專利名稱：抑制血小板聚集的新化合物及其制法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及抑制血小板聚集的新化合物，含有這些化合物的藥物組合物及使用這些化合物的方法。
據信，血小板聚集主要是通過纖維蛋白原受體或GPIIb-IIIa血小板受體復合物來調節，后者是稱作氧基哌吲哚的粘連受體中的一員。現已發現氧基哌吲哚受體的天然配體常常是包含Arg-Gly-Asp順序(在單字母氨基酸編碼中的RGD)的蛋白。作為GPIIb-IIIa受體的天然配位體的Von Willebrand因子和纖維蛋白原在其基本結構中具有RGD順序。就其功能而言，這些蛋白能夠在相鄰的血小板上結合交聯GPIIb-IIIa受體，從而對血小板聚集發生作用。
纖維結合素、玻璃體結合蛋白、血小板反應素是含RGD的蛋白，已證明它們也可以結合到GPIIb-IIIa上。纖維結合素存在于血漿中，并且在分子內基質中作為結構蛋白。結構蛋白與GPIIb-IIIa之間的結合可能會引起血小板粘連損傷的血管壁上。
在WO89/05150(PCT US 88/04403)中公開了結合到玻璃體結合蛋白上并含有RGD順序的線性和環狀肽。EP0275748公開了結合到GPIIb-IIIa受體上并能抑制血小板聚集的線性四至六肽和環狀六至八肽。在EP-A0341915中報導了其他線性和環狀肽，這些公開的內容并入本文作為參考。然而，這些抑制劑的類肽結構在藥物釋放、代謝穩定性和選擇性方面常常造成一些問題。在EP-A0372486、EP-A0381033和EP0478363中公開了不是由天然氨基酸順序構成的纖維蛋白原受體的抑制劑。WO92/07568(PCT/US91/08166)公開了纖維蛋白受體拮抗劑，它通過形成單環七員環結構在RGD順序中模仿構象的γ-轉變。然而，仍需要新的纖維蛋白原受體拮抗劑(例如GPIIb-IIIa蛋白的抑制劑)，這種拮抗劑具有強烈的體內和體外效力，并沒有氨基酸順序的肽骨架結構。
本發明公開了新化合物。這些化合物能抑制向GPIIb-IIIa受體上的結合，并抑制血小板聚集。
一方面，本發明涉及如下式(I)所述的新化合物。
本發明還涉及抑制血小板聚集或血塊形成的藥物組合物，它包括式(I)化合物和可藥用的載體。
本發明進一步涉及抑制需要這種抑制作用的哺乳動物的血小板聚集的方法，它包括內服有效量的式(I)化合物。
另一方面，本發明提供了在溶解纖維蛋白原治療后抑制哺乳動物動脈或靜脈再閉塞的方法，它包括內服有效量的纖維蛋白溶解劑和式(I)化合物。本發明還涉及治療中風、暫時局部缺血發作、心肌梗塞形成或動脈粥樣硬化的方法。
本發明公開了抑制血小板聚集的新化合物。據信，這些新化合物可以很好地與GPIIb-IIIa受體相互作用，并且這些新化合物在六和五員環上的取代基側鏈被定向，也使其能很好地與受體相互作用。
盡管不想受任何特定的作用機理的限制，但認為這些化合物能抑制纖維蛋白原向血小板結合纖維蛋白原受體GPIIb-IIIa上的結合，并可以通過公認的RGD結合部位的拮抗作用而與其他的粘連蛋白相互作用。
本發明化合物是下列式(I)化合物或其可藥用的鹽W-(CR′2)q-Z-(CR′R10)r-U-(CR′2)s-V-(Gly)n-(Asp)m-A(I)其中W是R′R″N-，R′R″NR′N-，R′R″NR′NCO-，R′2NR′NC(＝NR′)-，R′ONR′C(＝NR′)-， 或 Z是(CH2)t、Het、Ar、C3-7環烷基或NR′；U和V不存在或各自獨立地代表下列基團CO，CR1′，C(＝CR′2)，S(O)r，O，NR′，CR′OR′，CR′(OR″)CR′2，CR′2CR′(OR″)，C(O)CR′2，CR′2C(O)，CONR′，NR′CO，OC(O)，C(O)O，C(S)O，OC(S)，C(S)NR′，NR′C(S)，S(O)rNR，NR′S(O)r，N＝N，NR′NR′，NR′CR′2，NR′CR′2，CR′2O，OCR′2，C≡C，CR′＝CR′，或CR′(NR′R″)C(O)；X是N＝CR′、C(O)或O；Y是S或O；m是0或1；n是0或1；
q是0至3每個r獨立地是0至3s是0至2每個t獨立地是0至2；每個R′獨立地是H、C1-4烷基、C3-7環烷基-C0-4烷基或Ar-G0-4烷基；每個R″獨立地是R′、-C(O)R′或-C(O)OR15；R10不存在或代表H、C1-4烷基或-NR′R′；每個R13獨立地是R′、CF3、S′或OR′；每個R14獨立地是C1-4烷基、C3-7環烷基-C0-4烷基、Ar-C0-4烷基、C(O)R′、CN、NO2、SO2R′或C(O)OR15；每個R15獨立地是C1-4烷基、C3-7環烷基-C0-4烷基、或Ar-C0-4烷基；A是 或 R2不存在或以下列基團存在一次或兩次C1-4烷基、J-CO2R′、CONR′、SR′、NR′R″、C1-4烷氧基、羥基、CN、CF3、鹵素、或 J是單鍵、-OCR′2-、-NR′CR′2-、CR′2-CR′2-、-CR′2-、-CR′＝CR′或-C(O)NR′CR′2-；Q是單鍵、CR′2、S、O或NR′；和D是C1-4烷基、C3-7環烷基、Ar或Het；條件是(1)當A是 則W-(CR′2)q-Z-(CR′R10)r-不是H2N-(CH2)3-5-CH-；(2)當A是 或 則W-(CR′2)q-Z-(CR′R10)r-不是NHR′；和(3)當A是 或 則W-(CR′2)q-Z-(CR′R10)r-不是 本發明還包括本發明化合物的配合物或前藥。前藥是能在體內釋放式(I)活性母體藥物的任意共價鍵合的載體。
在本發明化合物可有一個或多個手性中心的情況下，除非另有說明，本發明包括可以通過常規技術合成和拆分的每個單一的非外消旋化合物及其對映體和非對映體混合物。在化合物具有不飽和碳碳雙健的情況下，順式(Z)和反式(E)異構體均在本發明范圍之內。在化合物以互變異構形式存在的情況下，如酮-烯酮醇互變異構體，例如 和 和胍型基互變異構體，例如 和 每一互變異構形式均包括在本發明范圍內，無論它是存在于平衡混合物中還中通過被R′適當取代而固定在一種形式。除非另有說明，在任何一次出現的任何取代基的意義是獨立的與在任何其他出現的任何其他取代基的意義無關。
對于式(I)，適宜地是Z是Het或(CH2)1-2；m、n和q各自為0；A是 W是R′R″N-；和在定義為苯基的A基團上的至少一個R2是J-CO2R。
由上面定義的亞通式(I)所包含的本發明的優選化合物包括(但不限于)下列化合物4-[2-[3-[6-氨基-2-吡啶基]-1-氧代丙基-(甲基)氨基]-1-氧代乙基]苯氧基乙酸；4-[2-[4-[6-氨基-2-吡啶基]-1-氧代丁基-(甲基)氨基]-1-氧代乙基]苯氧基乙酸；和4-[[N-甲基-N-[5-(2-氨基苯并咪唑基)]氨基]乙酰基]-2，2′-[1，2-亞苯基二(氧基)]二乙酸；或其可藥用的鹽。對于式(I)適宜地還有Z是(CH2)1-2m、n和q各自為0；A是 W是 和在定義為苯基的A基團上至少一個R2是-CO2R′。
由上面定義的亞通式(I)所包含的本發明的特別優選化合物包括(但不限于)4-[[N-甲基-N-[3-(4-吡啶基)丙酰基]氨基]乙酰基]-2，2′-[1，2-亞苯二(氧基)]二乙酸或其可藥用的鹽。
對于式(I)適宜地還有Z是(CH2)1-2或苯基；r是S各自為0；m和n各自為1；V不存在；A是 W是 或
由上面定義的亞通式(I)所包含的本發明的優選化合物包括(但不限于)下列化合物Nα-乙酰基-刀豆氨酰基-甘氨酰基-天冬氨酰基-苯胺；Nα-苯甲酰基-N-(胍基)氰基-Nα-甲基-L精酰甘氨酰基-L-天冬氨酰-1-苯胺；和Nα-苯甲酰基-N-[(氰基亞氨基)(苯氧基)甲基]-Nα-甲基-L-鳥氨酰甘氨酰基-L-天冬氨酰-1-苯胺。
對于式(I)適宜地還有Z是Het；m和n各自是1；V不存在；A是 和W是R′R″N-。
由上面定義的亞通式(I)所包含的本發明的優選化合物包括(但不限于)下列化合物3-[6-氨基-2-吡啶基]丙酰基-甘氨酰基-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸；和4-[6-氨基-2-吡啶基]丁酰基-甘氨酰基-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸；或其可藥用的鹽。
對于式(I)適宜地還有Z是(CH2)1-2或NR′；A是 其中D是Het；W是 或 由上面定義的亞通式(I)所包含的本發明的優選化合物包括(但不限于)下列化合物Nα-苯甲酰基-N-[1H-咪唑-2-基]-L-鳥氨酰甘氨酰基-β-(2-苯并噻唑基)-β丙氨酸；和±-N-[(4-胍基氨基)丁酰基肌氨酰基]-β-(2-苯并噻唑基)-β-丙氨酸；或其可藥用的鹽。
對于式(I)適宜地還有Z是Ar或Het；m和n各自是1；s是0V不存在；W是R″R′N-。
由上面定義的亞通式(I)所包含的本發明的優選化合物包括(但不限于)環-(S，S)-(2-巰基)苯甲酰基-Nα-甲基)-4-氨基甲基苯丙氨酰基-甘氨酰基-天冬氨酰基-(2-巰基)苯基酰胺。
本文中使用在肽及化學領域常用的縮寫和符號來描述本發明化合物。通常，氨基酸縮寫按照在Eur.J.Biochem.158，9(1984)中所述的IUPAC-IUB Joint Commssion on Biochemical Nomenclature方法。
Arg指精氨酸，MeArg指Nα-甲基精氨酸，HArg指高精氨酸，NArg指去甲精氨酸，(Me2)Arg指N′，N″-二甲基精氨酸，(Et2)Arg指N′，N″-二乙基精氨酸，Orn指鳥氨酸。這些基團是取代基R6的適宜組成成分。這些氨基酸的N-取代衍生物也可用于本發明。制備α-取代衍生物的典型方法公開于下列文獻中美國專利4,687,758；Cheung等人，Can.J.Chem.，55，906(1977)；Freidinger等人，J.Org.Chem，48，77(1982)；Shuman等人，PEPTIDES PROCEEDINGS OF THE 7TH AMERICAN PEPTIDE SYMPOSIUM，Rich，D.Gross，E.，Eds，Pierce Chemical Co.，Rockford，III，617(1981)，這些文獻并入本文作為參考文獻。
本文所用的C1-4烷基是指支鏈或非支鏈的碳鏈，包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基和叔丁基。C1-6烷基還包括戊基、正戊基、異戊基、新戊基和己基及其簡單的脂族異構體。C0-4烷基和C0-6烷基還指不需要烷基存在(例如共價鍵)。
本文所用的Ar或芳基是指苯基或萘基，或被一至三個R2基團取代的苯基或萘基。特別是R2可以為C1-4烷氧基、C1-4烷硫基、三氟甲基、OH、Cl、Br、F或J-CO2H，其中J如式(I)所定義。
Het或雜環是指含有一至三個選自氮、氧和硫雜原子的任意取代的五或六元單環或九或十元雙環，它們是穩定的并可通過常規的化學合成得到。雜環的實例有咪唑、苯并咪唑、吡咯、吲哚、吡啶、嘧啶、吡嗪、喹啉、苯并呋喃、呋喃、苯并吡喃、苯并噻吩、噻吩、噻唑、苯并噻唑、二氫吲哚、嗎啉、哌啶、哌嗪、吡咯烷、異喹啉、四氫和全氫喹啉和異喹啉。在通過化學合成可得到的且穩定的Het環上，多至三個取代基(如選自R2)的任何可得到的組合物包括在本發明范圍之內。
