專利名稱：發酵制備氨基酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種發酵制備氨基酸如L-賴氨酸或L-蘇氨酸的改進方法。
L-賴氨酸是一種必需氨基酸并大量地被用作動物飼料添加劑。
通常通過生物合成生產大量的氯基酸，并且該方法是本領域專業人員熟知的。通過在短時間內以高濃度把這些氨基酸分泌到培養基中的能力來鑒別生產氨基酸的細菌菌株。通常為了避免底物的高起始濃度，一般采用分批進料的工藝。由于所用的生產菌株有很高的代謝能力，因此采用使最大需氧量和放熱量保持在經濟學上可接受的數量級這一發酵方法對于完成發酵過程是極其重要的。
因此，為了調節生物體的代謝活性，采用了各種手段，以確保氧氣的供給和熱量的釋放以及在同一時間平衡生物量和產物形成的分布。
在CSFR-PS212558中公開了間歇供料的方法，其中在生長期通過改變pH并通過α-氨基氮調節生物量總量來調節代謝活性。SU-PS157059公開了一種間歇供料的方法，其中以蘇氨酸濃度作為供料標準，并使還原化合物的比例保持在3到5%。在FR-PS8303487中公開了一種很精細地調節過程。在該過程中，連續加入兩種供料溶液以這樣的速度加入磷酸亮氨酸溶液，即通過補充料加入的速度限制生物代謝強度和生物量的形成。以實際糖濃度保持在5到15g/l的速度加入第二種供料溶液，即糖溶液。這表明，由于在供料期由亮氨酸/磷酸鹽補充物的限制，隨后在任何一個時間，培養物可利用的糖均比在培養基中可得到的少。該方法與重復記載的應當避免C-限制和過度的C-超量(如，DD-PS269167)的觀點是一致的。為了該目的，HasjSassi等人在“BiotechnLetters，Volume10，No.8，pp.583-586(1988)”中甚至建議葡萄糖濃度保持在90到140g/l。因此，代謝活性總是由只有碳源以外的因素調節的。
本發明的目的是提供一種發酵制備氨基酸的生產方法，該方法以較高轉化率轉化所用的碳源(糖)，并在不含生物量的干物質中得到高濃度的氨基酸。
本發明涉及一種發酵制備氨基酸物的生產方法，其中在營養培養基中培養產生一種或多種氨基酸的短桿菌屬或棒狀桿菌屬的菌株，并在發酵結束時從培養液中分離氨基酸，特征在于在活躍的生長期(生產期期間)后，細菌培養基可得到的碳源量比以它在其菌株結構基礎上可代射的量少并且在營養培養基中提供一定量的其它必需補充物。發酵(營養)培養基為常規培養基組合物。除含碳源如可同化的糖、蔗糖、葡萄糖，糖蜜或淀粉水解物及銨離子外，在自養型生產菌的情況下，由于一種或多種營養缺陷，它還含有復雜的成分作為所需的有機補充物源，如蛋白水解物作為α-氨基氮源，維生素及無機鹽。在發酵開始時呈現的活躍生長通常是一個對數生長期。如果需要，可通過限制補充物和/或碳源來縮短對數生長期。
對數生長期之后是細胞生長，但這種生長的范圍局限于活躍生長期的一小部分。優選地是使用生產L-賴氨酸和/或L-蘇氨酸的菌株。選擇發酵培養基，以使溫度為25到40℃，最好是30到36℃，pH從6到8，最好為7到7.5，銨濃度從0.5到8g/l。攪拌發酵液并充分地供氧。可以通過改變加入的氨基酸量控制糖代謝，特別是在使用氨基酸營養缺陷型賴氨酸分泌菌的情況下。生長期后，這些補充物或其它必需補充物的濃度優選地是各自為0到0.1g/l，最好各自為0到0.05g/l。因此，例如在亮氨酸-營養缺陷型賴氨酸分泌菌中，在連續加料的培養基中選擇糖/亮氨酸比率，以便通過添加亮氨酸限制生物量的形成，但同時所提供的糖數量僅僅是在給定的亮氨酸濃度下可被轉化之糖的一部分。
在活躍生長期后，可利用之糖的濃度較好為0到＜3g/l，最好為0到1g/l。
就任何所需的補充物或碳源來說，在發酵液中的濃度為0g/l并不意味著不連續提供這些物質。它意味著這些化合物是以立刻被細菌培養物攝取的量提供的。按照本發明的方法完成上述發酵與上述的常規方法相比有許多很重要的優點，即1.可以直接影響并沒有因供料速度而延緩代謝活性和由此導致的培養物需氧量及熱釋放改變，且適應于發酵罐的能力。
