瘧疾疫苗的制作方法

專利名稱：瘧疾疫苗的制作方法
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本發明涉及預防瘧原蟲屬(Plasmodium)寄生蟲感染的疫苗，更具體地說，涉及可作為治療藥劑使用以抑制瘧疾寄生蟲感染的多肽，該多肽包括來自鄰接于瘧原蟲表面蛋白中心重復區的免疫原決定簇，以及來自該重復區的重復的免疫原決定簇(但比其總數要少);還涉及純化這些多肽的方法;并涉及編碼這些多肽的表達載體;還涉及治療人體以預防瘧疾感染的方法。
瘧疾是一種廣泛分布的嚴重疾病，盡管經過了多年的廣泛努力，仍然沒有研制出一種疫苗。參見Science226∶679(1984年11月9日)。通過用輻照過的孢子小體接種，已實驗性地在哺乳動物(包括人體)中預防過瘧疾病原體瘧原蟲的感染。Clyde等，Am.J.Trop.Med.Hyg.24∶397(1975)和Rieckman等，Bull，WHO57(Supp.1)261(1979)。Yoshida等在Science207∶71(1980)中報道，這種預防作用至少部分是由針對孢子小體表面蛋白的抗體介導的，即孢子小體外周(CS)蛋白;針對CS蛋白的單克隆抗體能在離體中中和感染性，并在活體中保護動物。CS蛋白在種內似乎具有高度的進化保守性，但在種間差別很大。
已知有四種瘧原蟲能感染人類。即惡性瘧原蟲(P.falciparum)、間日瘧原蟲(P.vivax)、卵形瘧原蟲(P.ovale)和瘧疾瘧原蟲(P.malariae)，后面兩種的發生率低得多。其他有科學意義的種有Plasmodiumbarghei和PlasmodiumKnowlesi，這些種的宿主分別為嚙齒類和猴類。
Kemp等人在WO84-02917-A中公開了惡性瘧原蟲cDNA在大腸桿菌中的克隆和表達。
Dame等人在Science225∶593(1984)中報道了惡性瘧原蟲CS蛋白在大腸桿菌中的克隆和表達。該蛋白被描述為含有大約412個氨基酸，分子量大約為44，000。它含有41個串聯的四肽重復單位。根據該重復區域合成的7、11和15殘基肽可與針對CS蛋白的單克隆抗體結合。
以惡性瘧原蟲CS蛋白的重復四肽為基礎的抗孢子小體疫苗一直未獲成功，它們只在少數個體中產生免疫作用，而且該免疫作用的持續時間很短。Science241∶522(1988)。因此，對于預防瘧疾寄生蟲的有效疫苗的需要仍然存在。
一般說來，本發明涉及一種多肽，它含有一個或多個來自瘧原蟲表面蛋白中心重復區的第一鄰接區的免疫原決定簇，一個或多個來自該重復區的第二鄰接區的免疫原決定簇，以及含有(但比其總數要少)或不含有中心重復區的重復的免疫原決定簇。
在一個具體方案中，本發明涉及的多肽含有至少一個瘧原蟲表面蛋白重復區的重復的免疫原決定簇，但比其總數要少，以及一個或多個瘧原蟲表面蛋白中鄰接重復區的區域中的免疫原決定簇。
在本發明的另一個具體方案中，該多肽含有差不多所有鄰接于中心重復區的區域中的免疫原決定簇，但不具有來自中心重復區的免疫原決定簇。另外，該多肽也可含有幾乎所有來自鄰接區域的免疫原決定簇，并進一步含有至少一個來自中心重復區的免疫原決定簇，但比其總數要少。
可用于本發明多肽的免疫原決定簇優選存在于惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、瘧疾瘧原蟲和卵形瘧原蟲表面蛋白中的決定簇。
在本發明的另一個具體方案中，該多肽通過基因工程與載體蛋白相融合，優選的載體蛋白是能增強多肽表達或增強多肽免疫原性或二者兼備的那些蛋白。