C3-7環烷基是指三至七個碳原子的任意取代的碳環體系，它可以包含多至兩個不飽和碳碳鍵。典型的C3-7環烷基有環丙基、環丁基、環戊基、環戊烯基、環己基、環己烯基和環庚基。在通過常規的化學合成可得到的且穩定的環烷基環上，多至三個取代基(如選自R2)的任何組合均在本發明范圍之內。
本文所用的 是指氮雜環，它可以是飽和或不飽和的穩定的五、六或七元單環或七至十元雙環，它含有多至三個氮原子的或含有一個氮原子和一個選自氧和硫的雜原子，并且在可產生的穩定結構的任意原子上它可被取代，其中氮原子可被任意季銨化。氮原子可以在任意穩定的位置被C1-4烷氧基、C1-4烷硫基、F、Cl、Br、I、NO2、NR2′、OH、CO2R′、CONHR′或C1-4烷基取代。 的實例有吡咯啉、吡咯、咪唑、咪唑啉、咪唑烷、吡唑、吡唑啉、吡唑烷、哌啶、哌嗪、嗎啉、吡啶、吡啶鎓、四氫吡啶、四氫和六氫氮雜、奎寧、奎寧鎓、喹啉、異喹啉。優選N為吡啶基、咪唑基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基或四氫吡啶基。
t-Bu指叔丁基、Boc指叔丁氧羰基，Fmoc指芴基甲氧基羰基，ph指苯基、CbZ指芐氧羰基，BrZ指鄰溴芐氧羰基，ClZ指鄰氯芐氧羰基，Bzl指芐基，4-MBzl指4-甲基芐基，Me指甲基、Et指乙基，Ac指乙酰基，AlK指C1-4烷基，Nph指1-或2-萘基，cHex指環己基。MeArg是Nα-甲基精氨酸。
DCC是指二環己基碳二亞胺，DMAP是指二甲氨基吡啶，DIEA是指二異丙基乙胺，EDC指N-乙基-N′-(二甲氨基丙基)碳二亞胺。HOBt指1-羥基苯并三唑，THF指四氫呋喃。DMF指二甲基甲酰胺，NBS指N-溴代琥珀酰亞胺，Pd/C指鈀/炭催化劑，PPA指1-丙烷磷酸環酐，DPPA指二苯基磷酰疊氮，BOP指苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)磷鎓六氟磷酸鹽，HF指氫氟酸，TEA指三乙胺，TFA指三氟乙酸，PCC指氯鉻酸吡啶鎓。
式(I)化合物一般按下法制備將式(II)化合物與式(III)化合物反應，A-(Gly)n(Asp)m-L′R6″-L2(II)(III)(其中A、m和n如式(I)中所定義，式(II)和式(III)化合物帶有被保護的任何反應性官能團；L1和L2是能夠反應形成-(CR′R10)r-U-(CR2′)s-V-鍵的官能團；R6″是-(CR2′)q·Z和與-(CR′R10)r-U-(CR2′)s-V-基的任何部分，并帶有被保護的任何反應性官能團；)然后，除去任何保護基，并任選地形成可藥用的鹽。
顯然，L1和L2的完全相同將取決于成鍵的部分。制備-(CR′R10)r-U-(CR2′)s-V-鍵的一般方法描述于例如EP-A0372486和EP-A0381033及EP-A0478363中，這些文獻并入本文作為參考。
例如，如果V是CONH，則L1可以是-NH2，L2可以是OH(作為酸)或Cl(作為酰氯)，R6″可以是W-(CR2′)q-Z-(CR′R10)r-U-(CR2′)s-C(O)，且帶有任意被保護的任何官能團。例如，R6″可以是(芐氧羰基脒基)苯甲酰基或(Nα-Boc，Nguan-Tos)精氨酰基。當L2是OH時，可使用偶合劑。
同樣，如果V是NHCO，則L1可以是-CO2H或CO-Cl，L2可以是-NH2，R6″可以是W-(CR2′)q-Z-(CR′R10)r-U-(CR2′)s-。例如，R6″可以是(芐氧羰基脒基)苯基、(芐氧羰基氨基)甲基芐基或6-(芐氧羰基氨基)己基。
當V是NHSO2時，L1可以是SO2Cl，L2可以是-NH2、R6″可以是如上所定義。當V是SO2NH時，L1可以是-NH2、L2可以是SO2Cl。制備這些磺酰氯的方法己被公開，例如J.Org.Chem.，23，2157(1958)。
如果V是CH＝CH，L1可以是-CHO，L2可以是CH＝P-Ph3，R6″可以是W-(CR2′)q-Z(CR′R10)r-U-(CR2′)s-。
當V是CH2CH2時，可通過還原合適的被保護的化合物(其中V是CH＝CH)來得到。
當V是CH2O、CH2N時，L1可分別為-OH、-NH，L2可以是Br；R6″可以是W-(CR2′)q-Z-(CR′R10)r-U-(CR2′)s-。例如，R6″可以是(芐氧基羰基氨基)甲基芐基，或2-(N-芐基-4-哌啶基)乙基。同樣，當U或V是OCH2、NR1CH2時，L1可以是-CH2Br，L2可分別為-OH、-NH。
按照J.Org.Chem.，54，1354(1989)公開的方法，由合適的被保護的化合物(其中V是CH＝CH)可制得其中V是CHOHCH2的化合物。
按照Tet.Lett.，31，231(1990)公開的方法，通過硼氫化和堿性氧化合適的被保護的化合物(其中V是CH＝CH)，可制得其中V是CH2CHOH的化合物。
本文所用的偶合劑是指可用于形成肽鍵的試劑，一般的偶合方法使用碳化二亞胺、活化的酐和酯，以及酰鹵。典型的試劑如EDC、DCC、DPPA、PPA、BOP試劑，HOBt、N-羥基琥珀酰亞胺和草酰氯。
形成肽鍵的偶合方法在本領域中是公知的。Bodansky等人，THE PRACTICE OF PEPTIDE SYNTHESIS，Springer-Verlag，Berlin，1984。Ali等人，J.Med.Chem，29，984(1986)和J.Med.Chem.，30，2291(1987)概括性地提出的肽合成的方法一般可作為該技術的實例，上述文獻并入本文作為參考。
使用用于形成酰胺鍵的常規方法，可完成形成酰胺或肽鍵的溶液合成。一般地，使用合適的碳化二亞胺偶合劑如N，N′-二環己基碳化二亞胺(DCC)，任選在催化劑如1-羥基苯并三唑(HOBt)和二甲基氨基吡啶(DMAP)存在下，使胺或苯胺通過其游離的氨基與合適的羧酸底物偶合。其它合適的方法如首先生成合適的被保護的酸底物的游離羧基的活化酯、酐或酰鹵，接著任選在堿的存在下與合適的被保護的胺的游離胺反應。例如，在無水溶劑如二氯甲烷或四氫呋喃(THF)中在堿如N-甲基嗎啉、DMAP或三烷基胺存在下，用氯甲酸異丁酯處理被保護的Boc氨基酸或CbZ-脒基苯甲酸生成“活化酐”，接著與另一被保護的氨基酸或苯胺的游離胺反應。
式(III)化合物可用本領域公知的常規方法由可從市場上買到的原料制備。W通常為堿性官能團，它任選通過烷基鏈與Z連接，在合成中W可被保護或者在形成-(CR′R10)r-U-(CR2′)s-V-鍵之后引入到分子中。例如，式(III)或式(I)化合物[其中W是合適地取代的R′R″N-、R2′N(R13)C＝N-、R″N＝(R13)C-NR′-、R2′N(R2′N)C＝N-或R″R′N(R′N＝)C-NR′]可用常規方法制備，其中包括EP-A0372486、EP-A0381033或EP-A-0478363中公開的方法，所有這些文獻在此引入作為參考。
特別是按照EP-A0478363公開的方法，可制備其中W是 的式(III)化合物。
按照J.Org.Chem.51，5047(1986)公開的方法，可制備W是R2′N(R2′N)C＝N-X或R″R′N(R′N＝)C-NR′-X-且X為0的化合物。
按照US3,714,253和Eur.J.Med.Chem-Chim.Ther.，20，25(1985)所公開的方法，可制備W是R′N(R2′N)C＝N-X-或R″R′N(R′N)＝C-NR′X-，且X為N＝CR′的化合物。
按照US3,714,253和Can.J.Chem.，43，3103(1965)所公開的方法，可制備W是R2′N(R2′N)C＝N-X-或R″R′N(R′N＝)C-NR′-X-且X為C(O)的化合物。
按照J.Het.Chem.，16，1063(1979)或J.Het.Chem.，26，125(1989)所公開的方法，可制備W是R′ONR′C(＝NR′)的化合物。
按照常規方法如Syn.，583(1974)公開的方法可制備W是R2′NR′NC(＝NR′)的化合物。
按照J.Prakt.Che.36，29(1967)所公開的方法，可制備W是R′R″NR′N-的化合物。
按照Bull.Chem.Soc.Jpn.，43，2257(1970)所公開的方法，可制備W是R′R″NR′NCO-的化合物。
按照Chem.Lett.，1379(1986)所公開的方法，可制備W是R″R′NC(＝NR′)Y且Y為S的化合物。
按照常規方法如日本專利2022751中所公開的方法，可制備式(III)或式(I)化合物，其中W是R″R′NC(＝NR′)Y且Y為O。
各合成片段側鏈的反應性官能團可按本領域公知的方法進行適當的保護。合適的保護基已公開于Greene，PROIECTIVE GROUPS INORGANIC CHEMISTRY，John Wiley和Sons，New York，1981中。例如，Boc、CbZ，鄰苯二甲酰基或Fmoc基團可用于保護氨基或脒基。Boc基團通常優選用于保護α-氨基。t-Bu、cHex或芐基酯可用于保護側鏈羧基。芐基或合適取代的芐基(例如4-甲氧基-芐基或2，4-二甲氧基芐基)用于保護巰基或羥基。甲苯磺酰基可用于保護咪唑基。甲苯磺酰基或硝基可用于保護胍基。合適取代的芐氧羰基或芐基也可用于保護羥基或氨基。芐氧羰基或芐基保護基的合適的取代基為在鄰位和/或對位取代的氯、溴、硝基或甲基，它們用于改變保護基的反應性。除了Boc基團外，氨基的保護基最便利的是用弱酸處理不能除去的那些基團，正如本領域技術人員所公知的，這些保護基可通過如催化氫化、在液氨中的鈉或HF等方法處理而被除去。
式(II)化合物其中A是 可用EP-A0381033所公開的方法制備，上述文獻并入本文作為參考。
式(II)化合物，其中A是 可用EP-A0483667所公開的方法制備，該文獻并入本文作為參考。
式(II)化合物其中A是 可用EP-A0319506所公開的方法制備，該文獻并入本文作為參考。式(II)化合物其中A是 可用WO/08464和WO92/13552所公開的方法制備，該文獻并入本文作為參考。
式(II)化合物，其中A是 可用EP-A0425212所公開的方法制備，該文獻并入本文作為參考。
用常規方法在合適的溶劑中由母體化合物和過量的酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、馬來酸、琥珀酸或甲磺酸制得式(I)化合物的酸加成鹽。特別有用的是乙酯鹽形式。某些化合物可形成內鹽或可接受的兩性離子化合物。用過量的含有合適陽離子的堿試劑如氫氧化物，碳酸鹽或醇鹽，或合適的有機胺處理母體化合物可制得陽離子鹽。陽離子如Li+、Na+、K+、Ca++、Mg++和NH4+是存在于可藥用鹽中的陽離子的具體實例。
本發明提供了藥物組合物，它包括式(I)化合物和可藥用的載體。因此，式(I)化合物可用于制備藥物。上文所述制備的式(I)化合物的藥物組合物要配制成用于非腸胃給藥的溶液或凍干粉劑。在使用之前，粉劑通過加入合適的稀釋劑或其他可藥用的載體重新配制。液體制劑可以是緩沖的等滲的含水溶液。合適的稀釋劑的實例為常規等滲鹽水溶液，標準的5％葡萄糖水溶液或緩沖的乙酸鈉或銨溶液。這些制劑特別適合于非腸道給藥，但也可用于口服給藥，或置于計量吸入器或噴霧器中用于吸入給藥。最好加入賦形劑如聚乙烯吡咯烷酮、明膠、羥基纖維素、阿拉伯膠、聚乙二醇、甘露醇、氯化鈉或檸檬酸鈉。
