專利名稱：：活性抗病毒聚合物的組成及應用方法這一申請是1993年2月24日提出的、編號為08/022,055、有待審批的申請的部分延續。本發明涉及一些用于治療由RNA病毒引起的疾病(如AIDS)的新型組合物及方法。本發明也提供了一種制備此類疾病的疫苗的方法。此外，該組合物還可用于抑制核糖核酸酶。盡管世界范圍的努力，對于人類免疫缺陷病毒(HIV)，迄今為止，所有試圖求助超突變的有規立構聚合物研制出一種有效的抗-AIDS藥物或疫苗的努力均告失敗。突變的有規立構聚合物至今也同樣妨礙著試圖研制出抗-其它RNA病毒所致疾病(諸如白血病和流感)的有效疫苗的努力。對付諸如HIVAIDS(獲得性免疫缺陷綜合征)病毒等RNA病毒的方法之一，是滅活HIV的逆轉錄酶(HIVRT)。遺憾的是，由于此病毒的突變率很高，至今仍無法研制出一種有效的抗-HIV的藥物或疫苗。此高度可變的HIV能迅速對所有已知的小分子量(Mr＜1000道爾頓)抑制劑(如，疊氮胸苷(AZT)、2′，3′-雙脫氧胞苷(ddC)、2′，3′-雙脫氧肌苷(ddI)及nevirapine等)產生耐受性[Larder，etal.，Seience243，1731(1989)；Larderandkemp，Science246，1155(1989)；St.Clair，etal.，Science253，1557(1991)；Shih，etal.，Proc.Natl.Acad.Scl.USA88，98/8(1991)]。已知(ChuanandWang，J.Biol.Chem.263，13003(1981))，親和劑3′-O-(5-氟-2，4-二硝基苯基)ADP醚及3′-O-(5-氟-2，4-二硝基苯基)ATP醚能夠標記線粒體F1-ATP酶的活性位點并抑制該ATP酶。然而，3′-O-(5-氟-2，4-二硝基苯基)ADP醚及相應的ATP醚需要上百萬倍高的摩爾濃度，才能抑制HIV的逆轉錄酶(HIVRT)，它們均不能以突變-不敏感的方式抑制HIVRT或其它RNA病毒。也已知(FukuiandDeClercq，BiochemJ203，755-760及Shannon，Ann.N.Y.Acad.Sci.284，472-507)抗病毒化合物，如聚(2-氟腺苷酸)、聚(2-溴腺苷酸)、聚(2-碘腺苷酸)及1-(4-氟芐氧基)腺苷聚腺苷酸等，可抑制逆轉錄酶。所有這些化合物都是通過將鹵素原子或其它基團連接到聚合物中的腺嘌呤殘基上衍生而來。這些化合物中最好的是(fl2A)n，它可抑制鼠白血病逆轉錄酶，其IC50為0.04μg/ml。本發明的FDNP-poly[A]能抑制此相同的RT(逆轉錄酶)，IC50為0.0017μg/ml(濃度低23倍)。本發明的一個實施方案提出了一種組合物，該組合物含有Y-poly[A]，它可用公式Mn(Y)mXi[A]n表示，其中[A]n＝含有n個腺苷酸殘基的多聚腺苷酸(5′)，Y＝FDNP，DNP，或部分為FDNP和部分為DNP，FDNP＝3-氟-4，6-二硝基苯基，通過醚鍵共價結合到[A]n的n個2′-羥基的m個上，DNP＝2，4-二硝基苯基，通過醚鍵共價結合到[A]n的n個2′-羥基的m個上，X＝一個酰基，i＝0或1，M＝一個陽離子，用來為該組合物提供所需的溶解度，而且具有如下之一的一般結構或并且其Y基團與腺嘌呤單位的比例至少為約1∶5；其中的n足夠大，使得Y-poly[A]能完全徹底地填充RNA病毒逆轉錄酶的活性位點裂口，從而有效地滅活逆轉錄酶，和/或能有效地滅活核糖核酸酶。本發明的另一個實施方案包括一種治療一種由RNA病毒所致疾病的哺乳動物的方法。該方法包括給該哺乳動物施用有效治療劑量的Y-poly[A]。本發明的另一個實施方案是一種暫時性地保護一種健康哺乳動物免受RNA病毒感染的方法。該方法包括給該哺乳動物施用有效預防劑量的Y-poly[A]。本發明的另一個實施方案包括制備抗-RNA-病毒疫苗的方法及接種疫苗以提供對RNA病毒所致疾病的預防的方法。該方法包括，向一個病人引入一種抗原，此抗原包括一種已被Y-poly[A]不可逆地滅活的RNA病毒，其中的Y至少部分為FDNP，從而使病人產生一種或多種抗該抗原的抗體，這些抗體也包括抗RNA病毒的抗體。本發明的另一個實施方案包括一種在用于輸注的血液等分樣品中消除RNA病毒的方法。該方法包括，向此血液等分樣品中加入有效消毒劑量的Y-poly[A]，其中的Y至少部分為FDNP。本發明的另一個實施方案包括一種從溶液中去除核糖核酸酶的方法。該方法包括，將此溶液通過一個含有固相化FDNP-poly[A]或DNP-poly[A]的親和柱。核糖核酸酶也能通過在核糖核酸酶溶液中加入有效量的Y-poly[A]被不可逆地抑制，其中Y至少部分為FDNP。根據本發明的一個實施方案的另一個有用的方法是不可逆地滅活RNA病毒。