在一個優選的具體方案中，本發明的多肽包括一個免疫原載體蛋白，例如流感病毒非結構蛋白1的81 N端氨基酸(NSl81)，它通過合成的接頭與瘧原蟲孢子小體外周(CS)蛋白的第一鄰接區融合，后者本身又與CS蛋白的第二鄰接區融合。
這種多肽可進一步包括一個以上的來自CS蛋白中心重復區的免疫原決定簇，但比其總數要少，例如，來自含有氨基酸順序為Asn-X-Y-Pro的四肽的重復區的免疫原決定簇，其中X是Ala或Val，Y是Asn或Asp。來自中心重復區的免疫原決定簇例如可定位于載體蛋白和第一鄰接區之間，或定位于第一鄰接區和第二鄰接區之間。
本發明的另一方面包括編碼多肽的表達載體，含有該多肽的疫苗;純化多肽的方法;利用該多肽治療人體以預防瘧疾感染的方法。
本發明的其他方面和優點公開于下面的詳細說明中。


圖1(a)和1(b)給出了曲線形式的ELISA數據，表明了兩組C3H/HEN小鼠的抗體應答，一組用NSl81RLf△9免疫，另一組用R32tet32免疫;
圖2(a)和2(b)給出了曲線形式的ELISA數據，表明了兩組C57BL/6小鼠的抗體應答，一組用NSl81RLf△9免疫，另一組用R32tet32免疫;
圖3(a)和3(b)是曲線形式的ELISA數據，表明了兩組BLAB/C小鼠的抗體應答，一組用NSl81RLf△9免疫，另一組用R32tet32免疫。
瘧疾寄生蟲瘧原蟲是一種原生動物，其細胞外表有若干階段特異性蛋白。發現這些表面蛋白具有三種共同的區域，即重復的中心抗原決定簇區和成對的鄰接區域。其中第一鄰接區與中心重復區的羧端融合，第二鄰接區與中心重復區的氨端融合。
本發明的多肽來自瘧原蟲表面蛋白的一部分。它含有(但比其總數要少)或不含有第一和第二鄰接區之間的中心重復區的免疫原決定簇，并以足以用作治療藥劑以抑制瘧疾寄生蟲感染的數量進行表達。
換言之，本發明的多肽在第一和第二鄰接區之間的串聯重復單位比野生型重復區數目要少。因此，將此多肽用于預防人體的惡性瘧原蟲感染時，該多肽可包括完整的第一鄰接區，也即惡性瘧原蟲孢子小體外周蛋白(PfCSP)的N端鄰接區，完整的第二鄰接區，也即PfCSP的C端鄰接區，以及在第一和第二鄰接區之間少于41個的來自PfCSP的串聯重復單位，亦即少于41個的結構式為Asn-X-Y-Pro的四肽，其中X是Ala或Val，Y是Asp或Asn。
在野生型瘧原蟲的表面蛋白中，重復區域具有免疫優勢。在本發明的多肽中，以這樣的方式來選擇串聯重復或重復單位的數目和定位，使其不致掩蓋第一和第二鄰接區的免疫應答。最好是，本發明多肽中的重復單位不多于野生型蛋白中重復單位的一半。更優選的是，本發明多肽中的重復數目不多于野生型蛋白中重復數目的大約四分之一。
已知有四種瘧原蟲感染人類，最常見的是惡性瘧原蟲，其次是間日瘧原蟲，而瘧疾瘧原蟲和卵形瘧原蟲則較少見。
惡性瘧原蟲孢子小體階段的孢子小體外周(CS)蛋白的中心重復區含有41個串聯的重復四肽，其中有31個的氨基酸順序為Asn-Ala-Asn-Pro，其中有4個的順序為Asn-Val-Asp-Pro。在中心重復區的兩側是含有區域Ⅰ和區域Ⅱ的所謂鄰接區，CS蛋白的這兩個區域的氨基酸順序幾乎與P.knowlesi(一種猴瘧疾)CS蛋白的相應區域完全一致(Dame等，Science225∶593，1984)。
血液階段的惡性瘧原蟲的各種表面蛋白也具有重復的抗原決定簇，例如S抗原(Pro-Ala-Lys-Ala-Ser-Gln-Gly-Leu-Glu-Asp);RESA抗原(Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala);FIRA抗原(Val-Thr-Thr-Gln-Glu-Pro);以及PF-11抗原(Glu-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Val-Val-Pro)。
