的試管壁倒流情況記錄下來。0、無移動(dòng)，Tr＝＜10％痰液沿倒置使館側(cè)壁流動(dòng)；1+＝10—20％痰液流動(dòng)；2+＝20—50％痰液移動(dòng)；3+＝75％的痰液移動(dòng)；4+＝所有痰液移動(dòng)。

這個(gè)實(shí)驗(yàn)用另一批痰樣品重復(fù)，有相同結(jié)果，煮沸的凝膠溶素片段無活性。
例2痰液研究采用較正式的流變分析方法，包括搖動(dòng)擺。參看圖1A囊性纖維變性的痰液硬度和粘彈性非常大，短時(shí)給予的壓力可引起很高頻率的振動(dòng)，從中可計(jì)算出彈性系數(shù)(G′)，假如凝膠溶素(圖1B)和凝膠溶素片段(1C)可減少振動(dòng)頻率，分別將系數(shù)降低3和10倍。此外，假如較高濃度的片段化凝膠溶素更有效。囊性纖維變性痰液對(duì)穩(wěn)定的應(yīng)力的強(qiáng)度反映可以顯示出固有的韌性或很差的順應(yīng)性，然而假如凝膠溶素及其片段，依據(jù)劑量依賴方式，可見它能增加痰液的順應(yīng)性，然而，所有樣品解除應(yīng)力后又見它們都恢復(fù)到最初狀態(tài)。表明粘合的多聚體可能是粘液多糖和DNA仍在凝膠中。
例3若丹明鬼筆環(huán)肽(Rhodamine phalloidin)可以與肌動(dòng)蛋白多聚體結(jié)合，加入囊性纖維變性痰液樣品中，可在相對(duì)照和熒光顯微鏡下觀察。樣品包含的胞內(nèi)碎片，被認(rèn)為是肌動(dòng)蛋白和DNA的來

源，能顯出很強(qiáng)的熒光，未經(jīng)治療的和經(jīng)凝膠溶素片段治療的痰液放在15M的NaCl溶液5ml內(nèi)稀釋、離心。在280nm處的吸收峰可以確定痰液中蛋白的釋放量。結(jié)果見表2，表中出示了凝膠溶素和260KDa片段使蛋白從痰液塞中釋放的情況。
表2分析與凝膠溶素一起孵育的囊性纖維變性痰液釋放的蛋白質(zhì)，從確定了光密度的溶液上清液中取50μl的樣品，加入等量的含有十二烷基硫酸鈉和β—巰基乙醇緩沖液?；旌弦褐械亩嚯目赏ㄟ^聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，凝膠用考馬斯亮蘭染色，在含有凝膠溶素和凝膠溶素片段溶液膠中有許多不同的蛋白質(zhì)和大量的三種蛋白，包括一種與肌動(dòng)蛋白一起移動(dòng)的作為分子量參照的標(biāo)準(zhǔn)蛋白。
抗肌動(dòng)蛋白免疫點(diǎn)雜交研究囊性纖維變性痰液，從兩個(gè)不同病人身上獲得的囊性纖維變性痰液懸浮在等量的0.15M NaCl和20mM Tris—HCl，中，PH＝7.0，并且搖勻。50μl的樣品加入等量的SOS凝膠緩沖液并且用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。把凝膠多肽轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上，肌動(dòng)蛋白帶用抗肌動(dòng)蛋白抗體鑒別。這條帶可以在含有痰液的部位看見。結(jié)果證明在囊性纖維性痰液中會(huì)有肌動(dòng)蛋白。
例4用肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白溶解膿性粘液。從CF病人得到的新鮮痰液樣品需要在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)試驗(yàn)，在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用流動(dòng)分析法對(duì)商品中DNA酶I與純化的血漿凝膠溶素直接比較(表3)。