該方法包括將該RNA病毒與一種滅活此RNA病毒有效劑量的FDNP-poly[A]接觸。本文提出了一種新型的聚合物抑制劑，它能緊緊地結合到并完全徹底地填充HIV逆轉錄酶(HIVRT)活性位點上的長結合裂口上。我們合成了這種新型抑制劑，并且發現它可迅速滅活溶液中的HIVRT，而且，如果其Y-poly[A]中的Y至少部分不可逆地是FDNP時，它能使易感性淋巴細胞在往培養皿中加入活的HIV后仍能繼續它們的正常生長。該抑制劑中，DNP-和/或FDNP-基團共價結合到聚合物的核糖殘基上。這些抑制劑是功能-特異性的，因此其毒性低，但不是種屬-特異性的，因而被認為是突變-不敏感性的(mutation-insensitive)。本文公開了這種組合物和其在五種不同的藥學和生物技術學應用中這些新型化合物的使用方法。基于以下的基本原理，我們研制出了一組突變-不敏感性的抑制劑。最近的晶體學研究表明HIVRT中的聚合酶位點包含一個開放末端裂口(open-endcleft)，此裂口的長度足以容納一個長度為25至30個殘基的RNA片斷[K＜i，etal.，Science256，1783(1992)；Arnold，etal.，Nature357，85(1992)]。可以推測，此活性裂口優先地結合多聚腺苷酸(5′)(以下簡稱“poly[A]”)，因為poly[A]-[dT]12復合物已被成功地而且相當頻繁地作為模板-啟動子(template-promoter)使用于體外逆轉錄實驗中。因此，將疏水基團連接到poly[A]的2′-OH位置上，以改善與RT的結合親和性，而不影響其模板功能。所得的poly[A]衍生物能夠結合到HIVRT上，完全徹底地填充其活性位點裂口，并可作為一種多功能親和劑。鑒于慣常使用Sanger試劑1-氟-2，4-二硝基苯基來標記蛋白質的親核基團，我們把親電子的3-氟-4，6-二硝基苯基(FDNP)基團通過醚鍵結合到poly[A]的2′-OH位置上，方法參照已發表的用于單核苷酸的程序[ChuanandWang，J.BiOl.Chem.263，13003(1981)，其內容引入本文作為參考]。這些親電子的FDNP基團不可逆地與逆轉錄酶活性位點裂口的親核基團反應并與其結合，因此可阻斷逆轉錄酶的作用。所獲得的聚合物衍生物(稱為FDNA-poly[A])的結構，可用如下所示的結構式表示，其通式為Mn(FDNP)mXi[A]n，其中[A]n＝含有n個腺苷酸殘基的多聚腺苷酸(5′)，FDNP＝3-氟-4，6-二硝基苯基，通過醚鍵共價結合到[A]n的n個2′-羥基的m個上，X＝一個酰基，i＝0或1，M＝一個陽離子，用來為該組合物提供一個所需的溶解度，并且具有如下之一的一般結構或我們進一步發現，DNP-poly[A]在滅活逆轉錄酶及核糖核酸酶中也有效。事實上，雖然DNP-poly[A]的作用是可逆的，發現，如果每1.5個腺嘌呤殘基結合一個DNP-基團，此DNP-poly[A]的效率約是FDNP-poly[A]的12倍(也就是說，其十二分之一的劑量具有相同的效率)。此聚合物衍生物(稱為DNP-poly[A])具有如下所示的結構式。用通式表示Mn(DNP)mXi[A]n，其中[A]n＝含有n個腺苷酸殘基的多聚腺苷酸(5′)，DNP＝2，4-二硝基苯基，通過醚鍵共價結合到[A]n的n個2′-羥基的m個上，X＝一個酰基，i＝0或1，M＝一個陽離子，用來為該組合物提供一個所需的溶解度，并且具有如下之一的一般結構或在這兩種情況中，n都足夠大，使得Y-poly[A](其中Y＝DNP、FDNP或部分為DNP另一部分為FDNP)能完全徹底地填充RNA病毒逆轉錄酶的活性位點裂口，從而有效地滅活逆轉錄酶和/或能有效地滅活核糖核酸酶。一般最好n相對較大，以20或更大為合適，25或更大則更優。下面陳述的實驗用于制備一個相對較高分子量的Y-poly[A](h-Mr)、n≈270、m≈69、Mr≈1.1×105(其中Mr代表分子量)以及用于制備一個相對較低分子量的Y-poly[A](1-Mr)、n≈28、m≈9、Mr≈1.2×104。FDNP基團一般能以FDNP基/[A]不超過1∶4的比例結合到poly[A]上，DNP基團則能以一個相當高的比例(約1∶1.5)結合到poly[A]上。也能合成混合型的FDNP/DNP-poly[A]聚合物。一般地，首先使1，3-二氟-2，4-二硝基苯(DFDB)與poly[A]起反應，所得產物的FDNP/[A]的比例為約1∶4～約1∶10。然后，使此產物與1-氟-2，4-二硝基苯(FDNB)起反應。如此獲得的合成物就有一個盡可能高的(FDNP+DNP基團)/[A]的總比例，一般能大于1∶4，更優的能大于1∶2。陽離子(M)可以是任何一種陽離子，只要它能使該合成物達到一個足夠的濃度以完成預期的目的，如滅活核糖核酸酶、治療一種由RNA病毒引起的疾病、生產可用于接種的滅活(死的)病毒、消毒貯存的血液等等。