間日瘧原蟲的孢子小體外周蛋白含有重復的抗原決定簇(Gly-Asp-Arg-Ala-Asp-Gly-Gln-Pro-Ala)，瘧疾瘧原蟲的孢子小體外周蛋白含有重復的抗原決定簇(Asn-Asp-Ala-Gly)和(Asn-Ala-Ala-Gly)。
本發明的多肽包括一個或多個來自瘧原蟲表面蛋白中心重復區的第一鄰接區的免疫原決定簇，一個或多個來自重復區的第二鄰接區的免疫原決定簇，以及含有(但比其總數要少)或不含有來自中心重復區的重復的免疫原決定簇。
免疫原決定簇即誘導B細胞或T細胞應答的氨基酸順序。免疫原決定簇一般至少包括6個氨基酸。可通過標準技術精確鑒別蛋白質中的免疫原決定簇，包括單克隆抗體定位法和/或使氨基酸缺失后進行活性檢測。優選的是，本發明的多肽包括至少大約15個來自第一和第二鄰接區的各15個氨基酸;更優選的是至少大約30個;最優選的是完整的第一和第二鄰接區，但不包括信號順序。
在一個具體方案中，本發明的多肽包括至少一個來自瘧原蟲表面蛋白中心重復區的免疫原決定簇，但比其總數要少，以及一個或多個來自鄰接于表面蛋白重復區的區域的免疫原決定簇。
在另一個具體方案中，本發明的多肽包括幾乎所有來自中心重復區的鄰接區域的免疫原決定簇，但缺乏來自中心重復區的免疫原決定簇，或者也可以含有至少一個來自中心重復區的免疫原決定簇，但比其總數要少。“幾乎所有”是指差不多完整的第一和第二鄰接區，但不包括信號順序;優選的是，每個區域中缺少的氨基酸不多于大約20個，更優選的是，使用完整的第一和第二鄰接區，但不包括信號順序。
優選的是，本發明的多肽是雜交多肽，即由一部分表面蛋白和載體蛋白構成的基因融合的蛋白質。
更優選是這樣的雜交多肽其中的載體蛋白遺傳融合于惡性瘧原蟲孢子小體外周(CS)蛋白的一部分，此部分含有(但比其總數要少)或不含有構成中心重復區的重復四肽。
尤其優選的是這樣的雜交多肽其中的載體蛋白不僅增強攜帶多肽的免疫原性，而且增強轉化體對多肽的表達。這種載體蛋白的其他有利性質包括促進多肽的純化或配制。這種載體蛋白的實例包括NSl81(流感病毒(A/PR/8/34)非結構蛋白的81 N端氨基酸)(Baez等，Nucleic Acids Research 8∶5845，1980);R32(〔Asn-Ala-Asn-Pro)15-(Asn-Val-Asp-Pro)〕2)(Young等，Science 228∶958，1985);和galK。
本發明的多肽類型的具體例子包括NSl81-RLf△9。一種包括流感病毒非結構蛋白1(NSl81)81 N端氨基酸的融合多肽;以及惡性瘧原蟲CS蛋白含有區域Ⅰ的鄰接區，但不包括信號順序(18個N端氨基酸)，和含有區域Ⅱ的鄰接區，但不包括其最初9個N端氨基酸(RLf△9)。NSl81和RLf△9的融合通過合成的DNA人工接頭順序完成，該順序編碼Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-;
NSl81-RLfAuth，此融合多肽包括NSl81;惡性瘧原蟲CS蛋白含有區域Ⅰ的鄰接區，但不包括信號順序，和含有完整區域Ⅱ的鄰接區(RLfAuth);
NSl81-(Asn-X-Y-Pro)n-RLfAuth，此融合多肽包括NSl81、RLfAuth和(Asn-X-Y-Pro)，其中X是Ala或Val，Y是Asn或Asp，n是大于或等于1的整數，并小于或等于100，最好是小于50;此外，其中的(Asn-X-Y-Pro)定位于NSl81和RLfAuth之間;