表3濃度μg/ml

因?yàn)镈NA酶I分子量31,000，凝膠溶素分子量為84,000，凝膠溶素被認(rèn)為更加有效。且迅速發(fā)揮與預(yù)期的化學(xué)計(jì)算量一致的作用。但DNA酶作用緩慢開始，因?yàn)镈NA酶的作用方式更加趨向于失去單體末端的方式，而不是傾向于肌動(dòng)蛋白多聚體解聚作用方式或酶對(duì)DNA的催化作用方式。
凝膠溶素和DNA酶I主要對(duì)CF痰液粘滯度產(chǎn)生影響，比較凝膠溶素和DNA酶I對(duì)CF痰粘滯度的影響程度，可以通過測(cè)定加入不同濃度的這些化合物對(duì)樣品痰液粘滯度的影響來分析。
痰液樣品是將CF病人咳出的痰液收集在一起得來的，要么立即用于實(shí)驗(yàn)，要么凍在液氮里和貯于-20℃中。經(jīng)這種方法處理的樣品與新鮮樣品的特性無顯著性差異。
粘滯度通過搖動(dòng)擺測(cè)定，并且通過在125mpa應(yīng)變壓力條件下把樣本的曲線上升段變化率計(jì)算出來。參見P.A.Janmey，JBiochem.Biophys.Methods，2241.1991。0.25ml相同的粘液塞從整塊痰樣品粘團(tuán)中切出并把它放在轉(zhuǎn)動(dòng)的有蓋滑片上，10微升緩沖液A(加或不加添加劑)加入50，75，150，250或500nM純化的人凝膠溶素或加100、250、500、600或750nM牛胰DNA酶I(worthingto Biochemical，F(xiàn)reahold，New Jersey)，將這些成分加入痰樣品中。每個(gè)病人的痰液樣品的粘滯度在培養(yǎng)60分鐘后測(cè)出每一個(gè)添加濃度，重復(fù)兩次實(shí)驗(yàn)。
見表4和圖3，凝膠溶素既使在最低濃度條件下都可見它顯著地降低了粘滯度，相反，DNA酶I濃度在500nM以下時(shí)對(duì)粘滯度無影響。
表4

例5DNA酶I和凝膠溶素協(xié)同作用，蛋白質(zhì)釋放的濃度依賴關(guān)系，從蛋白質(zhì)釋放的實(shí)驗(yàn)中可以看出三個(gè)囊性纖維變性病人得到的痰液樣品的蛋白釋放濃度依賴粘液的溶解性。痰液樣品等量懸浮于0.5ml的0.15M NaCl溶液中，該溶液包含純化的血漿凝膠溶素，濃度分別為2.0mg/ml，4mg/ml，7mg/ml，21mg/ml，在37℃中培養(yǎng)30分鐘后樣品離心，在波長(zhǎng)λ、280n.m處測(cè)定上清溶液的光密度。用相對(duì)值，A280讀數(shù)如下2μg/ml0.25；4μg/ml1.30；7μg/ml1.86；21μg/ml180。A280在4μg/ml DNA酶I時(shí)約0.5，在4μg/mlDNA酶I加2μg/ml凝膠溶素時(shí)1.3。凝膠溶素在低劑量時(shí)可以有較強(qiáng)的溶解性但是DNA酶I在該濃度基本無作用。
凝膠溶素和DNA酶I聯(lián)合使用對(duì)CF痰液粘滯度影響。明確凝膠溶素與DNA酶I聯(lián)合用是否在降低粘滯度上有協(xié)同作用，我們可以通過測(cè)定加入其一或兩種化合物的痰液樣品的粘滯度中看出來。
從CF病人咳出的痰中收集痰樣品并且立即用于實(shí)驗(yàn)或凍在液氮里貯藏于-20℃條件下，貯存樣品的流體特性與新鮮標(biāo)本無差別。