另外，為了口服給藥這些化合物可包于膠囊中，或制成片劑或制成乳劑或糖漿劑。可加入可藥用的固體或液體載體以增強或穩定組合物或以便容易制備組合物。固體載體包括淀粉、乳糖、硫酸鈣二水合物，白土，硬脂酸鎂或硬脂酸，滑石粉，果膠，阿拉伯膠，瓊脂或明膠。液體載體包括糖漿、花生油、橄欖油、鹽水和水。載體還可包括持續釋放的物質如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，它們可以單獨使用或與蠟一起使用。固體載體的量可以變化，但優選大約20mg至大約1g/單位劑量。藥物制劑可按常規藥學技術制備，就片劑而言，必要時包括碾磨、混合、制粒和壓片；對于硬明膠膠囊劑，包括碾磨、混合和裝填。當使用液體載體，可制成糖漿制、酏劑、乳劑或含水或不含水的懸浮劑。這些液體制劑可直接口服給藥或裝到軟明膠膠囊中。
對于直腸給藥，本發明化合物還可與賦形劑如可可脂、甘油、明膠或聚乙二醇混合，然后模制成栓劑。
本發明還提供了抑制哺乳動物特別是人的血小板聚集和血栓形成的方法，該方法包括內服式(I)肽和可藥用載體。治療的病癥包括急性心肌梗塞(AMI)，深靜脈血栓形成、肺栓塞、解剖無尿癥，暫時性缺血發作，中風和其他與梗塞有關的疾病以及易變的絞痛。對慢性或急性過聚集癥如分散的血管內凝固(DIC)、敗血病，外科或感染性休克，手術后和產后創傷，心肺的分流外科手術，不相容的輸血，胎盤早期脫離，血栓性血小板減少性紫瘢(TTP)，蛇毒和免疫疾病的治療也有效。另外，本發明化合物可用于下列方法中預防轉移疾病、預防或治療真菌或細菌感染，誘導免疫刺激，預防或治療骨吸收為起因的疾病。
本發明化合物可以口服或非腸道方式給藥于病人，血漿中的藥物濃度應足以抑制血小板聚集或其他病癥。含有本發明化合物的藥物組合物可以大約0.2至大約50mg/kg劑量并以與病人病情相適應的方式給藥。對于急性治療，優選非腸道給藥，對于過聚集性的持續性病癥，靜脈內灌輸化合物的5％葡萄糖水或常規鹽水液最為有效，盡管肌肉內單次快速靜脈注射也是有效的。
對于慢性的不嚴重的血小板聚集的病癥，口服膠囊或片劑或肌肉內單次快速靜脈注射是合適的。本發明化合物以大約0.4至大約50mg/kg劑量每天給藥一至四次從而達到總的日劑量為大約0.4至大約200mg/kg/天。
本發明還提供了在溶解纖維蛋白治療后抑制動脈或靜脈的再閉塞的方法，它包括內服式(I)化合物和纖維蛋白溶解劑。現已發現在溶解纖維蛋白治療中服用某些化合物能完全防止再閉塞或延長再閉塞的時間。
本發明所用的術語纖維蛋白溶解劑是指天然或合成的任何化合物，它可直接或間接地引起纖維蛋白凝塊的溶解。纖維蛋白溶酶原活化劑是公知的一類纖維蛋白溶解劑。有用的纖維蛋白溶酶原活化劑包括anistreplase，尿激酶(UK)，前尿激酶(pUK)，鏈激酶(SK)，組織纖維蛋白溶酶原活化劑(tPA)和保持纖維蛋白溶酶原活化劑活性的突變體或變異體，如化學修飾的變異體，或在其中加入、去除或取代一種或多種氨基酸，或在其中加入、去除或改變一個多個官能區，例如通過使一種纖維蛋白溶酶原活化劑的活化部位與另一種纖維蛋白溶酶原活化劑的纖維蛋白結合區或纖維蛋白結合分子結合，其他變異體的實例包括tPA分子，其中可改變一個或多個甘氨酰基化部位。優選的纖維蛋白溶酶活化劑是tPA變異體，其中在生長因子區中的主氨基酸序列被改變，以便延長纖維蛋白溶酶原活化劑的血清半衰期。tPA生長因子變異體已被公開，例如見Robinson等人，EP-A0297589和Browne等人，EP-A0240334。其他變異體包括雜交蛋白如在EP-0028489，EP-0155387和EP-0297882中所公開的，所述文獻并入本文作為參考。Anistreplase是一種優選的用于本發明的雜交蛋白，纖維蛋白溶解劑可從天然來源中分離出來，但可用傳統的遺傳工程的方法常規制得。
有用的tPA、SK、UK和PUK制劑已被公開，例如在EP-A0211592，EP-A0092182和US4568543中，所有文獻并入本文作為參考。通常纖維蛋白溶解劑可配制成含水的緩沖等滲溶液例如乙酸或己二酸鈉或銨的pH3.5-5.5的緩沖溶液。還可加入其他賦形劑如聚乙烯吡咯烷酮、明膠、羥基纖維素、阿拉伯膠、聚乙烯、乙二醇、甘露醇和氯化鈉。可將所述組合物冷凍干燥。
藥物組合物可在同一容器中將式(I)化合物與纖維蛋白溶解劑配制而成，但是優選在不同容器中配制。當兩種藥劑以溶液形式提供時，它們可包含在同時的灌輸/注射體系中或在一前一后安排的體系中。
所述治療的適應癥包括心肌梗塞，深表靜脈血栓形成、肺栓塞、中風和其他與梗塞有關的疾病。在非腸道施用了tPA或其他纖維蛋白溶解劑之前或之后施用本發明化合物。在確定再灌注已最大地抑制了治療后的再閉塞后，最好用本發明化合物繼續治療一段時間。tPA、SK、或pUK的有效劑量是0.5-5mg/kg，肽的有效劑量是大約0.1-25mg/kg。
為了便于在相同或不同的時間服用抑制劑和纖維蛋白溶解劑、可制成成套包裝形式，即在單一容器(如箱、紙箱或其他容器中)包含單個的瓶、包、小瓶或其他容器，它們各自裝有供非腸道給藥的有效量的上述抑制劑和供非腸道給藥的有效量的上述tPA或其他纖維蛋白溶解劑。這種成套包裝可包括存在于分開的容器中或同一容器中的藥劑，它們可以是凍干粉；以及用于重新配制的溶液的容器。另一方法是將用于重新配制的溶液和冷干粉置于單一容器的兩個室中，在使用之前進行混合，在這樣的安排下，本發明的化合物和纖維蛋白溶解劑可分別包裝于兩容器中或一起凍干成粉末并以單一容器提供。
當兩種藥劑以溶液形式提供時，它們可包含在同時給藥的灌輸/注射體系中或在一前一后安排的體系中。例如，血小板聚集抑制劑可采用靜脈內注射形式或灌輸袋，該灌輸袋通過管子與纖維蛋白溶解劑的第二灌輸袋串聯。使用這種體系，病人開始得到抑制劑的單次快速靜脈注射或灌輸，接著得到纖維蛋白溶解劑的灌輸。
本發明化合物的藥理活性可通過測定它們抑制3H-SK&F107260(一種已知的RGD纖維蛋白原拮抗藥)與GPIIbIIIa受體結合的能力，體外抑制血小板聚集的能力以及體內抑制血栓形成的能力來測定。 將10單位的過時的洗滌過的人血小板(由紅十字會得到)在3％辛基葡糖苷，20mM Tris-HCl，pH7.4，140 M NaCl，2mM CaCl2中的4℃下緩慢攪拌2小時而溶解。溶解產物在100,000g下離心1小時。將所得的上層清液加到5ml Lentil植物血凝素瓊脂糖凝膠4B柱(E.Y.Labs)中，該柱預先用20mM Tris-HCl，pH7.4，100mM Nacl，2mM CaCl2，1％辛基葡糖苷(緩沖液A)平衡。保溫2小時后，用50ml冷緩沖液A洗柱。用含有10％葡萄糖的緩沖液A洗脫植物血凝素保持的GPIIb-IIIa。所有步驟在4℃下進行，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示所得GPIIb-IIIa純度＞95％。
GPIIb-IIIa與脂質體的混合在氮氣流下將磷脂酰絲氨酸(70％)和磷脂酰膽堿(30％)(Avanti Polar Lipids)的混合物干燥到玻璃管的壁上。將純的GPIIb-IIIa稀釋至最終濃度為0.5mg/ml，并與以蛋白∶磷脂比為1∶3(W∶W)的磷脂混合。再懸浮混合物并在聲浴中聲處理5分鐘。然后用12,000-14,000分子量的斷流透析管并用1000倍過量的50mM Tris-HCl，pH7.4，100mMNaCl2，2mM CaCl2(2可變)透析混合物過夜。將含有GPIIb-IIIa的脂質體在12,000g下離心15分鐘，再懸浮于透析緩沖液中，最終的蛋白濃度為大約1mg/kg。將脂質體在-70C下貯存直至需要使用。
對GPIIb-IIIa的競爭性結合用[3H]-SK&F-107260作為RGD-型配體，按間接競爭性結合的方法，測定對纖維蛋白原受體(GPIIb-IIIa)的結合。用0.22Um親水性硬孔膜在96井濾板裝置(MilliponeCorporation，Bedford，MA)中進行結合測定。在室溫下用0.2ml10μg/ml聚賴氨酸(Sigmd Chemical Co.，St.Louis，MO.)預先涂層各井1小時以阻止非特定結合。以一式四分地方式將各種濃度的未標記的苯并二氨雜品加到各井中，然后將[3H]-SK&F-107260加到各井最終濃度為4.5nM，接著加入1μg含純化的血小板GPIIb-IIIa的脂質體。混合物在室溫下保溫1小時。用Milliporr過濾歧管過濾從未結合的物質中分離出GPIIb-IIIa結合的[3H]-SK&F-107260，接著用冰冷卻的緩沖液洗滌(2次，每次0.2ml)。濾液中保持的結合放射性用1.5mlReady Solre(Beckman Instruments，Fullerton，CA)，BeckmanLiquid Seintillation Counter(Model LS 6800)計數測定，效率40％。在2μM未標記的SK&F-107260存在下測定非特定結合，試樣的總放射性保持小于0.14％。所有數據點均以一式四份方式測定。本發明化合物抑制[3H]-SK&F-107260結合的Ki為大約10μM至大約200μM。
血小板聚集的抑制從首次用來做實驗的成年雜種狗上收集血樣(加入檸檬酸鹽防止凝固)。在室溫150xg下離心10分鐘制得血小板富集的血漿PRP。將PRP在800xg下離心10分鐘制得洗滌過的血小板。將所得的細胞小丸用無Ca++的Tyrode緩沖液(pH6.5)洗滌兩次，再懸浮在含有1.8mM Ca++的Tyrode緩沖液(pH7.4)中濃度為3×105細胞/ml。在所有血小板聚集試驗中在激動劑之前3分鐘加入化合物。最終激動劑濃度為0.1單位/ml凝血酶和2mM ADP(Sigma)。用Chrono-Log Lumi-Aggregometer監測聚集。加入激動劑后5分鐘的光透射率用來計算百分聚集率，按下列公式計算％聚集＝[(90－CR)O(90－10)]×100，其中CR為圖表讀數，90為基準，10為PRP空白讀數。IC50通過。畫出[％聚集的抑制]對[化合物的濃度]的曲線來確定。以200mM濃度測定化合物并依次用指數2稀釋以確定合適的劑量反應曲線。
本發明化合物抑制由ASP刺激的人血小板聚集的IC50為大約70至大約200μM。
為了評價化合物對血漿蛋白酶的穩定性，在加入激動劑之前將化合物在PRP中保溫3小時(而不是3分鐘)。
在體內血小板聚集的抑制按照Aiken等人，Prostaglandins，19，629(1980)所述的方法，將肽灌輸到麻醉的狗中，記錄全身的和血液動力學作用，從而確定體內血栓形成的抑制。
下面的實施例并不是對本發明范圍的限定，而是提供說明怎樣制備和使用本發明的化合物。對本領域技術人員來說，許多其他實施方案是顯而易見的和可行的。