NSl81RLfAuth+(Asn-X-Y-Pro)n，此融合多肽包括NSl81;RLfAuth;以及(Asn-X-Y-Pro)，其中X和Y如上述所定義，n小于41;而且，其中的(Asn-X-Y-Pro)定位于惡性瘧原蟲CS蛋白含有區域Ⅰ的鄰接區和含有區域Ⅱ的鄰接區之間，亦即原來由中心重復區所占據的區域。
然而，這些多肽只是作為舉例說明。根據本專利申請公開的內容，本領域的專業人員將會知道如何構建和測試本發明范圍內的其他多肽，例如，含有來自表面蛋白順序的多肽，包括惡性瘧原蟲以外的各種瘧疾寄生蟲的孢子小體外周蛋白，含有多于或少于來自表面蛋白的氨基酸的多肽，經過化學修飾的多肽，以及與其他或額外氨基酸或蛋白順序融合的多肽。這種多肽很容易通過基因工程和/或蛋白合成的標準技術構建，并能基本上如下所述在動物模型中進行測試。例如，本發明的蛋白可包括來自表面蛋白鄰接區域的氨基酸順序，例如缺乏中心重復區的幾乎完整的孢子小體外周蛋白，并在融合蛋白中與乙型肝病毒表面抗原(HBsAg)融合，該融合蛋白能夠形成雜交的HBsAg顆粒，如1988年8月17日公開的歐洲專利申請EP278，940中所述。
本領域的專業人員利用已知技術很容易得到表面蛋白鄰接區域、四肽、合成的DNA人工接頭順序和載體蛋白的基因編碼順序。這些技術包括合成，最好是通過信使RNA的反轉錄合成，或通過基因組DNA完整基因的直接克隆得到。惡性瘧原蟲信使RNA的反轉錄記載于Ellis等，Nature302∶536(1963)中。惡性瘧原蟲基因組DNA的完整基因的直接克隆記載于Dame等的同上文獻中。含有重復區的多肽的克隆和表達記載于1988年10月11日提交的07/256，229號共同未決專利申請中，該申請的公開內容作為本文的參考文獻。
在克隆了所有或部分瘧原蟲DNA以后，可以通過已知技術制備編碼所有或部分表面蛋白的片段。
合成DNA的技術是公知的，并可利用市售可得的DNA合成儀來完成。
多肽的編碼順序可插入大腸桿菌表達載體中，其中有許多都是公知的，并且很容易得到。用大腸桿菌實施本發明時，編碼本發明多肽的DNA順序在用于轉化大腸桿菌的DNA載體中以可操作方式與調節單元連接。許多包括這種調節單元的革蘭氏陰性細菌表達載體都可使用。該調節單元包括促進RNA聚合酶結合和轉錄的啟動子。優選為可調節的啟動子，即可誘導或可阻抑的啟動子。有大量啟動子可用于在大腸桿菌中表達異源多肽。包括trp啟動子和λPL啟動子(參見US4，578，355和Courtney等，Nature 313∶149，1985)。正如下面所詳細描述的，已經發現，本發明的多肽的編碼順序尤其適于通過大腸桿菌表達載體pMG-1進行表達。也可利用pMG-1的衍生物，它們編碼NSl81以外的載體蛋白，例如R32和galK。
用鏈霉菌(Streptomyces)實施本發明時，本發明多肽的DNA編碼順序在用于轉化鏈霉菌的DNA載體中以可操作方式與調節單元連接。該調節單元包括促進RNA聚合酶結合和轉錄的啟動子。優選的是可調節的啟動子，即可誘導或可阻抑的啟動子。有大量啟動子可用于在鏈霉菌中表達異源多肽。包括鏈霉菌半乳糖操縱子的半乳糖可誘導的啟動子(Fornwald等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84∶2130，1987)，變鉛青鏈霉菌(S.lividans)β-半乳糖苷酶基因的組成啟動子(Eckhardt等，J.Bacteriol.169∶4249，1987;Brawner等，US4，717，666)以及長孢鏈霉菌(S.longisporus)胰蛋白酶抑制劑基因的組成啟動子(歐洲專利申請87307260.7號)，或瞬時調節型啟動子如在棘孢小單孢菌(M.echinospora)中報道的啟動子(Baum等，J.Bacteriol.170∶71，1988)。