專利名稱：叔丁氧羰基-l-酪氨酰-肽聚糖單體及其125i-標(biāo)記的衍生物，其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖單體及其125I-標(biāo)記的衍生物，還涉及其制備方法以及本發(fā)明新化合物在藥學(xué)上的應(yīng)用。已證明叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖單體在藥學(xué)上尤其具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤的作用，而新的125I-標(biāo)記的衍生物顯示出抗PGM抗體結(jié)合作用。
已發(fā)現(xiàn)，作為叉開短桿菌細(xì)胞壁肽聚糖最小重復(fù)單元的肽聚糖單體(PGM，GlcNAc-β-(1-4)-MurNAc-L-Ala-D-iGln〔(L)-meso-Azpm-(D)-amide-(L)-D-Ala-D-Ala〕)具有免疫刺激、抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移作用(Tomasic，J.and Hrsak，I.(1988)，peptidoglycan monomer originating from Breviacterium divarccatum-its metafalism amd fvological actiuities in the host，inSurface Structuie of Microorganisms and Their Interaction with the Mammalian Host(Schuinner，E，Richhmond，M.H.，Seibert，G and Schwartz，U.，Eds.)，p113-121，VCH Verlagsge-sellschabt，Weinheim)。
也已知道，在氨基酸滿足下列條件的情況下可形成肽鍵a)首先通過加入所謂的保護(hù)基將其轉(zhuǎn)化為N-保護(hù)的氨基酸，b)在羧基上被活化，c)與C-末端被保護(hù)的氨基酸、二、三或多肽發(fā)生反應(yīng)，及d)通過特定的反應(yīng)小心地除去所得的二、三或多肽上的保護(hù)基(Houben-Weyl，Methoden der organischen Chemie，4.Auflage，herausgegeben Von Egon Muller，Synthese Von Peptidon Ⅰ und Ⅱ，Bd 1511 und 1512，Georg Thieme Verlag，Stuttgart 1974)。
而且，在具有很復(fù)雜結(jié)構(gòu)的多官能團(tuán)分子，如由二糖戊肽(糖和肽殘基)組成的肽聚糖單體中，還必須a)保護(hù)GlcNAC和MurNAC(分子的糖部分)上的羥基，及b)在形成肽鍵的反應(yīng)完成之后脫去糖基上的保護(hù)基。
并且還知道，將酪氨酸插入肽或蛋白質(zhì)的常規(guī)方法是“活性酯法”，其中Boc-L-Tyr-ONSu是?；煞?Assoian，R.R.(1980)Anal.Biochem，103，70)。
對潛在的具有免疫刺激作用和抗腫瘤活性的新物質(zhì)的不斷增長的需求導(dǎo)致了本發(fā)明的構(gòu)思。它涉及的是式Ⅰ的叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖單體(Boc-Tyr-PGM)新物質(zhì)及其125I-標(biāo)記的衍生物。
新的肽聚糖單體(Ⅰ)有可能提供一種親脂性得到提高的化合物，它使得該物質(zhì)易于透過細(xì)胞壁并延長其在生物體內(nèi)的殘留時間。這一效果是通過向PGM分子中加進(jìn)一個天然芳香族氨基酸酪氨酸而獲得的。在加入酪氨酸之后，由二糖戊肽得到了二糖己肽(Boc-Tyr-PGM)，再用放射性125I標(biāo)記后就得到了其衍生物在制備新的肽聚糖單體衍生物的方法方面，所使用的是肽化學(xué)領(lǐng)域的已知方法;但在合成過程中，首次使用了完全未被保護(hù)的具有非常復(fù)雜結(jié)構(gòu)的分子。
制備本發(fā)明新的PGM衍生物的方法可用下面的反應(yīng)路線表示
按照本發(fā)明，是在三乙胺存在下將Boc-Tyr-ONSu與PGM分子中內(nèi)消旋二氨基庚二酸上的ω-氨基進(jìn)行區(qū)域選擇性反應(yīng)，產(chǎn)生新的二糖-己肽衍生物，然后首先在Sephadex G-25柱、接著在硅膠柱上通過凝膠層析分離，最后通過在Biogel p-2上進(jìn)行凝膠層析完全純化并用于生物研究。