2.由整體地干物質的較高產物含量和較高的純度區別發酵液。通過在整個供料期間，給細菌培養物提供比它所能轉化的量較少的底物來阻制因副產品形成而造成的損耗，因而碳源構成了初級限制。
3.發酵的產率比主要由添加方式限制的發酵高。
4.在監測產物的過程中，在最佳或平穩期，可直接地并且沒有任何延遲地停止發酵，并且在全部時間內的粗產率等于凈產率。
5.在完成包括經蒸發而直接濃縮發酵液的方案中，發酵罐中的內含物可以在出現技術故障的情況下直接繼續加工，而不會因高殘余糖含量損壞產品的質量。
下列實施例記載根據本發明之方法的可能的實施方案。
實施例1(比較實施例)把5.1kg含下列成分的無菌溶液引在帶攪拌器和通氣系統的發酵罐中水4540g糖蜜26g葡萄糖125g谷物谷蛋白水解物(用硫酸水解)35g生產菌生物量的水解物(用硫酸水解)320g
硫酸銨45g磷酸(85%)7g硫酸鎂3g其它無機鹽，微量元素和生物素及硫胺素。用銨溶液把溶液的pH調至7.3。在33到35℃，把帶遺傳標記leu-，惡溶菌素抗性和氨乙基抗性的0.6l谷氨酸棒桿菌DM346-1的接種物加到上述溶液中。經33℃，pH7，在攪拌和通氣條件下在培養基上培養15小時制備接種物，所述培養基含4.4%(質量)糖蜜，另外還有2%蔗糖以及14%大豆粉水解物(用硫酸水解)，附加的還有3%硫酸銨，0.05%磷酸和0.02%硫酸鎂以及維生素，生物素和硫胺素。
伴隨強烈攪拌，通風以及用氨水溶液把pH調到7.3，將用氨水溶液中和的下列培養基在對數生長期結束后的32小時之內按常規方法連續加到主發酵罐中，以使在發酵液中可測量的糖濃度為5到35g/l(以蔗糖和葡萄糖為基礎的酶法測定)水1250g糖蜜94g葡萄糖1456g玉米谷蛋白水解物(用硫酸水解)39g生產菌生物量的水解物(用硫酸水解)265g硫酸銨31g磷酸(85%)4g
硫酸鎂2g其它無機鹽，微量元素和生物素及硫胺素。
在發酵結束時，當用完發酵培養基中的所有可同化糖時，糖轉化成賴氨酸的轉化率是35%，按LysxHCl計算，并且，沒有生物量的濃縮發酵液中的賴氨酸基本含量是45%。
實施例2制備接種物，把培養基引入主發酵罐并且使用與實施例1相似的培養條件。
培養基2也有除下列改變外的同樣組成水1560g糖蜜25g葡萄糖1170g在本實驗中，以與實施例1中同樣的速度加入供料培養基。對以可同化糖為基礎的進展所作分析表明，與本發明在本文中所說的一致，在整個供料期間，可測量的可同化糖的濃度保持在3g/l，并幾乎總是保持低于1g/l。使用氨基酸分析儀，以發酵液中的亮氨酸為基礎的分析表明，在培養基1中提供的亮氨酸量用完后，供料期間亮氨酸的濃度沒有大于0.05g/l的點。
發酵結束后，糖轉化成賴氨酸的轉化率(按LysxHCl計算)為40%，并且，無生物量之濃縮發酵液的賴氨酸基本含量為54%。
實施例3
把含下列組分的3980kg無菌培養基引入10m3的反應容器中蔗糖320kg糖蜜20kg玉米谷蛋白水解物230kg25%含水硫酸銨150kg檸檬酸·H2O 2.3kg磷酸(89%)6.6kgMgSO4·7H2O 2.8kgCaCl2·2H2O 75gFeSO4·H2O 113gMnSO4·H2O 113gZnSO4·7H2O 5.6gCuSO4·5H2O 0.6g生物素1.1g硫胺素·HCl0.8gNH4OH(2-3%) 1010kg水2258kgpH7.0在33℃攪拌反應器的內含物并充分通氣。把250l攜帶遺傳標記亮氨酸營養缺陷型和氨乙基半胱氨酸抗性的菌株DM282-2的接種物(在含6%糖蜜，14%大豆粉水解物，1%硫酸銨和0.1%磷酸的培養基中，于30℃，pH7條件下培養16小時后)轉移到10m3的反應器中，加入氨水使pH保持在7.0，并調整通氣速度以使氧含量總是15%以上的飽和度。
