細胞激動素合成抑制因子、其拮抗物及其使用方法

專利名稱：細胞激動素合成抑制因子、其拮抗物及其使用方法
技術領域：
本發明一般涉及治療與免疫系統不平衡、尤其是包括體液和細胞免疫反應不平衡的疾病的方法和組合物。本發明還包括能夠調節包含于免疫系統中的某些細胞激動素的合成的蛋白質及其拮抗物，以獲得治療效果。
對抗原的免疫反應可分為以細胞免疫為主的，其實例為遲發型過敏性(DTH)現象，或以體液免疫為主的，其實例為產生抗體。細胞免疫性對于瘤的抑制以及對于從許多病毒、細菌、原蟲以及真菌感染中恢復是最重要的。然而，體液免疫反應對從循環中消除毒素和侵入的生物體是最有效的免疫形式。已發現，對不同抗原，這兩種反應的一種或另一種經常以相互排斥的狀態占優勢，還發現某些疾病例如麻風、利什曼原蟲病和某些形式的自身免疫的嚴重性可能起因于一種反應不適當地比另一種反應占優勢，參見Mosmann等，Immunol.Today，第8卷，第223-227頁(1987);Mosmann等，Ann.Rev.Immunol.，第7卷，第145-173頁(1989);Parish，Transplant.Rev.第13卷，第35-66頁(1972);以及Liew，Immunol.Today，第10卷，第40-45頁(1989)。還發現，細胞激動素組分別與DTH反應和體液免疫反應有關，參見Cher等，J.Immounol.，第138卷，第3688-3694頁(1987);以及Mosmann等(1987和1989，如上所引述)，據認為與這些種類的反應有關的疾病是由有關的細胞激動素組的不適當生產引起的。
例如，大量事實表明r干擾素(IFN-r)的過量產生會引起與主要組織相容性復合體(MHC)有關的自身免疫疾病參見Hooks等，NewEnglandJ.Med.，第301卷，第5-8頁(1979)，(與自身免疫性有關的IFN-r的血清含量提高)Basham等，J.Immunol.，第130卷，第1492-1494頁(1983)(IFN-r會增加MHC基因產物的表達;Battazzo等，Lancet，第1115-1119頁(11/12/83)(與某些形式的自身免疫性有關的異常MHC基因產物的表達);Hooks等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，第301卷，第21-32頁(1980)(與SLE患者的疾病的較高嚴重性有關的較高IFN-r含量，干擾素的組胺釋放增強的活性可被抗干擾素血清抑制);以及Iwatani等，J.ClinEndocrin.andMetabol.，第63卷，第695-708頁(1986)(抗IFN-r單克隆抗體消除了白細胞凝集素激發的T細胞誘導HLA-DR表達的能力)。假定過量IFN-r引起MHC基因產物的不適當表達，該基因產物本身又引起對組織的自身免疫反應，組織的細胞不適當地表達MHC產物并在該產物的范圍內顯示自身抗原。
在臨床寄生物學領域中最近觀察到，IFN-r和IL-2含量是原蟲感染即利什曼原蟲病的增進和/或消退的重要因素。尤其是，足夠含量的IFN-r的存在對活化感染的巨噬細胞以消除細胞內的無鞭毛體看來是必須的，參見Mauel和Behin，Cohen等編輯的ImmunologyofParasiticInfections(Blackwell，London，1982)。此外，在疾病的鼠模型中發現，IFN-r的高含量和IL-4的低含量伴隨著消退，而IFN-r的低含量和IL-4的高含量伴隨著利什曼原蟲病的增進，參見Heinzel等，J.Exp.Med.，第169卷，第59-72頁(1989)。
由上述可以看出，按照療法要求，分別獲得能把一種免疫反應的優勢轉移到另一種上去，特別是能抑制或增強IFN-r和/或其它細胞激動素的合成的藥劑是有利的。這些藥劑特別有助于治療伴隨不適當或不充份免疫反應的疾病，比如組織排斥、利什曼原蟲病和其它寄生性疾病，以及MHC伴隨的免疫紊亂，包括風濕性關節炎、全身紅斑性狼瘡(SLE)、重癥肌無力、依賴于胰島素的糖尿病、甲狀腺炎等等。
本發明的目的是提供哺乳動物細胞激動素合成抑制因子(CSIF)、CSIF的類似物、CSIF肽、以及CSIF拮抗物。它包括顯示CSIF活性的多肽的核酸編碼、以及多肽本身、其激動劑的和/或拮抗物的類似物、其制備方法、以及使用它們治療伴隨細胞激動素不平衡的疾病，尤其是導致不適當免疫反應的一類疾病的方法。本發明還包括單獨地或作為疫苗助劑使用CSIF或其拮抗物分別有選擇地導致細胞免疫反應占優勢或體液免疫反應占優勢。較好的是，CSIF的拮抗物來源于能夠妨礙CSIF生物活性的單克隆抗體。本發明的核酸被以下兩點所限定(1)它們對這里所述的克隆互補DNA(cDNA)序列的同系性，或它們對具有這里所述的克隆互補DNA(cDNA)序列形成可檢測的雜種的能力，以及(2)施加于用核酸編碼的多肽上的CSIF活性的功能測定。這里涉及蛋白質或多肽的術語“CSIF活性”是指蛋白質或多肽能夠抑制或大大降低下述測定中至少一種下述細胞激動素的產量IFN-r、白細胞介素-2(IL-2)、淋巴細胞毒素、白細胞介素-3(IL-3)、或粒細胞-巨噬細胞群體刺激因子(GM-CSF)。
本發明的較佳實施方案是由下述氨基酸序列定義的開放讀碼的成年人CSIFMHSSALLCCL VLLTGVRASP GQGTQSENSC THFPGNLPNMLRDLRDAFSR VKTFFQMKDQ LDNLLLKESL LEDFKGYLGCQALSEMIQFY LEEVMPQAEN QDPDIKAHVN SLGENLKTLRLRLRRCHRFL PCENKSKAVE QVKNAFNKLQ EKGIYKAMSEFDIFINYIEA YMTMKIRN,其中L-氨基酸的標準單字母符號(參見下文)從N-末端甲硫氨酸開始由左至右列出更佳的是，成年人CSIF由下述氨基酸序列定義SPGQGTQSEN SCTHFPGNLP NMLRDLRDAF SRVKTFFQMKDQLDNLLLKE SLLEDFKGYL GCQALSEMIQ FYLEEVMPQAENQDPDIKAH VNSLGENLKT LRLRLRRCHR FLPCENKSKAVEQVKNAFNK LQEKGIYKAM SEFDIFINYI EAYMTMKIR N.
在這些序列中，間隔僅僅是為了方便讀者。這里對氨基酸使用標準單字母編碼AAla丙氨酸MMet甲硫氨酸CCys半胱氨酸NAsn天冬酰胺DAsp天冬氨酸PPro脯氨酸EGlu谷氨酸QGln谷氨酰胺FPhe苯丙氨酸RArg精氨酸GGly甘氨酸SSer絲氨酸
HHis組氨酸TThr蘇氨酸IIle異亮氨酸VVal纈氨酸KLys賴氨酸WTrp色氨酸LLeu亮氨酸YTyr酪氨酸本發明部分地是以能夠表達具有CSIF活性的蛋白質的cDNA的發現和無性繁殖為基礎。因此，幾種被表示為pcD(SRα)-F115(帶有小鼠CSIF基因)、以及pH5C和pH15C(每種均帶有人CSIF基因)的這樣的克隆體已儲存在AmericanTypeCultureCollection(ATCC)，Rockville，MD，登記號分別為68027、68191和68192。


圖1表示在幾個用不同量CSIF處理的小鼠T細胞克隆中IFN-r合成抑制程度的劑量-反應關系。
圖2表示哺乳動物表達載體pH5C和pH15C的主要特征。
圖3表示質粒TAC-RBS-hCSIF的RBS-ATG多聯接區域。
圖4表示pH15C的cDNA插入物的核苷酸序列。
本發明包括pH5C、pH15C、pcD(SRα)-F115的cDNA插入物的最大開放讀碼的成熟多肽或蛋白質、實際上同源的cDNA及其拮抗物。對于分泌的蛋白質，開放讀碼通常編碼由在其N-末端與信號肽共價連接的成熟的或分泌的產物組成的多肽。信號在成熟的或活性的多肽分泌之前被裂解。裂解位點可以由經驗規則，例如VonHeijne，NucleicAcidsResearch，第14卷，第4683-4690頁(1986)高度精確地估計出，而且信號肽的精確氨基酸組份對其功能而言看來并不嚴格，例如Randall等，Science，第243卷，第1156-1159頁(1989);Kaiser等，Science，第235卷，第312-317頁(1987)。因此，成熟蛋白質可由為信號肽編碼的載體很容易地表達，這與被用pH5C、pH15C、以及pcD(SRα)-F115的cDNA插入物所定義的開放讀碼所編碼的非常不同。
Ⅰ.CSIFcDNA的獲得和表達這里的術語“實際上同源”指核苷酸序列能夠通過由本發明的cDNA克隆得出的雜交探針而被測定出來。測定為確定CSIF活性編碼的核酸所必須的同系性的確切數值取決于如下幾個因素(1)探針與伴隨目標核酸的非CSIF編碼序列的同系性，(2)雜交條件的嚴格性，(3)是使用單股探針還是雙股探針，(4)是使用RNA探針還是DNA探針，(5)為降低探針的非特定結合所采取的測量法，(6)用于標記探針的方法的性質，(7)在探針中胍和胞嘧啶堿的含量，(8)探針和目標之間的失配的分布，(9)探針的大小，等等。較佳的是，實際上同源的核酸序列至少百分之九十(90%)與本發明的cDNA是同源的。最特別的是，實際上同源的核酸序列是這樣的序列，其cDNA使用在實施例中描述的錯誤正信號不多于幾個，例如少于100個的雜交規程，可被由pcD(SRα)-F115、pH5C、pH15C或其同等物的cDNA插入物構成的探針所分離。有大量的文獻為選擇這些雜交的條件提供了指導，例如Hames等，NucleicAcidHybridizationAPracticalApproach(IRLPress，Washington，D.C.，1985);Gray等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第80卷，第5842-5846頁(1983);Kafatos等，NucleicAcidsResearch，第7卷，第1541-1552頁(1979);Sambrook等，Molecular.CloningALaboratoryManual，第二版(ColdSpringHarborLaboratory，NewYork，(1989);以及Beltz等，Meth.inEnzymol.，第100卷，第266-285頁(1983)。
這里使用的術語“同系性”是兩個核苷酸(或氨基酸)序列之間類似性的變量。同系性可用在兩個序列(長度可能不同)被校準后匹配堿(或氨基酸)的份數或百分數來表示。術語“校準”的意義是指在TimeWarps，StringEdits，andMacromoleculesTheoryandPracticeofSequenceComparison(Addison-Wesley，Reading，MA(1983)的第一章由Sankoff的Kruskal所定義的。大致地說，兩個序列可通過使兩個序列之間匹配堿(或氨基酸)的數目達到最大而把最小數目的“空白”或“無效”堿插人任一序列以達到大約最大重疊來校準。對給定的兩個序列，可用下述算法計算其同系性，例如Needleham和Wunsch，J.Mol.Biol.，第48卷，第443-453頁(1970);以及Sankoff和Kruskal(如上所述)第23-29頁。而且還可以得到進行這些比較的商業服務和軟件包，例如Intelligenetics，Inc.(PaloAlto，CA);以及UniversityofWisconsinGeneticsComputerGroup(MadisonWisconsin)。