Boc-Tyr-PGM的放射性碘標(biāo)記可用標(biāo)準(zhǔn)的T氯胺法(Bolton，AA.E.(1985)，inRadioiodination Techniques，Second Edition，p109，Amersham lnt.plc.englond)完成。
通過在酪氨酸羥基的鄰位上進(jìn)行苯酚環(huán)的親電子取代反應(yīng)，可獲得具有高比活性和足夠的放射化學(xué)穩(wěn)定性的125I-標(biāo)記的分子。
以下反應(yīng)路線代表了制備方法，
按照本發(fā)明，放射性碘標(biāo)記的Boc-Tyr-PGM的合成是通過標(biāo)準(zhǔn)的T氯胺法利用Na〔125I〕來完成，得到碘化的產(chǎn)物Ⅱ，然后通過在Sephadex G25柱上的凝膠層析分離，并用于抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)的檢查。
新的PGM衍生物二糖己肽可用在具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性的藥物中，而新的125I-標(biāo)記的衍生物可用在具有抗PGM抗體結(jié)合作用的藥物中。
下面通過實(shí)施例說明本發(fā)明實(shí)施例1叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖單體(Ⅰ)在加入三乙胺(30μl)的情況下，將肽聚糖單體(PGM，100mg，0.1mmol)溶于無水二甲基甲酰胺(DMF，2.6ml)。然后在攪拌下，將固體Boc-Tyr-ONSu(56mg，0.12mmol)分批加至(冰-水)冷卻的溶液中。于室溫反應(yīng)16小時，然后利用機(jī)械泵產(chǎn)生的真空蒸發(fā)DMF。將粘稠的漿狀蒸發(fā)殘?jiān)苡谒霉腆w檸檬酸酸化至pH3，并用乙酸乙酯(3×10ml)萃取。將水溶性部分濃縮至2ml，并裝入水中的Sephadex G-25柱(90×2.5cm)上。通過230nm處的吸收分析各級分(3ml)，并合并和蒸發(fā)對應(yīng)于高分子量化合物的級分。將所得玻璃狀殘?jiān)?110mg)溶于正丁醇、乙醇、NH3(25%)和水(5∶3∶2∶2)的混合物中，并利用相同的洗脫液在硅膠柱上層析，用HOAC中和并蒸發(fā)后得到產(chǎn)物，最后通過Biogel P-2柱(70×2.5cm)上的凝膠層析純化(用水洗脫)。合并流動性最強(qiáng)的組分，濃縮并凍干。得到58mg(46%)純的Boc-Tyr-PGM(Ⅰ).
氨基酸分析GlcNH20.82;MurNH20.57;Ala，3;
Glu，1;A2pm 0.98;Tyr，0.80。
1H-NMR譜(D2O)1.29(s，Me3C)，1.34-1.70(m，partial overlapping with Me3C，21 H，3x Me-Ala+lactoyl-Me)，1.89 and 1.98(2s，6H，2x NAc)，6.77 and 7.07(2d，2H each，IH，H8.55Hz，-C6H4-).
薄層層析正丁醇-乙醇-NH3(25%)-水(5∶3∶2∶2)，用碘蒸氣和肽反應(yīng)物檢測，Rf＝0.5。
實(shí)施例Ⅱ叔丁氧羰基-〔125I〕-L-酪氨酰-肽聚糖單體(Ⅱ)向Boc-Tyr-PGM(5μg)的磷酸鹽緩沖液(25μ，0.5M，pH7.5)溶液中加入Na〔125I〕(10μl，3.7×10βq，1mci)和氯胺T(50μg)的磷酸鹽緩沖液(25μl，0.25M，pH7.5)。45秒鐘后，加入焦亞硫酸鈉(50μg)的25μl水溶液以終止反應(yīng)。然后將反應(yīng)混合物裝入預(yù)先用人白蛋白溶液洗過并用0.025M磷酸鹽緩沖液(pH7.5)(它也用于洗脫)平衡過的Sephadex G-25柱(30×1.5cm)上。取2ml各級分樣品測試放射性，并合并對應(yīng)于Boc-〔125I〕-L-Tyr-PGM的級分。所得衍生物Ⅱ的比活性約3.12MBq/μg(0.087mCi/μg)。
實(shí)施例Ⅲ叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖單體(Boc-Tyr-PGM)的免疫刺激活性在綿羊紅細(xì)胞(綿羊紅血細(xì)胞，SRBC)免疫過的小鼠中測試Boc-Tyr-PGM的免疫刺激活性。