在鏈霉菌中的轉錄終止區來自若干種鏈霉菌基因的3′端，例如在鏈霉菌半乳糖操縱子末端的終止信號，或在弗氏鏈霉菌(S.fradiae)新霉素磷酸轉移酶基因末端的終止信號(Thompson和Gray，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80∶5190，1983)。鏈霉菌中負責蛋白輸出的順序包括從變鉛青鏈霉菌β-半乳糖苷酶基因、變鉛青鏈霉菌LEP-10基因(歐洲專利申請87307260.7號)和長孢鏈霉菌胰蛋白酶抑制劑基因中分離的順序。
本發明多肽的編碼基因被摻入一個更大的DNA分子中，其中包括一個基因選擇標記系統。選擇標記系統可以是已知的標記系統中的任一種，使得該標記基因賦予轉化細胞可選擇的新表型即可。其實例包括鏈霉菌藥物抗性基因如硫鏈絲菌肽抗性核糖體甲基化酶(Thompson等，Gene20∶51，1982)、新霉素磷酸轉移酶(Thompson等，同上)和紅霉素抗性核糖體甲基化酶(Thompson等，同上文獻)。DNA分子還可含有在鏈霉菌中自動復制的順序，例如pIJ101衍生物(Keiser等，Mol.Gen.Genet.185∶223，1982)或SLP1衍生的載體(Bibb等，Mol.Gen.Genet.184∶230，1981)。DNA分子還可含有允許基因擴增的標記。這種標記物在鏈霉菌中幫助擴增基因拷貝數，包括壯觀霉素抗性基因(Hornemann等，J.Bacteriol.1692360，1987)和精氨酸營養缺陷型(Altenbuchner等，Mol.Gen.Genet.195∶134，1984)。
利用酵母實施本發明時，本發明多肽的DNA編碼順序在用于轉化酵母的DNA載體中以可操作方式與調節單元連接。具有轉化、克隆和表達系統的任何酵母宿主都可使用。具體實例包括漢遜酵母屬(Hansenula)、畢赤酵母屬(Pichia)、Kluveromyces、裂殖酵母屬(Schizosacharomyces)、假絲酵母屬(Candida)和酵母屬(Saccharomyces)的酵母。優選的酵母宿主是啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
調節單元包括促進RNA聚合酶結合和轉錄的啟動子。優選的是可調節的啟動子，即可誘導或可阻抑的啟動子。有大量啟動子可用于在酵母中表達異源多肽。包括銅可誘導的金屬硫因基因(CPU1)啟動子和糖酵解基因甘油醛-3磷酸脫氫酶(TDH3)和乙醇脫氫酶(ADH)的組成啟動子。酵母中的轉錄終止區來自數種酵母基因中任一種的3′端，例如異-1-細胞色素C(CYC1)基因。
本發明多肽的編碼基因被摻入一個更大的DNA分子中，其中包括一個基因選擇標記系統。選擇標記系統可以是已知的標記系統中的任一種，使得該標記基因賦予轉化細胞可選擇的新表型即可。其實例包括生物合成酶的酵母基因，例如磷酸核糖基鄰氨基苯甲酸異構酶(TRP1)或乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶(URA3)或異源藥物抗性基因例如G418抗性或苯菌靈鄰氨基苯甲酸異構酶(TRP1)或苯菌靈抗性(BEN1)。DNA分子還可含有在酵母中自動復制的順序，例如酵母2微米環形ori區或染色體自動復制區(ARS)，例如ARS1，以及酵母著絲粒(CEN)，例如CEN3，使得質粒能在酵母中自動復制。