在此報告的實驗中用的是鉀鹽，不過，也可用例如銨鹽、銣鹽、銫鹽或其它鹽來替代。一個重要的因素是Y基團與[A](腺嘌呤)單位的摩爾比。一般地說，單個Y-poly[A]化合物的效率隨著Y/[A]的摩爾比的增加而增加。因此，理想的是，此比例能相當高。一般，此比例至少應為約1∶10，如果比例能更高些，如1∶5或更高，則更優。在此報告的實驗則是用比例為1∶1.5、1∶3.9及1∶4.8的Y-poly[A]化合物進行的。更高的比例將更理想。我們發現，在納摩爾濃度時，Y-poly[A]即是一種逆轉錄酶的有效抑制劑，因而它似乎是一種有效的抗-RNA病毒的治療藥物(而且也是一種有效的和，當Y至少部分為FDNP時，不可逆的核糖核酸酶的抑制劑)，而即使在微摩爾濃度下，它也不會抑制主要的宿主細胞酶(是在體外試驗中進行檢測的)，包括RNA-聚合物II、cAMP-依賴的蛋白激酶、丙酮酸激酶、己糖激酶及腺苷酸激酶。因此，可制定出既能有效地、不可逆地抑制RNA病毒中的逆轉錄酶，又不會抑制基本的細胞酶的劑量配方。Y-poly[A]能與核糖核酸酶結合，此功能可用來滅活和/或去除溶液中的核糖核酸酶。例如，可把Y-poly[A](其中至少有一部分Y是FDNP)加到核糖核酸酶的溶液中，從而不可逆地抑制核糖核酸酶。另一種方法，也是更可取的一種方法是將Y-poly[A]與一種親和材料結合(一般常與親和柱相連)，然后將含核糖核酸酶的溶液流過該柱，其中的核糖核酸酶被吸附到柱上，從柱中流出的溶液即為無核糖核酸酶的溶液。當使用此柱技術時，Y-poly[A]最好是DNP-poly[A]，因為FDNP-poly[A]中的FDNP基團在柱上會被水解，而一個DNP-poly[A]柱則能經洗滌后再次使用。所用的柱材料并不嚴格，實際上只要是Y-poly[A]能被結合上去的任何柱材料都行。例如，我們曾用過一個纖維素柱。一個長的抑制劑分子(諸如Y-poly[A]，其FDNP基團的多個點可與HIVRT活性位點處的許多特定的氨基酸殘基共價結合，或其DNP基團的多個點可與HIVRT活性位點處的許多特定的氨基酸殘基非共價結合)，可選擇作為一種可能的突變-不敏感性抑制劑，因為某一次隨機突變極不可能改變所有這些特定的氨基酸殘基，以致此突變型的酶不能再結合Y-poly[A]，但仍能結合模板poly[A]。為了能繼續生存，這種高度可變性的HIV必須含有一種保持著一個長的活性位點裂口的RT。這種存活的突變型HIVRT要避免與此種抑制劑的結合，將是非常困難的。這一推論已被以下的觀察所證實盡管HIVRT、禽類成髓細胞瘤病毒逆轉錄酶(AMVRT)及莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄酶(MLVRT)的一級結構有極大的差別，但這三種逆轉錄酶在25℃下，在10分鐘或更短的時間內，均被納摩爾濃度的FDNP-poly[A]所滅活。經我們要求，由美國國立癌癥研究所(NCI)癌癥治療部(theDivisionofCancerTreatment)在治療開發計劃中(theDevelop-mentalTherapeuticsProgram)，對Y-poly[A](h-Mr)和Y-poly[A](l-Mr)作為可能的抗-HIV藥物，與易感的淋巴細胞和HIV一起進行體外試驗。結果發現，這些活性聚合物能有效地保持HIV中的淋巴細胞的存活(見下文實施例5)。由于這些聚合物是被設計用來滅活所有的逆轉錄酶的，因此它們也能被用來治療由RNA病毒所致的其它疾病，例如成人T細胞白血病/淋巴瘤，甲-、丙-、丁-、戊-型肝炎，流感，副流感(parainfluenza)，嬰兒細支氣管炎和肺炎，普通感冒，麻疹，流行性腮腺炎等等。因此，由以下的RNA病毒(并不局限于所列舉的)引起的疾病都可用本發明進行控制，如HTLV(成人T細胞白血病/淋巴瘤病毒)、HAV(甲型肝炎病毒)、HAC(丙型肝炎病毒)、HDV(丁型肝炎病毒)、HAC(戊型肝炎病毒)、HEV(流感病毒)、副流感病毒、RSV(呼吸合胞體病毒)、引起普通感冒的冠病毒(coronavirus)和鼻病毒、麻疹病毒、以及流行性腮腺炎病毒。其它RNA病毒所致的疾病也同樣可用本發明控制。為了使本發明被更好地理解，可參看以下實施例。實施例1Y-poly[A](h-Mr)的帶備程序1將10毫克多聚腺嘌呤鉀鹽(購自Sigma，Mr～1.1×105)溶于含0.5ml水和1.6ml0.2MK2CO3+1.5MKHCO3的溶液(pH9.2)中。攪拌下，將0.8ml含10倍過量的1，3-二氟-2，4-二硝基苯(DFDB)的丙酮溶液分三次等量加入上述溶液，每次間隔十二小時。室溫下反應48小時后，用7∶1(v/v)的二氯甲烷和二甲基亞砜混合溶劑多次萃取過剩的DFDB。