通過腹膜注射，用綿羊紅細(xì)胞(1×108SRBC)的Hank氏溶液免疫每組5只的小鼠(CBA或AKR)。第二天(+1天)，通過靜脈注射僅給對照小鼠服用Hank氏溶液，而試驗(yàn)小鼠則通過靜脈注射服用200μg Boc-Tyr-PGM的Hank氏溶液;用作陽性對照的一組小鼠則通過靜脈注射服用200μg肽聚糖單體(PGM)的Hank氏溶液。四天后(+4天)，利用Gerne的技術(shù)(Jerne，N.K.Nordin，A.A.，and Henry，C.(1963)，The agar plaqul techniqul porrecognizcing antibody producing cells;in“Cell Bound Antibodies”，p109，Wistar Institute Press，Philadalphia)，測定脾中抗體形成細(xì)胞(噬斑形成細(xì)胞，PFC)的數(shù)目。
試驗(yàn)結(jié)果列于表1
Boc-Tyr-PGM證實(shí)了兩個鼠系中的免疫刺激(輔助)活性，測得的PFC數(shù)與對照組相比提高約50%。兩個試驗(yàn)中Boc-Tyr-PGM的效力均可與陽性對照(即肽聚糖單體)的效力相比。
實(shí)施例Ⅳ叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖單體(Boc-Tyr-PGM)的抗腫瘤(抗轉(zhuǎn)移)活性對Boc-Tyr-PGM的抗腫瘤活性的研究是在接種了黑素瘤B-16的小鼠中進(jìn)行。
在0天，給每組5只的每只小鼠(C57BL/6，雄性，4月齡)靜脈注射1×105個黑素瘤細(xì)胞。
選擇其中一組作為對照，不經(jīng)任何其它處理。
按照以下方案對實(shí)驗(yàn)組的每只小鼠靜脈注射1mg BOC-Tyr-PGM第1組-第3天第2組-第7天第3組-第3天和第7天(共2mg Boc-Tyr-PGM)而選擇對照的三組小鼠則按同樣方案靜脈內(nèi)接受PGM(PLIVA)。
于第23天處死小鼠后對肉眼可測的肺轉(zhuǎn)移瘤進(jìn)行計數(shù)，所得結(jié)果列于表Ⅱ。
用Boc-Tyr-PGM進(jìn)行處理引起抗轉(zhuǎn)移作用，導(dǎo)致所有處理小鼠組中轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目的減少(抑制率為37.8%-43.6%)。在不同時間(第3天或第7天)用不同總劑量(第3天和第7天各接受1mg或第3天和第7天共接受2mg)處理的小鼠中未觀察到明顯的抑制差別。
Boc-Tyr-PGM的效果可與用作陽性對照的PGM(PLIVA)的效果相比。
權(quán)利要求
1.下式的叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖單體及其125I-標(biāo)記的衍生物(125I-Boc-Tyr-PGM)
2.一種制備權(quán)利要求1的式(Ⅰ)叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖單體的方法，其特征在于將叔丁氧羰基-L-酪氨酰-N-羥基琥珀酰亞胺基酯在三乙胺存在下與未保護(hù)的肽聚糖單體縮合，然后將所得的叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖單體(Boc-Tyr-PGM)先在Sephadex G-25上通過凝膠層析、接著在硅膠柱上通過柱層析以及在Biogel p-2上通過層析分離。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于通過加入Na〔125I〕和氯胺T用125I標(biāo)記Boc-Tyr-PGM，并在加入亞硫酸鈉終止反應(yīng)后，在Sephadex G-25柱上分離產(chǎn)物(用磷酸鹽緩沖液洗脫)。
4.叔丁羰基-L-酪氨酰-肽聚糖單體作為藥物的應(yīng)用。
5.叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖單體作為具有免疫刺激作用的藥物的應(yīng)用。
6.叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖單體作為具有抗腫瘤活性的藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的叔丁氧羰基-L-酪氨酰-肽聚糖單體及其
文檔編號C07K1/14GK1062735SQ9111172
公開日1992年7月15日 申請日期1991年12月21日 優(yōu)先權(quán)日1990年12月21日
發(fā)明者朱德吉卡·節(jié)法考維克, B·弗拉尼斯, J·托馬塞為克, I·核薩克, B·拉德斯克 申請人:普利瓦藥物、化學(xué)、食品和化妝品工業(yè)公司