使用帶有本發明的cDNA載體的限制性核酸內切酶片段建立探針(使用比如缺口轉譯的標準技術，例如參見如上引述的Sambrook等引文如上)篩選有懷疑生產CSIF的細胞類型的低雜交嚴緊型基因組或cDNA庫(也用標準技術建立)。使用標準篩選程序，例如Grunstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第72卷，第3961-3965頁(1975);或者Benton等，Science，第196卷，第180-183頁(1977)或Woo，MethodsinEnzymology，第68卷，第389-396頁(1979)。另一方面，基因庫可用序列由pcD(SRα)-F115、pH5C和pH15C的cDNA插入物的核苷酸序列所確定的，經標記的低核苷酸探針篩選。這種探針可用商業上可得到的DNA合成器，例如AppliedBiosystems381A型，使用標準技術，例如Gait，OligonucleotideSynthesisAPracticalApproach，(IRLPress，WashingtonD.C.，1984)來合成。在任一情況下，探針至少18-30個堿基長是較好的。探針為至少50-200堿基長更好。也可以使用雜交探針在基因庫建立之前篩選CSIFmRNA的候選來源。
可使用很大范圍的單細胞和多細胞表達體系(即宿主-表達載體結合物)生產本發明的蛋白質。宿主細胞的可能類型包括，但并不限定于細菌、酵母、昆蟲、哺乳動物，等等。有許多評述可以指導具體表達體系的選擇和/或修飾，僅舉幾例，在Kroon編輯的GenesStructureandExpression(JohnWiley&Sons，NewYork，1983)第205-247頁中，deBoer和Shepard，"StrategiesforOptimizingForeignGeneExpressioninEscherichiacoli"評述了幾種E.coli表達體系;Kucherlapati等，CriticalReviewsinBiochemistry，第16卷，第4期，第349-379頁(1984)以及Banerji等，GeneticEngineering，第5卷，第19-31頁(1983)評述了轉染和轉化哺乳動物細胞的方法;Reznikoff和Gold編輯的MaximizingGeneExpression(Butterworths，Boston，1986)評述了在E.coli，酵母，以及哺乳動物細胞中基因表達的選定課題;以及Thilly，MammalianCellTechnology(Butterworths，Boston，1986)評述了哺乳動物表達體系。此外，還可得到許多描述連接和/或操作具體cDNA的技術和條件以及表達對照序列以便制造和/或修飾適用于本發明的表達載體的評述，例如Sambrook等(如上引述)。
Riggs在美國專利4431739中公開了一種E.coli表達體系，該文列入本發明的參考文獻。對在Ecoli中的高表達特別有用的原核啟動子是由Boer在美國專利4551433中公開的tac啟動子，該文列入本發明的參考文獻。分泌表達載體也可用于E.coli宿主。特別有用的是由Ghrayeb等在EMBOJ。，，第3卷，第2437-2442頁(1984)中公開的pIN-Ⅲ-ompA載體，其中把將被轉錄的cDNA融合到編碼ompA蛋白質信號肽的E.coliOmpA基因的部分中，ompA蛋白質本身又使成熟蛋白質被分泌到細菌的周質空間。關國專利4336336和4338397也公開了對原核生物細胞的分泌表達載體。這些文獻也列入本發明的參考文獻。
大量細菌菌株都是原核表達載體的合適宿主，包括E.coli菌株，比如W3110(ATCCNO.27325)、JA221、C600、ED767、DH1、LE392、HB101、X1776(ATCCNO.31244)、X2282、RR1(ATCCNO.31343)MRCI;枯草桿菌(Bacillussubtilis)菌株;以及其它腸桿菌科例如鼠傷寒沙門氏菌或粘質沙雷氏菌、以及假單胞菌屬的各個種。CurtisⅢ在美國專利4190495中公開了獲得用于真核蛋白質表達的衍生細菌菌株，例如E.coliK12X1776的一般方法。把該專利列作本文參考。
除了原核和真核微生物外，也可使用包含由多細胞生物得到的細胞的表達體系以生產本發明的蛋白質。特別有意義的是哺乳動物表達體系，因為其轉譯后的處理機理更易于生產生物活性的哺乳動物蛋白質。現已使用幾種DNA腫瘤病毒作為哺乳動物宿主的載體，包含偶聯到細菌復制對照序列上的SV40復制、轉錄、和/或轉譯對照序列的大量載體是特別重要的，例如pcD載體，它是由Okayama和Berg培養并公開在Mol.Cell.Biol，第2卷，第161-170頁(1982)和Mol.Cell.Biol.，第3卷，第280-289頁(1983)上，并由Takebe等改進，參見Mol.Cell.Biol.，第8卷，第466-472頁(1988)。這些文獻列作本文參考。其它以SV40為基礎的哺乳動物表達載體包括那些由Kaufman和Sharp公開在Mol.Cell.Biol.，第2卷，第1304-1319頁(1982)上的，以及由Clark等公開在美國專利4675285上的，兩篇文獻也列作本發明參考。猴細胞通常是上述載體的最佳宿主。含有SV40ori序列和完整A基因的這些載體可以自動地在猴細胞中復制(比非自動復制質粒可得到更高的復制數和/或更穩定的復制數)。而且，含有SV40ori序列而沒有完整A基因的載體可在COS7猴細胞中自動地復制達到高的復制數(但不穩定)，參見Gluzman，Cell，第23卷，第175-182頁(1981)，并可以由ATCC得到(登記號CRL1651)。上述SV40基載體也能夠通過整合到宿主細胞DNA中轉化其它哺乳動物細胞，比如小鼠L細胞。
多細胞生物也可用作生產CSIF的宿主，例如昆蟲幼蟲，見Maeda等，Nature，第315卷，第592-594頁(1985)和Ann.Rev.Entomol.，第315-372頁(1989);以及基因轉移動物，見Jaenisch，Science，第240卷，第1468-1474頁(1988)。
Ⅱ、CSIF的離體測定CSIF活性是在T輔助細胞總體中在由IFN-r、淋巴毒素、IL-2、IL-3以及GM-CSF組成的組內抑制至少一種細胞激動素合成的性能，該輔助細胞通過暴露在同源抗原表露細胞(APC)和抗原下而被誘導合成一種或多種這些細胞激動素。較佳的是，把APC進行處理使之不能復制，但使其抗原處理機理仍然有效。這可在與T細胞混合之前通過輻照APC，例如用大約1500-3000R(r或X輻射)而容易地實現。
另一方面，細胞激動素的抑制可在混合淋巴細胞初級反應，更好是在混合淋巴細胞次級反應(MLR)時測定，在這種情況下不必使用同源APC.MLR是在本領域中熟知的，例如Bradley在Mishell等編輯的SelectedmethodsinCellularImmunology(FreemanSanFrancisco，1980)，第162-166頁;以及Battisto等，Meth.inEnzymol.，第150卷，第83-91頁(1987)中所述。簡言之，把兩群異源淋巴樣細胞混合，其中一群在混合前已被處理，例如通過輻射處理以避免增殖。較佳的是，在補給性培養基中以濃度大約2×106個細胞/毫升制備細胞群體，例如帶有10%胎牛血清的RPMI 16 40。對于對比的和試驗培養物而言，每群混合0.5毫升用于測定。對于次級MLR，用新制備的受輻射刺激的細胞再次刺激在初始MLR中保留7天之后的細胞。可在混合時把懷疑含有CSIF的樣品加到試驗培養物中，在混合后1至3天可測定對比的和試驗的培養物的細胞激動素的產生。
獲得用于CSIF測定的T細胞群和/或APC群可使用本領域熟知的技術，這些技術在DiSabato等編輯的Meth.inEnzymol.，第108卷，(1984)中進行了詳盡描述。用于最佳CSIF測定的APC是周邊血單核細胞。這些可使用標準技術獲得，例如在Boyum，Meth.inEnzymol.，第108卷，第88-102頁(1984);Mage，Meth.inEnzymol.，第108卷，第118-132頁(1984);Litvin等，Meth.inEnzymol.，第108卷，第298-302頁(1984);Stevenson，Meth.inEnzymol.，第108卷，第242-249頁(1989);以及Romain等，Meth.inEnzymol.，第108卷，第148-153頁(1984)中所述，以上均作為本文參考。較佳的是，把輔助T細胞用于CSIF測定中，輔助T細胞可通過首先把淋巴細胞與周邊血分離，然后使用商業上可得到的抗CD4抗體，例如在美國專利4381295中所述并可從OrthoPharmaceuticalCorp.得到的OKT4，通過隨動攝影或流動血細胞計數分選輔助細胞。在Boyum，Scand.J.Clin.Lab.Invest.，第21卷(Suppl.97)，第77頁(1968);Meth.inEnzymol.，第108卷，(如上所述)，以及Bram等，Meth.inEnzymol.，第121卷，第737-748頁(1986)中已對必需的技術進行了詳盡描述。一般地說，可通過Ficoll-Hypaque密度梯度離心法從新鮮血液中獲得PBL。
在測定中可使用各種抗原，例如Keyhole鑰匙血藍蛋白(KLH)、雞r-球蛋白等。更佳的是，在測定中用抗CD3單克隆抗體代替抗原，用例如在美國專利4361549中公開的OKT3刺激輔助T細胞。
用標準生物和/或免疫化學分析測定對比的和試驗樣品中的細胞激動素濃度。當可以得到經純化的細胞激動素時，對特定細胞激動素的免疫化學分析測定的設計是本領域所熟知的，例如Campbell，MonoclonalAntibodyTechnology(Elsevier，Amsterdam，1984);Tijssen，PracticeandTheoryofEnzymeImmunoassays(Elsevier，Amsterdam，1985);以及美國專利4486530是本課題大量文獻中的典型例子。人IL-2、人IL-3、以及人GM-CSF的ELISA試劑盒可以從GenzymeCorp.(Boston，MA)買到;人IFN-r的ELISA試劑盒可以從Endogen，Inc.(Boston，MA)買到。對人淋巴細胞毒素有特異性的多克隆抗體可從GenzymeCorp.得到，它可用于人淋巴細胞毒素的放射免疫測定中，例如Chard，AnIntroductiontoRadioimmumnoassayandRelatedTechniques(Elsevier，Amsterdam1982)。
上面所列的細胞激動素的生物測定也可用于確定CSIF的活性。人淋巴細胞毒素的生物測定已公開于Aggarwal，Meth.inEnzymol.，第116卷，第441-447頁(1985)，以及Matthews等在Clemens等編輯的LymphokinesandInterferonsAPracticalApproach(IRLPress，Washington，D.C.，1987)的第221-225頁。人IL-2和GM-CSF可用從ATCC得到的登記號分別為TIB214和CCL246的依賴于細胞系因子的CTLL-2和KG-1測定。人IL-3可用其在軟瓊脂培養物中刺激大范圍造血細胞菌落形成的能力來測定，例如Metcalf，TheHemopoieticColonyStimulatingFactors(Elsevier，Amsterdam，1984)中所述。INF-r可用抗病毒測定來定量，例如Meager在Clemens等編輯(如上所述)的第129-147頁所述。
