專利名稱：抗凝血酶多肽的制備方法
技術領域：
本發明涉及已從水蛭Hirudinaria manillensis分離出的具有抗凝血酶活性的多肽的制備方法。
最普通的抗凝劑肽可能要數水蛭素一類。最初由醫用水蛭(Hirudo medicinalis)中分離出的水蛭素是人們非常熟悉且經過充分鑒定的凝血酶的多肽類抑制劑(1，2)。更具體地說，它是通過離子反應結合凝血酶，從而防止血纖維蛋白原裂解為血纖維蛋白，并進而防止血纖維蛋白凝塊的形成。在動物研究中已證實水蛭素能有效地預防靜脈血栓形成、血管旁路閉塞以及凝血酶誘導的彌漫性血管內凝血。另外，水蛭素顯示出低毒性，很少或沒有抗原性，且其從循環中清除的時間極短。
已從另一種水蛭，水蛭Hirudinaria manillensis中分離出具有抗血活性的多肽(EP-A-0347376和WO90105143)。該水蛭被認為是比醫用水蛭更為有利，因此可合成其氨基酸序列不同于水蛭素和其它已知的水蛭素變體之氨基酸序列的抗凝劑肽。
本發明人已對自Hirudinaria manillensis的一種制劑進行了分析，發現了三種新的具有抗凝血酶活性的多肽。因此，本發明提供了包括如下氨基酸序列的多肽及其藥用的鹽
(i)P1Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Tyr Cys Leu1 510 15Cys Val Gly Gly Asn Leu Cys Gly Gly Gly Lys His Cys Glu Met20 25 30Asp Gly Ser Gly Asn Lys Cys Val Asp Gly Glu Gly Thr Pro Lys35 40 45Pro Lys Ser Gln Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Glu50 55 60Yaa Ile Leu Asn Zaa;
65(ii)P2Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Tyr Cys Leu1 510 15Cys Val Gly Ser Asn Val Cys Gly Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu20 25 30Ser Ser Ser Gly Asn Gln Cys Val His Gly Glu Gly Thr Pro Lys35 40 45Pro Lys Ser Gln Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Glu50 55 60Yaa Ile Leu Asn Zaa;或(iii)P3Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Tyr Cys Leu1 510 15Cys Val Gly Ser Asn Val Cys Gly Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu20 25 30Ser Ser Ser Gly Asn Gln Cys Val His Gly Glu Gly;
35 40
氨基酸殘基是按三聯密碼子表示的(Eur·J·Biochem.138，9-37，1984)。殘基Yaa代表Asp或Tyr，Zaa為-OH、-NH2或Gly-OH。鹽可以是酸加成鹽。它們可以是與氫鹵酸(如鹽酸)、硫酸、磷酸或焦磷酸等無機酸形成的鹽，也可以是與苯磺酸、對甲苯磺酸、甲磺酸、乙酸、乳酸、棕櫚酸、硬脂酸、蘋果酸、酒石酸、抗壞血酸或檸檬酸等有機酸形成的鹽。多肽也含有游離羧基，因此可以作為鈉鹽、鈣鹽、鉀鹽、鎂鹽、銨鹽或與生理上可耐受的有機含氮堿形成的鹽的形式存在。多肽也可以是內鹽形式的。
因此，本發明的多肽主要由氨基酸序列(ⅰ)至(ⅲ)組成。從Hirudinaria manillensis分離出的天然多肽具有氨基酸序列(ⅰ)或(ⅱ)(其中Yaa為Asp，Zaa為-OH)或具有部分氨基酸序列(ⅲ)。可對本發明的多肽進行分離和純化以用作抗凝血酶劑。
所產生的多肽前面可按有全部或部分前導序列。相對于獲得多肽的細胞來說，該前導序列可以是天然或外源前導序列。該前導序列能夠指導多肽從細胞中分泌。本發明的兩種天然多肽在表達時帶有后來被切掉的前導序列。因此，可呈現該前導序列的全部或一部分，該序列為Met Phe Ser Leu Lys Leu Phe Val Val Phe Leu Ala Val Cys Ile Cys Val Ser Glu Ala。
本發明的天然多肽或其鹽可通過自Hirudinaria manillensis水蛭的組織或分泌物中分離所說的多肽或其藥用鹽而制得。更具體地說，可按照WO90/05143中所述方法制備并對所得制劑進行高壓液相層析而得到本發明的多肽。
也可按如下方法制備本發明的多肽或其鹽(a)提供宿主，在適于在宿主內表達該多肽的條件下用含有編碼該多肽之DNA序列的表達載體轉化之，(b)分離如此獲得的所說多肽或其藥用鹽。
該方法基本上是基本獲得編碼希望表達的多肽的核苷酸序列并在重組生物體內表達之。培養經過遺傳修飾的生物體即可產生顯示出全部生物學活性的所需產物。因此，本發明還提供了-一種包含了編碼本發明多肽之DNA序列的表達載體;
-一種被本發明的相容性表達載體轉化了的宿主;
-一個編碼本發明多肽的DNA序列。
本發明的多肽能夠在其中表達的宿主是通過用本發明的相容性表達載體轉化宿主而制得的。可按如下方法制備表達載體(a)化學合成編碼本發明多肽的DNA序列;
(b)將該DNA插入表達載體。
還可按如下方法制備表達載體(a)從Hirudinaria manillensis水蛭的mRNA產生和分離編碼本發明多肽的cDNA;
(b)將分離的cDNA插入表達載體。
然后通過在適于多肽表達的條件下提供被轉化宿主而制得本發明的多肽。當使用真核宿主時，可獲得被糖基化的多肽。可分離多肽本身或其藥用的鹽。按照這一方法，可獲得純的本發明多肽或其鹽。
可通過在任一端或兩端同時延長氨基酸的方式對本發明的多肽進行修飾。當然，由該延長序列組成的多肽必須仍然顯示出抗凝血酶活性。例如，可在任一末端或兩端提供一長達30個氨基酸殘基的短序列。
可對本發明的多肽進行一種或多種轉譯后修飾，如硫酸化、羧基酰胺化、酰化或多肽鏈的化學改變。例如，可用肽酰甘氨酸α-酰胺化單加氧酶(PAM酶)對其羧基末端具有甘氨酸殘基的多肽進行酶促酰胺化。
