專利名稱：以氨基葡聚糖為還原劑和保護劑制備膠態金屬分散體的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種具有交聯多糖涂層的穩定膠態金屬顆粒的制備方法，其中所說的交聯多糖上連接有官能團。更具體地說，本發明涉及一種以氨基葡聚糖為金屬離子還原劑及所得膠粒的涂層保護劑來制備所選膠態金屬顆粒的方法，涂覆在顆粒上的氨基葡聚糖利用交聯劑予以穩定。
溶液中的金屬離子吸引在官能化的聚合物分子附近。金屬離子還原成金屬(O)原子使得金屬(O)原子在某一特定聚合物位點處于過飽和狀態。因此，金屬顆粒的核化發生在各個聚合物分子的自身區域內。不同聚合物-金屬區域間的空間位阻使得所述區域彼此獨立，而顆粒上聚合物的官能團與金屬原子之間的引力又使顆粒處于一個單一的區域范疇之內。由此產生的綜合效應是，金屬核被各個聚合物分子所固定，同時又防止了金屬(O)顆粒聚集生長，即防止各聚合物分子中的核發生遷移和聚集形成較大的顆粒。
雖然聚合物分子可以防止金屬(O)顆粒聚集生長，但由于金屬離子向金屬(O)顆粒核附近擴散，顆粒生長仍可能發生。當溶液中的可遷移金屬離子耗盡時，顆粒的生長終止。由此生成的金屬(O)顆粒粒度均勻，形狀一致。有關均勻沉淀的詳細資料可由下述文獻查尋A.E.Nielsen的“沉淀動力學”(McMillan，紐約，1964);E.Matijevic，Accts.Chem.Res.，1422(1981);T.Sugimoto，Adv.Coll.Interface Sci.，2565-108(1987)。
通過審慎選擇聚合物、金屬離子、還原劑、各組份的選擇濃度及進行反應時的溫度已經生產出了不同金屬的膠態分散體。在有保護聚合物如PVA(聚乙酸乙烯酯)存在時，簡單的醇如甲醇或乙醇已被用作溶劑和還原劑。多元醇、乙二醇、二甘醇已同樣用作溶劑和還原劑。官能化的聚合物如聚丙烯酸
(hydrazinium polyacrylate)在制備金、銀、銅、鉑和硒單分散顆粒時已作為還原劑和保護聚合物用。在制備金水溶膠時，含有連接在糖上、一般是葡萄糖上一至三個三羥基苯基羧酸基團的單寧可以作為還原劑和保護物質。例如，參見L.Hernandez等人，J.Colloid Sci.，3363-375(1948)(以氫為還原劑的銠-聚乙酸乙烯酯[Rh-PVA]聚合物);H.Thiele等人，J.Colloid Sci.，20679-695(1965)(聚丙烯酸的酰肼(PAH)-Au，Ag，Cu，Pt和polyethyleneimiacid-Au);H.Harai等人，J.Macromol.Sci.Chem.，A121117-1141(1978)(以甲醇為還原劑的Rh-PVA);H.Harai等人，J.Macromol.Sci.Chem.，A13633-649(1979)(以甲醇為還原劑的Rh-、Pd-、Os-、Ir-、和Pt-PVA);H.Harai等人，ibid.，A13727-750(1979)(以乙醇為還原劑的Rh-、Pd-、Ag-、Os-和Ir-PVP);F.Fievet等人，MRS Bulletin，1989，12，pp.29-34(Au-、Ag-、Pd-、Pt-、Cu-、Co-、Ni-、Cd-和Pb-多元醇);O.Siiman等人，J.Chem.Soc.Faraday Trans.，82851-867(1986)(Au-PVP-乙醇);H.B.Wieser的“無機膠體化學，Vol.I，膠體元素”(Wiley，紐約，1933)(單寧-Au);T.W.Smith等人，Macromol.，131203-1207(1980)(Se-PA肼)和T.W.Smith等人，J.Phys.Chem.，841621-1629(1980)(Fe-聚合物)。
膠態金已常用作抗體、酶、植物凝血素和其它蛋白質的吸附劑，這主要是因為蛋白質能非特異性地吸附在膠態金上。實際上，任何蛋白質材料都可吸附在膠態金上。保持活性狀態的蛋白質-金物種已作為細胞表面標記物用于光學和電子顯微鏡。[參見“膠態金原理、方法及應用”，Vol.Ⅰ.Ⅱ和Ⅲ，M.A.Hayat，ed.(Academic Press，紐約，1989)，以及A.J.Verkleij和J.L.M.Leunissen的“細胞生物學中的免疫-金標記”(CRC Press，Boca Raton，Fla.1989)]。在M.J.De Brabander等人的US4，752，567中對用光顯微鏡通過偏振光外照明來檢測粒徑為10-100nm的膠態金屬顆粒作了說明，特別令人感興趣的是那些直接或間接吸附了抗體的膠態金顆粒。間接吸附是指抗體連接在第一吸附層上，例如，第二抗體、抗生物素蛋白或蛋白質A或G。配位體一葡聚糖復合物已吸附在膠態金上了。配位體包括植物凝血素、刀豆球蛋白A、蓖麻凝集素和小麥胚凝集素[D.Hicks和R.S.Molday，Invest.Opthalmol.Vis.Sci.，261002-1013(1985)]以及哇巴因[R.J.Mrsny等人，Eur.J.Cell Biol.，45200-208(1987)]。