細胞激動素的生產也可用mRNA分析測定。細胞激動素mRNA可用胞質點雜交測量，比如White等，J.Biol.Chem.，第257卷，第8569-8572頁(1982)以及Gillespie等，美國專利4483920所述。這些文獻作為本文參考。其它方法包括用純化的RNA的點印法，例如Hames等編輯的NucleicAcidHybridizationAPracticalApproach(IRLPress，Washington，D.C.，1985)，第6章。一般地說，胞質點雜交包括把mRNA從細胞或組織樣品中固著在固相載體例如硝化纖維上，把DNA探針雜交到固定的mRNA上，以及除去非特定地結合到固相載體上的探針序列或與mRNA形成錯配的雜種，從而只保留與目標mRNA形成基本上完全雜種的探針序列。留下的DNA探針的量是固定到固相載體上的目標mRNA的數目的度量。留下的DNA探針的量可通過其標記物產生的信號來測定。已有幾種標準技術可標記單股和雙股的核酸片段。它們包括引入放射性標記物，例如Harper等，Chromosoma第83卷，第431-439頁(1984);直接附著螢光標記物，例如Smith等，NucleicAcidsResearch，第13卷，第2399-2412頁(1985)，和Connolly等，NucleicAcidsResearch，第13卷，第4485-4502頁(1985);以及對核酸片段的各種化學修飾能使它們通過免疫化學方法或其它親和反應方法測定出來，例如Tchen等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第81卷，第3466-3470頁(1984);Richardson等，NucleicAcidsResearch，第11卷，第6167-6184頁(1983);Langer等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第78卷，第6633-6637頁(1981);Brigati等，Virology，第126卷，第32-50頁(1983);Broker等，NucleicAcidsResearch，第5卷，第363-384頁(1978);以及Bayer等，MethodsofBiochemicalAnalysis，第26卷，第1-45頁(1980)。
較佳的是，為了雜交，通過下面的描述把來自T細胞的mRNA粘附到探針上。把分離的T細胞經在4℃，以最終濃度1×108個細胞/毫升懸浮在溶胞緩沖液(0.14M NaCl，1.5m M MgCl2，10m M Tris-HC 1PH8.6，0.5% Nonidet P-40(一種非離子洗滌劑，例如由Sigma得到的))中而溶解。把懸浮液渦漩10秒種并且細胞核成團(13000克，2.5分鐘)。然后把所得胞質溶解產物轉移到無菌的含有0.3體積20×SSC(1×SSC=0.15M NaCl，0.015M檸檬酸三鈉(標準檸檬酸鹽))和0.2體積37%(重量/重量)甲醛的1.5毫升試管中。然后把混合物在60℃培育15分鐘并以等分試樣貯存在-70℃。為進行分析，把每個樣品15毫升經在15×SSC中連續三倍稀釋到0.1毫升96-凹陷式平底微量滴定盤(Falcon，BectonDickinson，Oxnard，CA)中滴定。每次稀釋使用96同步Minifold設備(SchleicherandShuell)吸到支持在濾紙(Whatman3mmChr，WhatmanInc.，Clifton，NJ)上的一片Nytran(一種可由SchleicherandSchuell，KeeneNH得到的改進的尼龍支持物;0.45毫米孔徑)上。然后把Nytran紙烘干(80，2小時)，并用含有50%甲酰胺(BRL，Gaitherburg，MD)6XSSC、50毫克/毫升E.colitRNA(Sigma)、以及菲可爾液(ficoll)(分子量＝400000)、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清清蛋白(BSA)各0.2%(重量/體積)的預雜交溶液處理。把探針施于Nytran載體上，濃度為大約50毫微克探針/毫升預雜交溶液。雜交之后，把載體于室溫下在2×SSC中洗滌兩次，每次15分鐘，然后在2×SSC/0.5%SDS中在60℃洗滌兩次，每次30分鐘。然后使用增強屏將載體暴露于膠片上，并使用激光光密度計(例如UltroscanXL，LKBInstrumentsInc.，Gaitherburg，MD)掃描測定其數量。如果胞質點雜交缺少足夠的靈敏性，較佳的是在印跡之前首先從PBL中提取RNA。例如可使用Chirgwin等在Biochemistry，第18卷，第5294-5299頁(1979)公開的硫氰酸胍法提取RNA。
在有些情況下，必須把欲測定CSIF活性的樣品預處理以去除會干擾測定的預先確定的細胞激動素。例如，IL-2增加了某些細胞中IFN-r的生產。因此由于在測定中使用輔助T細胞，必須把IL-2從被測定樣品中除去。這種去除可使樣品通過標準抗細胞激動素的親和柱而很容易地完成。
Ⅲ、CSIF特異性單克隆抗體和拮抗物較佳的是，本發明的拮抗物來源于人CSIF特異性抗體。更佳的是，本發明的拮抗物含有人CSIF特異性片段或結合組合物。抗體含有由二硫化物橋連接在一起的多肽鏈的組合。被稱為輕鏈和重鏈的兩種主要多肽鏈組成了抗體的全部主要結構類型(同型抗原)。重鏈和輕鏈均被進一步分為稱為變化區和恒定區的亞區。重鏈包含一個變化區和三個不同的恒定區。而輕鏈包含一個變化區(不同于重鏈的變化區)和一個恒定區(不同于重鏈的恒定區)。重鏈和輕鏈的變化區對于抗體的結合特異性是可反應的。
這里術語“重鏈變化區”是指一種多肽，(1)其長度為110至125氨基酸，以及(2)其氨基酸序列與本發明的單克隆抗體的重鏈的氨基酸序列一致并從重鏈的N末端氨基酸開始。同樣，術語“輕鏈變化區”是指一種多肽，(1)其長度為95至115氨基酸，以及(2)其氨基酸序列與本發明的單克隆抗體的輕鏈的氨基酸序列一致并從輕鏈的N末端氨基酸開始。
這里術語“單克隆抗體”是指能夠特定地結合到人CSIF上的免疫球蛋白的均勻群體。
這里術語“結合組合物”是指含有兩個多肽鏈的組合物，該多肽鏈(1)當操作上聯系時，呈現對人CSIF具有高的結合親和力的構象，以及(2)來自于產生人CSIF特異性單克隆抗體的雜種瘤。術語“操作上聯系”是指兩個多肽鏈通過各種方式使得對結合來說放置得彼此相關，包括通過在天然抗體片段中相結合的方式，比如Fab或Fv，或者通過在羧基末端經遺傳工程設計的含半胱氨酸多肽銜接物的方式，一般地，兩個多肽鏈與人CSIF特異性單克隆抗體的輕鏈變化區和重鏈變化區相一致。較佳的是，本發明的拮抗物來自于人CSIF異性的單克隆抗體。通過在標準CSIF生物測定法中抑制CSIF誘導作用，例如抑制IFN-r合成能力選擇能夠阻斷或中和CSIF的單克隆抗體。
本發明的雜種瘤可用熟知的技術生產。通常，該方法包括把不滅細胞系與產生所要求抗體的B-淋巴細胞融合。另一方面，為生產產生不滅抗體的細胞系的非融合技術則是可能的，并包含于本發明的范圍內，例如病毒誘導的轉化Casali等，“HumanMonoclonalsfromAntigen-SpecificSelectionofBLymphocytesandTransformationbyEBV”，Science，第234，第476-479頁(1986)。不滅細胞系通常是轉化的哺乳動物細胞，特別是嚙齒動物、牛、以及人的骨髓瘤細胞，最通常的是由于方便和容易得到而使用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞系。從注射有目標抗原的哺乳動物中獲得適當淋巴細胞的技術是熟知的，一般地，當需要人細胞時，使用周邊血淋巴細胞(PBL)，或者當需要非人哺乳動物時使用脾臟細胞或淋巴節細胞。對宿主哺乳動物以重復劑量注射純化過的抗原，并先使哺乳動物生產所需要的產生抗體的細胞，然后收獲這些細胞以用于與不滅細胞系融合。融合技術也是本領域所熟知的，一般包括把細胞與融合劑比如聚乙二醇混合。用標準方法比如HAT選擇法選擇雜種瘤。從這些雜種瘤中，經用標準免疫測定，比如Western印跡、ELISA、RIA、CSIF中和能力等等，測定其培養基來選擇分泌要求的抗體，即人CSIF特異性抗體的雜種瘤。可使用標準蛋白質純化技術，比如Tijssen，PracticeandTheoryofEnzymeImmunoassays(Elsevier，Amsterdam，1985)，從培養基中回收抗體。現有許多文獻可指導使用上述任何技術，例如Kohler等，HybridomaTechniques(ColdSpringHarborLaboratory，NewYork，1980);Tijssen，PracticeandTheoryofEnzymeImmunoassays(Elsevier，Amsterdam，1985);Campbell，MonoclonalAntibodyTechnology(Elsevier，Amsterdam，1984);Hurrell，MonoclonalHybridomaAntibodiesTechniquesandApplications(CRCPress，BocaRaton，FL，1982);等等。然后使用上述CSIF測定法對生產人CSIF特異性單克隆抗體的雜種瘤進行第二次篩選，以便選擇能阻斷或中和CSIF生物活性的雜種瘤。
抗體片段的使用和生產也是公知的，例如Fab片段Tijssen，PracticeandTheoryofEnzymeImmunoassays(Elsevier，Amsterdam，1985);和Fv片段Hochman等，Biochemistry，第12卷，第1130-1135頁(1973)，Sharon等，Biochemistry，第15卷，第1591-1594頁(1976)以及Ehrlich等，美國專利4355023;以及抗體半分子Auditore-Hargreaves，美國專利4470925。
也可以采用重組體方法生產本發明的雜種瘤所特有的抗體和抗體片段，即提取信使RNA、建立cDNA庫、并選擇編碼抗體分子片段的克隆，例如Wall等，NucleicAcidsResearch，第5卷，第3113-3128頁(1978);Zakut等，NucleicAcidsResearch，第8卷，第3591-3601頁(1980);Cabilly等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第81卷，第3273-3277頁(1984);Boss等，NucleicAcidsResearch，第12卷，第3791-3806頁(1984);Amster等，NucleicAcidsResearch，第8卷，第2055-2065頁(1980);Moore等，美國專利4642334;Skerra等，Science，第240卷，第1038-1041頁(1988);以及Huse等，Science，第246卷，第1275-1281頁(1989)。特別是，可使用這些技術生產種間單克隆抗體抗體，其中一個物種的結合區與另一物種的抗體的非結合區結合以降低免疫原性，例如Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第84卷，和3439-3443頁(1987)。