為了以DNA重組技術產生抗凝血酶多肽，制備了編碼本發明多肽的基因。DNA編碼序列一般不包括內含子。分離和純化該DNA序列。將該基因插入到能夠促使重組產物產生的表達載體中。該DNA序列可以是cDNA序列，也可以是合成的DNA序列。合成基因通常是通過用化學方法合成完全對應于所需基因的寡核苷酸，然后對這些寡核苷酸進行裝配而制得的。
因此，可從六個化學合成的寡核苷酸構建基因，每一寡核苷酸均代表雙鏈DNA基因之一條鏈的大約三分之一。將這些寡核苷酸連接并退火即得到所需的基因。根據需要，可通過定點誘變對該基因序列進行修飾，使一個或多個密碼子發生改變。為了有助于隨后的操作，通常在基因的每一末端構建限制性酶切位點。
也可提供一種還編碼上面所述的前導序列的DNA序列。該前導序列能夠指導多肽自表達它的細胞中分泌。編碼前導肽的序列通常被融合至編碼多肽之DNA序列的5端。
當需要在細菌宿主(如大腸桿菌)中進行表達時，前導肽可以是Omp A前導肽。當在昆蟲細胞中進行表達時，前導肽可以是水泡性口腔炎病毒G蛋白(VSVG蛋白)。編碼Omp A和VSV G蛋白前導序列的合適DNA序列為
Omp A前導序列ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT 42TTC GCT ACC GTA GCG CAG GCC 63VSV G蛋白前導序列ATG AAG TGC CTT TTG TAC TTA GCC TTT TTA TTC ATT GGG GTG 42AAT TGC 48可提供編碼一融合蛋白的DNA序列，該融合蛋白能夠被切斷而釋放出本發明的多肽。可使用編碼載體多肽序列的DNA序列，該載體多肽序列則通過可斷裂的連接鍵與本發明多肽的N末端相融合。可斷裂的連接鍵可以是能被溴化氰裂解的連接鍵。
為了表達多肽而構建了一表達載體，它包括編碼多肽的DNA序列且在加至合適的宿主中時能夠表達該多肽。還提供了合適的轉錄和轉譯控制成分，包括DNA序列的啟動子、轉錄終止位點以及轉譯起始和終止密碼子。DNA序列是以正確讀碼的形式提供，以保證多肽在與載體相容的宿主中被表達。
表達載體通常包括一復制起點，并根據需要還包含一選擇標記基因，如抗生素抗性基因。啟動子是被可操縱地連接至編碼多肽的DNA序列上的。表達載體可以是核粒。在這種情況下，最好是將選自Ptrp和Plcc/lac的啟動子可操縱地連接到DNA序列上。表達載體也可以是病毒。該病毒可以是重組桿狀病毒，其中將多角體啟動子被可操縱地連接到編碼多肽的DNA序列上。
可以任何方便的方式制備能夠表達多肽的表達載體。可將編碼多肽的DNA片段插入到表達載體(如核粒載體)的合適限制性酶切位點中。重組桿狀病毒可按以下方法制備(ⅰ)在多角體啟動子下游的限制性位點將編碼多肽的基因克隆到桿狀病毒轉移載體中;
(ⅱ)用步驟(ⅰ)的重組轉移載體和完整的野生型桿狀病毒DNA共轉染易受桿狀病毒感染的昆蟲細胞。
同源重組發生后產生重組桿狀病毒，它攜帶了位于多角體啟動子下游的多肽基因。桿狀病毒轉移載體可在多角體ATG起始密碼子的下游具有一獨特的克隆位點。由所產生的重組桿狀病毒隨后表達的產物將是一種融合蛋白質，其中多角體蛋白的N-末端部分被融合到多肽的N-末端上。如上所述，可在融合連接處提供可斷裂的連接鍵。
步驟(ⅱ)中所用的昆蟲細胞通常為草地粘蟲(Spodoptera frugiperda)細胞。野生型桿狀病毒通常為苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核多角體病毒(AcNPV)。
將編碼多肽的表達載體提供給合適的宿主，用多肽基因轉化細胞。在適于使多肽在其中表達的條件下提供轉化的宿主。例如，對轉化細胞進行培養以保證發生表達。可使用任何相容性宿主一載體系統。
轉化的宿主既可以是原核宿主，也可以是真核宿主。可使用細菌或酵母宿主，如大腸桿菌或釀酒酵母(S.cerevisiae)。可使用革蘭氏陽性細菌。優選的細菌宿主是大腸桿菌B型菌株。也可使用昆蟲細胞，在這種情況下桿狀病毒表達系統比較合適。昆蟲細胞通常是草地粘蟲細胞。另外還可以轉化哺乳動物細胞系的細胞。可提供產生多肽的轉基因動物，如除人之外的哺乳動物。
被表達的多肽可被分離和純化。可得到具有任一前面所述的氨基酸序列(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)的多肽，所有這些序列均由轉譯起始密碼子編碼的Met殘基引導。或者如上所述，可獲得一融合蛋白質，它包括與載體序列相融合的本發明多肽的氨基酸序列即上述的序列(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)。當在融合蛋白質的氨基酸序列(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)與載體序列之間提供一合適的連接鍵時，可通過用合適的試劑裂解連接鍵而釋放出具有氨基酸序列(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)的多肽。
本發明的多肽或其可藥用的鹽也可按如下方法制備(a)用化學方法合成所說的多肽，(b)分離由此獲得的多肽或其藥用鹽。
因此，可通過化學合成的方法按照所需多肽序列的順序由單個氨基酸和/或兩個或多個氨基酸預成的肽組構該多肽。可以使用固相或液相方法。可根據需要將所產生的多肽轉化為其藥用鹽。
在固相合成法中，所需多肽的氨基酸序列是從結合至不溶性樹脂上的C-末端氨基酸逐步組構成的。當所需的多肽產生后，將其從樹脂上裂解下來。當使用液相合成法時，可同樣從C-末端氨基酸開始組構所需的多肽。該氨基酸的羧基始終被合適的保護基所保護，并在合成結束時除去保護基。
無論是使用固相還是液相技術，加到反應系統中的每一個氨基酸通常具有被保護的氨基以及活化的羧基。側鏈官能團也被保護。在合成過程中的每一步驟之后均除去氨基保護基團。而側鏈官能團則通常是在合成結束后再除去。
可將多肽轉化為藥用鹽。可用有機或無機酸將其轉化為酸加成鹽。合適的酸包括乙酸、琥珀酸和鹽酸。另外也可將肽轉化為羧酸鹽如銨鹽或堿金屬鹽如鈉鹽或鉀鹽。
可將多肽或其藥用鹽與藥用的載體或其賦形劑一起用于藥用組合物中。該配方通常是通過靜脈注射使用(在這種情況下載體通常是具有相當純度的無菌鹽水或水)。本發明的多肽是一種抗凝血酶，適用于治療主要是人類的血栓形成性疾病，如血液凝固。因此，該多肽可在血液透折、血液分離以及體外血液循環中用于治療和預防血栓形成和血栓栓塞(包括預防手術后的血栓形成)、用于急性休克治療(例如治療膿毒性或多創傷性休克)以及用于治療消耗性凝血病。在另一實施方案中，可將本發明的多肽或其鹽與纖維蛋白溶酶原激活劑(如組織纖維蛋白溶酶原激活劑)一起使用。