還有其他一些表達系統也是已知的，并很容易得到。例如，有大量昆蟲細胞及其表達系統可以用來表達異源蛋白，例如用于在鱗翅目細胞中表達異源蛋白的棒狀病毒(baculovirus)表達系統。如果需要在真核表達系統中表達，也許有必要去掉表面蛋白的羧端固著區。例如，可能需要使氨基酸392-412缺失，此順序包括惡性瘧原蟲的羧端固著區(見1988年12月21日提交的共同未決的美國專利申請07/287，934，該申請公開的內容作為本文參考文獻)。
另一個可以例舉的表達系統公開于1988年7月28日提交的07/222，202號美國專利申請中，該公開文本作為本文的參考文獻，該申請涉及用選擇的異源基因轉化的沙門氏菌(Salmonella)菌株，所述基因以可操作方式與大腸桿菌的啟動子順序連接，該轉化體能夠組成性地表達異源基因的產物。
利用標準的蛋白分離技術，從生產細胞培養液中分離和純化這樣表達的多肽，這些技術大部分都是本領域公知的。作為舉例，可以采用的純化程序包括(1)細菌細胞的破碎，(2)細胞碎片的澄清，(3)使本發明的多肽從澄清的細胞提取液的其他多肽中分離出來，(4)最終純化以去除殘留雜物，包括殘留多肽、碳水化合物、核酸、脂多糖和內毒素。
在本發明的疫苗中，可以直接使用多肽的含水溶液，最好緩沖至生理pH。此外，可使多肽與多種已知佐劑中的任一種相混合，或吸收在其中。這種佐劑例如包括氫氧化鋁、胞壁酰二肽和saponons例如QuilA。作為進一步的舉例，可使多肽包囊于微型顆粒如脂質體中。作為進一步的選擇方案，本發明的多肽可與免疫刺激性大分子相結合，例如殺死的博德特氏菌(Bordetella)或破傷風類毒素。
疫苗制備的一般描述可參見《疫苗新趨勢及其發展》，Voller等編，UniversityParkPress，Baltimore.MD，USA(1978)。在脂質體中的包囊例如可參見Fullerton的4，235，877號美國專利。蛋白質與大分子的結合公開于Likhite的4，372，945號美國專利和Armor等的4，474，757號美國專利中。QuilA的應用例如可參見Dalsgaard等，ActaVet.Scand.18∶349(1977)。
每劑量份疫苗中的多肽用量為能誘導免疫預防應答而無顯著副作用的量。此用量根據所用的具體多肽和疫苗中是否有佐劑而不同。一般說來，每劑量份可含有1-1000μg多肽，優選為10-200μg。通過觀察主體內的抗體滴度和其他應答等常規研究，能夠確定具體疫苗中的最佳用量。在最初的接種之后，最好使主體在大約四星期內接受加強劑量，然后每6個月再加強一次，只要存在感染危險就不停止。
一般優選采用肌肉、皮下或靜脈內注射方式，但在某些情況下，也可采用其他途徑。例如，使用重組的沙門氏菌時，優選途徑為口服。
下述實例是說明性的，并不限制本發明。CS蛋白的編碼順序由JamesWeber，WalterReedArmyInstituteforResearch提供，其形式為λmPF1的2337堿基對EcoRⅠ片段(Dame等，Science225∶593，1984)，插在pUC8的EcoRⅠ位點中，這是一個標準的大腸桿菌克隆載體(例如可得自BethesdaResearchLaboratories，Inc.，Gaithersburg，MD)。所產生的pUC8衍生物稱為pUC8克隆1。
實例1 pNSl81RLf△9的構建pNSl81RLf△9的構建簡單概括如下。pCSP(見下述)是一種大腸桿菌的表達載體，它含有1216堿基對的片段，它編碼除最前面的18個氨基酸以外的完整的惡性瘧原蟲孢子小體外周(CS)蛋白。使第一等分試樣的pCSP用限制性核酸內切酶FokⅠ消化。填平(Klenow片段)后用限制性核酸內切酶BamHⅠ消化。通過電泳洗脫回收產生的318bp(堿基對)片段，它編碼CS蛋白的氨基酸19(Leu)至123(Pro)。