用扭轉(zhuǎn)擺測(cè)定粘滯度，并在125mpa應(yīng)變壓力條件下強(qiáng)度變化率來計(jì)算粘滯度。參見P.A.Janemy，J.Biochem BiophysMethods，2241 1991。0.25ml相同的粘液塞從痰樣品粘團(tuán)中切出來，并且把這個(gè)粘液塞放在轉(zhuǎn)動(dòng)的有蓋滑片上，10微升緩沖液A(不加添加劑)加250nM純化的人凝膠溶素，250ml牛胰DNA酶I(Worthington Biochemical，F(xiàn)reehold，New Jersey)或加250nM凝膠溶素和DNA酶I混合液，將它們分別加入樣品中，然后按壓懸掛在晃動(dòng)擺盤上的有蓋的滑片。每一個(gè)病人的痰液樣品粘滯度分別在加入緩沖液15、30、45、60分鐘后測(cè)定兩次。
如圖4所示，凝膠溶素和DNA酶I聯(lián)合使用比單獨(dú)使凝膠溶素大大降低了痰液粘滯度。而在同樣濃度的DNA酶I則對(duì)粘滯度無作用。相同病人來源的痰液樣品只用緩沖液A處理，其粘滯度在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中無變化。
例6結(jié)合肌動(dòng)蛋白的化合物的混合物對(duì)CF痰的作用，測(cè)定結(jié)合肌動(dòng)蛋白化合物的聯(lián)合使用對(duì)CF痰液粘滯度的影響和痰液樣品加入凝膠溶素和GC球蛋白(維生素D結(jié)合蛋白)后粘滯度的變化。
從5個(gè)CF病人中得到32個(gè)痰液樣本，樣本立即實(shí)驗(yàn)或凍在液氮里保存于-20℃的中。貯后樣品的流體特性與新鮮樣本無差異。
用晃動(dòng)擺測(cè)定粘滯度，并在125mpa應(yīng)變壓力條件下從樣品曲線上升段的強(qiáng)度變化率中求出粘滯度，參見P.A.Janmey，J.Biochem Biophys Methods 2241 1991.0.25ml相同的粘液塞從痰樣品粘團(tuán)中切出來，并把這個(gè)粘液塞放在轉(zhuǎn)動(dòng)的有蓋滑片上。10μl緩沖液A不加或加250nM人純化凝膠溶素和GC球蛋白(Calbiochem，La Jolla California)混合物加入每個(gè)樣品中，按壓與懸吊的晃動(dòng)擺盤相對(duì)位置的帶蓋滑片，來源于每個(gè)病人的樣本分別在加入緩沖液后15、30、45、60分鐘測(cè)其粘滯度，測(cè)試兩遍。
如圖5所示，凝膠溶素與GC球蛋白聯(lián)合使用能迅速降低痰樣本的粘滯度。相同病人痰液經(jīng)緩沖液A處理后的粘滯度無變化。
到現(xiàn)在為止，已全面地描述了這項(xiàng)發(fā)明，本領(lǐng)域人員應(yīng)明白在不影響本發(fā)明范圍或其任何實(shí)施方案下，條件參數(shù)等也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.溶解呼吸道疾病患者氣道內(nèi)病理狀態(tài)下的粘液或膿性粘液的一種方法，包括將有效劑量的一或多種結(jié)合肌動(dòng)蛋白的化合物而不是DNA酶I，或者應(yīng)用其片段或功能衍生物給藥于呼吸道患者。
2.降低呼吸道疾病患者氣道內(nèi)病理狀態(tài)下的粘液或膿性粘液的粘滯度的一種方法，包括將有效劑量的一或多種結(jié)合肌動(dòng)蛋白的化合物而不是DNA酶I，或者其片段或功能衍生物給藥于呼吸道患者。
3.治療由于病理狀態(tài)下氣道粘液或膿性粘液引起的氣道阻塞的一種方法，包括將有效劑量的一或多種結(jié)合肌動(dòng)蛋白的化合物而不是DNA酶I，或用其片段或功能衍生物給藥于呼吸道患者。
4.權(quán)利要求1—3中任何一種方法至少有一個(gè)肌動(dòng)蛋白結(jié)合物具有分離肌動(dòng)蛋白絲的活性。
5.權(quán)利要求中，結(jié)合肌動(dòng)蛋白的一種化合物或幾種化合物是從一組化合物中選擇出來的，這組化合物包括凝膠溶素，絨毛蛋白(villin)，片段化蛋白(fragmin)和肌割蛋白(severin)。