在培養物生長到約為30的光密度(535nm)后，以30l/h的速度加入有下列組成的生產培養基蔗糖940kg糖蜜50kg玉米谷蛋白水解物180kg25%含水硫酸銨80kg檸檬酸·H2O 1kg磷酸(89%)2.8kgMgSO4·7H2O 1.2kgFeSO4·H2O 48gMnSO4·H2O 48gZnSO4·7H2O 2.4gCuSO4·5H2O 0.3g生物素0.6g硫胺素·HCl0.4gNH4OH(25%) 80kg水740kgpH7.5
生產期間pH保持在7.3。根據本發明的描述，生長培養基中提供的糖用完后，供料期間可同化糖的濃度不超過1g/l，可測定的亮氨酸濃度低于0.05g/l。在發酵結束時，糖轉化成賴氨酸(以Lys·HCl的形式)的轉化率是32.3%，不含生物量的濃縮發酵液不的賴氨酸含量是54.7%。
實施例4(比較實施例)制備接種物，方法參數，以及生長期和生產期的培養基與在實施例3中說明的條件相一致，但在這種情況下以大約100l/h的速度完成供料。結果，在生長培養基中提供的糖用完后，供料期間可測量的可同化糖濃度明顯高于5g/l，但亮氨酸濃度保持低于0.05g/l。在發酵結束時，糖轉化成賴氨酸(以Lys·HCl計算)的轉化率是30.9%，且不含生物量的發酵液中賴氨酸基本含量為43.5%。
實施例5(比較實施例)除了在生長培養基中用25g/l的蔗糖代替葡萄糖，在生產培養基中用564g/l的蔗糖代替葡萄糖外，培養生長以及生產所用的培養基均與實施例1所述者相似。包括制備接種物在內的培養參數也完全相同。把0.82kg(0.8l)無菌培養基引入一配有攪拌器和通氣裝置的小發酵罐中。在33到35℃向該溶液中加入1.1l的谷氨酸棒桿菌DSM5717的接種物。當光密度達到約30(535nm)時，在24小時內連續加入533g(430ml)的生產培養基。
供料期間，發酵培養基中可測量的糖含量總是大于5g/l，且在生長培養基中提供的糖用完后，亮氨酸含量總是低于0.05g/l。發酵結束時，在培養基中檢測到作為Lys·HCl的賴氨酸為74g，在蔗糖總輸入量為275g的情況下，相應的轉化率是27%。總干生物量的賴氨酸含量是30.5%。
實施例6在另一實驗中也使用DSM5715菌株，其中所有培養基和培養條件的參數與實施例5的相同，在39小時內連續加入生產培養基。與本發明所述的一致，生長培養基中提供的碳源和亮氨酸用完后，在供料期間，實際的蔗糖濃度低于1g/l且亮氨酸濃度低于0.05g/l。在發酵結束時，在培養基中檢測到89g賴氨酸(以Lys·HCl的形式)，且轉化率為32%。在全部干物質中賴氨酸含量為36.3%。
權利要求
1.一種發酵制備氨基酸的方法，其中，在營養培養基中培養生產一種或多種氨基酸的短桿菌屬和棒狀桿菌屬菌株，并在發酵結束時，從培養液中分離氨基酸，其特征在于在活躍生長期后，細菌培養物可以得到比基于該菌株之結構可以被其代謝的較小量碳源，并在營養培養基中提供一定量的其他必要添加物。
2.根據權利要求1的方法，其特征在于活躍生長期后，碳源的濃度是從0到＜3g/l。
3.根據權利要求1和2的方法，其特征在于，使用營養缺陷型細菌菌株并且在一些多菌株營養缺陷情況下，至少加入一種有機化合物，在活躍生長期后，把其濃度限制到0到0.1g/l。
4.根據權利要求1到3之任一項的方法，其特征在于使用生產L-賴氨酸和/或L-蘇氨酸的菌株。
5.根據權利要求4的方法，其特征在于使用谷氨酸棒狀桿菌的亮氨酸營養缺陷型菌株。
全文摘要
本發明涉及發酵制備氨基酸的方法。其中在營養培養基中培養生產一種或多種氨基酸的短桿菌屬和棒狀桿菌屬菌株，并在發酵結束時從培養液中分離氨基酸，特征在于在活躍生長期后，細菌培養物得有供它自己使用的可吸收碳源，這個碳源量比基于該菌株結構上可代謝的量少，并在營養培養基中提供一定量的其它必需添加物。
文檔編號C07K16/00GK1070687SQ92110718
公開日1993年4月7日 申請日期1992年9月16日 優先權日1991年9月17日
發明者W·費佛勒, H·勞特, H·福里德里奇, W·狄格奈 申請人:底古薩股份公司