用限制性核酸內切酶TthlllⅠ消化第二等分試樣的pCSP，填平后用限制性核酸內切酶SalⅠ消化。通過電泳洗脫回收產生的655bp(堿基對)片段，它編碼CS蛋白的氨基酸297(Gly)至412(Asn)。(此順序缺乏含有區域Ⅱ的鄰接區的9個N端氨基酸，即288號(Pro)至296號(Gln))。
用限制性核酸內切酶BamHⅠ和SalⅠ消化大腸桿菌表達載體pUC18(見下述)，然后將CS蛋白基因的318bp(堿基對)和655bp(堿基對)片段連接在其中。產生的載體稱為pUCRLf△9。
用限制性核酸內切酶BamHⅠ消化pUCRLf△9，填平后用限制性核酸內切酶SalⅠ消化。通過電泳洗脫回收產生的1035bp片段，它編碼CS蛋白的氨基酸19至123和297至412。
用限制性核酸內切酶EcoRⅤ和XhoⅠ消化表達載體pMG-1(見下述)，它含有流感病毒非結構蛋白1的N端氨基酸1(Met)至81(Met)的DNA編碼片段和合成的DNA人工接頭順序。將預先從pUCRLf△9中分離的1035bp片段連接在pMG-1中。產生的表達載體稱為pNS1RLf△9，它編碼的蛋白具有如下順序NSl81-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123-CS297-412下面詳述pNSl81RLf△9的構建。
A.pCSP的構建用限制性核酸內切酶StuⅠ和RsaⅠ(各100單位)在400μl中緩沖液(含有50mM Tris，50mM NaCl，1mM二硫蘇糖醇(DTT)，10mM MgCl2，pH為7.5)中，使純化的pUC8的克隆1質粒DNA(40μg)，于37℃消化1.5小時。產生的1216 bp片段編碼除最前面18個氨基酸以外的(據信為CS蛋白的信號順序)完整的孢子小體外周(CS)蛋白，在6%聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)上電泳分離，通過電泳洗脫回收。
用限制性核酸內切酶BamHⅠ(25單位)在200μl中緩沖液(如上述)中使10μg表達載體pASl(ATCC 39262，詳情參見M.Rosenberg的4，578，355號美國專利)在37℃消化1.5小時。然后，使切割的質粒在25℃用DNA聚合酶Ⅰ大片段處理15分鐘(在20mM Tris-HCl pH7.5中含有5單位Klenow片段，7mM MgCl2，60mM NaCl，6mM2-巰基乙醇，四種脫氧核苷三磷酸各0.25mM，以填平BamHⅠ位點)。
然后，在30μl連接緩沖液中(含有50mM Tris，1mM DTT，10mM MgCl2，100μM rATP，pH7.5)，用1單位T4-DNA連接酶使孢子小體外周蛋白的基因片段(1μg)連接至此載體(100ng)中，連接反應于4℃進行16小時。
用連接混合物轉化大腸桿菌MM294Cl+株。得到氨芐青霉素抗性集落后，篩選pASl中插有CS基因片段的集落。鑒別到正確構建的質粒(pCSP)。
B.pUCRLf△9的構建用限制性核酸內切酶FokⅠ(100單位)在400μl中緩沖液(見上述)中使純化的pCSP質粒DNA(100μg)于37℃消化3小時。然后，質粒用DNA聚合酶Ⅰ大片段(上述)處理以填平FokⅠ位點。然后，用限制性核酸內切酶BamHⅠ(100單位)在400μl中緩沖液(上述)中使質粒于37℃消化3小時。產生的318bp片段編碼CS蛋白的氨基酸19-123，在6%聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)上電泳分離，通過電泳洗脫回收。