所獲得的水溶液用SephadexG-25-80進行離心凝膠過濾，然后凍干。產物中3-氟-4，6-二硝基苯基與腺嘌呤基的摩爾比可以通過分別觀測330nm及259nm處的吸光率計算而得摩爾比為1/3.9，其中以3-氟-4，6-二硝基苯基乙醚(ε259＝3900，ε330＝6300)和一磷酸腺苷(AMP)(ε259＝15400)作為標準品。這樣，聚合物抑制劑平均每分子中含有270個腺嘌呤殘基和69個2′-O-FDNP基團。當pH值從9降低至5后，FDNP-poly[A](h-Mr)稀釋溶液的吸光率降低并不顯著(＜5％)。這一觀察表明，在制備過程中已被水解成不反應的3-羥基-4，6-二硝基苯基基團的3-氟-4，6-二硝酸苯基基團部分，在產物中所占的比例小于5％。產量＝3mg。程序2將10毫克的多聚腺嘌呤鉀鹽(購自Sigma，Mr～1.1×105)溶于0.5ml水和0.1ml0.1MK2CO3＋2.0MKHCO3的溶液(pH＝8.8)中。攪拌下，將0.4ml含5倍過量的1，3-二氟-2，4-二硝基苯的丙酮溶液分四次等量加入上述溶液中，每次間隔6小時。在反應過程中，檢測反應混合液的pH，并加入K2CO3和KHCO3以調整pH至8.8。并通過對反應混合液的薄層層析分析(TLC分析)監測反應的進程(它是時間的函數)將混合液滴在含有熒光指示劑的柯達纖維素平板上，用(20mMK2HPO4＋20mMKH2PO2)∶CH3CN＝2∶1(V/V)作為展開劑。最后，所有來自polyA的在Rf＝0.38處的帶都變弱，而在Rf＝0.77處一條新的FDNP-polyA的帶變強。繼續反應直至在Rf＝0.38處的帶消失后，一般是在室溫下進行24小時以后，過剩的DFDB用7∶1(V/V)的二氯甲烷和二甲基亞砜多次萃取移去。所得的水溶液用SephadexG-50-80凝膠過濾或進行透析，然后凍干。產物中的3-氟-4，6-二硝基苯基與腺嘌呤基團的摩爾比，可以從330nm和259nm處分別觀察到的吸光率計算而得，為1/4.8，其中，用3-氟-4，6-二硝基苯基乙醚(ε259＝3900，ε330＝6300)和一磷酸腺苷(ε259＝15400)作為標準品。此1/4.8的FDNP/腺嘌呤比例已被19F-NMR和31P-NMR兩種核磁共振證實。盡管與程序2相比，程序1所得產物的FDNP基與腺嘌呤基團的比率比較高、比較理想，但我們發現，反應48小時后，約有5％的5-氟基團被水解成羥基。當反應被限定在24小時時，則并沒有發現水解作用。由于水解產物不能與產物分離，因此，程序2更優。用1-氟-2，4-二硝基苯(FDNB)代替DFDB，可按程序2相似的方法合成DNP-polyA。在合成DNP-polyA時，讓polyA與過量的FDNB在室溫下反應48小時，產物DNP-polyA中DNP基團與腺嘌呤殘基的摩爾比為1/1.5。該比率高于FDNP-poly[A]中獲得的比例，因為后者為了避免5-氟基團發生明顯的水解作用，于48小時后終止了反應。實施例2FDNP-poly[A](l-Mr)的制備將867mg二磷酸腺苷(ADP，鉀鹽)、25mg一磷酸腺苷(AMP，游離酸)和393mgK2CO3溶于4ml水中，制得摩爾比為28∶1的ADP和AMP的混合液。不斷添加固體K2CO3，使溶液的pH值從8.2變到9.05。然后把該溶液與20μl含有1MMgCl2和8單位多聚核苷酸磷酸化酶(購自Sigma，從大腸桿菌中制得)的溶液混合。將混合液在37℃下孵育48小時后，通過SephadexG-25-80進行離心凝膠過濾以除掉所有ADP、AMP及分子量低于5000的寡聚核苷酸。測定259nm處的吸光率，顯示濾液中含有63mg產物FDNP-poly[A](l-Mr)。取1小份該FDNP-poly[A](l-Mr)溶液，過SephadexG-50-80柱進行第二次凝膠過濾，表明用這種方法制得的寡聚物中，有99.7％分子量Mr＜10000。隨后，用與前面所述相似的方法，使該FDNP-poly[A](l-Mr)與FDNB發生反應，以生成FDNP-poly[A](l-Mr)，FDNP基團/腺嘌呤殘基的摩爾比＝1/3.9。按上述程序2也合成了FDNP-poly[A](l-Mr)，得到的產物其FDNP/腺嘌呤的摩爾比為1/4.8。DNP-poly[A](l-Mr)的制備方法相似，產物的DNP/腺嘌呤的摩爾比為1/1.5。實施例3用FDNP-poly[A]對溶液中的病毒逆轉錄酶的不可逆性抑制將來自HIV的逆轉錄酶(HIVRT)樣本、來自莫洛尼鼠白血病病毒的逆轉錄酶(MLVRT)樣本、以及來自禽類成髓細胞瘤病毒的逆轉錄酶(AMVRT)樣本，分別與FDNP-poly[A]一起，在內含1mMMgCl2和125mMKCl的Tris-HCl緩沖液(0.1M，pH8.2)中，25℃下孵育，并測定RT的活性。