但是，蛋白質在水溶液中膠態金顆粒上的吸附是一可逆平衡反應。吸附有蛋白質的顆粒與未吸附即游離蛋白一般是通過離心法分離開的。但在分離除去游離蛋白后，重新制成純化的蛋白-金屬膠體懸濁液時，由于其自身發生再平衡，由此進一步損失了所吸附的材料。因此，長期保存純的吸附蛋白-金共軛體尚不現實。本領域的一些工作者把純化的蛋白-金膠體懸浮在含有阻滯劑如牛血清蛋白(BSA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)和其它聚合材料的緩沖溶液中以期提高穩定性。聚合材料可以覆蓋在膠態金顆粒表面的任何裸露面上，由此防止了金顆粒的聚集然而，由于聚合材料大大地超過了吸附在膠態金上的蛋白質的量，因此會與蛋白質競爭膠態金位點，這樣，不可避免地會有一些蛋白質從金上解吸下來，并作為游離蛋白存在于溶液中。
本發明的目的即在于制備出具有穩定化多糖材料涂層的膠態金屬顆粒，優選是膠態金或銀顆粒。本發明的另一個目的是利用所述的帶涂層膠體制備穩定的蛋白-膠體共軛物。本發明的蛋白-膠體共軛物克服了因蛋白直接吸附在膠體金屬表面而造成的不穩定性和定向問題。
本發明提供了制備具有固體芯核的單分散膠態金屬(O)顆粒的方法，所說的膠態金屬顆粒上涂覆有胺衍生的多糖層，該涂層帶有多個不穩定的(pendent)官能團并在化學交聯劑的作用下發生交聯或被固定。所說的不穩定的官能團可以是，或者是帶有末端醛或羧酸根，胺基，巰基或馬來酰亞胺基以及多克隆或單克隆抗體。
本發明提供了一種一步法制備帶涂層膠態金屬(O)顆粒的方法，即，在足以能使金屬鹽還原為金屬(O)顆粒，同時多糖又能涂覆在顆粒上的溫度下，加熱含金屬鹽和至少有一個，最好有多個還原糖組分的胺衍生多糖的水溶液一定時間。隨后，用雙官能交聯劑，優選戊二醛、二胺(優選1，3-二氨基丙烷)，和還原劑，優選硼氫化鈉，處理已涂層的顆粒，然后，純化得到穩定化的涂有胺衍生多糖層的金屬(O)顆粒。在此多糖既為金屬離子的還原劑，又是所生成的零價膠態金屬顆粒的涂層劑。多糖涂層用適當的交聯劑通過交聯而穩定化。此后，可將所得的已涂層且穩定的膠態金屬顆粒與蛋白質如酶、植物凝血素、多克隆或單克隆抗體等進行共軛。這些蛋白質可連接亦可不連接可檢測標記物如染料、含放射性元素的化合物、電子密集元素(electron dense elements)、酶等。所得的含蛋白膠態金屬(O)共軛物可用于各種診斷和分析方法。
附圖簡要說明
圖1A-1D示出了按本發明采用不同氨基葡聚糖/Au(Ⅲ)之比制備的金水溶膠在其可見光區的吸收消光光譜。
圖2示出了混合氨基葡聚糖T-40和硝酸銀水溶液而制成的銀水溶膠的消光光譜。
圖3中圖3B為FITC-葡聚糖-Au(Ⅲ)溶液的吸附光譜，使混合的FITC-葡聚糖-Au(Ⅲ)溶液接近沸點溫度形成金水溶膠，其吸附光譜示于圖3A(上光譜)中。
本發明描述了具有多糖涂層的膠態金屬(O)顆粒的制備，所說的顆粒特別有益于與抗體和其它蛋白質共軛。氨基葡聚糖是優選的多糖。本發明所述的葡聚糖是指任何D-葡萄糖的支鏈多糖，而不管其重復單元的支鏈點，即不管支鏈點在否1→2，1→3，1→4位。氨基葡聚糖是指已經過改性的帶有一個或多個胺(NH2)基的葡聚糖。為了避免糖殘基內部和殘基之間發生交聯(因為交聯會使葡聚糖的胺官能化失效)，1，3-二氨基丙烷是優選的二胺。
許多不同的，且一般是雙官能的交聯劑如雙[2-(琥珀酰亞胺基氧代羰氧基)乙基]砜、酒石酸二琥珀酰亞胺酯、乙二醇雙(琥珀酰亞胺基琥珀酸酯)、辛二酸二琥珀酰亞胺酯及戊二醛均可用于實施本發明。普通商購的戊二醛為優選的交聯劑，其一般主要含在280nm處吸收的單體。但此戊二醛產品同時還含有某些在235nm處有吸收的聚合物種。聚合物種，三聚物或線形低聚物可能有足夠的長度使存在于所吸附的氨基葡聚糖上的氨基之間形成分子內和分子間橋接。通過審慎選擇反應條件，氨基葡聚糖可以適當地固定在膠態芯核顆粒上，這樣，在后續處理過程中所說的糖不致被除去。由此，可以避免因游離氨基葡聚糖過度交聯而形成較大的絮凝物，并可防止粒間交聯。
為了適用于生物和醫學領域，固定或交聯在膠態金顆粒上的氨基葡聚糖涂層應帶有能與生物活性物質共軛的官能團。生物物質如單克隆抗體共價偶合到涂層上比簡單如吸附要好。利用“短鏈”二胺或聚胺及異雙官能試劑可以使抗體即多克隆或單克隆抗體偶合到交聯氨基葡聚糖表面涂層上。(后文中二胺一詞包括三個或三個以上胺基的多胺)。二胺能與存在于交聯氨基葡聚糖表面的殘留醛或羧酸根發生反應，后二者是固有的或在本發明過程中存在的。二胺不僅能夠阻滯醛和羧酸根，而且可以補充在交聯過程中反應的胺基。二胺與醛基反應生成席夫堿類。然后席夫堿通過還原反應，最好用硼氫化鈉還原成穩定的胺基。
為了避免同一顆粒上相鄰醛或羧酸根交聯，或者避免不同顆粒上這些基團相互連接，優選短鏈二胺。一個二胺基與涂層表面反應，其它未反應的可以直接或間接地偶合蛋白材料。二胺通常選自下組物質H2NCH2-(CH2)x-CHy(CH3)z和C6H4+a(NH2)2，其中x＝0-3，y＝1或2，當y＝1時，z＝1，或當y＝2時，z＝0;a＝0或6。其實例包括乙二胺、苯二胺、丙鄰二胺、1，4-環已二胺、環已烯二胺、四亞甲基二胺等。三胺包括二亞乙基三胺和1，5-二氨基-3-(2-氨乙基)戊烷等。優選乙二胺。