實施例14-[2-[3-[6-氨基-2-吡啶基]-1-氧代丙基(甲基)氨基]-1-氧代乙基]苯氧基乙酸(i).3-(2-[6-溴吡啶基])炔丙醇將2，6-二溴吡啶(15g，63mmol)放入燒瓶中，用氬氣沖洗燒瓶。加入200ml三乙胺，將燒瓶冷卻至0℃。向其中加入炔丙醇(5ml，85mmol)，二(三苯基膦)氯化鈀(II)(1.5g，1.4mmol)和碘化銅(0.50g，2.6mmol)。反應混合物在0℃下攪拌20分鐘。然后加熱至室溫，在氬氣氛下繼續攪拌18小時。之后，反應混合物用乙酸乙酯稀釋，過濾、用乙酸乙酯清洗。蒸發溶劑，將所得的淺棕色固體用硅膠色譜純化，用70％乙酸乙酯/己烷洗脫，得8g(59％)淺橙色固體的粗產物。將所得固體用己烷研制得到6.5g(48％)淺黃色固體的產物。NMR(CDCl3)7.52(“t”，1H，J＝7.8)；7.45(d，1H，J＝7.8)；7.39(d，1H，J＝7.4)；4.52(s，2H)。質譜194(M＋H+－H2O)212(M＋H+)；234(M＋Na+)，還可觀察到顯著量的雙加合物(2，6-二(3-羥基-1-丙炔基)吡啶)。(ii).3-(2-[6-溴吡啶基])丙-1-醇用Tiley等人(JOC，1988，p.386)的方法，還原3-(2-[6-溴吡啶基])炔丙醇。將(1)(420mg，2.0mmol)溶于10ml乙醇中，用氧化鉑(IV)水合物(20mg，0.08mmol)和三乙胺(0.20ml，15mmol)處理。用H2沖洗燒瓶，在室溫1個H2氣壓下攪拌90分鐘。然后反應混合物通過短硅膠塞過濾，用乙酸乙酯洗脫，除去大部分催化劑，所得的灰色油狀物用硅膠和50％乙酸乙酯/己烷色譜純化得到310mg(72％)無色油狀的產物。NMR(CDCl3)7.48(“t”，1H，J＝7.7)；7.30(d，1H，J＝7.8)；7.16(d，1H，J＝7.5)；4.12(br，1H)；3.69(t，2H，J＝6.2)；2.88(t，2H，J＝7.5)；1.97(“q”，2H，J＝6.6)。質譜1 98(M＋H+－H2O)；216(M＋H+)；238(M＋Na+)。(iii).3-(2-[6-溴吡啶基])丙酸將3-(2-[6-溴吡啶基])丙-1-醇(1.3g，6.0mmol)溶于100ml丙酮并冷卻至0℃。分三批以20分鐘的間隔加入瓊斯試劑(4.5ml)。加入最后一批20分鐘后，反應混合物用過量的異丙醇驟冷并攪拌10分鐘。然后反應混合物用水稀釋，并旋轉蒸發除去有機溶劑。所剩下的水溶液用較多的水稀釋，用乙酸乙酯萃取4次。再用鹽水沖洗有機層一次，用硫酸鈉干燥并蒸發得到1.1g(80％)白色固體產物。NMR(CDCl3)7.48(“t”，1H，J＝7.8)；7.34(d.1H，J＝7.9)；7.17(d，1H，J＝7.5)；3.09(br，1H)；2.85(t，1H，J＝7.2)；質譜212(M＋H+－H2O)；230(M＋H+)；254(M＋Na+)。(iv).3-(2-[6-氨基吡啶基])-丙酸在裝有干冰/丙酮冷凝器和配有玻璃攪拌葉片的機械攪拌器的三頸瓶中濃縮250ml氨。向其中加入大約100mg Fe(NO3)3.9H2O和元素鈉(7.5g，190mmol)。將所得的黑藍包溶液回流攪拌75分鐘，然后加入3-(2-[6-溴吡啶基])丙酸(1.2g，5.2mmol)的10ml無水THF溶液。大約10分鐘后再加入10mlTHF。反應混合物回流6.5小時，然后用60g氯化銨驟冷。使氨蒸發過夜。所得的褐色固體用乙酸乙酯完全萃取，然后所得粗產物用硅膠色譜純化，用15％甲醇/1％乙酸乙酯/二氯甲烷洗脫。得到0.47g(40％)所需產物，為乙酸鹽。NMR(CD3OD)7.62(“t”，1H，J＝8.0)；6.64(d，1H，J＝8.7)；6.60(d，1H，J＝7.3)；2.92(t，2H，J＝6.8)；2.60(t，2H，J＝6.9)；19.4(br)質譜149(M＋H+－H2O)；167(M＋H+)。還得到13％產率的溴代酰胺。(v).4-[2-[3-[6-氨基-2-吡啶基]-1-氧代丙基(甲基)氨基]-1-氧代乙基]苯氧基乙酸將3-(2-[6-氨基吡啶基)丙酸(95mg，0.42mmol)，4-[2-(甲基氨基)-1-氧代乙基]苯氧基乙酸芐酯鹽酸鹽(1.49，0.43mmol)和1-羥基苯并三唑水合物(HOBT)(76mg，0.56mmol)與8ml二甲基甲酰胺混合，并用氬氣沖洗燒瓶然后加入二異丙基乙胺(335μl，1.9mmol)，將燒瓶冷卻至0℃。混合物攪拌5分鐘后，一次性加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)(103mg，0.54mmol)，混合物加熱至室溫，混合物在氬氣氛下攪拌三天。然后使用高真空在幾小時內除去二甲基甲酰胺。所得殘余物用硅膠色譜純化，用10％甲醇/二氯甲烷洗脫。接著將所得產物(45mg，0.97mmol)溶于甲醇中，并用鈀(10％在炭上)的丁醇漿狀物(16mg)處理，用H2沖洗燒瓶，然后在H2氣壓室溫下攪拌幾小時。接著用丙醇稀釋溶液、過濾并旋轉蒸發除去溶劑。反相HPLC得到所需的產物，為三氟乙酸鹽，兩步的產率為17％。NMR(CD3OD)7.96(d，2H，J＝8.8)；7.76(“t”，1H，J＝8.1)；7.03(d，2H，J＝8.8)；6.81(d，1H，J＝9.0)；6.73(d，1H，J＝7.3)；4.87(s，2H)；4.72(s，2H)；3.14(s，3H)；3.05(t，2H，J＝6.1)；2.99(t，2H，J＝6.5)。這組峰具有相應于酰胺鍵構象體孿生峰(比例約為3∶1)；質譜370(M－H)-；484(M＋CF3COO-)；741(2M－H)-。C19H21N3O5·1.0F3C2O2H·0.5H2O計算值C，51.02；H，4.69；N，8.50。實測值C，51.19；H，4.38；N，8.14。
實施例24-[2-[4-[6-氨基-2-吡啶基]-1-氧代丁基(甲基)氨基]-1-氧代乙基]苯氧代乙酸(i).4-(2-[6-溴吡啶基])-3-丁炔-1-醇用3-丁炔-1-醇代替炔丙醇進行與實施例1(i)的同樣反應。產率49％，NMR(CDCl3)7.49(“t”，1H，J＝7.7)； 7.41(d，1H，J＝7.8)；7.34(d，1H，J＝7.3)；3.85(t，2H，J＝6.1)；2.72(t，2H，J＝6.2)。質譜226(M＋H+)；250(M＋Na+)。得到雙加合物產率16％。(ii).4-(2-[6-溴吡啶基])丁-1-醇用4-(2-[6-溴吡啶基])-3-丁炔-1-醇進行與實施例1(ii)同樣的反應。產率82％。NMR(CDCl3)7.46(“t”，1H，J＝7.6)；7.30(d，1H，J＝7.6)；7.12(d，1H，J＝7.3)；3.68(t，2H，J＝6.3)；3.0(br，1H)；2.79(t，2H，J＝7.7)；1.79(m，2H)；1.63(m，2H)質譜212(M＋H＋H2O)-；230(M＋H+)；252(M＋Na+)。EAC9H12NOBr計算值C＝46.98；H＝5.26；N＝6.09；實測值C＝46.96；H＝5.16；N＝5.89。還得得到烯烴，產率8％。(iii).4-(2-[6-溴吡啶基])丁酸用4-(2-[6-溴吡啶基])丁-1-醇進行與實施例1(iii)同樣的反應。產率95％。NMR(CDCl3)9.9(br，1H)；7.48(″t″，1H，J＝7.6)；7.32(d，1H，J＝7.8)；7.14(d，1H，J＝7.3)；2.84(t，2H，J＝7.5)；2.42(t，2H，J＝7.1)；2.06 (″q″，2H，J＝7.3)(iv)4-(2-[6-氨基吡啶基])丁酸用4-(2-[6-溴吡啶基])丁酸進行與實施例1(iv)同樣的反應，只是用乙酸乙酯重結晶進行最后的純化。產率71％。NMR(CD3OD)7.58(″t″，1H，J＝8.0)；6.59(m，2H)；2.71(t，2H，J＝7.6)；2.30(t，2H，J＝7.1)；1.95(″q″，2H，J＝7.3).質譜163(M＋H+-H2O)；181(M＋H+).(v).4-[2-[4-[6-氨基-2-吡啶基]-1-氧代丁基(甲基)氨基]-1-氧代乙基]苯氧基乙酸用4-(2-[6-氨基吡啶基])丁酸進行與實施例1(v)同樣的反應，只是用1％乙酸水溶液代替異丙醇進行接著的氫化濾液除去催化劑。總產率26％。NMR(DMSO-d5)7.93(d，2H，J＝8.7)；7.75(“t”，1H，J＝8.0)；7.62(br，1H)；7.4(d，2H，J＝8.8)；6.73(d，1H，J＝8.8)；6.66(d，1H，J＝7.2)；4.83(s，2H)；4.81(S，2H)；3.36(br)；3.00(s，3H)；2.70(t，2H，J＝7.3)；1.86(m，2H)。這組峰還有相應于酰胺鍵構象體孿生峰(比為約2∶1)質譜384(M－H)-；498(M＋CF3COO-)；769(2M－H)-。EAC20H23N3O5·1.5F3C2O2H2O·OH2O計算值C，46，63；H，4.85；N，7.09。實測值C，46，25；H，5.02；N，6.88。
實施例33-[6-氨基-2-吡啶基]丙酰基甘氨酰基-(L)-天冬氨酰基-(L)-苯基丙氨酸使3-(2-[6-氨基吡啶基])丙酸(63mg，0.28mmol)，HOBT(50mg，0.37mmol)，HCl·H2N-Gly-Asp(OBn)-Phe-OBn(155mg，0.28mmol)和二異丙基乙胺在7ml無水二甲基甲酰胺中混合。反應混合物在7ml無水二甲基甲酰胺中混合。反應混合物冷卻至0℃，一次性加入EDC(68mg，0.35mmol)，反應混合物加熱至室溫，并置于氬氣氛下。18小時，40℃下旋轉蒸發除去二甲基甲酰胺。殘余物在乙酸乙酯和水間分配，有機層用水清洗一次，用5％檸檬酸清洗兩次，再用水清洗一次，用5％碳酸氫鈉溶液清洗兩次，再用水清洗一次，最后用鹽水清洗一次。用硫酸鈉干燥有機溶液，并除去乙酸乙酯。從此溶液中得到85mg(55％)起始的肽。用稀NaOH調節合并的含水清洗液至pH9，并用二氯甲烷萃取。所得油狀物通過硅膠色譜純化，用5％甲醇/二氯甲烷洗脫。將所得產物(30mg，0.5mmol)溶于5ml乙醇中，用10％Pd/C(用丁醇濕潤)(10mg)處理，用H2中洗燒瓶，并在H2氣氛下攪拌18小時。之后，TLC顯示有一些起始原料，再加入7mg10％Pd/C，再將反應混合物置于H2下。24小時后，用旋轉蒸發器除去溶劑，殘余物用1％乙酸的水溶液處理。過濾溶液，用HPLC純化。得到19mg所需產物，為白色粉末。總產率10％。NMR(CD3OD)7.79(“t”，1H，J＝8.1)；7.22(m，5H)；6.81(d，1H，J＝9.0)；6.73(d，1H，J＝7.2)；4.74(“t”，1H，J＝5.1)；4.61(m，1H)；3.85(s，2H)；3.18(“a-b”d，1H，J＝4.5)；3.02(m，3H)2.79(“a-b”d，1H，J＝5.0)；2.66(m，3H)。質譜484(m－H)-；598(M＋CF3COO-)。EAC23H27N5O7·2.5F3C3O2H·2.5H2O計算值C，41.24；H，4.22；N，8.59。實測值C，41.30；H，4.26；N，8.81。
實施例44-[6-氨基-2-吡啶基]丁酰基甘氨酰基-(L)-天冬氨酰基-(L)-苯基丙氨酸用實施例3的同樣方法處理4-(2-[6-氨基吡啶基])丁酸。總產率，11％。
NMR(DMSO-d5)8.21(d，1H，J＝8.1)；8.16(br，1H)；8.01(d，1H，J＝7.7)；7.80(″t″，2H，J＝7.9)；7.20(m，5H)；6.79(d，1H，J＝8.8)；6.70(d，1H，J＝7.3)；4.59(″q″，1H，J＝5.1)；4.36(″q″，1H，J＝5.2)；3.69(s，2H)；3.41(br)；2.97(″a-b″d，2H，J＝5.2，J＝8.5)；2.67(m，3H)；2.42 Ca-b″，1H，J＝8.3)；2.19(t，2H，J＝7.1)；1.85(m，2H).