每次實驗中，所選的酶都在25℃下與給定濃度的抑制劑的鉀鹽孵育10分鐘。10分鐘后，將孵育混合液迅速注入一測定液中，并在37℃下再孵育10分鐘，然后用三氯乙酸沉淀。經洗滌后，用閃爍計數法測定生成的放射性多聚核苷酸。測定混合液內含125mMTris-HCl(pH8.2)、1mMMgCl2、125mMKCl、250μM[3H]dTTP(作為底物)、和23nMpoly[A]-[dT]12(作為模板)。將每一種逆轉錄酶與FDNP-poly[A]在25℃下預孵育10分鐘所觀測到的殘留酶活性的百分率作為抑制劑濃度的函數作圖，并從圖中確定出抑制50％酶活性時所需的抑制劑濃度(IC50)。結果總結如下。用DNP-poly[A]也得到相似的結果。觀測所得的IC50值顯示，DNP-poly[A](h-Mr)、FDNP-poly[A](h-Mr)和FDNP-poly[A](l-Mr)在水溶液中均是逆轉錄酶的強抑制劑。動力學測定表明，DNP-poly[A]和FDNP-poly[A]都是與模板-引物多聚腺苷酸-十二胸苷酸(poly[A]-[dT]12)競爭HIVRT分子中的相同結合位點。將孵育后的混合液加到纖維素-寡聚[dt]柱上然后用洗脫層析分離，結果顯示，FDNP-poly[A]與逆轉錄酶是以共價鍵相連。因此，它對酶的滅活作用是不可逆的。上面的數據也顯示了，盡管在一級結構上有顯著的差異，這三種病毒逆轉錄酶(HIVRT、MLVRT及AMVRT)均被亞納摩爾濃度的FDNP-poly[A]在25℃下作用10分鐘后所滅活。這有力地說明了FDNP-poly[A]是突變-不敏感性的。實施例4DNP-poly[A]和FDNP-poly[A]對不同HIV逆轉錄酶的抑制DNP-poly[A]和FDNP-poly[A]對不同的突變型HIVRT的抑制作用由JoeC.Wu博士免費測定，其中逆轉錄酶來自4株不同的人類病毒HIV-1RT(野生型)、HIV-2(野生型)、HIV-145，215RT(AZT-耐受突變型，Thr(蘇氨酸)215→Tyr(酪氨酸)，Met(甲硫氨酸)41→Leu(亮氨酸))、及HIV-1181CRT(Nevirapine-耐受突變型)，用polyC-[dG]12-18作為模板、[3H]dGTP作為底物。檢測條件與實施例3中的相同。觀測到的IC50值總結如下表從這些實驗，我們發現，DNP-poly[A]和FDNP-poly[A]兩者都是所有這四種逆轉錄酶的強有力的抑制劑，而poly[A]本身并沒有抑制作用。實施例5DNP-、FDNP-poly[A](h-Mr)和FDNP-poly[A](l-Mr)對易感的淋巴細胞的抗HIV防護由美國國立癌癥研究所(NCI)癌癥治療部的治療開發計劃對FDNP-poly[A](h-Mr)、DNP-poly[A](h-Mr)及FDNP-poly[A](l-Mr)作為可能的抗-HIV藥物，使其與敏感的淋巴細胞與HIV在一起，作了體外試驗檢測。確認這三種抑制劑均是有效的。國立癌癥研究所草案中包括在微培養板中，把各種不同濃度的FDNP-poly[A](h-Mr)、DNP-poly[A](h-Mr)或FDNP-poly[A](l-Mr)與易感的T4淋巴細胞(CEM-SS細胞系)混合，其中含或不含HIV，將這些培養板孵育6天，然后用比色終點法測定剩下的活細胞數(方法參考Weislow，etal.，J.Natl.CancerInst.81，577-586(1989))。試驗結果顯示，在HIV存在的情況下，FDNP-poly[A]和DNP-poly[A]均可有效地保持淋巴細胞的存活力。觀測到的有效濃度(EC50)為FDNP-poly[A](h-Mr)為2.65±0.15μg/ml或24±2nM，DNP-poly[A](h-Mr)為0.2±0.1μg/ml或2±1nM。因此，這些聚合物都是有效的抗病毒試劑。兩種聚合物的可溶性鹽，均可直接用來治療被HIV感染的哺乳動物。其施藥方式為配成適當的溶液經非腸胃給藥，或制成藥丸口服給藥。實施例6在37℃下，0.01MHCl中并存在胃蛋白酶時Y-poly[A](h-Mr)的穩定性人體胃液中含有胃蛋白酶和大約0.01M的HCl。為了模擬人體胃內的酸性環境，我們將FDNP-poly[A]在0.01MHCl中37℃下孵育，結果發現0.01MHCl中孵育4小時以后，它作為HIVRT的一種不可逆性抑制劑，其功效僅下降50％。并發現DNP-poly[A]在同樣的條件下具有更高的穩定性。有關FDNP-poly[A]的結果列于下表。<在另一個單獨的實驗中，將FDNP-poly[A](h-Mr)(34nM)在37℃下、內含1.0mg/ml胃蛋白的0.01MHCl溶液中進行孵育。發現2小時后抑制劑的功效并不受影響，但孵育4小時后，其功效下降到65％。這些觀察結果提示，在胃液環境中，FDNP-poly[A]的抗HIV能力在2小時之內不會被破壞。