生物物質偶合到固定的帶有氨基葡聚糖涂層的膠態金顆粒上包括用水溶性異雙官能試劑激活自由氨基，所說的試劑如鹽酸2-亞胺基硫醇烷(iminothiolane)(IT)、磺基琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環已烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)、間-馬來酰亞胺基琥珀酰亞胺酯、N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯、琥珀酰亞胺基-4-(對-馬來酰亞胺基苯基)丁酸酯、N-琥珀酰亞胺基-(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯，上述所列試劑作為戊二醛等的取代物。其中鹽酸2-亞胺基硫醇烷及馬來酰亞胺基和琥珀酰亞胺基試劑是優選的。參見E.Ishikawa的Immunoassay Supp.，11-16(1980)和J.Immunoassay，4209-227(1983);M.Imagawa等人的J.Appl.Biochem.，441-57(1982);M.D.Partis的J.Protein Chem.，2263-227的(1983)。當用磺基-SMCC，在pH7.0-7.5時，磺基-SMCC的活性磺基琥珀酰亞胺基酯端與胺發生反應形成肽鍵。所形成的磺基-SMCC/二胺橋鍵單元其長度大約為16A°。
pH為6.5-7.5時，磺基-SMCC的馬來酰亞胺基將與自由巰基反應形成穩定的共價硫醚鍵。因此，與磺基-SMCC反應的涂層顆粒不含任何會與磺基-SMCC中馬來酰亞胺基端反應的自由巰基是必不可少的條件。用氨基葡聚糖作涂層劑解決了此問題，因為該糖與其它涂層材料如明膠不同，其不含任何自由巰基。
蛋白質，特別是單克隆抗體或多克隆抗體可以憑借其自身固有的或衍生而來的巰基連接到用磺基-SMCC官能化的氨基葡聚糖金膠粒涂層上的所說的磺基-SMCC中的馬來酰亞胺基端上。帶半胱氨酸殘基的蛋白質本身即含巰基。為了引入外源巰基，可用Traut試劑，即鹽酸2-亞胺基硫醇烷(IT)在pH7-10條件下激活蛋白質的胺基。當蛋白質為抗體時，用IT激活抗體上的賴氨酰和末端胺基。參見M.Ereinska的Biochem.Biophys.Res.Commun.，76495-500(1977);J.M.Lambert等人的Biochemistry，175406-5416(1978)和M.E.Birnbaumer等人的Biochem.J.，181201-213(1979)。
當使用本發明的氨基葡聚糖涂層金膠粒時，可以改變反應條件和試劑濃度以確定最佳偶合反應，由此，蛋白質，特別是抗體可以保持其最大的官能活性。馬來酰亞胺在溶液中與巰基的反應速度相當快，因此應該使固定在所述顆粒上的這些基團有一定較長的反應時間，以確保反應完全。在抗體共軛反應中，特別是當采用IgM抗體時，為避免聚集作用，應選擇最佳的顆粒和抗體濃度。IgM抗體的最佳方法可適用于等電點在約5.0-9.0范圍內的所有單克隆抗體。一般說來，完成共價偶合所需要的抗體量比簡單吸附所需要的重量少大約30倍，這對昂貴或難以獲得的抗體來說是很重要的結論。
本發明不必再分別進行如下步驟先制備膠態金屬顆粒，然后制成用于聚合物(涂層)吸附的膠體并交聯。這些步驟通過采用下述本發明方法可以合而為一，即在足以使金屬鹽還原為膠態金屬(O)顆粒的溫度下，使金屬鹽與含有可氧化糖的胺衍生多糖如氨基葡聚糖反應一段時間，在該反應的同時多糖涂覆在所說的顆粒上。優選的溫度為約90-100℃。根據本發明，可以使用還原電勢等于或大于+0.7伏(H3IO6/IO5)的金屬離子。[其實例可見“物理化學手冊”第64版(CRC Prese，Boca RatonFL(1983-84)，第D-156頁]。金和銀鹽是優選的，也可以用Rh(Ⅲ)、Pd(Ⅱ)、Pt(Ⅱ)和Ir(Ⅲ)的鹽類。以金和銀鹽為非限制性實例，本發明所用的氨基葡聚糖在制備膠態金屬顆粒及后續反應中具有如下多重作用1、作為Au(Ⅲ)→Au(O)或Ag(I)→Ag(O)的還原劑，其中，吡喃葡萄糖環首先氧化為醛
然后，再氧化為有機酸
2、作為膠體保護物種，因為氨基與金屬離子或原子間有很強的相互作用力。另外，在溶液中氨基與金屬陽離子結合后帶正電荷，并使陽離子分散體穩定。雖然葡聚物能夠還原Au(Ⅲ)或Ag(Ⅰ)離子，但其不能使所得膠體穩定。
3、在膠體形成過程中，使由糖基氧化而產生的醛基與已經存在于氨基葡聚糖上的氨基發生交聯，生成席夫堿，-HC＝N-，由此進一步加強了顆粒-聚合物復合體。
4、交聯劑如戊二醛可用于進一步橋接金屬(O)顆粒涂層上的氨基，并包封住膠態顆粒，這樣僅憑純物理方法是不能使之釋放的。按照上述平衡反應，后來共價連接到交聯涂層上的蛋白質不會與膠態金屬顆粒分離。
5、未反應的聚合物上的氨基和用二胺阻滯未反應的醛基所產生的氨基成為抗體或其它蛋白質連接到膠態顆粒涂層的連接位點。在蛋白質和涂層氨基之間可用橋連基團。
本發明的方法可用于制備粒徑為5-100nm范圍的膠態金屬(O)顆粒。隨著反應中所用原料試劑(氨基葡聚糖、金屬離子)的濃度，形成膠體的溫度，攪拌金屬離子和氨基葡聚糖混合物的速率以及反應中所用氨基葡聚糖的平均分子量，所形成的顆粒的具體尺寸會有所變化。
在實施本發明時，應該考慮到用共價偶合法金屬顆粒可能會出現的特殊問題。具體地說，表面金屬原子或離子由于蛋白質共價結合到有機涂層時所常用的偶合劑、激活劑和阻滯劑的作用可能會很容易參與化合反應和瀝濾。蛋白質結合至有機涂層時所用的含有此影響的一些典型試劑是亞胺基硫醇烷(iminothiolane)、戊二醛、乙二胺、半胱氨酸、碘乙酰胺及磺基琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環已烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)。在實施本發明時，必須認真選擇試劑及控制它們的濃度。盡管第一層聚合涂層通常可能容易涂覆到金屬顆粒上，但在后來使用涂層顆粒過程中仍必須加以防范，因為小分子很容易穿過聚合物層中的微孔，金屬顆粒表面仍可接觸這些分子。