Ⅳ、提純和藥物組合物當以溶解形式表達本發明的多肽時，例如作為轉化酵母或哺乳動物細胞的分泌產物，可以按照本領域的標準程序把它們提純，包括硫酸銨沉淀、離子交換色譜法、凝膠過濾法、電泳、親和色譜法和/或等等步驟，例如“EnzymtPurificationandRelatedTechniques，”MethodsinEnzymology，22233-577(1977)，以及Scopes，R.，ProteinPurificationPrinciplesandPractice(Springer-Verlag，NevYork，1982)為這些提純提供了指導。另外，當以非溶解形式表達本發明的多肽時，例如作為凝集體、包涵體等等，可以按照本領域的標準程序將它們提純，包括用離心法把包涵體與破裂的宿主細胞分離，用離液序列高的試劑和還原劑溶解包涵體、稀釋溶解的混合物、和降低離液序列高的試劑和還原劑的濃度以便使多肽呈生物活性構象。后者的程序公開于下述文獻中，也系本文參考文獻Winkler等，Biochemistry，254041-4045(1986);Winkler等，Biotechnology，3992-998(1985);Koths等，美國專利4569790;以及歐州專利申請86306917.5和86306353.3。
這里“有效量”是指足以改進自身免疫病理狀況的癥狀的量。對具體患者的有效量取決于被處理的自身免疫病理狀況的狀態、患者的綜合健康狀況、給藥方法、副作用的嚴重性等因素而可以改變。一般地，CSIF以含有有效量的CSIF和藥物載體的藥物組合物形式給藥。藥物載體可以是任何適合于把本發明的組合物傳遞給患者的可配伍的無毒物質。一般地說，這些藥物中用于胃腸外給藥的組合物是熟知的，例如Remington'sPharmaceuticalScience，第15版，(MackPublishingCompany，Easton，PA1980)。另一方面，本發明的組合物也可用可植入的或可注射的藥物傳遞體系引入患者體內，例如Urquhart等，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，第24卷，第199-236頁(1984);Lewis編輯，ContrclledReleaseofPesticidesandPharmaceuticals(PlenumPress，NewYork，1981);美國專利3773919;美國專利3270960;等等。
當胃腸外給藥時，將CSIF配制成體隨藥物載體的單元劑量可注射形式(溶液、懸浮液、乳狀液)。這些載體的實例是生理鹽水、Ringer溶液、葡萄糖溶液、以及Hank溶液。也可以使用非水載體比如固定油和油酸乙酯。較佳載體是5%葡萄糖/鹽水。載體可含有少量添加劑，比如增強等滲性和化學穩定性的物質，例如緩沖劑和防護劑。較佳的是，CSIF以基本上無聚集團和其它蛋白質的純態配制成濃度范圍大約為5至20微克/毫升。另外較佳的是，CSIF用連續注入方式給藥，使得每日提供量的范圍大約為50-800微克(即大約1-16微克/千克/日)。每日注入率則根據監測副作用和血細胞計數而改變。
CSIF可由被帶有CSIF基因的表達載體所暫轉染或穩定轉化的哺乳動物細胞的培養物上清液中提純。較佳的是，CSIF由被pcD表達載體所暫轉染的COS7細胞的培養物上清液中提純。用pcD轉染COS7細胞按如下方法進行在轉染前一天，把大約106COS7猴細胞在含有10%胎牛血清和2mM谷氨酰的Dulbecco改進的Eagle培養基(DME)中接種到單個100毫升培養皿內。為實現轉染把培養基從每個培養皿中抽出并用4ml含有50mM tris-HC 1pH7、4、400毫克/毫升DEAE-Dextran和50微克質粒DNA的DME代替。把培養皿在37℃培育4小時，然后除去含DNA的培養基，并用5ml無血清DME洗滌兩次。把DME加回到培養皿中，然后將培養皿再在37℃培育3小時。把培養皿用DME洗滌一次，之后以標準濃度加入含有4%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、毒霉素(100U/L)和鏈霉素(100微克/升)的DME。然后將細胞在37℃培育72小時，然后為提純CSIF收集生長培養基。另外，轉染可經過實施例中所述的電穿孔實現。用于轉染的質粒DNA可通過生長由Casadaban和Cohen，J.Mol.Biol.，第138卷，第179-207頁(1980)所描述的在E.Coli MC 1061或類似生物中含有CSIF cDNA插入物的pcD(SRα)來實現。用標準技術從培養物中分離質粒DNA，例如Maniatis等，MolecularCloningALaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratory，NewYork，1982)。
當本發明的拮抗物來自抗體時，它們一般是胃腸外給藥，較佳的是靜脈內給藥。由于這種蛋白質或肽拮抗物可以是免疫性的，所以它們最好是或者通過常規Ⅳ給藥裝置，或者由皮下儲存方式緩慢給藥，例如Tomasi等在美國專利4732863中所述。如上所述，當胃腸外給藥時，把抗體和/或片斷配制成與如上所述藥物載體相結合的單元劑量可注射形式。抗體較佳是以基本上無聚集物、其它蛋白質、內毒素等等的純態配制成濃度大約為5至30毫克/毫升，更佳是10至20毫克/毫升。較佳的是，內毒素的含量小于2.5EU/毫升。
拮抗物給藥制度的選擇取決于幾個因素，包括拮抗物的血清轉換率、伴隨被治療的病況的CSIF的血清含量、拮抗物的免疫性、靶CSIF的可及性(例如如果要阻塞非血清CSIF時)、CSIF對其受體-CSIF對拮抗物的相對親合性、等等。較佳的是，按照可接受的副作用的程度，給藥制度使傳遞給病人的拮抗物的量達最大。因此，所傳遞的拮抗物的量部分地取決于特定拮抗物和被治療的病理狀況的嚴重性。選擇合適劑量的說明可在有關抗體治療用途的文獻中找到，例如Bach等在Ferrone等編輯的HandbookofMonoclonalAntibodies(NogesPublication，ParkRidge，NJ，1985)的第22章;在Haber等編輯的AntibodiesinHumanDiagnosisandTherapy(RavenPress，NewYork，1977)中，Russell，第303-357頁，以及Smith等，第365-389頁。較佳的是，一當拮抗物包含單克隆抗體或其Fab校準的片段(包括結合組合物)，劑量的范圍為每日大約1-20毫克/千克。更佳的是，劑量范圍為每日大約1-10毫克/千克。
Ⅴ、遺傳工程突變體CSIF一旦可以得到一種天然蛋白質的核酸序列和/或氨基酸序列的信息，那么就可得到實質上按天然序列有效產生任何突變的各種技術，例如Shortle，Science，第229卷，第1193-1201頁(1985);Zoller和Smith，MethodsinEnzymology，第100卷，第468-500頁(1983);Mark等，美國專利4518584;Wells等，Gene，第34卷，第315-323頁(1985);Estell等，Science，第233卷，第659-663頁(1986);Mullenbach等，J.Biol.Chem.，第261卷，第719-722頁(1986)，以及Feretti等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第83卷，第597-603頁(1986)。這些文獻作為本文參考。
在許多情況下需要天然多肽的突變蛋白質。例如用某些突變蛋白質可降低不希望的副作用，特別是當副作用活性和與希望的活性的多肽部分不同的多肽部分相聯系時。在某些表達體系中，天然多肽可能對蛋白酶降解是敏感的。在這些情況下，所選擇的能改變敏感序列的氨基酸的替代和/或取代會大大增加產率。例如英國專利申請2173804-A，其中在人組織血纖維蛋白溶酶原激體的275位處的Arg被Gly或Glu取代。突變蛋白質也可在提純程序中增加產率和/或通過消除易于氧化、酰化、烷基化、或其它化學修飾的氨基酸而延長蛋白質的貯存期限。例如，甲硫氨酸容易受到氧化而形成亞砜，在許多蛋白質中它伴隨著生物活性的損失，例如Brot和Weissbach，Arch.Biochem.Biophys.，第223卷，第271頁(1983)。甲硫氨酸經常被惰性更大的氨基酸替代而很少損失或不損失生物活性，例如澳大利亞專利申請AU-A-52451/86。在細菌表達體系中，通過消除或替代構象上不重要的半胱氨酸殘基有時可增加產率，例如Mark等，美國專利4518584。
較佳的是使用基因盒誘變生產突變體蛋白質。合成基因用沿著基因幾乎均勻分布的核酸內切限制酶序列的位點構建;即使當基因插入到適當的載體中時也應選擇這些核酸內切限制酶位點使保持單一性。單一的核酸內切限制酶位點使得基因的節片被容易地切去，并用為希望的突變編碼的合成寡核苷酸(即“基因盒”)替代。確定單一限制位點的數目和分布必須考慮幾個因素，包括(1)先于在表達中使用的載體的限制位點，(2)是希望使用種特異還是屬特異的密碼子，(3)可得到的不同的非載體切割核酸內切限制酶的數目(以及它們在合成基因內的多重性)，以及(4)在各單一限制位點間各節片的合成和/或排序的方便和可靠性。
上述技術是一種按天然蛋白質序列實現保守氨基酸替代等的方便的方法。這里“保守”是指(ⅰ)變更在構象上盡可能是中性的，即目的是與天然蛋白質相比在突變體多肽的三級結構上產生最小的變化，以及(ⅱ)變更在抗原上盡可能是中性的，即目的是與天然蛋白質相比在突變體多肽的抗原定子中產生最小的變化。為保持生物活性需要構象中性，而為避免在用本發明的化合物治療的病人或動物中引起免疫反應則需要抗原中性。雖然難于絕對可靠地挑選哪一個可供選擇的對象是在構象上和抗原上將是中性的，但存在著一些可以指導本技術領域中的善通技術人員高兒率地制造出在構象上和抗原上為中性的變體的法則，(如Anfisen(上面引證的);Berzofsky，Science，Vol.229，pgs.932-940(1985)，和Bowieetal，Science.Vol.247，pgs.1306-1310(1990))。一些較重要的法則包括(1)置換疏水殘基不太可能產生抗原性的變化，因為這些殘基可能位于蛋白質的內部(如Berzofsky(上面引證的)和Bowieetal(上面引證的);(2)生理化學上相似的，即同義的殘基的置換也較少可能地產生構象上的改變，因為進行取代的氨基酸可以起到與被取代的氨基酸相同的結構上的作用;(3)保守的進化序列的變更可能產生有害的構象上的作用，因為進化的保守性意味著這些序列在功能上是重要的。除了這種用于選擇突變蛋白質序列的基本法則之外，檢測可確定生物的活性及設計的分子的構象。對本發明的多肽的生物檢測在前面已作了較充分的描述。構象的變更至少可用兩個熟知的測定法來進行檢測微補償固定法(如Wassermanetal.，J.Immunol.，Vol.87，pgs.290-295(1961)，或Levineetal.MethodsinEnzymology，Vol.11.pgs.928-936(1967))，該法被廣泛地用于蛋白質三結構進化研究;和對一組構象特殊的單克隆抗體的親和性(如Lewisetal.，Biochemistry，Vol.22，pgs.948-954(1983)。