質譜498(M－H)-； 612(M＋CF3COO-)。EAC24H29N5O7·2.0F3C2O2H·1.5H2O計算值C，44.57；H，4.54；N，9.28。實測值C，44.84；H，4.80；N，8.68。
實施例5Nα-乙酰基刀豆氨酰基-甘氨酰基-天冬氨酰基苯胺(i).Nα-叔丁氧羰基-Nω-叔丁氧羰基-刀豆氨酸將刀豆氨酸硫酸鹽(5.0g，18.2mmol，Sigma)溶于10％NaOH(水溶液，50ml)和叔丁醇(50ml)的混合物中，在室溫下用碳酸二叔丁酯(12.0g，55mmol)處理13天(反應在2天內完成)。真空蒸發反應混合物，然后在減壓下用甲醇蒸發。粗產物經其鈉鹽形式在真空下貯存。無需進一步純化則可使用MS(FAB)鈉鹽m/e398[(M－H)＋Na]+。(ii).Nα-叔丁氧羰基-Nω-叔丁氧羰基-刀豆氨酸基甘氨酸甲酯用二異丙基乙胺(19ml，109.3mmol)、甘氨酸甲酯鹽酸鹽(4.58g，36.5mmol，Schweizerhall)、1-羥基苯并三唑(4.93g，36.5mmol)和苯并三唑-1-基氧三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸鹽(16.1g，36.5mmol)處理上述被保護的刀豆氨酸鹽的DMF(250ml)溶液，并在室溫下攪拌24小時。真空蒸發后，殘余物用反復快速色譜純化(硅膠，8×20cm，2％甲醇的氯仿溶液；硅膠，8×20cm，60％乙酸乙酯的己烷溶液)得到3.86g(47％由刀豆氨酸硫酸鹽)產物。
1H-NMR(CDCl3，250MHz)d 1.44(s，9H)；1.49(s，9H)；198-2.13(m，2H)；3.77(s，3H)；3.93-4.24(m，6H)；4.37-4.53(m，1H)；5.55-5.68(m，1H)；6.31-6.48(m，1H)；7.74-7.84(m，1H)。(iii)，Nα-叔丁氧羰基-γ-芐基天冬氨酰基苯胺將Nα-叔丁氧羰基-γ-芐基天冬氨酸(5.0g，15.5mmol，PRF)溶于DMF(100ml)中，用苯胺(2.1ml，23.3mmol)，1-羥基苯并三唑(2.3g，17.1mmol)和N，N-二環己基碳化二亞胺(3.2g，15.5mmol)在室溫下處理24小時。過濾反應混合物并真空蒸發濾液。殘余物用快速色譜純化(硅膠，6×20cm，15％乙酸乙酯的己烷溶液)得到5.70g(92％)產物1H-NMR(CDCl3)δ1.45(s，9H)，2.60-3.23(m，2H)，4.53-4.87(m，1H)，5.20(s，2H)，5.90(d，1H，J＝9Hz)，7.00-7.67(m，5H)，7.40(s，5H)，8.63(brs，1H)。(iv).γ-芐基天冬氨酰基苯胺鹽酸鹽用4N HCl的二噁烷溶液在室溫下處理Nα-叔丁氧羰基-γ-芐基天冬氨酰基苯胺(2.75g，6.9mmol)4小時。減壓蒸發反應混合物。然后殘余物首先用甲苯蒸發，然后用甲苯/甲醇蒸發，并真空干燥得到粗產物，無需進一步純化則可使用。(v).Nα-叔丁氧羰基-Nω-叔丁氧羰基刀豆氨酰基甘氨酸用5.2ml 1N NaOH(含水)在室溫下處理Nα-叔丁氧羰基-Nω-叔丁氧羰基刀豆氨酰基甘氨酸甲酯(1.54g，3.45mmol)的二噁烷(10ml)溶液4.5小時，調節反應混合物在pH至5.5-6.0(1N，HCl水溶液)，然后真空蒸發。殘余物用甲苯蒸發并真空干燥得到產物，無需進一步純化則可使用。(vi).Nα-叔丁氧羰基-Nω-叔丁氧羰基刀豆氨酰基-甘氨酰基-γ-芐基-天冬氨酰基苯胺將化合物γ-芐基天冬氨酰基苯胺鹽酸鹽和Nα-叔丁氧羰基-Nω-叔丁氧羰基刀豆氨酰基甘氨酸溶于DMF(200ml)中，用二異丙基乙胺(3.61ml，20.7mmol)、1-羥基苯并三唑(932mg，6.9mmol)和苯并三唑-1-基氧三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸鹽(3.05g，6.9mmol)處理，并在室溫下攪拌5天。真空蒸發反應混合物，殘余物通過反復快速色譜純化(硅膠，6×21cm，3-10％甲醇的氯肪溶液；硅膠，6×21cm，60-100％乙酸乙酯的己烷溶液)得到2.20g(89％)混有少量HMPA(用BOP試劑)的產物1H NMR(CDCl3，90MHz)d 1.43(s，9H)，1.47(s，9H)，1.97-2.27(m，2H)，3.03(d，2H，J＋7.5Hz)，3.77-4.10(m，4H)，4.20-4.55(m，1H)，4.90-5.23(m，1H)，5.17(s，2H)，5.93(d，1H，J＝7.5Hz)，6.17(brs，2H)，6.83-8.17(m，13H)，8.87(brs，1H)；MS(ES)m/e 714(M＋H)+.(vii).刀豆氨酰基-甘氨酰基-γ-芐基-天冬氨酰基-苯胺鹽酸鹽用TFA在室溫下處理被保護的肽產物(486mg，0.677mmol)2小時。減壓蒸發反應混合物。殘余物用甲苯蒸發，用4N HCl的二噁烷溶液蒸發兩次，然后用甲苯蒸發，得到粗產物，為鹽酸鹽，無需進一步純化則可使用。(viii).Nα-乙酰基-刀豆氨酰基-甘氨酰基-γ-芐基-天冬氨酰基-苯胺將上述粗鹽溶于DMF中，用二異丙基乙胺中和。加入乙酐(64μl，0.677mmol)，所得溶液在室溫下攪拌24小時。真空蒸發反應混合物，殘余物通過快速色譜純化(硅膠，4×20cm，20％甲醇的氯仿溶液)得到產物1H NMR(CD3OD，90MHz)δ2.02(s，3H)，2.15(t，2H，J＝6.0Hz)，2.93-3.17(m，2H)，3.83-4.10(m，4H)，4.27-5.13(m，2H＋HOD)，5.20(s，2H)，6.83-7.93(m，10H)；MS(ES)m/e 466(M+H)+.(ix).Nα-乙酰基-刀豆氨酰基-甘氨酰基-天冬氨酰基-苯胺將上述被保護的肽溶于含5％Pd/C的甲醇中，用氫氣(Par反應器，50psi，室溫)處理4小時。用硅藻土墊過濾反應混合物，并減壓蒸發。然后殘余物用甲苯和甲醇的混合物蒸發得到190mg粗產物。將部分產物(96mg)通過分配純化(G-25，2.5cm×1m)，用正丁醇∶乙酸∶水(4∶1∶5)的上層液洗脫，得到47.6mg純產物ES(FAB)m/e 466[M＋H]+，m/e464[M－H]-；HPLC K′2.29[5μPRP-1Hamiliton，4.6×250mm，流速＝1.5ml/min，UV檢測為220nm，88∶12(0.1％三氟乙酸(含水)0.1％三氟乙酸的乙腈溶液)]HPLC K′2.79 [5μPRP-1Hamiliton，L4.6×250mm，流速＝1.5ml/min，UV檢測為220nm，梯度洗脫(0.1％三氟乙酸(含水)0.1％三氟乙酸的乙腈溶液)，開始時為95∶5，20分鐘后為50∶50，保持5分鐘，5分鐘內回到95∶5]；TLC Rf0.23(硅膠，4∶1∶11丁醇∶乙酸∶水)；TLC Rf0.42(硅膠，1∶1∶1∶1丁醇∶乙酸∶水∶乙酸乙酯)。
實施例64-[[N-甲基-N-[3-(4-吡啶基)丙酰基]氨基]乙酰基]-2，2′-[1，2-亞苯基二(氧基)]二乙酸i).N-(芐氧羰基)腎上腺酮向5℃攪拌著的腎上腺酮鹽酸鹽(28.6g，0.121mol)的2N氫氧化鈉(200ml)溶液中同時滴加入氯甲酸芐酯(20.6g，0.121mol)的甲苯(18ml)和2N氫氧化鈉(60ml)的分離的溶液，所得溶液在5℃攪拌75分鐘，用水(230ml)稀釋并用1N鹽酸(536ml)酸化。攪拌所得的懸浮液30分鐘后，過濾形成的淺棕色固體，在水(180ml)中攪拌再次過濾。濾餅在乙醇(135ml)中短暫攪拌，過濾并空氣干燥。用乙醇(135ml)研制固體，過濾并真空干燥得到標題化合物(28.6g，75％)mp.183-6℃，1H NMR(250MHz，MeOD4)δ7.35(m，7H)，6.83(d，1H)，5.1(s，2H)，4.55(s，2H)。ii).4-[[N-(芐氧羰基)-N-甲基氨基]乙酰基]-2，2′-[1，2-亞苯基二(氧基)]二乙酸二甲酯將實施例6(i)的化合物(23.6g，0.0748mol)。丙酮(340ml)和無水碳酸鉀(21.0g)的混合物在氬氣氛下加熱回流70分鐘。將所得懸浮液冷卻至室溫，滴加入溴乙酸乙酯(29.0g，0.189mol)處理。懸浮液在室溫攪拌16小時，在50℃攪拌6小時，冷卻并過濾。濃縮濾液，殘余物溶于二氯甲烷(800ml)中。溶液用水(160ml)、5％碳酸氫鉀水溶液(2×100ml)洗滌并干燥(硫酸鈉)。濃縮得到標題化合物(26.35g，82.3％)mp56-9℃；MS(DCI，NH3)m/e446[M＋H]+；1NMR(250MHz，CDCl3)δ7.55(d，J＝8.5，1H)，7.5(s，1H)，7.4(m，5H)，6.85(d，J＝8.5，1H)，5.15(s，2H)，4.80(s，2H)，4.77(s，2H)，4.7(d，2H)，3.80(s，6H).元素分析(C22H23NO9·3/8H2O)計算值C，58.44；H，5.29；N，3.10。實測值C，58.44；H，5.13；N，2.94。(iii).4-[(N-甲基氨基)乙酰基]-2，2′-[1，2-亞苯基二(氧基)]二乙酸二甲酯鹽酸鹽用1M氯化氫的乙醚(12ml)溶液處理實施例6(ii)化合物(5.0g，11.7mmol)的無水甲醇(150ml)溶液，加入10％鈀/炭，懸浮液在室溫下氫化(10psi)。5分鐘后，過濾混合物，濃縮濾液得到標題化合物(3.6g，94％)mp＞197℃(分角)；1H NMR(250MHz，MeOD4)δ7.65(d，J＝8.5，1H)，7.56(s，1H)，7.05(d，J＝8.5，1H)，4.88(s，2H)，4.85(s，2H)，4.5(s，2H)，3.75(s，6H).iv).4-[[N-甲基-N-[3-(4-吡啶基)丙酰基]氨基]乙酰基]-2，2′-[1，2-亞苯基二(氧基)]二乙酸二甲酯將3-(4-吡啶基)丙酸(0.75g，5mmol)在亞硫酰氯(6ml)中回流12分鐘。濃縮混合物并用甲苯濃縮兩次。將所得黃色固體懸浮于二氯甲烷(10ml)中，并在氬氣氛下滴加入含有二異丙基乙胺(1.9g，15mmol)的實施例6(iii)化合物(1.6g，5mmol)二氯甲烷(50ml)的冷溶液中。在氬氣氛室溫下攪拌淺琥珀色溶液20小時。用水和鹽水洗滌混合物，干燥有機相(硫酸鎂)并濃縮。殘余的油狀物通過色譜純化(硅膠、2％甲醇/二氯甲烷)。