采用本發明方法實現的聚合涂層不必覆蓋膠態金屬顆粒的整個表面。因此，仍有顆粒聚集的可能性。然而，在用交聯劑固定化之前，通過審慎選擇聚合物濃度和分子量，可將膠體顆粒上的裸露斑點減少到最低程度。通過幾次超離心分離和淘汰非流動殘渣使涂層金膠體再分散后，可以消除聚集體。聚合物的大小應小于膠體金屬顆粒的直徑。對于直徑為20nm的金粒，為了防止聚合物發生橋連絮凝，聚合物平均分子量應為約40，000道爾頓。聚合物分子必須圍繞金粒，而不是金粒包裹聚合物分子。對于濃度為1012粒/mL的20nm直徑的金粒，聚合物濃度范圍應為約0.1-2.5mg/mL。
活化金粒與活性蛋白質如單克隆抗體反應的最佳條件可以依與其它膠粒的同類反應來確定。例如，為了避免顆粒聚集和得到在1μm平均直徑的磁珠上載有單克隆抗體的良好表面，顆粒濃度為1.83-3.73×108粒/cm8，總的抗體濃度為0.313-0.625mg/mL。該顆粒濃度的平均粒子間距為64-81μm或64-81個粒徑。20nm直徑的膠態金粒一般在1.30×1012粒/cm3濃度下制備，得到的平均粒子間距為0.92μm或46個粒徑。因此，為了在類似于磁粒的動力學條件下操作，必須將金溶液稀釋3-6倍。
實施例1 氨基葡聚糖的制備方法1 小規模制備氨基葡聚糖用下述步驟制備氨基葡聚糖將葡聚糖中的吡喃葡萄糖環部分分解并氧化成醛官能基團，使醛基與1，3-二氨基丙烷偶聯形成席夫堿鍵，將席夫堿鍵還原成穩定的氨基。在一個典型的步驟中，使20g葡聚糖溶解在150mL pH值為6.5的50mM醋酸鉀緩沖液中。在大約10分鐘期間和劇烈磁力混合條件下，向葡聚糖中滴加一種由2.14g高碘酸鈉和25mL蒸餾水形成的溶液。在15-27℃的室溫下攪拌得到的溶液約1.5小時，然后用蒸餾水滲析。將20mL 1，3-二氨基丙烷與20mL蒸餾水相混合，在冰浴中冷卻，劇烈攪拌，并通過加入冰醋酸在約15分鐘內將pH值從11.5調整到約8.7。通常用15-20mL冰醋酸。在15-20分鐘內將滲析的葡聚糖滴入冷的二胺溶液中。加入完成后，在室溫下攪拌生成的溶液約2.25小時。在室溫下于約15分鐘內向葡聚糖反應混合物加入一種由0.8g硼氫化鈉在10mL0.1mM氫氧化鈉中形成的還原溶液。在硼氫化物加入期間攪拌反應混合物，以消除大部分的泡沫。用蒸餾水徹底滲析該粗氨基葡聚糖溶液，直到流出物的電導率為3-4μmho/cm為止。此后用一個0.2μm的過濾器過濾滲析的溶液，在一臺TDS-00030-A型號的Dura-Dry微信息處理機控制的冷凍干燥機中(FTS Systems，Inc.)冷凍干燥24小時，得到4.25g淺黃色片狀晶體，產率為21%。
方法2 大規模制備氨基葡聚糖將方法1的程序改進為大規模制備氨基葡聚糖，并增加引入葡聚糖的氨基數目。用空心纖維膜過濾代替滲析，用較小的二胺-高碘酸鹽摩爾比來避免進一步切割糖聚合物成為低分子量的片段。一個空心纖維筒(聚砜，3ft3膜表面積，1mm直徑纖維和截滯5000MW)與一臺輸入動力泵(兩個泵頭，帶有18號Norprene食品級管，最大流量為約4.56升/分)垂直安裝在一起，輸送壓為15-20psi，該壓力與滯留管線(retenate line)中的5-1Opsi壓力相對應。以50-100mL/min的速度收集濾液。用20-30升蒸餾水沖洗6-8小時。電導率降低為約3-4μmho-cm-1，pH值為6.0-6.5。在脫鹽期間維持2升的進料體積，而后在第一次洗滌氧化葡聚糖時濃縮到800mL，在第二次洗滌氨基葡聚糖時濃縮到400mL。
在一種標準的放大制法中，將80g葡聚糖傳到裝有600mL蒸餾水的1夸[升]玻璃混合器的杯中。以中等速度將該固體在2-5分鐘內加入其中以溶解所有葡聚糖。將8.56g高碘酸鈉溶入100mL蒸餾水中，在10分鐘內利用劇烈的磁力攪拌將形成的溶液滴入到葡聚糖溶液中。加入完畢后，在室溫下再攪拌形成的溶液3小時。隨后用蒸餾水稀釋所得粘稠反應混合物至2升，并用一個空心纖維筒脫鹽。初始電導率為1.5mmho-cm-1或更高，初始pH值為4.0。用18-22升蒸餾水，使最終電導率約為3-4μmho-cm-1，最終pH為6.0-6.5。洗后的氧化葡聚糖溶液的最終體積為800mL。
在10分鐘內和室溫下，向洗過的氧化葡聚糖溶液中慢慢加入80mL無色的1，3-二氨基丙烷液體。然后在室溫下再攪拌生成的混合物3小時。攪拌結束后，在磁力攪拌條件下，在5分鐘內將溶于40mL1mM氫氧化鈉水溶液的3.2g硼氫化鈉加到室溫下的氨基葡聚糖反應混合物中。硼氫化鈉加完后，再攪拌生成的混合物1小時，然后用一個空心纖維筒脫鹽。初始電導率為5.0mmho-cm-1或更高，初始pH值為12.0。用了約20-25升蒸餾水來將電導率降低到約3-4μmho-cm-1和pH降到6.0-6.5。氨基葡聚糖的最終體積為400mL。使該溶液通過一個0.2μm的無菌醋酸纖維素過濾器單元，然后冷凍干燥48小時，得到48克淺黃色片狀晶體，產率為52%。
對用上述方法由葡聚糖T-2M制備的兩種氨基葡聚糖樣品進行了元素分析(C，H，N)，結果如下樣品120g葡聚糖規模，滲析脫鹽。