Ⅵ、人CSIF肽抗體本發明包括由人CSIF衍生的肽，和含有載體和本發明的肽之間的接合體的免疫原。本文所用的術語“免疫原”指的是能引起免疫反應的物質。本文所用的術語“載體”，指的是當其化學地接合到本發明的肽上時，可使因該接合而得以免疫的受體生物體產生專對該接合肽的抗體的任何物質。載體包括紅血細胞、噬菌體、蛋白質和諸如瓊脂糖珠之類的合成粒子。載體最好是蛋白質，如血清清白白，r-球蛋白，鎖孔戚形血蘭蛋白、甲狀腺球蛋白、卵清蛋白、血纖維蛋白或其同類物。
本發明的肽用常規技術(如StewartandYoung，SolidPhasePeptideSythesis，2ndEd.(PierceChemicalCompany，Rockford.1L.1984))合成。最好使用市售的肽合成器(如model430AofAppliedBiosystems，Inc.(FosterCity.CA))。本發明的肽是通過將在交聯的聚苯乙烯載體上的固相合成物集合而成的，集合自羧基末端殘基開始，然后逐步添加氨基酸，直到形成完整的肽。下列文獻是對在合成期間所用的化學知識的指導Merrified.J.Amer.Chem.Soc.，Vol.85.pg.2149(1963);Kentetal.，pg185.inPeptides1984，Ragnarsson.Ed.(AlmquistandWeksell.Stockholm，1984);Kentetal.，pg.217inPeptideChemistry84，Izumiya，Ed(ProteinResearchFoundation，B.H.Osaka，1985);Merrifield，Science，Vol.232，pgs.341-347(1986);Kent，AnnRev.Biochem.，Vol.57，pgs.957-989(1988)，而參考文獻引證在最后兩篇文獻中。
在固態合成中，最重要的是消除合成副產物，這主要是終止，缺失或修飾肽。大多數副反應可以通過使用純凈的，性能良好的樹脂、純凈的氨基酸衍生物、純凈的溶劑，及通過選擇合適的偶聯和分裂方法及反應條件而被消除或減至最小(如BaranyandMerrifield.ThePeptides，CrossandMeienhofer.Eds.，Vol.2，pgs1-284(AcademicPressNewYork，1979)。重要的是監測偶聯反應以確定它們是否進行至完成，從而避免缺一個或多個殘基的缺失肽。定量茚三酮反應對此目的是有用的(見Sarinetal.Anal.Biochem，Vol，117.pg147(1981))。使用帶有對鏈組合條件穩定，而對強酸不穩定的合適的支鏈保護基團的Na-t-丁氧羰基(t-Boc)-氨基酸。被保護的肽鏈組合后，除去保護基，然后在有硫酯清除劑存在的條件下，通過使用濃度先低后高的無水氟化氫使肽結合鍵裂開(見Tametal.J.Amer.Chem.Soc.，Vol.105.pg.6442(1983))，可被采用的適宜的支鏈保護基團用所討論的氨基酸的三個縮寫字母及括號中的保護基表示Asp(OBzL).Glu(OBzL).Ser(BzL).Thr(BzL).Lys(Cl-Z).Tyr(Br-Z).Arg(NGTos).Cys(4-MeBzl).以及His(ImDNP).(Bzl＝芐基;Tos＝甲苯磺基氧;DNP＝二硝基苯基;Im＝咪唑。Z＝芐氧基羰基)。剩下的氨基酸沒有支鏈保護基。每次將(t-BocNa)-保護的肽-樹脂暴露于65%的三氟乙酸(得自EastmanKodak)(使用前蒸餾)的二氯甲烷(DCM)，(Mallenckrodt)溶液中先暴露1分鐘，然后暴露13分鐘，以排除Na-保護基團。在DCM中洗滌該肽-樹脂，再用10%的二異丙基乙胺(DIEA)(Aldrich)的二甲基甲酰胺(DMF)(AppliedBiosystems)溶液中和兩次，每次1分鐘。通過用DMF洗滌接著進行中和。用DMF中的氨基酸的對稱酐進行偶聯16分鐘。在合成器中通過將2mmol的氨基酸溶于6ml的DCM中，然后加入在2mlDCM中的1mol的二環己基碳化二亞胺(Aldrich)而制成該對稱酐。5分鐘后，將活化的氨基酸移到一個單獨的容器中，并用連續的氮氣流吹掃將DCM蒸發掉。在吹掃的各階段，用DMF(共6ml)取代DCM，首次偶聯后，用DCM，10%的DIEA的DCM溶液，再用DCM洗滌該肽-樹脂。為了再偶聯，將同樣的氨基酸和活化劑，二環己基碳化二亞胺順次地移到該反應容器中。在原地活化和偶聯10分鐘后，添加足量的DMF，結果制成50%的DMF-DCM混合物，然后使該偶聯持續15分鐘。精氨酸以一種羥基苯并三唑(Aldrich)的酯的形式在DMF中被偶聯60分鐘，然后在同樣的條件下，作為其它的氨基酸的形式被再偶聯。天冬酰胺和谷酰胺，作為羥基苯并三唑的酯，在DMF中被偶聯兩次，每次40分鐘。所有的殘基而言，在第二次偶聯后，該樹脂都要沖洗，為用定量茚三酮反應(Sarinetal(前面已引證)監測殘留的未偶聯的α-胺，自動地取出一個樣品。
將合成肽連接到載體上的通用技術已在幾篇文獻中講到，如，WalterandDoolittle，"AntibodiesAgainstSyntheticPeptides"，inSetlowetal.eds.，GenticEngineering，Vol.5，pgs.61-91(PlenumPress，N.Y.，1983);Greenetal.Cell，Vol.28，pgs，477-487(1982);Lerneretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，Vol.78，pgs.3403-3407(1981);Shimizuetal.，U.S.Patent4，474，754;及Ganfieldetal.，U.S.Patent4，311，639。相應地這些文獻經引證已被接合入本之中。將半抗原連接于載體所用的技術基本上與上述所引證的技術相同(如Chapter20inTij-sseu′sPracticeandtheoryofEnzymeImmunoassaysElsevier，NewYork，1985))。將肽與載體連接的四種最通用的系統是(1)用于氨基偶聯的戊二醛(如于KaganandGlick.inJaffeandBehrman，eds.MethodsofHormoneRadioimmunoassay.pgs.328-329(AcademicPress.N.Y.1979)和Walteretal.Proc.Natl.Acad.Sci.，Vol.77，pgs5197-5200(1980)中所公開的);(2)用于羰基與氨基偶聯的水溶碳化二亞胺(由Hoare等公開于J.Biol.Chem.，Vol.242，pgs:2447-2453(1967);(3)用于酪氨酸與酪氨酸支鏈偶聯的雙一偶氮聯苯胺(DBD)，(如公開于Bassirietal.，pgs.46-47，inJaffeandBehrman，eds(前已引證)和Walteretal(前已引證);(4)用于半胱氨酸(或其它的硫氫基)與氨基偶聯的馬來酰亞胺苯甲酰基-N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)(如公開于Kitagawaetal.，J.Biochem(TOKYO)Vol，79，pgs.233-239(1976)，和Lerneretal(前已引證)。選擇一種將給定的肽偶聯到蛋白質載體上的合適的方法的通用法則可表述如下包含在連接物中的基團只應在該序列中出現一次，最好是出現在該片段的適宜的端部。例如，如果一個酪氨酸殘基出現在一個序列(該序列是因其潛在的抗原特性而被挑選的)的主要部分，則不應使用BDB。類似地，位于中心的賴氨酸不容于戊二醛法，而且天冬氨酸和谷氨酸的存在也經常排斥碳化二亞胺法。另一方面，可將合適的殘基置于作為連接位點的，經選擇的序列的片段的任一端，而不論它們是否出現在“天然”蛋白質序列之中。與氨基和羧基的終端不同的內片段，將在“末連接端”處與在天然蛋白質中發現的同樣的序列顯著地不同，在該天然蛋白質中，多肽的主鏈是連續的。這個問題在一定程度上可通過將α-氨基乙酰化，然后借助于羧基末端與肽連接而得以補救。與載體蛋白質偶聯的效率，可通過使用放射性示蹤肽而方便地得以測定，而該放射性示蹤肽既可通過使用合成過程中的一個階段中的一種放射性氨基酸來制備，也可通過使由于酪氨酸殘基磺化而完成的肽示蹤來制備。如果愿意，在肽中的酪氨酸的存在還可使人們建立起一種靈敏的放射性免疫檢測法。因此，如果酪氨酸不是被天然多肽限定的肽序列的部分，則它就可以作為終端殘基而引入。
優選的載體是蛋白質，而較好的蛋白質載體包括牛血清清蛋白、肌球蛋白、卵清蛋白(OVA)，鎖孔戚形血蘭蛋白(KLH)及其類似物。通過半胱氨酸，靠MBS可將肽連接到KLH上(如公開于Liuetal.，Biochemistry，Vol.18，pgs.690-697(1979)中)。將這種肽溶于磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.5)0.1M的硼酸鈉緩沖液(pH9.0)或1.0M的乙酸鈉緩沖液(pH4.0)。選擇溶解肽的pH值，以得到最佳的肽溶解度。可溶肽的游離半胱氨酸的含量用Ellman的方法確定(見Ellman，Arch.Biochem.Biophy.，Vol.82，pg7077(1959))。對于每種肽而言，都是將在0.25ml的10mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.2)中的4mgKLH與0.7mg的MBS(溶于二甲基甲酰胺中)進行反應，并在室溫下攪動30分鐘。滴加MBS以確保甲酰胺的局部濃度不致太高，因為KLH在＞30%的甲酰胺中是不溶的。然后使反應產物KLH-MBS通過由50mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)平衡的SephadexG-25，以除去游離的MBS。從該柱的洗脫物的峰值餾分(由OD280監測)中回收的KLH的回收率估計約為80%。然后將KLH-MBS與溶于1ml的所選的緩沖液中的25的5mg肽反應。將pH值調到7-7.5;在室溫下將反應物攪動3小時。通過結合物樣品對磷酸鹽緩沖鹽水的透析，用放射性肽來監測偶聯效果，其范圍為8-60%。一旦獲得了肽-載體的結合體，就可用常規技術生產出多克隆或單克隆抗體(如公開于Campbell，MonoclonalAntibodyTechnology(Elsevier，NewYork，1984);Hurrell，ed.MonoclonalHybridomaAntibodiesTechniquesandApplications(CRCPress，BocaRaton，FL，1982);Schreieretal.HybridomaTechniques(ColdSpringHarborLaboratory，NewYork，1980)，U.S.Patent4，562，003;或類似文獻)。其中特別將U.S.Patent4，562，003經引證而結合人本文中。