因此，FDNP-poly[A]的固體鹽可以與適當的摻入物混合，壓成藥丸或包裝成膠囊，用于口服給藥。實施例7FDNP-poly[A]在37℃下人血清中的穩定性一份正常人血清冷凍標本(男性，AB型，購自Sigma)，解凍后用來溶解FDNP-poly[A](h-Mr)(34nM)。HIVRT的這種抑制劑的相對抑制效力，可以以37℃下，作為孵育時間的一個函數來確定，并列于下表<由于人血清中的FDNP-poly[A]在37℃下，孵育4小時后，其效力減少不超過20％，因此，該化合物可溶于適當的溶液中，用于非腸道給藥。實施例8使用FDNP-poly[A]完全而有效地滅活HIV用于研制有效的抗-HIV疫苗被FDNP-poly[A](或Y-poly[A]，其中Y部分為FDNP)完全而不可逆地滅活的HIV，也可以用作一種完全抗原，用于研制一種有效的抗-AIDS疫苗。全世界都在致力于發現一種預防AIDS的有效疫苗，至今尚未成功。用AIDS病毒的基因工程片段研制而成的疫苗，不能提供對AIDS的充分防護，其主要原因是病毒具有極高的突變率。最后報道了一種活的HIV減毒疫苗，在其nef基因中有一缺失，這種疫苗具有令人鼓舞的保護性作用[Daniel，etal.，Science258，1938(1992)]。這一新發現提醒了以往實踐中的研究人員，可利用完整病毒的減弱變形體(weakenedversion)來觸發保護性的免疫反應。例如，活病毒可用甲醛處理，使其減弱，這種減弱的病毒可以用作抗原以觸發免疫反應。但是，這是一個具有危險的程序，因為在醛和氨基之間形成席夫堿的反應是可逆的，該縮合反應的逆轉將會重新產生全活性病毒，這對于病人來說是致命的。由于Y-poly[A](其中Y至少部分為FDNP)可以使HIV發生100％有效和不可逆的失活，因此可利用Y-poly[A](其中Y至少部分為FDNP)為人類研制出一種真正有效的抗-AIDS疫苗—把滅活的HIV作為抗原導入病人體內，例如注射給病人。實施例9對貯存的輸注用血液中可能存在的痕量活HIV的滅活由于捐獻的血液中有可能存在即使是痕量的活HIV，對受血者(同樣地也對血液輸注人員)構成一種長期性威脅。那么可在存入血庫之前，往捐獻的血液中加入很少但足夠量的Y-poly[A](其中Y至少部分是FDNP)。由于不可逆性抑制劑的IC50會隨時間的延長而減小[KangandWang，J.Biol.Chem.，inpress，May1994]，當作為一種安全措施時，該加入的Y-poly[A]能把在貯存過程中可能存在的痕量HIV滅活。為了檢測Y-poly[A]的有效性，把HIVRT(57nM)與不同濃度的抑制劑(FDNP-poly[A](h-Mr))在25℃下孵育10分鐘。孵育后所剩的原始酶活性的百分率列于下表抑制劑濃度(nm)酶活性(％)01001.6894.87216.754254233294215506552600實施例10FDNP-poly[A]對核糖核酸酶的不可逆性抑制在生物技術工業及相關的研究室里，經常需要分離未受損的RNA大片段。為了避免RNA產物被痕量外源性核糖核酸酶作用，發生偶然裂解，常需要加入焦碳酸二乙酯(DEPC)把所有溶液預先煮一下，或者加入一種核糖核酸酶的抑制劑，通常是用可買到的商品RNasin(可購自Promega)。對于大規模操作來說，這兩種程序都是很昂貴的。我們發現，Y-poly[A](其中Y至少部分為FDNP)是核糖核酸酶的有效且不可逆的抑制劑，加入少量但已足夠量的這種Y-poly[A]既能不可逆地滅活可能存在于加工處理過程中所用的溶液或容器中的痕量核糖核酸酶。這種Y-poly[A]作為核糖核酸酶的有效抑制劑，其有效性可以從下面的實驗中看出來。核糖核酸酶A(RNaseA)的催化活性是通過監測300nm處的吸光率(A300)隨時間而減少來確定，因為在25℃下，溶液中的胞苷-2′，3′-環一磷酸(cCMP)被不斷催化水解。檢測液為內含1.9mMcCMP(鈉鹽)的50mM醋酸鹽緩沖液(pH5.0)。無FDNP-poly[A]的對照反應是將10μl54.4μM的RNaseA貯液注入到2.000ml檢測液中，混勻并監測A300隨時間的減小。做抑制研究時，則先把RNase與各種不同濃度的FDNP-poly[A](h-Mr)預孵育1.0分鐘，然后注入到cCMP溶液中開始檢測。結果總結如下。所有RNase的最終總濃度均為268nM，抑制劑濃度為54μM。</tables>這些數據表明，即使是在亞微摩爾濃度，每個FDNP-poly[A]分子都能迅速滅活很多外源性RNase分子。實施例11雙螺旋DNP-polyA-poly[dT]的有效性雙螺旋DNP-polyA-poly[dT]已被發現是比DNP-polyA更有效的HIV-1RT的抑制劑。