試驗值C，43.04;H，6.60;
N，1.09;
O(有差別)，49.27。
樣品280g葡聚糖規模，膜過濾脫鹽。
試驗值C，42.53;H，5.52;
N，1.01;
O(有差別)，49.94。
對C46H79NO37·3H2O的計算值C，42.76;H，6.63;N，1.08;O，49.53。
對兩種方法制備的氨基葡聚糖的分析結果是很相似的，這說明不管是滲析脫鹽還是膜過濾脫鹽都得到了同樣的產物。對樣品1，得到的經驗公式C46H84NO40非常類似于式C46H79NO37·3H2O，后者基于29個葡萄糖單元(C6H10O5)，1個完全由二胺取代的糖環單元(C12H28N4O3)和12個單位的水。所以，葡聚糖中的二胺取代程度在樣品1中為1/30，而基于100%高碘酸鹽分解和二胺取代的理論值為1/12。由樣品2得到的經驗式C49H90NO43非常近似于式C49H84NO40·3H2O，后者基于31個葡萄糖單元、1個二胺完全取代的糖環單元和12個單元的水。樣品2的葡聚糖中二胺的取代度為1/32。
實施例2 用氨基葡聚糖制備金水溶膠。
先制備一種貯備金溶液將112.4mg HAuC1(49%Au)溶入1L蒸餾水中，得到一種2.8×10-44MAu(Ⅲ)溶液。使貯備金(Ⅲ)溶液(380mL)沸騰，快速攪拌，并用吸管加入45.0mL濃氨基葡聚糖(10.3mg/mL)。約1分鐘后，混合物的初始淺紫紅色變成酒紅色。煮沸混合物并攪拌15-20分鐘，以完成反應，并使金溶膠總體積變為200mL，使氨基葡聚糖濃度為2.3mg/mL(0.23%w/v)。使用帶有1X(1X＝3.3%糖殘基取代基)、2X(6.6%)和3X(9.9%)摩爾數量氨基的平均分子量為10，000、40，000和2，000，000(T-10，T-40和T-2M)的氨基葡聚糖，得到類似的結果。使用在實施例1所述葡聚糖的1X氧化中所用量2和3倍的高碘酸鈉，得到2X和3X氨基葡聚糖。用來形成席夫堿的1，3-二氨基丙烷量保持不變。
下列氧化還原反應式給出了反應的化學計量。第一個反應式涉及分解和氧化吡喃葡萄糖環成為醛和還原Au(Ⅲ)成為Au(O)2AuCl4-+3-(OH)CH-CH(OH)-→2Au(O)+8Cl-+6-CH(O)+6H+第二個反應式是醛氧化成為羧酸和Au(Ⅲ)還原成Au(O)
Au(Ⅲ)轉化為Au(O)的下一步是在可見光區域監測金膠體的吸收光譜。約20nm直徑的小金粒一般在水溶液中在520nm處有最大吸收光譜。該峰移向較長波長轉移表示較大的顆粒或初始顆粒集結成為雙重體、三重體等等。通過分析一系列制品的可光光譜，確定了產生單一型、聚合物穩定化顆粒所需的最佳氨基葡聚糖-金摩爾化。利用1X氨基葡聚糖、衍生T-10，在0.005、0.010、0.015和0.020%w/v的濃度下，得出了圖1A-1D。未反應的糖單元分別為1.49×10-5、2.98×10-5、4.47×10-5和5.95×10-5摩爾。用了50mL貯備Au(Ⅲ)溶膠或1.40×10-5金。未反應的糖與Au的摩爾比分別約為1∶1(圖1A)、2∶1(圖1B)、3∶1(圖1C)和4∶1(圖1D)。圖1所示結果表明，要獲得一種穩定的氨基葡聚糖保護的金水溶膠，需要3∶1或更高的摩爾比。使用較低的比率，結果形成了聚集的顆粒。
實施例3 葡聚糖與氯金酸反應。
將2.5g葡聚糖T-40溶于50mL蒸餾水中。將10mL(3mmol糖殘基)這種溶液加到95mL(0.03mmol Au)沸騰的貯備Au(Ⅲ)溶液(2.8×10-4M Au)中。煮沸該混合物，并進行劇烈的磁力攪拌2-3分鐘，在此期間出現一種紅紫色懸浮液。繼續煮沸5分鐘后，在容器壁上形成淺紅色沉淀物。該沉淀物是不穩定的固體金，它被葡聚糖分解成細小的膠體狀態。
實施例4 用氨基葡聚糖制備銀水溶膠。
將135μL 0.589M的硝酸銀(0.080mmol Ag)溶液加到95mL蒸餾水中。使該溶液沸騰并加入16.1mL(0.6mmol糖殘基)氨基葡聚糖T-40(6.2mg/ml)。繼續使之沸騰并劇烈地磁力攪拌該混合物20分鐘，在此期間，溶液慢慢變黃，爾后變紅。將銀粒懸浮液冷卻到室溫，測出其特性吸收光譜圖2，在395nm有一波峰，接近500nm有肩峰，A395/A500＝4.56。在烘箱中處于90℃的一個派熱克斯(pyrex)反應瓶中進行相同的反應3小時后還未見顏色變化，但得到一種黃色銀溶膠，在24小時后該溶膠變紅。在90℃進行的一種貯備Au(Ⅲ)溶液與氨基葡聚糖的平行烘箱反應用了3.5小時，得到一種酒紅色金溶膠。
實施例5 用熒光素異硫氰酸酯(FITC)-葡聚糖制備金水溶膠。
將25mg FITC-葡聚糖(δ型;17，000MW;0.01mol FITC/mol葡萄糖殘基)加到5mL沸騰的貯備Au(Ⅲ)溶液(2.8×10-4M Au)中。盡管固體葡聚糖衍生物溶在了水中，但未檢測到反應。5分鐘后，向沸騰的混合液中再加入10mL貯備Au(Ⅲ)溶液，再過15分鐘后，出現表征膠態金的酒紅色。圖3A和3B示出了吸收光譜。Au(Ⅲ)在420nm有一吸收峰，接近480nm處有一肩峰，細分散金粒在535nm處有一附加帶。用25mg FITC-葡聚糖(2，000，000 MW;0.04mol FITC/mol葡萄糖殘基)在20ml貯備Au(Ⅲ)溶液中得到了類似的結果。在一臺的Beckman L8-70超離心機的SW60轉子中，在15℃和20，000rpm轉速下對FITC-葡聚糖金溶膠離心分離30分鐘，除去上層清液，將流動性膠體金殘余物再分散在pH值為7.2的1X磷酸鹽緩沖的鹽水中。紅色的膠態金粒在一臺熒光顯微鏡下沒有顯示任何FITC的綠色輻射。