多克隆和單克隆抗體均可用ELISA篩選。如其它的固相免疫測定一樣，本試驗也是以大分子非特定地吸附于塑料的傾向為基礎的。這種反應的不可逆性，不損失免疫活性，使抗原-抗體復合體得以通過將其從未結合的原料中簡單地分離出來而形成。為滴定抗肽血清，將結合在載體(該載體與用于免疫的載體不同)上的肽吸取到96井的滴定皿的井中。然后使被吸取的抗原在池中與稀釋的抗肽血清反應。將未結合的抗體洗去，使剩下的抗原-抗體復合體與專用于經免疫的動物的IgG抗體反應。將該二次抗體與一種酶，例如堿性磷酸酶結合。在添加酶底物時而產生的可見的有色反應產物示出哪一個井已接上了抗肽抗體。使用分光光度計讀數可更好地給已接上專用的肽抗體的量進行定量。高滴定抗血清產生一條在10-3-10-5稀釋度之間的線性滴定曲線。
實施例下列實施例用于說明本發明。所選擇的載體和宿主以及試劑的濃度、溫度及其它變量的值僅用作本發明的例證，而不被視為本發明的限制。
實施例1小鼠CSIF的生物活性通過將T細胞克隆(5×106)個細胞/ml)在無血清培養基(缺酚紅和含0.05m M2-巰基乙醇及20mM HEPES的RPMI 1640)和伴刀豆球蛋白A 5ug/ml中培養24小時而獲得含小鼠CSIF的得自若干T細胞克隆的上清液。該克隆包括細胞系，D9(述于U.S.Patent4，613，459)，D10(述于下面)，MB2-1(述于Mosmann et al.J.Immunol.，Vol.136，pgs 2348-2357(1986)，CDC25和CDC35(述于Tony et al.J.Exp.Med.，Vol.161，pg.223(1985)及M411-2和M411-6。測定該T細胞上清液在細胞系HDK-1中抑制IFN-r合成物的能力(如在Cherwinski，et al，Exp.Med.，Vol.166，pgs.1229-1244(1987)中所述)。在96井的平底微滴定淺盤中制備一系列二倍稀釋度的取自每種T細胞克隆的樣品稀釋液，其體積為0.05ml。將HDK-1細胞(5×104個細胞/井)隨經輻照的(2500R)同源的APC(5×105細胞/井的脾細胞)和抗原(鎖孔戚形血蘭蛋白，150μg/ml)一起加入到0.15ml的容積中。將11B11抗-IL-4抗體(10μg/ml)(如在Ohara et al.Nature，Vol.315，pgs.333-336(1985)中所述)加到估計含IL-4的樣品中。于37℃培養24小時后，收集上清液，并在4℃保存不到一周的時間，或在80℃保存更長時間。通過使用一種大鼠的抗鼠IFN-r單克隆抗體，XMG1.2，和親合性-提純的免的抗-鼠IFN-r抗體的兩位點多層結構的ELISA測定IFN-r的含量。圖1示出了以對照物含量百分數表示的IFN-r合成的抑制程度。
將由D10細胞產生的CSIF部分地提純，并施用到兩種不同的T細胞克隆上，以檢查作為CSIF濃度的函數的細胞激動素合成的抑制程度。制備部分地提純的CSIF的方法如下用AmiconYM-5膜(AmiconCorp.Danvers，MA)將1-2.5L兒批伴刀豆球蛋白A-誘發的D10上清液濃縮約10倍，再通過一個5ml的與甘露糖接合的瓊脂糖柱(E-YLaboratories.SanMateo.CA)然后再濃縮3-5倍，即總的濃度為原來的30-50倍。然后用高性能的液體色譜法分兩步進一步地提純該原料首先涂在以羥基磷灰石為基的柱上(Bio-GelHPHT，Bio-RadLaboratories，Richmond，CA)，然后再涂在硅膠過濾柱上(TSK-G3000SW，60cm長，LKBInstruments，Gaithersburg，MD)。將這樣一批部分提純的CSIF等份保存在-80℃下，并將之用作CSIF活性的一種標準。當一開始測定時，這種制劑在1/200的稀釋度下，在0.2ml的測定容積中引起了大約50%的對產生IFN-r的抑制。這樣，該標準單位是通過規定1000U/ml為標準CSIF制劑來定義的。在后面每次測定中，未知樣品的CSIF活性的定量，是通過IFN-r合成物被未知樣品抑制的程度與該標準樣品的比較而完成的。用于抑制細胞激動素合成的被測定的T細胞克隆是HDK-1(上面已述)和MD13-10(述于Cell.Immunol.，Vol.97，pg.357(1986))。為測定IL-3和GM-CSF的含量，使這種經部分提純的CSIF在抗-IL-3和抗-GM-CSF，親合性的柱上通過而得以被進一步地處理。在4℃時，通過輕柔地混合4小時，將在0.1M NaCl 0.1M的HEPES和0.08M的CaCl2中的抗體偶聯到Affi-Gel 10(Bio-Rad)上。每1-2ml的柱大約含10-20mg的已偶聯的抗體。
如下表所示，IFN-r的產生在兩種克隆中被抑制。在MD13-10細胞中，其它的細胞激動素，IL-2，淋巴細胞毒素、IL-3和GM-CSF的合成也被抑制到較低的程度，或被抑制到完全沒有的程度。
表細胞系細胞激動素對照合成量(%)14U/ml42U/ml125U/mlHDK-1IFN-r47.629.118.6IL-271.759.640.4淋巴細胞毒素41.945.142.8IL-363.952.638.4GM-CSF86.979.166.8MD13-10IFN-r36.027.523.2IL-288.2109.396.0IL-360.263.051.0GM-CSF109.0119.997.6
實施例Ⅱ由D10細胞構建cDNA信息庫及克隆pcD(SRα)-F115的分離一種cDNA信息庫是在pcD(SRα)載體中，由自D10細胞中提取的mRNA，按照Okayama和Berg等人的方法構成的(上述D10細胞述于Kaye et al.，J.Exp.Med.，Vol.158pg.836(1983))，上述方法見Mol.Cell，Biol.2∶161-170(1982)及3∶280-289(1983)，而且該方法已公開于U.S.Patent 4，695，542中，該文獻已經引征結合于本文中)。帶有cDNA插入物的pcD(SRα)載體在E.coli中被放大。從這些隨機挑選的克隆，庫中提取質粒DNA，并用于轉染COS7猴細胞(如下所述)。然后測定COS 7培養物的上清液的CSIF活性。按下述方法轉染COS細胞;在轉染前一天，在含5%的胎牛血清(FCS)和2mM谷氨酰胺的Dulbecco改進的Eagle培養基中將約1.5×106COS7猴細胞接種到單個的100mm平皿上。為完成此轉染，通過用胰蛋白酶培養從該皿中取出COS7細胞，然后在無血清DME中洗兩次、在無血清DME中懸浮至107個細胞/ml。將0.75ml的等分試樣與20μg的DNA混合，然后轉移到0.4cm的無菌穿孔杯中。10分鐘后，Bio Rad基因脈沖裝置中，以200伏，960μF使該細胞脈動。再過10分鐘后，從該杯中取出細胞，再加到20ml的含5%FCS，2mM谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素和慶大霉素的DME中。將混合物等分于4個100mm的組織培養皿中。12-24小時后，在37℃、5%CO2下，用僅含1%FCS的類似的培養基取代該培養基，然后在37℃，5%CO2下繼續再培養72小時，此后收集該培養基并測定CSIF活性。接著pcD(SRα)-F115的cDNA插入物的最大開放讀碼被確定于下5'-ATGCCTGGCTCAGCACTGCTATGCTGCCTGCTCTTACTGACTGGCATGAGGATCAGCAGGGGCCAGTACAGCCGGGAAGACAATAACTGCACCCACTTCCCAGTCGGCCAGAGCCACATGCTCCTAGAGCTGCGGACTGCCTTCAGCCAGGTGAAGACTTTCTTTCAAACAAAGGACCAGCTGGACAACATACTGCTAACCGACTCCTTAATGCAGGACTTTAAGGGTTACTTGGGTTGCCAAGCCTTATCGGAAATGATCCAGTTTTACCTGGTAGAAGTGATGCCCCAGGCAGAGAAGCATGGCCCAGAAATCAAGGAGCATTTGAATTCCCTGGGTGAGAAGCTGAAGACCCTCAGGATGCGGCTGAGGCGCTGTCATCGATTTCTCCCCTGTGAAAATAAGAGCAAGGCAGTGGAGCAGGTGAAGAGTGATTTTAATAAGCTCCAAGACCAAGGTGTCTACAAGGCCATGAATGAATTTGACATCTTCATCAACTGCATAGAAGCATACATGATGATCAAAATGAAAAGCTAA-3';
并且用規則確定的成熟鼠的CSIF蛋白質的氨基酸序列如下QYSREDNNCT HFPVGQSHML LELRTAFSQV KTFFQTKDQLDNILLTDSLM QDFKGYLGCQ ALSEMIQFYL VEVMPQAEKHGPEIKEHLNS LGEKLKTLRM RLRRCHRFLP CENKSKAVEQVKSDFNKLQD QGVYKAMNEF DIFINCIEAY MMIKMKS.
實施例Ⅲ用自pcD(SRα)-F115衍生的探針篩選人CSIF的cDNA信息庫pH5C和pH15C的分離用收集的70鏈節寡核苷酸篩選自人T細胞克隆提取的mRNA，在pcD(SRα)中構成的cDNA信息庫，其序列與編碼的成熟CSIF的鼠CSIF基因斷片編碼或非編碼鏈互補。標準的雜交方法被使用，如在150mm陪氏培養皿上生長的細菌落被移植到基因篩選膜上，用放射性示蹤的寡核苷酸探針處理，洗滌、然后在X-射線膠片上曝光。在對探針長度約束不嚴的條件下，使探針雜交包括在60℃，于5×SET(20×SET是3MNaCl+0.4Tris-HCl(pH7.8)+20mMEDTA)中培養靶核酸的預雜交，接著在同樣的條件下進行雜交，并在50℃，在5×SET中洗滌，帶有質粒pH5C和pH15C的兩個克隆被鑒定。兩種質粒都表達了在COS7中的能在PHA-刺激的人PBL中抑制IFN-r合成的蛋白質。pH15C的cDNA插入物被圖解于圖4中，它的最大開放讀碼的核苷酸序列如下5'-ATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCAGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAGCTGCACCCACTTCCCAGGCAACCTGCCTAACATGCTTCGAGATCTCCGAGATGCCTTCAGCAGAGTGAAGACTTTCTTTCAAATGAAGGATCAGCTGGACAACTTGTTGTTAAAGGAGTCCTTGCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCTGGGTTGCCAAGCCTTGTCTGAGATGATCCAGTTTTACCTGGAGGAGGTGATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCAGACATCAAGGCGCATGTGAACTCCCTGGGGGAGAACCTGAAGACCCTCAGGCTGAGGCTACGGCGCTGTCATCGATTTCTTOOCTGTGAAAACAAGAGCAAGGCCGTGGAGCAGGTGAAGAATGCCTTTAATAAGCTCCAAGAGAAAGGCATCTACAAAGCCATGAGTGAGTTTGACATCTTCATCAACTACATAGAAGCCTACATGACAATGAAGATACGAAACTGA-3'.