所用的劑量主要取決于具體的服用方式以及治療或預防的目的。個體劑量的大小以及給藥的方法可根據對個體疾病的具體情況的判斷而定。為此目的所需之測定相關血液因子的方法是本領域熟練技術人員所熟知的，一般在注射情況下，治療有效量的本發明化合物的劑量范圍為每公斤體重約0.005-0.1mg，優選每公斤體重約0.01-0.05mg。給藥是通過靜脈注射、肌肉注射或皮下注射的方式進行。相應地，根據給藥的方式不同，以單個劑量形式用于胃腸道外給藥的藥用組合物每份劑量含有約0.4-7.5mg的本發明化合物。除活性成分外，藥物組合物還含有為維持PH值在3.5-7之間所需緩沖液(如磷酸鹽緩沖液)以及用于調節等滲性所需的氯化鈉、甘露醇或山梨醇。這些組合物可以是冷凍干燥形式溶解形式的，含有抗菌活性防腐劑如0.2-0.3%4-羥基苯甲酸甲酯或乙酯的溶液可能更為有利。
局部應用的組合物可以是水溶液、洗劑、凝膠、油性溶液、懸浮液或含脂(尤其是乳化的)軟膏。水溶液形式的組合物可通過例如將本發明的活性成分或其藥用鹽溶于PH為4-6.5的含水緩沖溶液中而制得，并可根據需要加入其它活性成分，如消炎劑和/或聚合粘合劑(如聚乙烯吡咯烷酮)和/或防腐劑。10ml溶液或10g凝膠中活性成分的濃度約為0.1-1.5mg，優選0.25-1.0mg。
適于局部給藥的油性組合物是通過例如將本發明的活性成分或其藥用鹽懸浮于油中而制得的，并可根據需要加入脹溶劑(如硬脂酸鋁)和/或HLB值(“親水-系脂平衡”)低于10的表面活性劑，這類表面活性劑有甘油單硬脂酸酯、脫水山梨醇單目桂酸酯、脫水山梨醇單硬脂酸酯或脫水山梨醇單油酸酯。含脂軟膏是通過例如將本發明的活性成分或其鹽懸浮于可分散的脂肪基質中制得的，并可根據需要加入HLB值低于10的表面活性劑。乳化軟膏是通過將本發明的活性成分或其鹽在柔軟的可分散脂肪基質中進行研磨并加入HLB低于10的表面活性劑而制得的。適于局部應用的所有這些劑型的組合物也可含有防腐劑。10g基質中活性成分的濃度約為0.1-1.5mg，優選0.25-1.0mg。
除了上面所述的組合物以及與其類似而打算在人體或哺乳動物體內直接作醫藥應用的藥用組合物外，本發明還涉及在人體外或哺乳動物體外作醫藥應用的藥用組合物和制劑。這類組合物和制劑主要是被用作血液的抗凝添加劑，而這種血液則正在經受體外循環或處理(例如在人工腎中的體外循環或透析)、貯存或更換(例如血液分離)。這類制劑(如原液或以單一劑量形式存在的不同制劑)在組成上與前面所述的注射制劑相似。但是，活性成分的量或濃度則更為有利地取決于所要處理的血液量，或更準確地說，是取決于其凝血酶的含量。在這一方面應當牢記即使在相對大量的情況下，能夠完全滅活約5倍重量凝血酶的本發明活性成分(游離形式)在生理上也是無害的，且即使在高濃度的情況下也能夠快速地從循環血液中清除出去，因此即使在輸血過程中也沒有過量的危險。根據其具體用途，合適的劑量為每升血液約0.01-1.0mg活性成分，但仍可在無危險的情況下超過這一上限。
以下的實施例將舉例說明本發明。
在附圖中
圖1是顯示實施例1中HPLC分析結果的層析圖。P1至P3代表得自實施例1制品的三個不同的峰，FT表示流出部分，4-AB表示4-氨基苯甲脒。
圖2顯示得自實施例2(b)胰蛋白酶消化的PE-P1(A)和PE-P2(B)的洗脫曲線。
圖3顯示編碼對應于峰2(P2)之蛋白質的大部分的6個寡核苷酸的核苷酸序列，其中第61位的氨基酸殘基為Asp，多肽鏈最后一個氨基酸殘基為Asn64。用黑體字顯示的序列代表BalⅠ位點，它已被用于進一步的構建。該圖的下半部分顯示了6個寡核苷酸的裝配模式。為了便于以后的操作而加進了HindⅢ和Pst位點。
圖4顯示中間體質粒M13-P2的構建方案，它是所用其它P2構建的BalⅠ-Bam H I DNA片段的來源。
圖5以圖解方式顯示新的重組M13(即OMP-P2)的構建，它攜帶與Omp A前導肽相連的完整P2基因。前導肽序列以黑體表示，而BalⅠ平端和HindⅢ粘性末端則以下劃線表示。
圖6以圖解方式顯示pFC-P2的構建，該質粒是用于在大腸桿菌中生產P2蛋白。
圖7顯示用于在大腸桿菌中生產p2的質粒pOMPA-p2的整體結構。我們使用了常規的基因操作技術來制備這一新質粒，其中p2基因處在雜合啟動子PlPP/lac的轉錄控制之下。即使在這種情況下，OmpA前導肽仍能驅使p2向大腸桿菌周質中分泌。
圖8顯示用于從昆蟲細胞中分泌p2的合成寡核苷酸的核苷酸序列及其裝配。以黑體字母表示的序列代表VSVG蛋白前導肽。
圖9顯示新的重組M13即VSV-P2的構建，其中完整的p2基因與VSVG蛋白前導肽相連。
圖10以圖解方式顯示用作向桿狀病毒基因組轉移的轉移載體的pAC-p2的構建，pACYM1是廣泛地用作向病毒轉夠的異源序列的受體的起始質粒。
圖11顯示編碼p2鏈起始部分的合成寡核苷酸的核苷酸序列及其裝配。編碼額外的甲硫氨酸殘基的ATG密碼子以黑體表示。
圖12以圖解方式顯示pAcFT1的構建，它被用于細胞內的表達。
圖13顯示新的轉移質粒pAcFT1-p2，它攜帶了與多角體的前18個氨基酸相連的完整p2序列。該質粒已被用于向桿狀病毒基因組轉移異源序列。
圖14圖解顯示擴增3′末端的RACE方法。在該圖中，“＊＊＊TTTT……”代表dT17連接子引物。在每一步驟中附圖簡化為僅說明如何利用前一步驟中所形成的新產物。
圖15顯示擴增5′末端的RACE方法。該圖中“＊＊＊TTTT…”和“＊＊＊”分別代表dT17連接子引物和連接子引物。其中每一步驟均簡化為僅說明如何利用前一步驟所形成的新產物。
實施例1按照下面a)和b)中所述的方法，由WO90/05143所述的Hirudinaria manillensis水蛭制備抗凝血酶制劑。
a)丙酮萃取將乙醇干燥過的水蛭頭部(2920g)切成小塊，并用40∶60丙酮/水混合液(7.51)處理。于室溫下攪拌均勻后，將該混合物以2700rmp的轉速離心15分鐘。取出上清液，將沉淀物再懸浮于40∶60丙酮∶水的混合液中，攪拌30分鐘后將混合物以2700rpm的轉速離心15分鐘。將上清液與前次的上清液合并，并用冰醋酸(體積8.5升)酸化至PH4.5。該混合物以2700rpm離心15分鐘，取出上清液后通過加入30%氨水將溶液的PH調節至6.0。于35℃旋轉蒸發后濃縮溶液的PH降至1.8;離心除去沉淀的污染物，使用9倍過量的丙酮從混合物中沉淀出抗凝血酶粗品，將混合物離心，將沉淀物重新懸浮于丙酮中，并再次離心。然后將沉淀物凍干。