實施例6 交聯膠態金上的氨基葡聚糖將0.8mL 25%的戊二醛加到200mL在0.23%w/v氨基葡聚糖存在下制備的pH約為6的膠態金懸浮液(實施例2)中。在室溫下攪拌該反應混合物1小時。向其中加入乙二胺(0.320mL)，得到的混合液再攪拌2小時。通常，二胺選自H2NCH2-(CH2)x-CHy(CH3)z-NHz和C6H4+a(NH2)2，其中x＝0-3，y＝1或2，和y＝1時z＝1或者y＝2時z＝0;a＝0或6。優選乙二胺。通過加入0.303g溶在2mL 1mM氫氧化鉀水溶液中的硼氫化鈉并攪拌該反應混合液30分鐘，還原添加二胺后形成的席夫堿鍵。還原之后，用蒸餾水徹底滲析該混合物，使電導率大約為66μmho/cm。然后，在15℃和25，000rpm轉速下，于一臺Bckman L8-70超離心機Ti50.2轉子的25mL管中對滲析的溶液進行40分鐘離心分離。使大部分膠態金-氨基葡聚糖流動層很容易地再分散于100mL 1X磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)溶液中。用一個1mm光程石英比色皿，觀察到λmax＝520nm處的吸收度讀數為0.24-0.29單位。該讀數表示存在單粒金。
用多角度多普勒電脈光在一臺Coulter DELSA 440上散射，測定用T-40衍生的、交聯的氨基葡聚糖涂覆的金粒的流動性。在水溶液中，pH范圍為3.5至10.3時，記錄的流動性為+0.486(11)×10-4cm2V-1S-1。利用Huckel方程，用該數據算得電勢為+9mV，并將涂層金粒確立為陽離子探針。將T11單克隆抗體(Coulter Immunology，Hialeah，Florida)共軛到氨基葡聚糖涂覆顆粒(見下文)上，不改變顆粒的陽離子性質。
實施例7 用FITC-葡聚糖交聯膠態金上的氨基葡聚糖將0.519mL氨基葡聚糖、T-2M(10.3mg/ml，0.033mmol葡萄糖殘基)溶液加到10mL沸騰的貯備Au(Ⅲ)溶液中(2.8×10-4M)。煮沸該混合物并劇烈地磁力攪拌15分鐘，以得到一種酒紅色金粒懸浮液。向酒紅色混合物中加入溶于2mL蒸餾水的26.5mg FITC-葡聚糖T-2M(δ，0.004取代度)，在室溫下再攪拌40分鐘得到的混合物。由于FITC共軛到葡聚糖上需要一元胺基團或葡聚糖，δ材料因而大概含有與FITC共軛的氨基葡聚糖。因此，通過向混合物加入40μL25%的戊二醛并進一步攪拌1小時來進行交聯反應。為了驟冷交聯反應，加入16μL乙二胺，并將形成的混合物攪拌1.5小時。最后，加入含15mg硼氫化鈉的0.1mL 1mM KOH并混合0.5小時，以便通過還原來穩定席夫堿。然后，在一個SW60轉子中于15℃和20，000rpm轉速下離心分離30分鐘由氫硼化物還原的混合物，除去上清液，使可流動金渣再分散在1%BSA、0.17%疊氮化鈉和1X磷酸鹽緩沖的鹽水中。在熒光顯微鏡下觀察到的這些金粒產生了鮮綠色的TIFC輻射。
實施例8 用磺基-SMCC活化交聯的氨基葡聚糖-金。
雖然試用過不同的磺基-SMCC/金比，但用每毫升交聯氨基葡聚糖金懸浮液2.25μL磺基-SMCC(10mg/ml，在1XPBS中)得到了最好的結果。在一典型反應中，將56.25μL磺基-SMCC加到25mL交聯的氨基葡聚糖金懸浮液中。攪拌混合物1小時，然后在15℃和20，000rpm下離心分離2次30分鐘。借助于超聲混合，將大部分可流動層首先在25mL此后在7.8mL 1X PBS中再分散。在使用前，用一臺低蛋白質結合的0.2μm過濾機過濾得到的活化氨基葡聚糖金溶膠。
實施例9 用鹽酸2-亞胺基硫醇烷(IT)活化抗體制備在含0.1%NaN3的1X PBS中含有43.77mg/mL T11單克隆抗體的貯備溶液。對于在15mg/mL濃度下利用30mg T11抗體的反應，總的反應體積應為2.00mL。若利用15∶1的IT∶T11活化比，需要2.81μmol(0.388mg)或194μL在1X PBS中的2mg/mL的IT。因此，將1.121mL 1XPBS溶液加到0.685mL T11貯備溶液中。混合了所有反應物溶液的總體積為0.194mL IT+1.121mL PBS+0.685mL T11＝2.0mL。在反應試管中滾動混合該溶液1小時。然后將反應試管中的物料加到一個100mL G-50交聯葡聚糖凝膠柱的頂部，平衡，并用500mL 1X PBS洗滌。用1X PBS洗脫衍生的單克隆抗體，用一紫外監測器收集多個50mL的餾份。匯合在280nm處吸收譜帶中間的各餾份，用A280值確定T/IT產物濃度。通常，該濃度約為2.5mg/mL。
實施例10 T11/IT和磺基-SMCC衍生XL-氨基葡聚糖金粒的共軛。