6.權(quán)利要求4的方法，其中結(jié)合肌動(dòng)蛋白的化合物是指凝膠溶素或有活性的片段或功能衍生物。
7.權(quán)利要求6中的活性片段是指胰凝乳蛋白酶片段的CT45。
8.權(quán)利要求6中的活性片段包括凝膠溶素的第25—165位氨基酸殘基。
9.權(quán)利要求1—3中的任何一項(xiàng)的方法，其中至少有一種結(jié)合肌動(dòng)蛋白的化合物解離復(fù)合物中的肌動(dòng)蛋白單體以抵制聚合。
10.權(quán)利要求9的方法，其中的結(jié)合肌動(dòng)蛋白一種化合或幾種化合物選自維生素D結(jié)合蛋白，cofili，抑制蛋白，和蠶食蛋白。
11.權(quán)利要求1—3中任何一個(gè)方法，其中一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合物是凝膠溶素或活性片段或功能衍生物，另一個(gè)結(jié)合肌動(dòng)蛋白的化合物是維生素D結(jié)合蛋白。
12.權(quán)利要求1—3中任何一個(gè)方法，其中DNA酶I是以聯(lián)合給藥形式給患者的。
13.權(quán)利要求1—3中任何一項(xiàng)的方法，其中病理氣管內(nèi)容物，粘液或膿性粘液是與一組疾病，包括囊性纖維變性，慢性支氣管炎，粘液樣支氣管炎惡化為粘液膿性或膿性支氣管炎，細(xì)支氣管炎，廣泛的細(xì)支氣管炎，膿性肺炎，肺泡硬化，哮喘，伴或不伴哮喘的支氣管擴(kuò)張粘液阻塞，急性或慢性膿性竇炎，膿胸，支氣管擴(kuò)張，或人呼吸道綜合癥(ARDS)，移植后的管腔閉塞性細(xì)支氣管炎和過敏性細(xì)支氣管炎(肺泡纖維化)有關(guān)。
14.藥物組合物，其包括一種或多種結(jié)肌動(dòng)蛋白的化合物和對(duì)患有呼吸道疾病的人可以接受的藥劑載體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的藥物組合物，其中肌動(dòng)蛋白結(jié)合化合物選自凝膠溶素其片段或功能衍生物，維生素D結(jié)合蛋白，凝膠溶素或其片段或功能衍生物與維生素D結(jié)合蛋白的混合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的藥物組合物，其中凝膠溶素片段是指胰乳蛋白酶片段CT45。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的藥物組合物，其中凝膠溶素片段含血漿凝膠溶素25—165氨基酸殘基。
全文摘要
本發(fā)明涉及改善氣流不暢的患者的正常呼吸道氣流和存在的病理性氣管內(nèi)容物，尤其是粘液內(nèi)容物引起的阻塞的方法。肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白被給予病理呼吸狀態(tài)的患者呼吸道，該狀態(tài)包括存在內(nèi)容物。該肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白與內(nèi)容物中肌動(dòng)蛋白聚合物結(jié)合并降低粘度。該肌動(dòng)蛋白也可防止肌動(dòng)蛋白與內(nèi)服或外服DNA酶結(jié)合，從而增叫了內(nèi)容物中DNA聚合物降解。
文檔編號(hào)C07K14/47GK1122108SQ94191951
公開日1996年5月8日 申請(qǐng)日期1994年4月4日 優(yōu)先權(quán)日1993年4月2日
發(fā)明者T·P·斯托塞爾, S·E·林德, P·A·簡(jiǎn)梅 申請(qǐng)人:布里格哈姆婦女醫(yī)院