實施例Ⅳ專對CSIF的單克隆抗體用以COS7細胞表達的人CSIF半提純制劑使一支Lewis雄大鼠免疫。用大約50μg的在弗羅因德氏完全佐劑中的人CSIF使該鼠第一次免疫，然后用同量的在弗羅因德氏不完全佐劑中這種物質增強兩次。取檢測用血。該動物被給予磷酸鹽-緩沖鹽水中的25μg的最后加強，4天后獲得用于融合的脾。
將大約3×108個大鼠脾細胞與同數的p3×63-AG8.653小鼠骨髓瘤細胞(自ATCC以登記號CRL 1580可得)融合。以每井5.7×104個親代骨髓瘤細胞給3840微滴平板井接種。接著進行融合和培養雜種的標準程序(如述于Chretien et al.J.Immunol.Meth.，Vol.117，pgs.67-81(1989))。融合12天后收集上清液，然后在用產生于CSIF中的人COS7細胞涂覆的PVC板上用間接ELISA進行篩選。用這種方式鑒定雜交瘤JES3-19FI，并保存在American Type Culture Collection。
產生阻斷抗體的雜交瘤從開始被篩選出的雜交瘤中，按其產生在PHA-激致的人PBL中抗CSIF-誘發的抑制IFN-r合成的抗體的能力進行選擇。
實施例Ⅴ人CSIF在細菌宿主中的表達由許多化學合成的雙鏈DNA斷片組合成合成的人CSIF基因，從而形成一個特指TAC-RBS-hCSIF的表達載體。在標準的細菌體系中，例如E.coliK-12菌株JM101、JM103或類似物中(述于VieraandMessing.inGene，Vol.19，pgs.259-268(1982))進行克隆和表達。使用標準程序進行核酸內切限制酶消化和連接酶的反應(該程序例如是Maniatisetal.，MolecualCloningALaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratory.NewYork，1982)。
這種堿性法(Maniatisetal，前已引證)被用于小規模的制備質粒。為大規模制備，使用該堿法的一種變型，在其中一份等容積的異丙醇被用于從該透明的溶解產物中沉淀出核酸。在氯化銫平衡密度離心分離和用溴乙錠檢查之前，帶有冷的2.5M乙酸銨的沉淀被用于取出RNA。
為進行過濾雜交，將Whatman540濾環用于提出菌落，這些菌落隨后被溶解。經用0.5M NaOH，1.5M NaCl 1M Tris-HCl(pH8.0)，1.5M NaCl(每次2分鐘)連續處理而被固定，然后在80℃加熱(30分鐘)。在6×SSPE，20%甲酰胺，0.1%十二烷基硫酸鈉，100mg/ml E.coli tRNA，100mg/ml考馬斯亮蘭G-250(Bio-Rad)中，溫度為42℃，時間為6小時，使用32P-標記的(Kinased)合成DNA(在800ml水中溶解174g NaCl，7.4g EDTA和27.6g NaH2PO4.9H2O而制成20×SSPE;用NaOH將pH值調到7.4，體積調到1升，并用高壓滅菌法使溶液滅菌)雜交。用1×SSPE，0.1%SDS將過濾器洗兩次(15分鐘、室溫)。放射自顯影后(Fuji RX膠片)，通過將再生的菌落與染成蘭色的菌落一起排列在該濾器上而將陽性菌落找出。用雙脫氧法使DNA排序(見Sanger et al.Proc.Natl.Acad，Sci.，Vol.74，pg 5463(1977)。雙脫氧反應的模板既可是經再次克隆在M13mp載體中的相關區域內的單鏈DNA(例如Messing et al.Nucleic Acids Res.，Vol.9，pg.309(1981))，也可是按微堿性制備的和用0.2M NaOH(5分鐘，室溫)變性的及通過添加2體積乙醇而從0.2MNaOH，1.43M乙酸銨中沉淀出的雙鏈DNA。按照使氨基磷酸酯化學，使用AppliedBiosystems380A合成器合成DNA。按照380A合成器說明書所述完成合成，去保護，分裂和提純(7M尿素PAGE，洗脫、DEAE-纖維素色譜)。
將欲被克隆的合成DNA的各互補鏈(每個400ng)相混，然后在50ml的反應容積內用多核苷酸激酶進行磷酸化。這種DNA與1mg經用適當的限制酶消化的載體DNA連接，連接是在50ml容積內，在室溫下用4-12小時進行的。磷酸化、限制酶消化、聚合酶反應和連接條件已經敘述(Maniatis等，上文已述)。通過沉積在用氨芐青霉素，導丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)(0.4mM)和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷(X-gal)(40mg/ml)補償的L瓊脂上，進行lacZ+菌落計數(當需要時)。
將DNA聚合酶填充在tacP-承載的質粒pDR540(Pharmacia)的單個BamHI位點構建TAC-RBS載體。然后將此載體連接到未磷酸化的合成寡核苷酸(Pharmacia)上，形成一種使編碼同感核糖體結合位點的雙鏈斷片(RBS，GTAAGGAGGTTTAAC)。連接后將該混合物磷酸化，并再與SstⅠ銜接體ATGAGCTCAT連接。然后用SstⅠ和EcoRI將該復合體分解，而該173bp斷片通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)而分離，并被克隆到EcoRI-SstⅠ-限制的pUC19(Pharmacia)(如后所述)。最終構建的RBS-ATG-聚銜接物區的序列(被稱為TAC-RBS)示于圖3。
用八個步驟將合成的CSIF基因組成一個pUC19質粒。克隆后，通過用插在步驟1中的ATG起始密碼子維持在密碼中的pUC19的lacZ(α)基因可檢測每步驟無缺失的插入物和/或插入物。通過對在含有x-gal和IPTG的L-氨芐青霉素的平皿上的蘭菌落進行計數，可以將有缺失和/或插入變化的克隆濾出。另外在每個步驟，在小規模質粒DNA制劑上使用通用順序引子可迅速地確定插入物的序列(所說制劑例如可得自BoehringerMannheim)。
在步驟1中，用SstⅠ將TAC-RBS載體消化，用T4DNA聚合酶對其處理(其3′-核酸外切酶活性消化SstⅠ切段的3′-突出鏈，結果形成鈍端斷片)，T4DNA聚合酶鈍化后，用EcoRI對其處理而形成含有TAC-RBS區和具有在ATC起始密碼子上的鈍端和在相對端的EcoRⅠ切段的173bp斷片。最后，將該173bpTAC-RBS斷片分離。
在步驟2中，將步驟1的被分離的TAC-RBS斷片與EcoRⅠ/KpnⅠ消化的質粒pUC19及合成斷片1A/B混合，如于后所示，該斷片在其上游末端具鈍端，而在其下游末端具有與KpnⅠ切段相應的交叉端。這個KpnⅠ端與BstE11位點的下端相鄰。將該斷片連接以形成步驟2的pUC19。
在步驟3中，將合成斷片2A/B和3A/B(示于后)與步驟2的BstEⅡ/Smal消化的pUC19(放大和純化后)相混合，然后連接以形成步驟3的pUC19。注意斷片3A/B的下游末端含有形成Smal鈍端的一些額外的堿基。這些額外的堿基在步驟4中被分開。斷片2A/B和3A/B還具有互補的9殘基單鏈端并通過混合對合，留下2A/B的上游BstEⅡ切段和3A/B的下游鈍端以連接成該pUC19。
在步驟4中，將步驟3的Aflll/XbaⅠ消化的pUC19(放大和純化后)經再提純、與合成斷片4A/B(示于后)混合、然后連接形成步驟4的pUC19。
在步驟5中，將步驟4的XbaⅠ/SalⅠ消化的pUC19(放大與合成斷片)與合成斷片5A/B(示于后)混合，并連接形成步驟5的pUC19。注意斷片5A/B的SalⅠ交叉端在步驟6中通過用HPal消化而除去。
在步驟6中，將步驟5的HPaⅠ/PstⅠ消化的pUC19(放大和純化后)與合成斷片6A/B(示于后)混合，再連接形成步驟6的pUC19。
在步驟7中，將步驟6的ClaⅠ/SphⅠ消化的pUC19(放大和純化后)與合成斷片7A/B(示于后)混合并連接成步驟7的pUC19。
在步驟8中，將步驟7的MluⅠ/HindⅢ消化的pUC19(放大和純化后)與合成斷片8A/B和9A/B混合并連接形成此最終結構。將此最終結構用常規技術插入E.coliK-12菌株JM101(如可從ATCC按登記號33876得到)。培養后，從JM101細胞中提取蛋白質，并測試提取物稀釋液的生物活性。
AGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAGCTGCACCCACTTC-TCGGGTCCGGTCCCGTGGGTCAGACTCTTGTCGACGTGGGTGAAG-CCAGGtAACCggtacGGTCCaTTGGc
斷片1A/BGtAACCTGCCTAACATGCTTCGAGATCTCCGAGATGCCTTCAGCA-GACGGATTGTACGAAGCTCTAGAGGCTCTACGGAAGTCGT-GAGTGAAGACTTTCTTTCTCACTTC斷片2A/BCAAATGAAGGATCAGCTGGACAACTTGTTcTtAAGTGAAAGAAAGTTTACTTCCTAGTCGACCTGTTGAACAAgAaTTC斷片3A/BGAGTCCTTGCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCTGGGTTGCCAAGCC-CTCAGGAACGACCTCCTGAAATTCCCAATGGACCCAACGGTTCGG-TTGTCTGAGATGATCCAGTTTTAtAACAGACTCTACTAGGTCAAAATaGAtC斷片4A/BCTaGAGGAGGTGATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCAGACATC-GAtCTCCTCCACTACGGGGTTCGACTCTTGGTTCTGGGTCTGTAG-AAGGCGCATGTtAACgTTCCGCGTACAaTTGcagct
斷片5A/BAACTCCCTGGGGGAGAACCTGAAGACCCTCAGGCTGAGGCTACGG-TTGAGGGACCCCCTCTTGGACTTCTGGGAGTCCGACTCCGATGCC-CGCTGTCATCGATctgcaGCGACAGTAGCTAg斷片6A/BCGATTTCTTCCCTGTCAAAACAAGAGCAAGGCCGTGGAGCAGGTG-TAAAGAAGGGACAGTTTTGTTCTCGTTCCGGCACCTCGTCCAC-AAGAAcGCgTgcatgTTCTTgCGcAc斷片7A/BCGCGTTTAATAATAAGCTCCAAGACAAAGGCATCTACAAAGCCAT-AAATTATTATTCGAGGTTCTGTTTCCGTAGATGTTTCGGTA-GAGTGAGTTTGACCTCA斷片8A/BATCTTCATCAACTACATAGAAGCCTACATGACAAT-CTCAAACTGTAGAAGTAGTTGATGTATCTTCGGATGTACTGTTA-GAAGATACGAAACTGACTTCTATGCTTTGACTtcga
斷片9A/B(印刷體小寫字母標志著與在同位上的天然序列不同的堿基)實施例Ⅵ專對CENKSKAVE-肽的抗體將50mg卵清蛋白(OVA)和50mg肌球蛋白(MYO)(如可取自Sigma)分別溶于10ml0.1M的碳酸氫鈉中，并在室溫下，于15mlFalcon試管(FalconPlastic，Oxnard，CA)或類似物中與1ml0.12的碘乙酰胺溶液(88mg碘乙酰胺溶于4ml0.1M碳酸氫鈉)反應1小時。將每種混合物于4RC對4升0.1M碳酸氫鈉透析一夜。分別地，在4ml試管中將10mgCENKSKAVE溶于2ml0.1M的二硫蘇糖醇)溶液(含50mMTris和2.5mM的EDTA，pH值為8)中，在37℃培養一夜;然后施于GF05凝膠濾柱(1.5×26.5cm)(LKB，Bromma.Sweden)上，再用含0.015M乙酸和0.005Mβ-巰基乙醇的肽洗脫緩沖液洗脫。將含還原肽的每份約為3.5ml的三份餾分在206nm用光密度鑒定，然后被收集，匯集，在干冰中冷凍并冷凍干燥一整夜。同時由透析物中回收OVA和MYO，并通過0.45微米過濾器過濾澄清。通過與溶在四氫呋喃(THF)(5mg/ml)中的380μl碘乙酸的N-羥基丁二酰酯(NHIA)分別混合(由Rector等人公開于J.Immunol.Meth.，Vol.24，pg321(1978))，在室溫下攪動30分鐘，對4升PBS(1.8gNaH2PO4-H20，7.2gNaH2PO4-H20;和溶于4升水中的34gNaCl)透析一夜而使OVA和MYO活化。分別地，使冷凍干燥的肽重懸浮于5ml硼酸鹽還原緩沖液(2gNa2B407.10H2O，17.4gNaCl和336mgEDTA-Na2溶于1升水，用濃HCl將pH值調到8.5，在氮氣中去氧15分鐘，其后添加178mg抗壞血酸)中。將經透析的碘乙酸化的OVA和MYO回收，分別與等體積的(最好是2ml)的含此肽的硼化物還原緩沖液混合，在室溫下培養一夜。將所得的結合體用SDS-PAGE(12.5%凝膠)分析。將含溶液的該結合體用PBS稀釋到1mg/ml，再進行無菌過濾并等分成便于免疫的體積(例如500微升)，和/或在4℃貯存。在大鼠和免(NewZealandWhite)二者中產生抗MYO結合體的多克隆抗血清。對兔的免疫程序如下開始(周O)提取10ml血清試樣作對照試樣。一周后(周1)將0.5ml肽-載體結合體與0.5ml弗羅因德氏完全佐劑混合并注射到腹膜內。三周后(周4)得到由0.5ml肽-載體結合物與0.5ml弗羅因德氏完全佐劑混合而構成的助促進劑。下一周(周5)再次得到另一個由0.5ml肽-載體結合體與0.5ml弗羅因德氏完全佐劑混合而構成的助促進體。再下一周(周6)也得到另一個完全相同的助促進體。在周7，從該動物身上抽取20ml血清。分離出細胞部分后，由ELISA測定血清陽性抗-CEN-KSKAVE值。除開始的注射液由0.15mlPBS和0.1ml肽-載體結合體與0.75ml弗羅因德氏完全佐劑的混合物構成，助促進體由0.15mlPBS和0.1ml肽-載體結合體與0.75mlF弗羅因德氏完全佐劑的混合物構成，并僅從該大鼠身上抽取2-3ml血清外，大鼠的免疫以類似于上述的程序進行。
本發明上述的實施例的描述一直是為解釋和說明的目的而提供的，不打算是詳盡的或將本發明精確地限于這種公開形式，并且很明顯，按照上述說明，很多改變和變化是可能的。為了最好地解釋本發明的原則，以借此能使本領域中的普通技術人員，以各種實施方式和用各種改進-這些方式和改進對予期的特殊用途是適宜的-來更好地利用本發明。本發明的范圍打算用附于本文的權利要求書來限定。
申請人已將帶有pcD(SRα)-F115、pH5C和pH15C的E.coliMC1061在AmericanTypeCultureCollection.Rockville.MD。USA(ATCC)，以登記號68027、68191和68192分別寄存。這些寄存物按ATCC′SagreementforCultureDepositforPatentPurposes所提供的條件制備，這些條件將使遵循35USC122和37CFR1.14者從美國專利和商標局可得到這些寄存物，并使公眾根據要求保存該寄存物的美國專利出版物得到這些寄存物。該被寄存的菌落的可獲得性不被解釋為對違犯任何政府的行政部門根據專利法所授的權利的許可。
該寄存物已經改進以符合BudapestTreatyontheDepositionofMicroorganisms的要求。
權利要求
1.基本上不含任何的其它哺乳動物蛋白質的哺乳動物細胞激動素合成抑制因子。
2.權利要求1的化合物，其中所述的哺乳動物細胞激動素合成抑制因子是基本上不含任何其它的人蛋白質的人細胞激動素合成抑制因子。
3.權利要求2的化合物，其中所述的人細胞激動素合成抑制因子選自由下列氨基酸序列定義的開放讀碼的成熟的多肽組中，所述的氨基酸序列如下MHSSALLCCL VLLTGVRASP GQGTQSENSC THFPGNLPNMLRDLRDAFSR VKTFFQMKDQ LDNLLLKESL LEDFKGYLGCQALSEMIQFY LEEVMPQAEN QDPDIKAHVN SLGENLKTLRLRLRRCHRFL PCENKSKAVE QVKNAFNKLQ EKGIYKAMSEFDIFINYIEA YMTMKIRN.