b)離子交換純化將抗凝血酶粗品重新溶于水中，對10mM乙酸銨緩沖液(PH4.0)透析，并加至在同一緩沖液中預平衡過的羧甲基瓊脂糖柱(CM Sepharose，Pharmacia，2.6×30cm)上。用100ml起始緩沖液洗柱后，用20mM乙酸銨(PH4.5)洗脫抗凝血酶活性部分，收集并合并之(1.3l)。為了進一步純化，將合并的部分在Minitan裝置(Millipore)中濃縮至0.5l;濃縮溶液用NaOH中和后加至在20mM Tris-Hcl(PH7.0)中平衡過的Q瓊脂糖柱上。用起始緩沖液中的0-1M線性梯度Nacl對結合物質進行洗脫。合并含有抗凝血酶活性的部分，通過在Superdex S-200柱上用20mM Tris-Hcl(PH7.5)以4ml/分鐘的流速洗脫而將其濃縮并脫鹽。自凝膠過濾所獲得的活性合并物用Minitan裝置濃縮，并用弱陰離子交換層析(DEAE FPLC)法進一步純化之。將活性材料上pnotein pak DEAE-5pW柱(Watcrs)，并用20mM Tris-Hcl(PH6.5)中的0-1M Nacl線性梯度以1.0ml/min的流速洗脫。合并活性部分，鑒定蛋白質含量及其活性(此活性800ATU/mg)，并在Spedvac濃縮器(Savant)中冷凍干燥。
為了得到均質多肽，接著將由此獲得的部分純化的材料(此活性800ATu/mg)按照下面c)和d)中所述的方法再進行兩次附加的層析純化c)凝血酶-瓊脂糖按照Lundblad(＊)所述的方法進一步純化市售的牛凝血酶(Sigma)。然后將其按照制選考推薦的方法吸附到活化的Sepharose CL 6B柱(Pharncacia)上。用50mM Tris-Hcl(PH8.3)平衡該柱(1.7mL)，并用得自DEAE-FPLC的凍干材料(在緩沖液中重新溶解)上柱。先用起始緩沖液，接著用含有3.0M Nacl的該緩沖液、最后用起始緩沖液三次洗柱，(每一種洗液均三倍于柱體積)。流速為0.3ml/分鐘，用25mMHcl中的10ml0.1M4-氨基苯甲脒洗脫結合的材料。合并活性部分，并在PD-10柱(Pharmacia)上在50mM Tris-Hcl(PH8.3)中交換緩沖液。
將用起始緩沖液洗柱洗脫的并仍具有抗凝血酶活性的未結合材料質上柱，直至所有的活性均被結合并層析分離之。
(＊)Lundtlad，R、L.，1971，Biochemistry，102501-2506。
d)RP-HPLC在c4vydac柱(4.6×250mm.5μ)經逆相高壓層析(RP-HPLC)對親和層析后獲得的物質進行最后的純化。用20mM磷酸鈉(PH7.5)作為第一洗脫液，然后改用50%的乙腈水溶液作洗脫液。于室溫下在45分鐘內用5-55%洗脫液B的線性梯度以1.0ml/分鐘的流速洗脫抗凝血酶多肽。所得的層析圖示于圖1中。
手工收集蛋白質峰(220nm處檢測)，真空濃縮后在同樣條件下再次層析。
在C4HPLC之后對純的抗凝血酶多肽進行蛋白質含量、氨基酸組成、N-末端序列、C-末端序列檢測并通過體外試驗(ATU/NIH試驗和“凝血酶時間”試驗)鑒定其活性。發現三個蛋白質峰均具有抗凝血酶活性。
對胰蛋白酶和V8蛋白酶消化所獲得的肽進行N-末端序列分析，可測定出圖1中被標為P1和P2的多肽的全部氨基酸序列。其序列在上面的(ⅰ)和(ⅱ)中給出。另一種多肽(P3)的部分氨基酸序列在上面的(ⅲ)中給出。
實施例2對吡啶乙基化(PE)的P1和P2進行胰蛋白酶消化并作出其肽圖譜a)還原/烷基化合并在凝血酶-瓊脂糖上經親和層析純化的活性部分(實施例1c)，并將PD-10柱上的緩沖液換成10mM Tris-Hcl(PH8.3)。將活性合并物(約50μg)在Speed-Vac離心機(Savant)上濃縮，然后在氮氣環境中用100μl在6M鹽酸胍/50mM Tris-Hcl(PH8.5)中的1%硫基乙醇溶液于暗處室溫下處理2小時。再加入4μl4-乙烯基-吡啶(純凈的)，并將混合物于同樣條件下再次保溫2小時。4首先在c4Vydac柱(4.6×250mm，5μm)上通過RP-HPLC從反應混合物中回收吡啶乙基化的多肽，其中用在0.1%TFA中的5-65%乙腈線性梯度以1.0ml/分鐘的流速洗脫90分鐘。在這些條件下，抗凝血酶多肽混合物各組分離較差，因此必須在實例1d所述的條件下使用磷酸鈉/乙腈洗脫系統在同一柱上再次層析。
b)對PE-P1和PE-P2進行胰蛋白酶消化和給制其肽圖譜。
在0.2M磷酸鈉存在下，用TPCK處理的胰蛋白酶(Sigma)在200μl1%碳酸氫銨(PH8.0)中的溶液消化己純化的PE-P1和PE-P2(分別為10和20μg)。按酶與底物的比率為1∶20(W/W)的量加入胰蛋白酶，于37℃保溫4小時。然后通過在Savant中冷凍干燥終止消化。
在μBondapak c18柱(3.9×300mm，10μ Waters)或C4-Vydac柱(4.6×250mm，5um)上分離經胰蛋白酶消化所獲得的肽，其中用線性梯度為5-65%的乙腈的0.1%TFA溶液的1.0ml/分鐘的流速洗脫60分鐘(圖2)。手工收集洗脫峰，在Savant中濃縮，然后在477A型脈沖液相序列分析儀(Applied Biosystems)上進行氨基酸分析和N-末端序列分析。
對胰蛋白酶消化的PE-P1(A)和PE-P2(B)進行C4-HPLC肽序列分析所得的結果如下片段 氨基酸序列A 1-13 VSYTDCTESGQNY14-26 CLCVGGNLCGGGK27-36 HCEMDGSGNK37-47 CVDGEGTPKPK37-47(＊) CVDGEGX*PKPK48-64 SQTEGDFEEIPDEDILNB 1-13 VSYTDCTESGQNY14-26 CLCVGSNVCGEGK27-47 NCQLSSSGNQCVHGEGX*PKPK48-64 SQTEGDFEEIPDEDILN
(＊)X為通過氨基酸序列分析未測出的殘基;x經氨基酸分析確定為T。
因此，P1和P2的完整氨基酸序列為P1Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Tyr Cys LeuCys Val Gly Gly Asn Leu Cys Gly Gly Gly Lys His Cys Glu MetAsp Gly Ser Gly Asn Lys Cys Val Asp Gly Glu Gly Thr Pro LysPro Lys Ser Gln Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp GluAsp Ile Leu AsnP2Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Tyr Cys LeuCys Val Gly Ser Asn Val Cys Gly Glu Gly Lys Asn Cys Gln LeuSer Ser Ser Gly Asn Gln Cys Val His Gly Glu Gly Thr Pro LysPro Lys Ser Gln Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp GluAsp Ile Leu Asn實施例3P2基因的化學合成基于大腸桿菌所優選的密碼子5，設計核苷酸編碼序列。而且，在非常靠近合成基因5′末端處加進-BalⅠ限制位點以便將該序列插入到不同的表達載體中，用實際上相同的合成基因在細菌和昆蟲細胞中表達重組P2蛋白。在使用昆蟲細胞的情況下，所使用的方法將以分泌產物或細胞質產物的形式產生蛋白質P2。