合并含有產物的餾分并濃縮得到白色固體的標題化合物(0.66g，30％)MS(ES)m/e459(M＋H)+；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.75(t，J＝6.7Hz，2H)，3.0(t，J＝6.7Hz，2H)，3.05(s，3H)，3.75(s，6H)，4.7(m，2H)，4.75(s，2H)，6.85(d，J＝8.5Hz，1H)，7.15(d，J＝6.5Hz，2H)，7.5(s，1H)，7.6(d，J＝8.5Hz，1H)，8.45(d，J＝6.5Hz，2H).v).4-[[N-甲基-N-[3-(4-吡啶基)丙酰基]氨基]乙酰基]-2，2′-[1，2-亞苯基二(氧基)]二乙酸將實施例6(iv)化合物(0.2g，0.43mmol)的10％乙酸水溶液回流35小時。濃縮混合物，殘余物用HPLC純化(YMCODS AQ，50×250mm；90ml/min，15％CH3CN/H2O/0.1％TFA，UV檢測220nm)。合并產物餾分，濃縮至少體積，冷凍干燥得到標題化合物(92mg，50％)，為松散的白色吸濕固體MS(ES)m/e 421(M＋H)+；1HNMR(400MHz，MeOD4)δ3.05(t，J＝6.7Hz，2H)，3.15(s，3H)，3.25(t，J＝6.7Hz，2H)，4.75(s，2H)，4.85(s，2H)，4.8(s，2H)，7.0(d，J＝8.5Hz，1H)，7.55(s，1H)，7.65(d，J＝8.5Hz，1H)，7.95(d，J＝6.5Hz，2H)，8.65(d，J＝6.5Hz，2H).元素分析(C21H22N2O8·1.5TFA·2H2O)計算值C，46.53；H，4.15；N，4.52。實測值C，46.33；H，4.27；N，4.66。
實施例7Nα-苯甲酰基-N-[(氰基亞氨基)(苯氧基)甲基]-Nα-MeOrn-Gly-Asp苯基酰胺i).Nα-芐氧羰基-Nα甲基-Orn(Phth)按類似J.Org。Chem.1983，48，77所述的方法，轉化NαCbz-Orn(Phth)得到標題化合物。ii).Nα芐氧羰基-NαMeOrn(Phth)-Gly甲酯將實施例7(i)化合物(9g，22mmol)、甘氨酸甲酯鹽酸鹽(3.5g，27.8mmol)、1-羥基苯并三唑(3.66g，27mmol)、二異丙基乙胺(8ml，18mmol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(5.13g，26.8mmol)的二甲基甲酰胺(50ml)溶液攪拌過夜，用水稀釋混合物，用乙酸乙酯萃取，有機相用稀鹽酸洗滌、用稀碳酸鈉洗滌、干燥(硫酸鎂)并濃縮得到標題化合物(8.3g)。iii).NαMeOrn(Phth)-Gly甲酯用15滴濃鹽酸和10％鈀/炭(5.0g)處理實施例7(ii)化合物(25.0g，51mmol)的甲醇(150ml)溶液。混合物在氫氣氛中振蕩5小時。過濾混合物并濃縮濾液得到標題化合物(21.0g，定量)。iv).Nα苯甲酰基-NαMeOrn(Phth)-Gly甲酯用二異丙基乙胺(22.3g，0.17mol)處理實施例7(ii)化合物(20.0g，58mmol)的二氯甲烷(150ml)溶液并在冰浴中攪拌。用苯甲酰氯(8.46g，60mmol)的二氯甲烷(20ml)溶液處理混合物，攪拌1小時，用3N鹽酸洗滌。干燥有機相(硫酸鎂)并濃縮提到標題化合物(23.6g，83％)。v).Nα苯甲酰基-NαMeOrn(Phth)-Gly將實施例7(iv)化合物(23g，47mmol)的丙酮(250ml)、水(200ml)和濃鹽酸(40ml)溶液加熱回流24小時；冷卻、用水稀釋并用乙酸乙酯萃取。干燥有機相(硫酸鎂)并濃縮得到標題化合物(200g，90％)。vi).Nα苯甲酰基-NαMeOrn(Phth)-Gly-Asp(O-Bzl)-苯基酰胺將實施例7(v)化合物(15.0g，32mmol)、Asp(O-Bzl)苯基酰胺(12.7g，32mmol)、1-羥基苯并三唑(6.07g，45mmol)、二異丙基乙胺(8.32g，64mmol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(6.68g，35mmol)的二甲基甲酰胺(70ml)混合物攪拌過夜。用水稀釋混合物、用乙酸乙酯萃取，有機相用冷的3N鹽酸洗滌、干燥(硫酸鎂)并濃縮。殘余物通過色譜純化(硅膠，3％甲醇(/二氯甲烷)得到標題化合物(12g，44％)MS m/e718.2M＋H]+。Vii).Nα苯甲酰基-NαMeOrn(Phth)-Gly-Asp-苯基酰胺在加熱下將實施例7(vi)化合物(5.0g，5.8mmol)溶于乙醇(100ml)中，用10％鈀/炭(2.0g)處理，用乙酸水溶液洗滌并過濾。混合物在氫氣氛下振蕩15小時，過濾并濃縮濾液得到標題化合物(4.4g，88％)。viii).Nα苯甲酰基-NαMeOrn-Gly-Asp-苯基酰胺用肼(1.0g，20mmol)處理實施例7(vii)化合物(4.4g，6.7mmol)的乙醇(60ml)溶液。加熱回流1小時，冷卻并濃縮得到粗標題化合物MS(FAB)m/e498[M＋H]+。ix).Nα苯甲酰基-N[(氰基亞氨基)(苯氧基)甲基]-NαMeOrn-Gly-Asp-苯基酰胺將實施例7(viii)化合物(2.0g，4.5mmol)和氰基碳化亞氨酸二苯酯(1.25g，5.3mmol)的異丙醇(40ml)混合物攪拌過夜、過濾并濃縮濾液。色譜純化(硅膠、4％-8％-15％甲醇/二氯甲烷含有2％乙酸)殘余物得到標題化合物(0.7g，25％)MS(ESI)m/e642.2[M＋H]+。
實施例8Nα苯甲酰基-NG-氰基-NαMeArh-Gly-Asp-苯基酰胺將實施例7(ix)化合物(0.3g，0.46mmol)溶于甲醇(20ml)中，冷卻，用氨氣流處理5分鐘。室溫下攪拌混合物過夜、液縮、殘余物溶于甲醇(2ml)中，用乙酸處理直到pH大約為5。用乙酸稀釋溶液得到白色固體的標題化合物(0.24g，92％MSm/e565.2[M＋H]+。
實施例9N-[Nα-苯甲酰基-NΔ-(1H-咪唑-2-基)-Nα-甲基-Orn-Gly]-3-(2-苯并噻唑基)-β-丙氨酸(i).3-(2-苯并噻唑基)-β-丙氨酸環己基酯a).2-[[3-(環己基氧羰基)-2-[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]丙酰基]氨基]苯基二硫化物將N-Boc-Asp β-環己基酯(3.2g，10mmol)，2-氨基苯基二硫化物(3.0g，12mmol)，氯甲酸異丁酯(1.44g，14.2mmol)和4-甲基嗎啉(1.326g，10mmol)的四氫呋喃混合物攪拌過夜。殘余物溶于二氯甲烷中，用水洗滌，干燥并減壓下濃縮。色譜純化(硅膠，30％乙醚/石油醚)殘余物。合并含有標題化合物的餾分，用1N鹽酸洗滌、用水洗滌、干燥并濃縮得到標題化合物(3.8g，90％)TLC Rf0.26(硅膠，7∶3石油醚∶乙醚)。
b).3-(2-苯并噻唑基)-3-(1，1-二甲基乙氧羰基)氨基丙酸環己基酯將實施例9(i)(a)化合物(3.1g，3.7mmol)和乙酸加熱至50℃，以15分鐘間隔加入鋅粉(5.6g)。過濾熱混合物、濃縮濾液、色譜純化(硅膠、30％乙醚/石油醚)得到標題化合物(2.2g，74％)TLC Rf0.42(硅膠，7∶3石油醚∶乙醚)。
c).3-氨基-3-(2-苯并噻唑基)丙酸環己基酯將實施例9(i)(b)化合物(6.9g，17mmol)和氯化氫的二噁烷(110ml)溶液攪拌過夜、濃縮、殘余物用甲苯處理并濃縮得到標題化合物(5.7g，98％)TLC Rf0.4(硅膠，97∶3二氯甲烷∶甲醇)MS(SCI/NH3)305[M＋H]+。ii).N-[Nα-苯甲酰基-Nα-甲基-Orn(Phth)-Gly]-3-(2-苯并噻唑基)-β-丙氨酸環己基酯將實施例7(v)化合物(5.0g，11mmol)、實施例9(i)(c)化合物(3.0g，11mmol)，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(2.95g，15.4mmol)，二異丙基乙胺(3.9ml，22mmol)和1-羥基苯并三唑(2.1g，15.5mmol)的二甲基甲酰胺混合物攪拌過夜。濃縮混合物，用水稀釋并用二氯甲烷萃取。有機相用水洗滌、干燥并濃縮。色譜純化(硅膠，5％甲醇/二氯甲烷)殘余物得到標題化合物(3.2g，40％)。iii).N-[Nα-苯甲酰基-Nα-甲基-Orn-Gly]-3-(2-苯并噻唑基)-β-丙氨酸環己基酯將實施例9(ii)化合物(3.2g，4.4mmol)和肼水合物(0.33g)在甲醇(27ml)中攪拌72小時。濃縮混合物，殘余物通過HPLC色譜純化(Ultrasphere ODS，41mm×250mm，60ml/min，35％乙腈/水/O/1％三氟乙酸，UV檢測254nm)得到標題化合物(1.7g，65％)。(iv).N-(2，2-二甲氧基乙基)-2-甲基-2-假硫脲a).N(2，2-二甲氧基乙基)硫脲用氨飽和甲醇(200ml)并與異硫氰酸根合乙醛二甲基縮醛(5.0g)一起攪拌2小時。濃縮混合物，色譜純化(硅膠，5％甲醇/二氯甲烷)殘余物得到標題化合物。
b).N-(2，2-二甲氧基乙基)-2-甲基-2-硫代假脲將實施例9(iv)(a)化合物(5.9g)和碘甲烷的乙腈溶液攪拌過夜、濃縮、溶于二氯甲烷中、干燥并濃縮得到標題化合物。v).N-[Nα-苯甲酰胺-Nα-甲基-N-[[(2，2-二甲基氧基乙基)氨基]硫代羰基)]-Orn-Gly]-3-(2-苯并噻唑基)-β-丙氨酸環己基酯將實施例9(iii)化合物(1.6g，27mmol)和實施例9(iv)化合物(1.1g，3.9mmol)與二異丙基乙胺(1.3ml，7.3mmol)的二甲基甲酰胺溶液一起攪拌。濃縮混合物，殘余物溶于水中。用二氯甲烷萃取沉淀出的固體，有機相用水洗滌、干燥并濃縮。色譜純化(硅膠、5％甲醇/二氯甲烷)殘余物得到標題化合物(1.2g，63％)。vi).N-[Nα-苯甲酰基-NΔ-(1H-咪唑-2-基)-Nα-甲基-Orn-Gly]-3-(2-苯并噻唑基)-β-丙氨酸環己基酯將實施例9(v)化合物(1.2g)在50％三氟乙酸水溶液(50ml)中攪拌28小時并濃縮。殘余物通過HPLC純化(UltrsphereODS，41mm×250mm，60ml/min，梯度，A乙腈B水/0.1％三氟乙酸，10％-80％乙腈，UV檢測254nm)得到標題化合物(0.2g)。viii).N-[Nα-苯甲酰基-NΔ-(1H-咪唑-2-基)-Nα-甲基-Orn-Gly]-3-(2-苯并噻唑基)-β-丙氨酸用氟化氫和苯甲醚處理實施例9(vi)化合物得到標題化合物。