4.權利要求3的化合物，其中所述的人細胞激動素合成抑制因子是按下述氨基酸序列定義的SPGQGTQSEN SCTHFPGNLP NMLRDLRDAF SRVKTFFQMKDQLDNLLLKE SLLEDFKGYL GCQALSEMIQ FYLEEVMPQAENQDPDIKAH VNSLGENLKT LRLRLRRCHR FLPCENKSKAVEQVKNAFNK LQEKGIYKAM SEFDIFINYI EAYMTMKIRN.
5.權利要求1的化合物，其中所述的哺乳動物細胞激動素合成抑制因子是基本上不含其它小鼠的蛋白質的小鼠細胞激動素合成抑制因子。
6.權利要求5的化合物，在其中所述的小鼠細胞激動素合成抑制因子是按下列氨基酸序列定義的QYSREDNNCT HFPVGQSHML LELRTAFSQV KTFFQTKDQLDNILLTDSLM QDFKGYLGCQ ALSEMIQFYL VEVMPQAEKHGPEIKEHLNSL GEKLKTLRMR LRRCHRFLPC ENKSKAVEQVKSDFNKLQDQ GVYKAMNEFD IFINCIEAYM MIKMKS.
7.一種編碼細胞激動素合成抑制因子的分離基因。
8.權利要求7的化合物，其中所述的細胞激動素合成抑制因子是人細胞激動素合成抑制因子。
9.權利要求8的化合物，其中所述的分離基因編碼按下列氨基酸序列定義的開放讀碼的成熟多肽，所述氨基酸序列為MHSSALLCCL VLLTGVRASP GQGTQSENSC THFPGNLPNMLRDLRDAFSR VKTFFQMKDQ LDNLLLKESL LEDFKGYLGCQALSEMIQFY LEEVMPQAEN QDPDIKAHVN SLGENLKTLRLRLRRCHRFL PCENKSKAVE QVKNAFNKLQ EKGIYKAMSEFDIFINYIEA YMTMKIRN.
10.一種能用連續核苷酸序列對呈現細胞激動素合成抑制因子的活性的多肽進行編碼的核酸，所說的核酸可與一個或多個由pcD(SRα)-F115，pH5C或pH15C的cDNA插入物在60℃時，在有5×SET存在下，或相當的條件下衍生的探針形成一種可探測的雜種。
11.權利要求10的核酸至少90%是與選自由pcD(SRα)-F115，pH5C和pH15C所組成的組中的載體的cDNA插入物的最大開放讀碼的成熟多肽的編碼區同源的。
12.權利要求10的核酸是自哺乳動物細胞源衍生的。
13.一種產生呈現人細胞激動素合成抑制因子活性的多肽的方法，該方法包括的步驟為構成一種包含為所述多肽編碼的核苷酸序列的載體，在其中該核苷酸序列可用由含該載體的一種宿主表達，并且在其中該核苷酸序列選自使由下列氨基酸序列定義的該開放讀碼的成熟多肽編碼的組中，所述氨基酸序列如下MHSSALLCCL VLLTGVRASP GQGTQSENSC THFPGNLPNMLRDLRDAFSR VKTFFQMKDQ LDNLLLKESL LEDFKGYLGCQALSEMIQFY LEEVMPQAEN QDPDIKAHVN SLGENLKTLRLRLRRCHRFL PCENKSKAVE QVKNAFNKLQ EKGIYKAMSEFDIFINYIEA YMTMKIRN;將該載體結合到該宿主中;并且在適于將該核苷酸表達在所述多肽中的條件下，在培養基中維持該宿主。
14.權利要求13的方法進一步包括將所說的多肽與所說的培養基及所說的宿主分離的步驟。
15.一種治療病人以控制與MHC連接的免疫反應相關聯的疾病的方法，該方法包括投入有效量的人細胞激動素合成抑制因子。
16.權利要求15的方法，其中所說的投藥步驟包括所說的人細胞激動素合成抑制因子靜脈供給量的范圍為每天約1-10μg/kg個體體重。
17.一種抑制病人中的細胞傳遞免疫反應的方法，該方法包括投入有效量的人細胞激動素合成抑制因子。
18.一種抑制在個體中的體液免疫反應的方法，該方法包括投入有效量的人細胞激動素合成抑制因子的拮抗物。
19.一種可表達在一宿主中的細胞激動素合成抑制因子蛋白質的表達載體。
20.權利要求19的表達載體，其中所說的宿主是哺乳動物。
21.權利要求20的表達載體，其中所說的細胞激動素合成抑制因子是人細胞激動素合成抑制因子。
22.權利要求21的表達載體選自由pH5C和pH15C所構成的組中。
23.權利要求19的表達載體，其中所說的宿主是細菌。
24.權利要求23的表達載體，其中所說的細胞激動素合成抑制因子是人細胞激動素合成抑制因子。
25.權利要求24的表達載體是由TAC-RBS-hCSIF構成的。
26.一種特定地接于人細胞激動素合成抑制因子的單克隆體。
27.權利要求26的單克隆抗體，其中所說的人細胞激動素合成抑制因子按下列氨基酸序列定義SPGQGTQSEN SCTHFPGNLP NMLRDLRDAF SRVKTFFQMKDQLDNLLLKE SLLEDFKGYL GCQALSEMIQ FYLEEVMPQAENQDPDIKAH VNSLGENLKT LRLRLRRCHR FLPCENKSKAVEQVKNAFNK LQEKGIYKAM SEFDIFINYI EAYMTMKIRN.
28.權利要求26的能抑制人合成抑制因子的生物活性單克隆抗體。
29.以下列氨基酸序列定義的人細胞激動素合成抑制因子，所說氨基酸序列為SPGQGTQSEN SCTHFPGNLP NMLRDLRDAF SRVKTFFQMKDQLDNLLLKE SLLEDFKGYL GCQALSEMIQ FYLEEVMPQAENQDPDIKAH VNSLGENLKT LRLRLRRCHR FLPCENKSKAVEQVKNAFNK LQEKGIYKAM SEFDIFINYI EAYMTMKIRN.
30.一種由6-30個氨基酸組成的肽，其序列與由下式定義的成熟人細胞激動素合成抑制因子的序列完全一樣，該式是SPGQGTQSEN SCTHFPGNLP NMLRDLRDAF SRVKTFFQMKDQLDNLLLKE SLLEDFKGYL GCQALSEMIQ FYLEEVMPQAENQDPDIKAH VNSLGENLKT LRLRLRRCHR FLPCENKSKAVEQVKNAFNK LQEKGIYKAM SEFDIFINYI EAYMTMKIRN.
31.權利要求30的肽由6-12個氨基酸組成，在其中所說的序列出現在由下式定義的所說的成熟的人細胞激動素合成抑制因子的一個部位中，該式為SPGQGTQSEN SCTHFPGNLP NMLRDLRDAF SRVKTFFQMK.
32.權利要求31的肽由氨基酸序列RDLRDA定義。
33.權利要求30的肽由6-12個氨基酸構成，在其中所述的序列出現在由下式定義的所說的成熟人細胞激動素合成抑制因子的一個部位中，該式為LEEVMPQAEN QDPDIKAHVN SLGEN.
34.權利要求34的肽由氨基酸序列ENQDPD定義。
35.權利要求30的肽，由6-12個氨基酸構成，在其中所說的序列出現在由下式定義的所說的成熟人細胞激動素合成抑制因子的一個部位，該式為CHRFLPCENK SKAVEQVKNA FNK.
36.權利要求35的肽由氨基酸序列ENKSKA定義。
全文摘要
本發明提拱的細胞激動素合成抑制因子(CSIF)的哺乳動物基因和蛋白質能抑制與延遲型超敏反應有關的細胞激動素的合成，并與拮抗劑一起可用于治療與細胞激動素不平衡有關的疾病，例如利什曼病和其它寄生蟲感染，以及包括產生過量干擾素-γ引起的與MHC有關的自免疫疾病的某些免疫紊亂。
文檔編號C07K14/00GK1051393SQ90106678
公開日1991年5月15日 申請日期1990年6月27日 優先權日1989年6月28日
發明者蒂莫菲·R·莫斯曼, 凱文·W·穆爾, 馬塔·W·邦德, 保羅·J·M·比埃拉 申請人:先靈公司