專利名稱：色譜式電泳分離方法
技術領域：
本發明涉及一種用于分離蛋白質不同組分的色譜式電泳分離方法，屬生物化學技術領域。
已有技術中，有一種反向作用色譜電泳，名稱為“CounterActionChromatographicElectrophoresis”，出處寫O’Farrell，P.H.“SeparationTechniqueBasedontheOppositionTwoCounteractingForcestoProduceaDynamicEquifrium”，ScienteVol227，1586(1985)，該技術將體積排除色譜原理與電泳原理相結合，并提出了相應的分離設備，其核心部分為長圓柱形電泳槽，電泳柱垂直放置，內部裝有多層不同規格的凝膠，上層為小孔凝膠，下層為大孔凝膠(以允許所有的蛋白質進入孔中)。分離時，蛋白質被載流從上層凝膠顆粒間沖入下層凝顆粒內孔中，其下移速率將減慢;調整電場強度，使目標蛋白質在電場作用下向上移動的速率與其被載流沖洗下移的速率相同，此時其凈遷移速率為零，在兩層凝膠的接界處聚焦，而其余的蛋白質則因為向上的電遷移速率與向下移動的速率不同而不被聚焦，因此從電泳柱的上端或下端出口流出。這樣在兩層凝膠的接界處就可獲得目標組分了。該技術的缺點是(1)每次分離僅能獲取一個目標組分，而其余組分均被稀釋沖出;因而當目標組分不只一個或目標組分為具有多個等電點的酶或蛋白質時，應用此方法就難取得高的產品收率。因此，此方法的適用范圍有很大的局限性;(2)由于蛋白質的遷移速率低，電極距離大，而提高電場強度又受到裝置換熱能力的限制，造成該方法的分離速度低，上樣量小，因此，此方法的分離處理量較低。
本發明的目的是提出一種新型電泳分離方法，它是將色譜分離操作與電泳分離原理結合，利用待分離組分在分離介質中的電遷移速率差異或等電點差異進行分離。
本發明的目的是這樣實現的在二個平行的窄長電極之間，沿長度方向平行設置三個或三個以上凝膠膜，凝膠膜將電極之間的空間隔成幾個腔室。最兩端的兩個腔室分別是陽極室和陰極室，中間的腔室按功能不同分為進樣室和沖洗室，進樣式和沖洗室互相間隔。分離進行時，向陽極室和陰極室分別施加電極液循環流。采用脈沖進樣的方式，將樣品液用泵注入到進樣室中。在電極上施加一與腔室中液流方向相垂直的電場。腔室內的液流在與其方向相垂直的電場的作用下，樣品液中的蛋白質將通過膜移向沖洗室。由于不同蛋白質在膜中的電遷移速率不同，遷移速率大的蛋白質先從膜中移出進入到沖洗室而被沖出，遷移速率小的蛋白質則需要更長一些的時間才能從膜中移出，遷入到沖洗室而被沖出這樣不同的蛋白質因為它們在膜中的電遷移速率不同而被分離。當樣品液中的蛋白質全部從沖洗室中被沖出后，一個分離周期即告結束，也就實現了分離不同蛋白質的目的。
圖1的a、b、c是色譜式電泳分離過程原理圖。
圖1中，1和2是電極扳，3是凝膠膜。4是陽極室，5是陰極室，6是樣品室，7是沖洗室，8是樣品中的快組分，9是樣品中的慢組分。其分離過程是圖1a為進樣，圖2a為快組分被分離后沖出，圖1c為慢組分被分離后沖出。
本發明中，電極之間的距離為0.1cm-10cm，電極之間的電壓為10V-400V，根據中間腔室的數量，適當調整電極電壓。本發明所用的電極液和沖洗液為普通緩沖溶液，如曲瑞斯一甘氨酸、曲瑞斯一醋酸等。電極液的循環流速不小于200ml/h。沖洗液和樣品液的流速為1ml/h-300ml/h。本發明所用的凝膠膜厚度為0.1mm-5mm。