實施例104-[[N-甲基-N-[5-(2-氨基苯并咪唑基)]氨基]乙酰基]-2，2′-[1，2-亞苯基二(氧基)]二乙酸i).4-[[N-甲基-N-(3，4-二硝基苯甲酰基)氨基]乙酰基]-2，2′-[1，2-亞苯基二(氧基)]二乙酸二甲基酯將3，4-二硝基苯甲酸(1.1g，4.5mmol)的亞硫酰氯(10ml)溶液回流3小時，將反應混合物冷卻，濃縮，用二氯甲烷濃縮幾次并減壓干燥0.5小時。殘余物溶于二氯甲烷(5ml)中，將其滴加到實施例6(iii)化合物(1.45g，4.0mmol)的含有二異丙基乙胺(4.0ml，13.5mmol)的二氯甲烷(25ml)溶液中。混合物在室溫下攪拌1.5小時，用稀鹽酸、5％碳酸氫鈉、鹽水洗滌混合物，干燥(硫酸鎂)并濃縮。殘余物通過快速色譜純化(硅膠、二氯甲烷∶甲醇，99∶1)得到標題化合物(650mg，33％)MS(FAB)m/e520[M＋H]+。1H-NMR(250MHz，CDCl3)δ8.08(s，1H)，8.0(d，1H)，7.9(s，1H)，7.60(d，J＝8.5，1H)，7.54(8，1H)，6.9(d，J＝8.5，1H)，4.9(s，2H)，4.82(s，2H)，4.79(s，2H)，3.8(s，6H)，3.0(s，3H).ii).4-[[N-甲基-N-(3，4-二氨基苯甲酰基)氨基]乙酰基]-2，2′-[1，2-亞苯基二(氧基)]二乙酸二甲基酯二鹽酸鹽用10％鈀/炭(100mg)處理實施例10(i)化合物(440mg，0.8mmol)的含有1M乙醚的鹽酸)1.0ml)的甲醇(20ml)的二氯甲烷(5ml)溶液并氫化(50psi)7小時。過濾混合物，濃縮濾液得到標題化合物(0.4g，94％)MS(ES)m/e460[M＋H]+。iii).4-[[N-甲基-N-[5-(2-氨基苯并咪唑基)]氨基]乙酰基]-2，2′-[1，2-亞苯基二(氧基)]二乙酸二甲基酯用5％碳酸鈉水溶液中和實施例10(ii)化合物(400mg，0.7mmol)的水(10ml)和甲醇(5ml)溶液至pH7.0，接著加入溴化氰(75mg，0.7mmol)。混合物在室溫下攪拌過夜。蒸發甲醇，用10％氫氧化鈉水溶液堿化水相至pH10.0，并用乙酸乙酯萃取產物。干燥有機相(硫酸鎂)、濃縮、色譜純化(硅膠，93∶7二氯甲烷∶甲醇)殘余物得到標題化合物(100mg，31％)MS(ES)m/e485[M＋H]+，483(M－H]-。iv).4-[[N-甲基-N-[5-(2-氨基苯并咪唑基)]氨基]乙酰基]-2，2′-[1，2-亞苯基二(氧基)]二乙酸二(三氟乙酸)鹽將實施例10(iii)化合物在10％乙酸水溶液(10ml)中加熱回流24小時，濃縮混合物，用三氟乙酸處理殘余物并用制備型MPLC(ODS柱，30％甲醇/水)純化得到標題化合物(39mg，28％)MS(ES)m/e457[M＋H]+，455[M－H]-；1H NMR(250MHz，MeOD4)7.75(d，J＝8.5，1H)，7.6(s，1H)，7.48(s，1H)，7.4(m，2H)，7.28(s，1H)，7.05(d，J＝8.5，1H)，5.0(s，2H)，4.8(s，2H)，4.76(s，2H)，3.05(s，3H).元素分析(C21H20N4O6·2TFA.2/3H2O)計算值C，43.11；H，3.88；N，8.04；實測值C，43.11；H，3.66；N，8.09。
實施例11N-[N-[4-[(氨基亞氨基甲基)亞肼基]丁酰基]-N-甲基-甘氨酰基]-3-(2-苯并噻唑基)-β-丙氨酸i).N-(3-羧基丙酰基)-N-甲基-甘氨酸芐酯將肌氨酸芐酯(3.0g，30.7mmol)和琥珀酐(5.5g，30.7mmol)的甲苯(75ml)混合物加熱回流3小時，冷卻，過濾并濃縮。殘余物溶于5％碳酸鈉水溶液，用乙酸乙酯萃取。用濃鹽酸調節水相至pH3(用剛果紅試紙測試)，用乙酸乙酯萃取。有機相用水洗滌、干燥(硫酸鎂)并濃縮得到得到標題化合物(7.4g，67.5％)TLC Rf0.48(硅膠，91∶1二氯甲烷∶甲醇∶甲酸)。ii).N-[(3-乙基硫代羰基)丙酰基]-N-甲基-甘氨酸芐酯將實施例11(i)化合物(7.4g，28mmol)，乙硫醇(1.76g，28.3mmol)，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(5.4g，28mmol)，二異丙基乙胺(6ml，34mmol)，4-二甲基氨基吡啶(3.42g，27mmol)和1-羥基苯并三唑(3.42g，28mmol)的二甲基甲酰胺混合物攪拌過夜。濃縮混合物，溶于二氯甲烷中，用水洗滌。干燥有機相(硫酸鎂)、濃縮、色譜純化(硅膠、二氯甲烷)殘余物得到標題化合物(4.8g，55％)TLC Rf0.13(硅膠，95∶5二氯甲烷∶甲醇)。iii).N-[(3-甲酰基)丙酰基]-N-甲基-甘氨酸芐酯向實施例11(ii)化合物(1.2g)和三乙基硅烷(1.37g，11.8mmol)的丙酮(30ml)溶液中分批加入10％pd/c。過濾混合物，濃縮濾液，色譜純化(硅膠，5％甲醇/二氯甲烷)殘余物得到標題化合物(0.72g，75％)TLC Rf0.24(硅膠，二氯甲烷)；MS(DCI/NH3)264[M＋H]+。iv).N-[4-[(氨基亞氨基甲基)亞肼基]丁酰基]-N-甲基-甘氨酸芐酯用硝酸氨基胍(0.5g，3.7mmol)處理實施例11(iii)化合物(0.6g，2.4mmol)的乙醇溶液，混合物在蒸汽浴中加熱。冷卻混合物，濾出沉淀出的固體，用丙酮、乙醚和水洗滌。用二氯甲烷處理固體并濃縮得到標題化合物(0.65g，65％)MS(DCI/NH3)320[M＋H]+。v).N-[4-[(氨基亞氨基甲基)亞肼基]丁酰基]-N-甲基-甘氨酸將實施例11(iv)化合物(0.5g，2.6mmol)，碳酸鉀(0.36g，2.6mmol)、水(2ml)和四氫呋喃(5ml)攪拌過夜。濃縮混合物，溶于水中，用1N鹽酸調節pH至6。濃縮混合物，用甲苯處理殘余物并濃縮得到標題化合物(0.3g，50％)TLC Rf0.13(硅膠，9∶1∶1二氯甲烷∶甲醇∶甲酸)MS(DCI/NH3)230[M＋H]+。vi).N-[N-[4-[(氨基亞氨基甲基)亞肼基]丁酰基]-N-甲基-甘氨酰基]-3-(2-苯并噻唑基)-β-丙氨酸環己基酯將實施例11(v)化合物(0.4g，1.7mmol)，實施例9(i)化合物(0.53g，1.7mmol)，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(0.33g，1.7mmol)，二異丙基乙胺(0.7ml，7.3mmol)和1-羥基苯并三唑(0.23g，1.7mmol)在二甲基甲酰胺(30ml)中的混合物在室溫下攪拌過夜。加入鹽酸的二噁烷溶液使pH為5，接著加入二環己基碳化二亞胺(0.35g)。將混合物攪拌過夜，濃縮，用水稀釋并用二氯甲烷萃取。干燥有機相、濃縮，并將殘余物色譜純化(硅膠，10％甲醇/二氯甲烷)，和薄層色譜純化(硅膠)得到標題化合物(50mg，15％)MS(ESI)516[M＋H]+。vii).N-[N-[4-[(氨基亞氨基甲基)亞肼基]丁酰基]-N-甲基-甘氨酰基]-3-(2-苯并噻唑基)-β-丙氨酸將實施例(vi)化合物(30mg，0.06mmol)溶于四氫(5ml)和甲醇(5ml)中，用碳酸鉀(12mg)的水溶液處理并且攪拌過夜。濃縮混合物，殘余物通過HPLC純化(Dynamax，梯度A乙腈B水/0.1％三氟乙酸，13-50％乙腈)并冷凍干燥得到標題化合物(1.4mg)MS(ESI)434[M＋H]+。
實施例12環-(S，S)-(2-巰基)苯甲酰基-(Nα-甲基)-4-氨基甲基苯丙氨酰基-甘氨酰基-天冬氨酰基-(2-巰基)苯基酰胺[環(S，S-Mba-MeAmf-Gly-ASP-Man](i).Nα-叔丁氧羰基-Nα-甲基-對碘苯基丙氨酸用類似Can.J.Chem.55，906(1977)所述的方法，便Nα-叔丁氧羰基對碘苯基丙氨酸轉化為Nα-叔丁氧羰基-N-甲基對磺苯基丙氨酸。(ii).Nα-叔丁氧羰基-Nα-甲基-4-氨基甲基苯基丙氨酸用類似Syn.Commun.21，2103(1991)所述的方法，使Nα-叔丁氧羰基-Nα-甲基對碘苯基丙氨酸轉化Nα-叔丁氧羰基-Nα-甲基-4-氨基甲基苯基丙氨酸。(iii).Nα-叔丁氧羰基-Nα-甲基-4-CBZ-氨基甲基苯基丙氨酸用類似J.Am.Chem.Soc.76，5552(1954)所述的方法，使Nα-甲基-4-氨基甲基苯基丙氨酸轉化為Nα-叔丁氧羰基-Nα-甲基-4-CBZ氨基甲基苯基丙氨酸，從而得到標題化合物。1HNMR(CDCl3，360MHz)δ1.1-1.4(d，9H)，2.6-2.7(d，3H)，2.8-3.3(br，2H)，4.2-4.4(d，2H)，4.4-4.6，4.7-4.9(br，1H)，5.0-5.2(s，2H)，6.9-7.4(br，9H)，9.4-9.7(br，1H)，MS(ES)m/e443.2[M＋H]+；HPLC K′12.7(5μ Altex Ultrasphere ODS，4.5mm×25cm，梯度，A乙腈B水-0.1％三氟乙酸，5％-50％乙腈，20分鐘。UV檢測220nm)；[α]D-67°(c30，CHCl3)。(iv).Boc-Asp(0-cHex)-Man(4-MBzl)向Boc-Asp(0-cHex)(31.5g，100mmol)的THF(500ml)和N-甲基嗎啉(13.1g，120mmol)的冷溶液中滴加入氯甲酸異丁酯(15.6ml，1.2mmol)。將反應混合物攪拌幾分鐘，然后加入Man(4-MBzl)(22.0g，96mmol)的THF(500ml)溶液。將反應混合物加熱至室溫并攪拌18小時。反應完成后，過濾反應混合物，將濾液濃縮至干。殘余物溶于乙酸乙酯(500ml)中，依次用5％檸檬酸水溶液(3×150ml)、水(1×400ml)、10％MaHCO3水溶液(1×400ml)、水(1×400ml)和飽和鹽溶液(1×300ml)洗滌。干燥溶液(無水K2CO3)，過濾并濃縮得到標題化合物(53g)。(v).Asp(0-cHex)-Man(4-MBzl)在室溫下用50％TFA/二氯甲烷(400ml)處理Boc-Asp(0-cHex)-Man(4-MBzl)(52g)45分鐘。蒸發溶劑，用二氯甲烷驅除幾次以便除去痕量的TFA。加入乙醚后，產物以其TFA鹽的形式沉淀出來。收集固體并空氣干燥得到白色固體(46.7g，88％)。