將2.200mL在1X PBS中的2.854mg/mL T11/IT試樣加到7.8mL如上所述制備的磺基-SMCC活化的涂有氨基葡聚糖的金粒中。該T11/IT溶液以0.5mL增量方式加入，每次添加之間進行聲波處理和迅速的物理混合。然后使形成的懸浮液在一15mL試管中滾動混合大約2小時。通過加入L-半胱氨酸共軛抗體后，阻滯磺基-SMCC活化顆粒上未反應的馬來酰亞胺基團。通常，將0.120mL在1X PBS中的5mg/mL L-半胱氨酸加到10mL共軛混合液中[(0.0120mL L-半胱氨酸)×(共軛混合液體積)]，滾動混合得到的懸浮液約15分鐘。然后，在15℃和10，000rpm條件下，于一個Beckman 50.2Ti轉子中離心分離該混合物30分鐘。使大部分流動層再懸浮在含0.1%NaN3和1%BSA的1X PBS中，并用一臺0.2μm過濾機過濾。得到的抗體共軛、交聯氨基葡聚糖涂覆的金粒發現適合在光學和電子顯微鏡檢測中用作標記物。用下述方法驗證了這些金粒上T11抗體的高活性(1)用GAM-FITC(對鼠免疫球蛋白-FITC有抗性的山羊抗體，Coulter免疫學)作為第二抗體加到一種T11-氨基葡聚糖-金粒和全血液的混合物中，并在一臺熒光顯微鏡下觀察到T11+細胞被金標記完全涂覆;(2)用一臺非照明結構(epiillumination configuration)倒相顯微鏡(Zeiss)，直接觀察到細胞表面上有小紅斑點，即為T11+細胞上的金粒。
另外，還成功地制備了若干抗體共軛的、涂覆了交聯氨基葡聚糖的金粒，其中使用了1、帶有2X氨基的氨基葡聚糖T-40;
2、帶有1X氨基的氨基葡聚糖T-40;
3、帶有1X氨基的氨基葡聚糖T-2M;和4、帶有1X氨基的氨基葡聚糖T-10。
制備這些涂有交聯氨基葡聚糖的金粒的每一種時都使用了三種不同的T11單克隆抗體共軛條件。它們是1、用磺基-SMCC活化1X，用0.833mg/ml T11/IT共軛，不用L-半胱氨酸阻滯;
2、用磺基-SMCC 1X，用0.653mg/ml T11/IT共軛，用0.0120x體積數的5mg/ml L-半胱氨酸阻滯;和3、用磺基-SMCC活化(1/3)X0.628mg/ml T11/IT和0.0120x體積數的5mg/ml L-半胱氨酸。
實施例11 在細胞群分析中的抗體-氨基葡聚糖-膠態金屬復合體。
用膠態金共軛抗體和兩種熒光染料共軛抗體(熒光紗和若丹明或藻紅素+抗體)完成了單個細胞的三重抗體染色，以用于偏振光外照明光顯微鏡檢測(J.J.M.Van.Dongen等人，J.Immunol、Methods，801-6，1985)和流動血細胞計數(R.Festin等人，J.Immunol、Methods，10123-28，1987)。在金(直角光散射)和熒光標記物之間來看到相互干擾。因此，可以在用流動血細胞計數或其它方法例如T、Russell，M.C.Hajek，C.M.Rodriquez，和W.H. Coulter的WO90/13013所述的方法進行的各種細胞群分析中，可以單獨或與熒光染料共軛抗體一起使用抗體-氨基葡聚糖-膠態金復合體。小顆粒的其它金屬例如鉑、鈀、銥或銠(它們的最大吸收光在紫外區而不是可見光區域(金膠體在約520nm;銀膠體在約400nm))證實可更好地用作抗體-氨基葡聚糖-膠態金屬類型的細胞標記，因為它們的吸收光帶與一般熒光染料的散射光帶不重迭。
為了分析T細胞分組(T4，T8)，使一種T4或T8單克隆抗體-氨基葡聚糖-金膠體復合體首先與一例全血液樣品(1x106總淋巴細胞最大值)混合6分鐘。然后加入T4-RD1(藻紅素)和T8-FITC(Coulter免疫學，Hialeah，FL)熒光標記物并混合10分鐘。此后通過Q-PREP(Coulter免疫學)溶解(甲酸)和RBCs的驟冷(碳酸鈉等和仲甲醛)處理形成的混合物。隨后分析樣品，通過流動血細胞計數分析在淋巴細胞前移(膠態金屬標記)對側散射區域中的T4和T8細胞群以及T細胞特異性。為了分析在全血液淋巴細胞中的T4和T8細胞群，用T4和T8-聚苯乙烯微珠共軛體(約2μm直徑)成功地進行了類似的分析。重要的是，微珠或金屬粒-抗體共軛體在加熒光標記物之前要先與全血液混合，以避免T細胞上的抗原位點被更小且流動性更強的分子染料-抗體共軛體所飽和。
金屬膠體標記的淋巴細胞的前移與側散射關系圖在程度和方向上是不同的，這取決于金屬粒的大小、形狀和折光系數。因此，可以相信，兩種或多種不同膠態金屬的顆粒可與不同的單克隆抗體作共軛，用其與多重熒光標記物通過流動血細胞計數分析散射點不重迭區域中的細胞小群。這可以用于調查以細胞小群例如約106細胞表達的抗原位點之間的差異。
權利要求
1.一種由金屬鹽溶液制備膠態金屬(O)顆粒并用同時亦為所述金屬鹽還原劑的高分子有機化合物涂覆所述顆粒的方法，所述方法包括(a)加熱一種含有一種胺衍生的、含可氧化糖的多糖和一種能被所述含可氧化糖的多糖還原的金屬鹽的溶液一段時間，加熱溫度足以將所述金屬鹽還原成膠態金屬顆粒，同時，所述多糖涂覆在所述顆粒上；和(b)用一種雙官能交聯劑、一種二胺和一種還原劑穩定涂在所述顆粒上的胺衍生的多糖。
2.按照權利要求1所述的方法，其中所述胺衍生的多糖是氨基葡聚糖。
3.按照權利要求1所述的方法，其中所述金屬鹽的還原電勢為+0.7伏或更高。
4.按照權利要求1所述的方法，其中所述金屬鹽選自能被所述多糖還原的金、銀、鉑、鈀、銠和銥鹽。
5.按照權利要求4所述的方法，其中所述金屬鹽是金鹽或銀鹽。