所有質粒DNA的操作均按Maniatis等人所述的方法進行。
用自動DNA合成儀(Applyied Biosystems)制備6個合成的互補寡核苷酸，其序列示于圖3中。在酶促磷酸化之后，使用DNA連接酶裝配這6個寡核苷酸，并將所產生的雙鏈序列插入到M13噬菌體載體mp18中，得到圖4所示的質粒M13-P2。為了使P2基因能夠插入M13載體，在合成的寡核苷酸中也加進了HindⅢ和PstⅠ位點。通過對單鏈噬菌體DNA進行序列分析(Sanger法)證實其具有正確的核苷酸序列。
重組質粒M13-P2為實施例中所用的所有表達載體提供了P2基因來源。
實施例4在大腸桿菌細胞中表達并從中分泌P2蛋白為了使重組產物向周質分泌，有必要合成前蛋白質形式的P2分子。更具體地說，負責有效分泌的稱為“前導肽”的氨基酸序列必須出現在P2的NH2末端8，9。而這一額外序列則在分泌過程中在體內被特定的大腸桿菌前導肽酶切除，產生正確的成熟序列10。
文獻中敘述過多種分泌系統11，12。我們選擇了基于以前公開的大腸桿菌外膜蛋白(OmpA)之分泌信號的系統。因此，我們設計了兩個編碼OnpA前導肽的附加互補寡核苷酸，它們的前面是已知負責促使RNA、有效轉譯的OmpA Shine-Dalgarno序列14。
如圖5所示，其序列中也包括了編碼前10個氨基酸的P2基因的起始部分。BalⅠ位點的存在使得該合成片段能夠與P2編碼序列的其余部分相連，而上游HindⅢ位點的存在則使得它能夠與M13載體相連。因此，可將合成的HindⅢ-BalⅠ片段與M13-P2的BalⅠ-BamHⅠ片段相連并插入至M13mp18中，從而得到新的質粒OMP-P2。圖5也圖解顯示了該新質粒的構建。
可從OMP-P2中切掉作為Hind Ⅲ-Ban HⅠ片段的P2基因，該片段編碼OmpA Shine-Dalgarno和前導肽以及其后的P2編碼序列。現在該限制片段準備插入到合適的表達載體中。從理論上講，可使用多種表達系統以在細菌中高水平地生產異源蛋白質。我們的實驗室過去曾成功地使用過基于Ptrp啟動子的表達系統14。即使在使用選擇的啟動子的情況下，給定多肽的表達水平同樣是不可預測的。
圖6所示的質粒PFC33已在文獻中提到14。它攜帶了氨芐青霉素抗性基因和細菌啟動子Ptrp，該啟動子驅使前脫脂蛋白A1的表達。在用HindⅢ和BamHⅠ消化pFC33之后，分離出攜帶抗生素抗性基因和啟動子的Hind ⅢBanHⅠ大片段，并將其連接到得自編碼P2基因之OMP-P2的Hind Ⅲ Ban H Ⅰ片段上。其構建的具體步驟示于圖6中。我們分離出新質粒pFC-P2，它是在大腸桿菌中生產P2的最終質粒。
本發明的目的之一是利用B型大腸桿菌來表達和向周質中分泌P2以及本發明的其它抗凝血酶多肽。事實上我們已發現，將質粒pFC-P2插入大腸桿菌B型菌株中能夠高水平地產生P2。令人感興趣的是，使用不同型的大腸桿菌菌株并不能同樣有效地表達，因此似乎宿主菌株的類型是成功生產水蛭素的關鍵。
可得到幾個B型大腸桿菌菌株并將其用于生產P2。優選的菌株是ATCC12407，ATCC11303，NCTC10537。下面是一個用質粒pFC-P2轉化菌株NDTC10537并在隨后培養該轉化株的實例。
利用Mandel和Higa15的氯化鈣法制備NCTC10537菌株的感受態細胞。用2μl質粒DNA(濃度約為5μg/ml)轉化約200μl濃度為1×109細胞/ml的這些細胞的制劑。在含有100μg/ml氨芐青霉素的L-瓊脂平板上篩選轉化株。用木牙鑒將兩個較小的菌落在含有相同抗生素的L-瓊脂上劃線(每條線約1cm長)。于37℃保溫12小時后，通過將劃線部分接種至10mlLB培養基(含有濃度為150μg/ml的氨芐青霉素)中并于37℃保溫連夜而試驗P2蛋白的產生。第二天將培養物按1∶100稀釋至M9培養基(含有相同濃度的氨芐青霉素)中，并于37℃保溫6小時。
將20ml該培養物于4℃以12000×g的轉速離心10分鐘。將細菌沉淀物重新懸浮于2ml33mM Tris-Hcl(pH8)中，然后加入等體積的第二溶液(33mMEDTA，40%蔗糖)，將整個混合物在溫和振蕩的條件下于37℃保溫10分鐘。離心后將有通透性的細胞重新懸浮于2ml冷水中并在冰中放置10分鐘。離心分離所得到的上清液，此即代表了細菌細胞的周質部分。
利用基于凝血酶對合成底物S-223816切割能力之抑制作用的生色檢測法，我們已在產生P2的細胞的周質部分中檢測到抗凝血酶活性，但未在對照的周質部分中檢測到這一活性。
利用類似的方法，我們也為P2構建出新的表達/分泌質粒，其中的PlPP/lac啟動子17代替了Ptrp啟動子。這一被稱為pCMP-P2的不同質粒示于圖7中。將該質粒插入B型大腸桿菌菌株中之后也得到了高水平的活性P2。我們使用了GHrayb等人17所述的質粒pIN-Ⅲ-OmpA3來作為構建pOMP-P2的起始質粒。有關培養以及用異丙基-β-D-硫代吡喃豐乳糖苷(IPTG)誘導表達的條件如以前所述17。
實施例5在昆蟲細胞中表達并從中分泌蛋白質P2為了從重組的昆蟲細胞中分泌出蛋白質p2，我們將p2編碼序列與能夠被這些細胞有效識別的前導肽相連接。我們使用了水泡性口腔炎病毒(VSV)G蛋白18的前導肽。與上文所述者相似，已制備出后面接有p2基因起始部分的編碼VSVG蛋白前導肽的合成DNA序列，圖8給出了其核苷酸序列，在此情況下，我們也提供了利于將其連接到P2基因的其余部分以及表達載體上的限制性位點(Hiad Ⅲ，BamH Ⅰ和BalⅠ)。
將合成的Hind Ⅲ-BalⅠ片段連接到得自M13-P2且攜帶P2基因的純化Bal Ⅰ-BamH Ⅰ片段上，并插入到已預先用Hind Ⅲ和BamHⅠ切割的M13mp18中。產生新質粒VSV-P2的這一構建過程示于圖9中。我們已從VSV-P2中切掉BamHⅠ-BamHⅠDNA片段，該片段攜帶已融合到VSV前導肽中的P2基因，然后將其插入至載體pAcYM119中(如圖10所示)。所產生的質粒被稱作pAc-p2。