(vi).Boc-Gly-Asp(0-cHex)-Man(4-MBzl)向Asp(0-cHex)-Man(4-MBzl)(46.7g，86.4mmol)的DMF(100ml)冷溶液中，加入二異丙基乙胺(15ml，86.1mmol)。加入N-羥基苯并三唑(14.0g，104mmol)，接著加入Boc-Gly(16.6g，94.8mmol)。冷卻下攪拌反應混合物幾分鐘，加入N-乙基-N′(二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(18.2g，94.9mmol)。將反應混合物加熱至室溫并攪拌18小時，濃縮反應混合物至少體積并傾入1.5L 10％K2CO3水溶液。過濾收集沉淀出的產物，用水洗滌至中性pH，得到標題化合物(50.6g)。(vii).Gly-Asp(O-cHex)-Man(4-MBzl)按實施例4(b)所述的方法，用50％TFA/CH2Cl2(80ml)處理實施例12(vi)化合物(11.7g，20mmol)得到12.4g標題化合物。(viii).Boc-Me-Amf(cBZ)-Gly-Asp(0-cHex)-Man(4-MBzl)使實施例12(vii)化合物與實施例12(iii)化合物偶合得到標題化合物。(ix).MeAmf(cBZ)-Gly-Asp(0-cHex)-Man(4-MBzl)用實施例12(v)的方法，用50％TFA/CH2Cl2處理實施例12(viii)化合物得到標題化合物的TFA鹽。(x).Mba(SEt)MeAmf(cBZ)-Gly-Asp(0-cHex)-Man(4-MBzl)按實施例12(vi)的方法，使化合物12(ix)與Mba(SEt)偶合得到標題化合物。(xi).環-(S，S)-Mba Meamf-Gly-Asp-Man用無水HF(10ml)和苯甲醚(1ml)在0℃下處理實施例12(x)的保護的線性肽(0.25g，0.25mmol)1小時。0℃真空下除去HF，用乙醚洗滌殘余物得到棕色固體(0.116g)。快速色譜純化(中壓，ODS反相柱，25％乙腈/H2O-0.1％TFA)得到0.069純產物MS(ES)m/e622[M&N]+HPLC R′9.1(Altex Ultrasphere ODS，4.5mm×25cm，梯度A乙腈B水-0.1％三氟乙酸，10-50％乙腈，20分鐘內，220nm)；實施例13非腸道的單位劑量組合物制備無菌干粉狀的含有20mg實施例4化合物的制劑如下將20mg化合物溶于15ml蒸餾水。在無菌條件下過濾該溶液，裝入25ml的多劑量安瓿中并冷凍干燥。為了用于靜脈內或肌肉內注射可通過加入20ml 5％葡萄糖的水溶液(D5W)使該粉末重新配制，從而由注射體積確定劑量。接著通過將計量體積的單位藥劑加到另一體積的注射用D5W中進行稀釋，或者將計量的藥劑加到另一分散藥劑的裝置中，如用于IV滴注灌輸或其他注射一灌輸體系的瓶或袋中。
實施例14口服的單位劑量組合物通過將50mg實施例4化合物與75mg乳糖和5mg硬脂酸鎂混合并碾磨制得口服給藥的膠囊劑。將所得粉末過篩并裝入硬明膠膠囊中。
實施例15口服的單位劑量組合物口服片劑按下法制備將20mg蔗糖、150mg硫酸鈣二水合物和50mg實施例4化合物與10％明膠溶液混合并制粒，將濕顆粒過篩、干燥、與10mg淀粉、5mg滑石粉和3mg硬脂酸混合并壓制成片。
上面說明了本發明的產生和使用。然而本發明不局限于本文所述的具體實施例，它還包括在下面的權利要求范圍內的所有改變。
權利要求
1.式(I)化合物或其可藥用的鹽W-(CR′2)q-Z-(CR′R10)r-U-(CR′2)s-V-(Gly)n-(Asp)m-A(I)其中W是 R′R″N-，R′R″NR′N-，R′R″NR′NCO-，R′2NRN′C(＝NR′)-，R′ONR′C(＝NR′)-， Z是(CH2)t、Het、Ar、C3-7環烷基或NR′；U和V不存在或各自獨立地代表下列基團CO，CR′2，C(＝CR′2)，S(O)r，O，NR′，CR′OR′，CR′(OR″)CR′2，CR′2CR′(OR″)，C(O)CR′2，CR′2C(O)，CONR′，NR′CO，OC(O)，C(O)O，C(S)O，OC(S)，C(S)NR′，NR′C(S)，S(O)rNR′，NR′S(O)r，N＝N，NR′NR′，NR′CR′2，NR′CR′2，CR′2O，OCR′2，C≡C，CR′＝CR′，或CR′(NR′R″)C(O)；X是N＝CR′、C(O)或O；Y是S或O；m是0或1；n是0或1q是0至3每個r獨立地是0至3s是0至2每個t獨立地是0至2每個R′獨立地是H、C1-4烷基、C3-7環烷基-C0-4烷基或Ar-C0-4烷基；每個R″獨立地是R′、-C(O)R′或-C(O)OR15；R10不存在或代表H、C1-4烷基或-NR′R′；每個R13獨立地是R′、CF3、S′或OR′；每個R14獨立地是C1-4烷基、C3-7環烷基-C0-4烷基、Ar-C0-4烷基、C(O)R′、CN、NO2、SO2R′或C(O)OR15；每個R15獨立地是C1-4烷基、C3-7環烷基-C0-4烷基或Ar-C0-4烷基；A是 或 R2不存在或以下列基團存在一次或兩次C1-4烷基、J-CO2R′、CONR′、SR′、NR′R″、C1-4烷氧基、羥基、CN、CF3、鹵素、或 J是單鍵、-OCR′2-、-NR′CR′2-、CR′2-CR′2-、-CR′2-、-CR′＝CR′或-C(O)NR′CR′2-；Q是單鍵、CR′2、S、O或NR′；和D是C1-4烷基、C3-7環烷基、Ar或Het；條件是(1)當A是 則W-(CR2′)q-Z-(CR′R10)r-不是H2N-(CH2)3-5-CH-；(2)當A是 或 則W-(CR2′)q-Z-(CR′R10)r-不是NHR′；和(3)當A是 或 則W-(CR2′)q-Z-(CR′R10)r-不是
2.根據權利要求1的化合物其中Z是Het或(CH2)1-2；m、n和q各自為0；A是
3.根據權利要求2的化合物，其中Z是Het，W是R′R″N-，和在定義為苯基的A基團上至少一個R2是J-CO2R。
4.根據權利要求3的化合物，化合物為4-[2-[3-[6-氨基-2-吡啶基]-1-氧代丙基(甲基)氨基]-1-氧代乙基]苯氧基乙酸；4-[2-[4-[6-氨基-2-吡啶基]-1-氧代丁基(甲基)氨基]-1-氧代乙基]苯氧基乙酸；4-[[N-甲基-N-[5-(2-氨基苯并咪唑基)]氨基]乙酰基]-2，2′-[1，2-亞苯基二(氧基)]二乙酸；或其可藥用的鹽。
5.根據權利要求2的化合物，其中Z是(CH2)1-2，W是 和在定義為苯基的A基團上至少一個R2是J-CO2R。
6.根據權利要求5的化合物，它是4-[[N-甲基-N-[3-(4-吡啶基)丙酰基]氨基]乙酰基]-2，2′-[1，2-亞苯基二(氧基)二乙酸或其可藥用的鹽。
7.根據權利要求1的化合物，其中Z是(CH2)1-2或苯基；r和s各自為0；m和n各自為1；V不存在；和A是
8.根據權利要求7的化合物，其中W是 或
9.根據權利要求8的化合物，它是Nα-乙酰基-刀豆氨酰基-甘氨酰基-天冬氨酰基-苯胺；Nα-苯甲酰基-N(胍基)氰基-Nα-甲基-L-精氨酰基甘氨酰基-L-天冬氨酰基-1-苯胺；Nα-苯甲酰基-N-[(氰基亞氨基)(苯氧基)甲基]-Nα-甲基-L-鳥氨酰基甘氨酰基-L-天冬氨酰基-1-苯胺；或其可藥用的鹽。
10.根據權利要求1的化合物，其中Z是Het；m和n各自為1；V不存在；A是
11.根據權利要求10的化合物，其中W是R′R″N-。
12.根據權利要求11的化合物，化合物為3-[6-氨基-2-吡啶基]丙酰基-甘氨酰基-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸；4-[6-氨基-2-吡啶基]丁酰基-甘氨酰基-L-天冬氨酰基-L-苯基丙氨酸；或其可藥用的鹽。
13.根據權利要求1的化合物，其中Z是(CH2)1-2或NR′；A是 W是 或
14.根據權利要求13的化合物，其中D是Het。
15.根據權利要求15的化合物，化合物為Nα-苯甲酰基-NV-[1H-咪唑-2-基]-L-鳥氨酰基甘氨酰基-β-(2-苯并噻唑基)-β-丙氨酸；(±)-N-[(4-胍基氨基)丁酰基肌氨酰基]-β-(2-苯并噻唑基)-β-丙氨酸；或其可藥用的鹽。
16.根據權利要求1的化合物，其中Z是Ar或Het；m和n各自為1S是0V不存在。
17.根據權利要求16的化合物，其中W是R″R′N-。
18.根據權利要求17的化合物，化合物為環-(S，S)-(2-巰基)苯甲酰基-Nα-甲基)-4-氨基甲基苯基丙氨酰基甘氨酰基天氨酰基(2-巰基)苯基酰胺或其可藥用的鹽。
19.根據權利要求1-18的任一權利要求的化合物用作藥物。
20.一種藥物組合物，它包括權利要求1-18的任一權利要求的化合物和可藥用的載體。
21.制備權利要求1定義的式(I)化合物或其可藥用鹽的方法，該方法包括使式(II)化合物與式(III)化合物反應A-(Gly)n(Asp)m-L1R6″-L2(II) (III)其中A、m和n如式(I)中定義，并具有被保護的任何反應性官能團；L1和L2為能夠反應形成鍵-(CR′R10)r-U-(CR′2)s-v-的官能團；R6″是W-(CR′2)q-Z-，或與L2連接的基團-(CR′R10)r-U-(CR′2)s-v-的任何部分，并帶有被保護的任何反應性官能團；隨后除去任何保護基，并且任選地形成可藥用的鹽。
22.權利要求1定義的式(I)化合物或其可藥用的鹽在制備能有效抑制血小板聚集的藥物中的應用。
23.權利要求1定義的式(I)化合物或其可藥用的鹽在制備治療中風或暫時局部缺血發作或心肌梗塞形成的藥物中的應用。
24.權利要求1定義的式(I)化合物或其可藥用的鹽和纖維蛋白溶解劑在制備促進動脈或靜脈再灌注和抑制再閉塞的藥物的應用。
25.一種有效抑制需要如此治療的接受者的血小板聚集的方法，它包括施用權利要求1的化合物。
26.根據權利要求25的方法，治療中風或暫時局部缺血發作或心肌梗塞形成。
27.一種促進動脈或靜脈再灌注和抑制再閉塞的方法，它包括給需要如此治療的接受者施用纖維蛋白溶解劑和權利要求1的化合物。
全文摘要
本發明涉及下式化合物這些化合物能有效抑制血小板聚集，本發明還涉及具有所述活性的藥物組合物以及抑制血小板聚集的方法。
文檔編號C07K5/00GK1114321SQ9410659
公開日1996年1月3日 申請日期1994年6月29日 優先權日1994年6月29日
發明者W·E·邦迪奈爾, J·F·長拉漢, W·F·哈夫曼, R·M·基南, B·W·梅特卡夫, J·沙馬倫, T·O·耶林 申請人:史密絲克萊恩比徹姆公司