6.一種制備涂有一種胺衍生的、含可氧化糖的多糖的膠態金屬(O)顆粒的方法，該方法包括(a)加熱一種可用糖還原的金屬鹽的水溶液，并向所述溶液中加入一種至少具有一種還原糖組分的胺衍生的多糖的水溶液;(b)在90-100℃溫度范圍內將步驟(a)所得溶液加熱并混合10-30分鐘，以便將所述金屬鹽還原成懸浮在所述多糖溶液中的膠態金屬顆粒;(c)將步驟(b)所得溶液冷卻到室溫，向該冷卻的溶液中先加入一種能與所述胺衍生多糖上的氨基反應的含水雙官能試劑;(d)向步驟(c)的產物加入一種有機二胺;(e)還原步驟(d)形成的可還原基團;(f)用水滲析步驟(e)的溶液;(g)離心分離步驟(f)的產物，得到能夠作為膠體分散的、涂有胺衍生多糖的顆粒。
7.按照權利要求6所述的方法，其中所述的衍生的多糖是氨基葡聚糖。
8.按照權利要求6所述的方法，其中所述金屬鹽的還原電勢為+0.7伏或更高。
9.按照權利要求6所述的方法，其中所述金屬鹽選自能用所述多糖還原的金、銀、鉑、鈀、銠和銥鹽。
10.按照權利要求9所述的方法，其中所述金屬鹽選自金鹽或銀鹽。
11.按照權利要求6所述的方法，其中所述首先加入的雙官能試劑是戊二醛。
12.按照權利要求6所述的方法，其中所述二胺選自H2NCH2-(CH2)x-CHy(CH3)z和C6H4+a(NH2)2，這里x＝0-3，y＝1或2，且y＝1時z＝1或y＝2時z＝0;a＝0或6。
13.一種制備涂有一種含可氧化糖的胺衍生多糖且其上連接有一種蛋白質的膠態金屬(O)顆粒的方法，所述方法包括(a)按照權利要求1制備由氨基葡聚糖涂覆的膠態金屬顆粒;和(b)使步驟(a)的顆粒與一種能與所述顆粒上存在的胺基形成一種共價鍵的蛋白質反應。
14.按照權利要求13所述的方法，其中所述蛋白質是一種單克隆抗體。
15.按照權利要求13所述的方法，其中所述膠態金屬顆粒選自膠態金、銀、鉑、鈀、銠和銥膠態顆粒。
16.按照權利要求15所述的方法，其中所述膠態顆粒是膠態金或銀顆粒。
17.一種制備涂有含還原糖的胺衍生多糖且其上連有蛋白質的膠態金屬(O)顆粒的方法，該方法包括(a)按權利要求1制備膠態金屬顆粒;(b)將所述顆粒上存在的氨基轉化成選自巰基和馬來酰亞胺基的一個基團;和(c)使步驟(b)的產物與下述物質反應(1)一種帶有可與所述巰基和馬來酰亞胺基反應的官能團的蛋白質，或者(2)一種具有選自巰基和馬來酰亞胺基中的至少一個官能團的衍生蛋白質，使得當所述顆粒含有巰基時，蛋白質含有馬來酰亞胺基，所述顆粒含有馬來酰亞胺基時，所述蛋白質含有巰基。
18.按照權利要求17所述的方法，其中所述蛋白質是一種帶或不帶可檢測標記的單克隆抗體，該標記例如可為酶、染料、電子密集元素、含放射性元素的化合物等等。
19.按照權利要求17所述的方法，其中所述膠態金屬顆粒選自膠態金、銀、鉑、鈀、銠和銥膠態顆粒。
20.按照權利要求17所述的方法，其中所述膠態顆粒是金或銀膠態顆粒。
21.具有高分子有機涂層的膠態金屬(O)顆粒，所述涂層包括一種穩定化的胺衍生的多糖，所述涂層是借助于一種雙官能交聯劑、一種二胺和一種還原劑穩定的。
22.按照權利要求21所述的顆粒，其中所述胺衍生的多糖是氨基葡聚糖。
23.按照權利要求21所述的顆粒，其中所述雙官能交聯劑是戊二醛。
24.按照權利要求21所述的顆粒，其中所述金屬(O)選自金、銀、鉑、鈀、銠和銥。
25.按照權利要求24所述的顆粒，其中所述金屬(O)是銀或金。
26.具有穩定的胺衍生的多糖涂層的膠態金屬(O)顆粒，所述顆粒由下述方法制備(a)加熱一種含有包括可氧化糖的胺衍生多糖和一種能被所述多糖還原的金屬鹽的水溶液一段時間，其溫度足以還原所述金屬鹽成為膠態金屬顆粒，同時使所述多糖涂覆所述顆粒上;(b)用一種雙官能交聯劑穩定所述顆粒上的胺衍生的多糖涂層;(c)使步驟(b)的產物與一種有機二胺反應;并用一種還原劑還原得到的產物;和(d)將步驟(c)的產物與雜質分離開，得到一種涂有穩定的胺衍生的多糖涂層的金屬顆粒。
27.按照權利要求26所述的顆粒，其中所述胺衍生的多糖是一種氨基葡聚糖。
28.按照權利要求26所述的顆粒，其中所述雙官能交聯劑是戊二醛。
29.按照權利要求26所述的顆粒，其中所述金屬(O)選自金、銀、鉑、鈀、銠和銥。
30.按照權利要求29所述的顆粒，其中所述金屬(O)是金或銀。
31.具有一層穩定的胺衍生多糖涂層且有一種蛋白質共價鍵合在所述涂層上的膠體金屬(O)顆粒，所述顆粒包括(a)按權利要求6制備的顆粒和一種共價鍵合在所述顆粒的多糖涂層上的蛋白質;或者(b)按權利要求6制備的顆粒，使之進一步反應，生成有反應性硫氨基或馬來酰亞胺基團連在多糖涂層上和蛋白質共價地鍵合在所述涂層上的巰基或馬來酰亞胺基團上的顆粒。
32.按照權利要求31所述的顆粒，其中所述蛋白質選自多克隆和單克隆抗體、酶、植物凝血素等等。
33.按照權利要求31所述的顆粒，其中所述蛋白質是一種單克隆或多克隆抗體。
34.按照權利要求31所述的顆粒，其中所述蛋白質具有一種與其相連接的、可檢測的酶或含有放射性元素的物質或染料。
全文摘要
本發明涉及膠態金屬(O)顆粒及其制備方法，該顆粒有一層帶不穩定的氨基團的交聯氨基葡聚糖涂層。該氨基葡聚糖作為一種還原劑用來把金屬離子還原成金屬(O)顆粒，并作為保護劑涂在形成的金屬(O)顆粒上，用交聯劑穩定氨基葡聚糖涂層后，涂覆的顆粒可用來共價鍵合蛋白質。得到的含蛋白質的膠態顆粒可以用來作為光學或電子顯微鏡檢測、免疫學和生物學測定中的標記物，并可能作為治療藥劑。
文檔編號C07K16/00GK1074844SQ9310052
公開日1993年8月4日 申請日期1993年1月29日 優先權日1992年1月29日
發明者奧拉威·希曼, 亞歷山大·伯士蒂恩 申請人:庫爾特有限公司