這種雙螺旋DNP-poly[A]-poly[dT]可以通過混合兩種組分并在90℃下加熱5分鐘而生成。以polyC-[dG]12-18作為模板-啟動子，[3H]TTP作為HIV-1RT的底物，得到下表中所列的數據。</tables>很明顯，雙螺旋DNP-poly[A]-poly[dT]是比單鏈DNP-poly[A]更好的HIV-1RT的抑制劑。實施例12DNP-poly[A]向人細胞的自發遷移將100μl成人淋巴細胞樣本(2×106個細胞)與100μlRPMI(RoswellParkMemorialInstitute)培養基和60μlDNP[14C]poly[A](1.3mg/ml，比放為120cpm/pmole)混合。將混合液在37℃下孵育，并且每隔一段時間取出50μl等分液，經過濾、洗滌后測定其放射性將每一等分液點在一片濾膜上(FA1.0μm，Millipore)，抽濾，并用100mMKCl水溶液洗滌8次。最后每個已干燥的附有細胞的濾膜用液體閃爍計數系統作放射性檢測。下面是來自一個典型實驗的數據。這些數據表明，通過擴散作用或細胞內吞作用，疏水的DNP[14C]poly[A]能自發地遷移到成人的淋巴細胞中。而在相同條件下，[14C]poly[A]則根本不能進入這些淋巴細胞中。實施例13DNP-poly[A]向鼠白血病病毒的自發性遷移在一模型實驗中，用莫洛尼鼠白血病病毒和DNP-poly[A]來演示抑制劑能自發遷移到逆轉錄病毒(retrovirus)中。每次實驗中，5μl的病毒懸浮液與37.5nMDNP-poly[A]一起在冰上孵育。一段時間后，混合液經100,000g離心10分鐘。小心移除上清液并將沉淀(實際上看不見)用200μlTris緩沖液(50nMTris-HCl，pH7.8)洗滌。將沉淀在檢測緩沖液(50mMTris-HCl，pH7.8，60mMKCl、2mMDTT和0.6mM醋酸錳)中攪勻，然后與0.02poly[A]-寡[dT]、1.5mM[3H]dTTP及0.1％Triton-100一起在37℃下孵育60分鐘。用10％的TCA終止反應。測定所沉淀的放射性產品[3H]poly[dT]的cpm，以計算逆轉錄酶的催化活性(A)。實驗數據總結于下表中，其中A°代表與抑制劑一起孵育前的原始催化活性。這些數據顯示，DNP-poly[A]可以穿透鼠白血病病毒的包膜并且抑制其中的逆轉錄酶。這些數據表明，FDNP-poly[A]也能穿透HIV的包膜(envelop)并且產生一種永久性滅活的HIV，此滅活的HIV適合于用作抗-AIDS疫苗的一個理想的抗原。而在相同的條件下，[3H]poly[dT]則根本不能進入此病毒。工業上的實用性本發明提供了一種組合物，該物質可用于治療RNA病毒引起的病(如AIDS)；可用于貯存的輸注用血液中的HIV的消毒；并可提供針對RMA病毒所致疾病的疫苗。在描述了本發明及其特殊的實施方案之后，我們將了解到，本發明還可作進一步的修改，并且本申請的目的旨在覆蓋凡遵循本發明原理的各種變化、應用、改編，并包括根據本發明所屬
技術領域：
里公知和習慣方法、和使用上文提出的實質特征、和落入本發明和所附權利要求范圍內的所有變化。權利要求1.一種組合物，包含公式Mn(Y)mXi[A]n表示的Y-poly[A]，其中[A]n＝含n個腺苷酸殘基的多聚腺苷酸(5′)，Y＝FDNP，DNP，或部分為FDNP部分為DNP，FDNP＝3-氟-4，6-二硝基苯基基團，通過醚鍵共價結合到[A]n的n個2′-OH羥基的m個上，DNP＝2，4-二硝基苯基基團，通過醚鍵共價結合到[A]n的n個2′-OH的m個上，X＝一個酰基，i＝0或1，M＝一個陽離子，用來為此組合物提供一個所需的溶解度，并有如下之一的一般結構或并且其Y基團與腺嘌呤單位的比率至少為約1∶5，其中的n足夠大，使得Y-poly[A]能完全徹底地填充RNA病毒逆轉錄酶的活性位點裂口，從而可有效地滅活逆轉錄酶和/或能有效地滅活核糖核酸酶。2.一種如權利要求1所述的組合物，其中n至少為約20。3.一種如權利要求1所述的組合物，其中Y至少部分包括FDNP。4.一種如權利要求1所述的組合物，其中Y包括DNP。5.一種如權利要求1所述的組合物，其中n至少為約25。6.一種治療患有RNA病毒所致疾病的哺乳動物的方法，包括給此哺乳動物施用有效治療劑量的Y-poly[A]。7.一種如權利要求6所述的方法，其中的給藥方式包括非腸道注射一種內含該Y-poly[A]的無菌可注射制劑。8.一種如權利要求6所述的方法，其中的給藥方式包括口服Y-poly[A]。9.一種如權利要求6所述的方法，其中的RNA病毒是HIV，該疾病是獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)。10.