本發明的效果是由于分離過程中電場的方向與沖洗載流的方向相互垂直，因而可以通過縮短電極間的距離，以低電壓產生高電場強度，加快了組分的遷移速率，縮短了電遷移路徑，減小了電泳熱效應。
下面介紹本發明的幾個實施例。
實施例1分離牛血紅蛋白一牛血清蛋白混合物。
1、電極電壓50V2、電極液和沖洗液曲瑞斯一甘氨酸(PH＝8.90，0.02M)3、樣品液含牛血紅蛋白2mg/ml含牛血清蛋白4mg/ml用曲瑞斯一甘氨酸配制樣品液。
4、二電極之間設置3張凝膠膜。
5、各液流流量電解液200ml/h樣品液120ml/h沖洗液10ml/h6、膜厚度2.0mm7、結果可獲得電泳純牛血紅蛋白和牛血清蛋白。產量達到10毫克/小時。
實施例2分離細胞色素C粗品1、電極電壓200V2、電極液和沖洗液曲瑞斯一醋酸(Ph＝5.90，0.02M)3、樣品液樣品濃度為5mg/ml，用曲瑞斯一醋酸配制。
4、電極之間設置5張凝膠膜，6個腔室依次是陽極室、進樣室、沖洗室、進樣室、沖洗室和陰極室。
5、各液流流量電解液250ml/h樣品液10ml/h沖洗液180ml/h6、膜厚度3.0mm7、結果可以細胞色素C粗品中獲得純的還原型細胞色素C，處理量為50mg/h(單個腔室)總處理量100ml/h。
實施例3分離尿激酶粗品1、電極電壓150V2、電極液和沖洗液曲瑞斯一甘氨酸(PH＝8.9，0.02M)
3、樣品液以人尿中獲得的尿激酶粗品，比活力≤4000iu/mgpr用曲瑞期一甘氨酸制備4、電極之間設置3張凝膠膜5、各液流溶量電極液200ml/h樣品液10ml/h沖洗液200ml/h6、膜厚度2.0mm7、結果產品比活力≥40000iu/mgpr，比原始樣品提高10倍，處理量為10萬單位/小時。產品的比活力達到衛生部頒發的尿激酶素制劑標準。
權利要求
1.一種色譜式電泳分離方法，其特征在于該方法是在二個平行的窄長極電之間，沿長度方向平行設置3張以上凝膠膜，凝膠膜將電極之間的空間隔成幾個互相平行的腔室，緊靠兩端電極的腔室為陽極室和陰極室，中間的腔室為進樣室和沖洗室，兩者相互間隔；對陽極室和陰極室施加電解液循環流，對進樣室施加樣品液流，對相鄰的沖洗室施加沖洗液流，在電極上施加一與腔室中液流方向相垂直的電場。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的電極之間的距離為0.1Cm-10Cm;電極的電壓為10V-400V。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的電解液循環流的流速大于200ml/h，樣品流和沖洗流的流速為1ml/h～300ml/h;電解液和沖洗液為普通緩沖溶液。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的凝膠膜厚度為0.01mm～5mm。
全文摘要
本發明涉及一種用于分離蛋白質不同組分的色譜式電泳分離方法，屬生物化學技術領域。本方法是在二個平行的窄長電極之間，沿電極長度方向平行設置三個以上凝膠膜，凝膠膜將電極之間的空間隔成電極室、樣品室、沖洗室等若干不同腔室。隨后采用脈沖進樣方式，利用待分離組分在凝膠膜中的電遷移速率差異作為分離基礎，在與電場方向相垂直的方向上施加一沖洗載流，將從膜中先后移出的組分依次沖出，從而實現分離。
文檔編號C07K1/36GK1083072SQ93108629
公開日1994年3月2日 申請日期1993年7月16日 優先權日1993年7月16日
發明者袁乃駒, 劉錚, 朱德權, 丁富新 申請人:清華大學