為了在昆蟲細胞中表達，必須將VSV-P2編碼序列轉移到位于多角體啟動子轉錄控制之下的桿狀病毒基因組中。為此，我們用野生型桿狀病毒DNA和轉移載體pAc-P2對昆蟲細胞進行了共轉染。對于昆蟲細胞，我們選擇草地粘蟲細胞作為宿主細胞。詳細實驗過程如下利用經過改進的Summers等20所述的方法，用感染性AcNPVDNA以及代表單個重組轉移載體的質粒DNA的混合物轉染草地粘蟲細胞。將1μg病毒DNA與25-100μg質粒DNA混合，并在20mMHEPES緩沖液(PH7.5)、1mM正磷酸氫二鈉、5mM氯化鉀、140mM氯化鈉和10mM葡萄糖(總體積1ml)存在下用終濃度為0.125M的氯化鈉沉淀之。
在35mm組織培養皿中將DNA懸液接種到106個草地粘蟲細胞的單層上，于室溫下1小時吸附到細胞上。然后更換1ml培養基。于28℃保溫3天后，收獲上清液，并用于在草地粘蟲細胞單層中產生噬斑。根據用光學顯微鏡檢測時無多角體存在而鑒定出含有重組病毒的噬斑，自這些噬斑中回收病毒，進一步純化噬斑后將其用于生產多角體陰性病毒原種。
利用上述方法可分離出一種重組桿狀病毒，其基因組中攜帶了處于多角體啟動子和VSVG蛋白前導肽控制之下的P2基因。我們利用這一病毒按照已知方法20感染草地粘蟲，復感染數為10。然后按照已公開的方法20，在10%胎牛血清存在下以旋轉培養中或單層方式培養感染的細胞。在這兩種情況下，利用S-2238生色檢測法在感染細胞的培養物上清液中均檢測到抗凝血酶活性。
實施例6在昆蟲細胞的胞質中表達蛋白質P2也可在草地粘蟲細胞的細胞質中產生和積累蛋白質P2。由于這一方法利用了作為非分泌性病毒蛋白質的多角體的表達信號，因此一般具有較好的異源蛋白質產率。
我們用以獲得大量重組蛋白質P2的方法是基于一融合多肽的表達，其中多角體的前18個氨基酸與P2的64個氨基酸相連。多角體NH2末端的存在使得表達能高水平進行21。另外，我們在多角體部分與P2序列之間加進了一個甲硫氨酸殘基，它使得在用CNBr處理雜合蛋白時能夠釋放出P2部分。
與前述方法相似，我們制備了一個能夠使Bal Ⅰ-BamH Ⅰ片段(得自M13-P2)與合適的轉移載體相連的合適DNA片段。圖11所示的該新的合成片段也包括了便于繼后操作的BamHⅠ和BalⅠ位點。
已獲得一種不同的轉移載體pAcFT1，它攜帶了編碼多角體前18個氨基酸的核苷酸序列(圖12)。簡單地說，pAcYM119的EcoRV-BamHⅠ片段已被含有自核苷酸-92至核苷酸+55之間的多角體基因序列的合成寡核苷酸所取代。該序列之后有一個方便的BamHⅠ位點，并可按照圖13所示的方案將其用于插入完整的P2編碼序列。通過這一構建過程，我們得到了一個新的質粒pAcFT1-P2，用它將雜合基因轉移到桿狀病毒基因組中。
按照實施例5所述的方法得到重組桿狀病毒。按照常規方法20感染草地粘蟲細胞。培養感染的昆蟲細胞導致融合蛋白在細胞質中的積累。該雜合蛋白是重組蛋白P2的來源。可按文獻中公開的幾種方法用CNBr切割該雜合蛋白22，23。應用Olson等23所述的方法可得到正確的P2多肽序列。該分子顯示出抗凝血酶活性。
實施例7為了獲得P2蛋白的Tyr61變體，用下列寡核苷酸取代上面實施例3中所述及圖3中所示的寡核苷酸5和6
oligo 5-Tyr5'CGAAATCTCAGACTGAAGGTGACTTCGAAGAAATTCCGGACGAATACATCCTGAACTAGTAACTGCA 3'oligo 6-Tyr5'-GTTACTAGTTCAGGATGTATTCGTCCGGAATTTCTTCGAAGTCACCTTCA 3'在寡核苷酸5-Tyr中，下面劃線的TAC三聯密碼子編碼酪氨酸，它取代了原來存在的編碼天冬氨酸的GAC三聯密碼子。寡核苷酸6-Tyr已被相應地校正以在兩條鏈之間獲得完全的互補性。在昆蟲細胞或大腸桿菌中表達和/或分泌變體的繼后步驟與實施例4-6中所述者相同。
實施例8為了得到P2蛋白的甘氨酸加長衍生物，用下示寡核苷酸序列取代上面實施例3中所述且示于圖3中的寡核苷酸5和6寡核苷酸5-Gly5'CGAAATCTCAGACTGAAGGTGACTTCGAAGAAATTCCGGACGAAGACATCCTGAAC-GGTTAGTAACTGCA 3'寡核苷酸6-Gly5' GTTACTAACCGTTCAGGATGTCTTCGTCCGGAATTTCTTCGAAGTCACCTTCA 3'在寡核苷酸5-Gly中，下面劃線且編碼甘氨酸的三聯密碼子GGT被插入終止密碼子之前。為了在兩條鏈之間獲得完全的互補性，對寡核苷酸6-Gly進行了相應的校正。以后的在昆蟲細胞或大腸桿菌中表達和/或分泌Gly加長衍生物的步驟與實施例4-6中所述者相同。
實施例9P1和P2的cDNA克隆(a)按照Cathala等人的方法24，由水蛭Hirudinaria manillensis頭制備出總RNA。
(b)按如下方法完成逆轉錄反應在冰上分別裝入10μg得自水蛭頭的總RNA、1μgdT17連接子引物、8μl5mMdnTP混合物、8μlAMV緩沖液(5x)，并加水至40μl，混合后將所得混合物于65℃加熱2分鐘，然后在冰上淬火。加入10單位核糖核酸酶(RNAsin)(Promega)和20單位的AMV逆轉錄酶(Bochringer Mannheim)于42℃保溫2小時。然后用苯酸氯仿萃取反應混合物。並用異丙醇沉淀。
(c)然后進行聚合酶鏈反應(PCR)。每次PCR反應的一般程序是將下列PCR反應混合物于95℃變性5分鐘5μl逆轉錄RNA，10μl10xPCR緩沖液(Cetus/Perkin Elmer)，16μl脫氧三磷酸核苷(dNTPs)混合物每種dNTP各125mM)2μlMgcl2(0.1M)，各25-500微微摩爾(pmole)引物。
加水至100μl;
然后加入215單位Tag聚合酶(Cetus/Perkin-Elmer)，并用80μl的礦物油敷蓋。反應在Cetus/Perkin-Elmer DNA熱循環器中反復進行。
循環方案為3分鐘 94℃2分鐘 60℃2分30秒 72℃ 循環1次1分鐘 94℃2分鐘 60℃3分30秒 72℃ 循環30次1分鐘 94℃2分鐘 60℃5分鐘 72℃ 循環1次7分鐘 72℃放置于 25℃殘余的Tag聚合物用苯酸-氯仿滅活，并用乙醇沉淀;樣品于-20℃保存。為了獲得P1和P2cDNA的完整序列，進行三輪PCR擴增。下面顯示了每一引物的序列。經改變個別核苷酸在寡核苷酸序列中引入簡并性的位置在引物序列下示出(N表示所有四種核苷酸均可利用)。劃線顯示為有助于擴增產物克隆而加入的限制位點。
dT17連接子引物