一種如權利要求6所述的方法，其中的RNA病毒是HIV、HTLV、HAV、丙型肝炎病毒、流感病毒、副流感病毒、RSV、冠病毒或鼻病毒、麻疹病毒或流行性腮腺炎病毒，該疾病分別是獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)、成人T細胞白血病/淋巴瘤、甲型肝炎、丙型肝炎、流感、副流感、嬰兒細支氣管炎和嬰兒肺炎、普通感冒、麻疹或流行性腮腺炎。11.一種如權利要求6所述的方法，其中Y至少部分包括FDNP。12.一種如權利要求6所述的方法，其中的Y包括DNP。13.一種暫時性地保護健康哺乳動物免受RNA病毒感染的方法，包括給此哺乳動物施用有效預防劑量的Y-poly[A]。14.一種如權利要求13所述的方法，其中的給藥方式包括非腸道注射一種內含Y-poly[A]的無菌可注射制劑。15.一種如權利要求13所述的方法，其中的給藥方式包括口服Y-poly[A]。16.一種如權利要求13所述的方法，其中的RNA病毒是HIV，該疾病是獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)。17.一種如權利要求13所述的方法，其中的RNA病毒是HIV、HTLV、HAV、丙型肝炎病毒、流感病毒、副流感病毒、RSV、冠病毒或鼻病毒、麻疹病毒或流行性腮腺炎病毒，該疾病分別是獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)、成人T細胞白血病/淋巴瘤、甲型肝炎、丙型肝炎、流感、副流感、嬰兒細支氣管炎和嬰兒肺炎、普通感冒、麻疹或流行性腮腺炎。18.一種如權利要求13所述的方法，其中的Y至少部分包括FDNP。19.一種如權利要求13所述的方法，其中的Y包括DNP。20.一種給病人接種一種針對RNA病毒所致疾病的疫苗的方法，包括向病人引入一種內含已被Y-poly[A]滅活的RNA病毒的抗原，其中Y至少部分為FDNP，由此，該病人產生一種或多種抗此抗原的抗體，抗此抗原的抗體也包括抗此RNA病毒的抗體。21.一種如權利要求20所述的方法，其中的RNA病毒是HIV，該疾病是獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)。22.一種如權利要求20所述的方法，其中的RNA病毒是HIV、HTLV、HAV、丙型肝炎病毒、流感病毒、副流感病毒、RSV、冠病毒或鼻病毒、麻疹病毒或流行性腮腺炎病毒，該疾病分別是獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)、成人T細胞白血病/淋巴瘤、甲型肝炎、丙型肝炎、流感、副流感、嬰兒細支氣管炎和嬰兒肺炎、普通感冒、麻疹或流行性腮腺炎。23.一種對存在于用于輸注的血液等份樣品中的RNA病毒進行消毒的方法，包括向此血液等份樣品中加入有效消毒劑量的Y-poly[A]，其中的Y至少部分為FDNP。24.一種如權利要求23所述的方法，其中的RNA病毒是HIV，該疾病是獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)。25.一種如權利要求23所述的方法，其中的RNA病毒是HIV、HTLV、HAV、丙型肝炎病毒、流感病毒、副流感病毒、RSV、冠病毒或鼻病毒、麻疹病毒或流行性腮腺炎病毒，該疾病分別是獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)、成人T細胞白血病/淋巴瘤、甲型肝炎、丙型肝炎、流感、副流感、嬰兒細支氣管炎和嬰兒肺炎、普通感冒、麻疹或流行性腮腺炎。26.一種不可逆地滅活溶液中的核糖核酸酶的方法，包括向溶液中加入滅活此核糖核酸酶有效劑量的Y-poly[A]，其中的Y至少部分為FDNP。27.一種從含有核糖核酸酶的溶液中去除核糖核酸酶的方法，包括將此溶液與一種含有固相化FDNP-poly[A]或DNP-poly[A]的親和材料相接觸，然后把此溶液從此親和材料中分離出來。28.一種不可逆地滅活RNA病毒的方法，包括將此RNA病毒與一滅活此RNA病毒有效劑量的Y-poly[A]相接觸，其中的Y至少部分為FDNP。全文摘要本發明合成出了具有2′-O-(3-氟-4，6-二硝基苯基)基團和/或2′-O-(2，4-二硝基苯基)基團的新型多聚腺苷酸(5′)衍生物，并發現它可當作病毒逆轉錄酶的突變-不敏感和功能-特異性抑制劑。本發明公開了這些新型化合物的結構組成、制備程序和用于治療攜帶有或感染有AIDS病毒或其它RNA病毒的人類患者、或攜帶有RNA病毒的其它哺乳動物的方法。文檔編號C07H21/00GK1121313SQ94191808公開日1996年4月24日申請日期1994年2月23日優先權日1993年2月24日發明者王瑞駪,康英孫,莫罕穆德·H·拉哈姆申請人:王瑞駪