5' GAC TCG AGT CGA CAT CGA TTT TTT TTT TTT TTT TT 3'XhoI SalI連接子引物5' GAC TCG AGT CGA CAT CG 3'XhoI SalI引物3-85' ATC GAA GCT TTA TAC CGA TTG TAC NGA 3'HindIII C A C CT引物52-565' CTA AGG ATC CTT CTT CGA AGT CNC C 3'BamHI C A A引物32-375' ATC GGA ATT CAG TTC TGG AAA TCA GTG CGT 3'EcoRI引物5′Ⅰ
5' CTA AGA ATT CTT CGC AAC TTA TAT GCG TT 3'EcoRI引物5′Ⅱ5' ATC GGA ATT CTT AAT TCA ATA TAT CTT CAT 3'EcoRI第一輪擴增用500mole跨越P2氨基酸序列3-8位及56-52位殘基的完全變性的引物作為PCR反應的反相引物。
cDNA3′末端的擴增(RACE方法)，參見Frohman等人的文章25根據第一輪擴增中測定的P2核苷酸序列，設計出從第32至37位殘基的基因特異性引物。將該引物與dT連接子引物一起用于擴增cDNA(圖14)。
cDNA5′末端的擴增(RAcE方法)，參見Frohmen等人的文章25。
參照以前描述的方法對得自水蛭頭的10μg總RNA進行反轉錄，不同的是用1μg基因特異性引物(5′Ⅰ)取代dT17連接子引物(參見圖15)。然后用異丙醇沉淀反應混合物，并按以下用量用末端脫氧核苷轉移酶(TdT)使第一鏈cDNA產物的5′-末端多聚腺苷酸化22μlcDNA1μl6mMdATP
6μl5×TdT緩沖液(BRL)1.1μlTdT(BRL)將樣品于37℃保溫10分鐘，然后于65℃加熱16分鐘。然后用蒸餾水將反應混合物稀釋至500μl。
利用10pmole dT17連接子引物、25pmole連接子引物和25pmole位于第一基因特異性引物上游用于轉錄的第二基因特異性引物(5′Ⅱ，圖15)，擴增10μl多聚腺苷酸化的產物。
d)PCR產物的分析在各引物的限制性位點處切割擴增的產物。對消化產物進行凝膠純化，并亞克隆到已用同樣的限制酶預先消化過的puc13載體中。用限制性酶切分析法鑒定攜帶有用插入子的質粒。按照制造商推薦的方法，用序列酶〔Seguenase(USB)〕對質粒DNA進行序列分析。如此獲得的P1和P2的cDNA序列以及由之推測的氨基酸序列如下。前導序列以下面劃線標示。
P1 cDNAtca aaa ATG TTC TCT CTC AAG TTG TTC GTT GTC TTC CTG GCT GTTMet Phe Ser Leu Lys Leu Phe Val Val Phe Leu Ala ValTGC ATC TGC GTG TCT CAA GCA GTG AGC TAC ACT GAT TGT ACG GAACys Ile Cys Val Ser Gln Ala Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr GluTCA GGC CAG AAT TAT TGT CTA TGC GTG GGA GGT AAT CTC TGC GGTSer Gly Gln Asn Tyr Cys Leu Cys Val Gly Gly Asn Leu Cys GlyGGA GGC AAA CAT TGT GAA ATG GAC GGT TCT GGA AAT AAA TGC GTCGly Gly Lys His Cys Glu Met Asp Gly Ser Gly Asn Lys Cys ValGAT GGG GAA GGT ACT CCG AAG CCT AAG AGC CAG ACT GAA GGC GATAsp Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Lys Ser Gln Thr Glu Gly AspTTC GAA GAA ATC CCA GAT GAA GAT ATA TTG AAT TAAPhe Glu Glu Ile Pro Asp Glu Asp Ile Leu Asn End
P2 cDNAaaa ATG TTC TCT CTC AAG TTG TTC GTT GTC TTC CTG GCT GTT TGCMet Phe Ser Leu Lys Leu Phe Val Val Phe Leu Ala Val CysATC TGC GTG TCT CAA GCA GTG AGC TAC ACT GAT TGT ACG GAA TCAIle Cys Val Ser Gln Ala Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu SerGGT CAG AAT TAT TGT CTA TGC GTG GGA AGT AAT GTC TGC GGT GGAGly Gln Asn Tyr Cys Leu Cys Val Gly Ser Asn Val Cys Gly GluGGC AAA AAT TGT CAA CTG AGC AGT TCT GGA AAT CAG TGC GTC CATGly Lys Asn Cys Gln Leu Ser Ser Ser Gly Asn Gln Cys Val HisGGG GAA GGT ACT CCG AAG CCT AAG AGC CAG ACT GAA GGC GAT TTCGly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Lys Ser Gln Thr Glu Gly Asp PheGAA GAA ATC CCA GAT GAA GAT ATA TTG AAT TAA cgaacgcatataagtGlu Glu Ile Pro Asp Glu Asp Ile Leu Asn EndtgcgaataattctgattttaagacattcccatcgcagctatggctatttacagtatattattataaataaagaattgaacgtttacgttgattgtaReferences1)Markwardt，F.1970，Methods in Enzymology，19，p.9242)Markwardt，F.1985，Biomed.Biochim.Acta.44，p.10073)Markwardt，F.Hauptmann，J.，Nowak，G.，Klessen，C.，and Walsmann，P.1982.Thromb.Haemostasis 47，p.226.
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1.一種制備包括如下氨基酸序列的多肽及其藥用鹽的方法(i)P1Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Tyr Cys Leu1 5 10 15Cys Val Gly Gly Asn Leu Cys Gly Gly Gly Lys His Cys Glu Met20 25 30Asp Gly Ser Gly Asn Lys Cys Val Asp Gly Glu Gly Thr Pro Lys35 40 45Pro Lys Ser Gln Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Glu50 55 60Yaa Ile Leu Asn Zaa；65(ii)P2Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Tyr Cys Leu1 5 10 15Cys Val Gly Ser Asn Val Cys Gly Glu Gly Lys Asn Cys Gln Leu20 25 30Ser Ser Ser Gly Asn Gln Cys Val His Gly Glu Gly Thr Pro Lys35 40 45Pro Lys Ser Gln Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Glu50 55 60Yaa Ile Leu Asn Zaa；or(iii)P3Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Tyr Cys Leu1 5 10 15Cys Val Gly Ser Asn Val Cys Gly Glu Gly Lys Asn Cys Gln Leu20 25 30Ser Ser Ser Gly Asn Gln Cys Val His Gly Glu Gly；35 40其中Yaa為Asp或Tyr，Zaa為-oH、-NH2或Gty-oH，該方法包括A)-在使多肽表達的條件下提供-宿主，該宿主被包括編碼所說多肽之DNA序列的表達載體轉化；和-分離由此獲得的多肽或其藥用鹽；或B)-用化學方法合成所說的多肽；和-分離由此獲得的多肽或其藥用鹽。
2.根據權利要求1所述的方法，其中方法A)中的宿主是細菌、酵母、哺乳動物細胞系、昆蟲細胞系或動物。
3.根據權利要求1所述的方法，其中方法A)中的宿主是B型大腸桿菌菌株或草地粘蟲(Spodoptera frugiperda)細胞系。
4.根據權利要求1所述的方法，其中方法B)中的多肽是以固相合成法合成的。
5.根據權利要求1所述的方法，其中多肽具有權利要求1所示的任何一種氨基酸序列，且各序列前均帶有Met殘基。
6.根據權利要求1所述的方法，其中多肽具有權利要求1所示的任何一種氨基酸序列，且前面均接有全部或部分前導肽。
7.根據權利要求1所述的方法，其中多肽具有權利要求1所示的任何一種氨基酸序列，且前面接有全部或部分下示前導肽序列Met Phe Ser Leu Lys Leu Phe Val Val Phe Leu Ala Val Cys Ile Cys Val Ser Gln Ala.
8.根據權利要求1所述的方法，其中多肽為一融合蛋白，其中權利要求1所示的任一氨基酸序列與一載體序列相融合。
9.一種制備權利要求1所限定的多肽或其藥用鹽的方法，該多肽具有氨基酸序列(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)，其中Yaa代表Asp，Zaa代表-OH，該方法包括從水蛭Hirudinaria manillensis的組織或分泌物中分離所說的多肽或其藥用鹽。
10.一種制備藥用組合物的方法，其特征在于將權利要求1限定的多肽與合適的藥用載體和/或稀釋劑相混合。
11.一種表達載體，它包括編碼權利要求1和5-8中任一項限定之多肽的DNA序列。
12.根據權利要求11所述的載體，其為質粒。
13.根據權利要求11所述的載體，其為病毒。
14.根據權利要求13所述的載體，其為病毒為重組桿狀病毒，其中多角體啟動子可操縱地連接到所說的DNA序列上。
15.根據權利要求11-14中任一項所述的載體，其中所說的DNA序列進一步編碼一前導肽，該前導肽能夠指導該多肽自表達該多肽的細胞中分泌。
16.根據權利要求11-15中任一項所述的載體，其中所說的DNA序列編碼一種融合蛋白，它能夠被切割而釋放出多肽。
17.一種被權利要求11-16中任一項的相容性表達載體轉化的宿主。
18.根據權利要求17的宿主，其為細菌、酵母、哺乳動物細胞系、昆蟲細胞系或動物。
19.根據權利要求18的宿主，其為B型大腸桿菌菌株或草地粘蟲(Spodoptera frugiperda)細胞系。
20.編碼權利要求1和5-8中任一項所限定的多肽的DNA序列。
21.根據權利要求20所述的DNA序列，其為合成的DNA序列。
22.根據權利要求20所述的DNA序列，其為cDNA。
23.根據權利要求20-22中任一項所述的DNA序列，它進一步編碼-前導肽，該前導肽能夠指導所說的多肽從表達該多肽的細胞中分泌。
24.根據權利要求20-23中任一項所述的DNA序列，它編碼一融合蛋白，該融合蛋白能夠被切割而釋放所說的多肽。
25.一種制備權利要求1和5-8中任一項所限定之多肽能夠在其中表達之宿主的方法，該方法包括用根據權利要求11-16中任一項的相容性表達載體轉化宿主。
26.根據權利要求25所述的方法，其中所說的表達載體按如下方法制備(a)用化學方法合成編碼該多肽的DNA序列;(b)將該DNA序列插入表達載體。
27.根據權利要求25所述的方法，其中所述的表達載體按以下方法制備(a)從水蛭Hirudinaria manillensis的mRNA產生并分離編碼所說多肽的cDNA;以及(b)將分離的cDNA插入表達載體中。
28.根據權利要求20所述的DNA序列，它基本上由下列序
29.根據權利要求20所述的DNA序列，它基本上要由下列序列組成
30.根據權利要求20所述的DNA序列，它基本上由下列序列組成
31.根據權利要求29或30所述的DNA序列，其中所列的序列緊接在以下序列之后
全文摘要
本發明涉及制備自水蛭Hirudinaria manillensis中分離的抗凝血酶多肽的方法。該抗凝血酶多肽可自水蛭Hirudinaria manillensis的組織或分泌物中分離，也可用重組DNA方法合成。
文檔編號C07K14/145GK1066272SQ9210114
公開日1992年11月18日 申請日期1992年2月27日 優先權日1991年2月28日
發明者P·瑟米恩托斯, P·D·T·督伯特, G·尼狄, E·薩徹里 申請人:法米塔利亞·卡洛·埃巴有限責任公司