用限制性核酸內切酶TthlllⅠ(100單位)在400μl中緩沖液(上述)中使另一等分試樣的pCSP(100μg)于65℃消化3小時。然后，質粒用DNA聚合酶Ⅰ大片段(上述)處理以填平TthlllⅠ位點。然后，用限制性核酸內切酶SalⅠ(100單位)在400μl中緩沖液中使質粒消化3小時，產生的655bp片段編碼CS蛋白的氨基酸297-412，在6%聚丙烯酰胺凝膠上對其進行電泳分離，通過電泳洗脫回收。
表達載體pUC18(Yanish-Perron等，Gene33∶103，1985)是標準的大腸桿菌克隆載體(例如可得自BethesdaResearchLaboratories，Inc.，Gaithersburg，MD)，用限制性核酸內切酶BamHⅠ和SalⅠ(各20單位)在200μl中緩沖液(上述)中使10μgpUC18于37℃消化2小時。然后，在30μl連接酶緩沖液(上述)中，用1單位的T4-DNA連接酶使318bpBamHⅠ末端填平的/FokⅠ片段(1μg)和655bpTthlllⅠ末端填平的/SalⅠ片段(1μg)連接至pUC18中，連接反應于4℃進行16小時。鑒別到正確構建的質粒(pUCRLf△9)。
C.pMG-1的構建用限制性核酸內切酶BamHⅠ和SacⅠ(各50單位)在200μl中緩沖液(上述)中使10μg表達載體pMG27N-(M.Gross等，Mol.Cell.Biol.5∶1015，1985)于37℃消化3小時。
表達載體pAPR801(Young等，Pro.Natl.Acad.Sci.USA 80∶6105，1983)含有流感病毒(A/PR/8/34)非結構蛋白1(NS1)的編碼區(Baez等，Nucleic Acids Research 8∶5845，1980)，用限制性核酸內切酶NcoⅠ和BamHⅠ(各20單位)在200μl高緩沖液(50mM Tris-HCl，1mM DTT，10mM MgCl2，100mM NaCl，pH7.5)中使10μg pAPR801于37℃消化2小時。產生的230 bp片段編碼NS1的前面81個N端氨基酸，在6%聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)上對其進行電泳分離，通過電泳洗脫回收。
使40ng BamHⅠ/SacⅠ切割的pMG27N-(見上述)與80ng 230 bp的NcoⅠ/BamHⅠ NSl81編碼片段和80ng具有如下順序的合成的人工接頭連接AspHisMetLeuThrAspBamHI5′CATGGATCATATGTTAACAGATATCAAGGCCTGACTGACTGAGAGCT3′3′CTAGTATACAATTGTCTATAGTTCCGGACTGACTGACTC5′SacI
鑒別到所產生的質粒pMG-1，其中，NSl81編碼順序的BamHⅠ位點與pMG27N-的BamHⅠ位點相連;NSl81編碼順序的NcoⅠ位點與合成人工接頭的NcoⅠ位點相連;而合成人工接頭的SacⅠ位點與pMG27N-的SacⅠ位點相連。此載體中導入了單一的限制性位點，從而能夠在三個解讀框的任一個插入DNA片段，能在cⅡ核糖體結合位點處的ATG起始密碼下游的所有三個解讀框中插入TGA終止密碼，而在表達以后，則可從所有三個解讀框中產生NSl81融合蛋白。如上述用限制性核酸內切酶NdeⅠ消化pMG-1然后使載體連接，則導致非融合蛋白的表達(也即未與NSl81融合)。
D.pNSl81RLf△9的構建用限制性核酸內切酶BamHⅠ(100單位)在400μl高緩沖液(上述)中使表達載體pUCRLf(100μg)于37℃消化3小時。然后，用DNA聚合酶Ⅰ大片段(上述)處理切割的質粒以填平BamHⅠ位點的末端。然后，用限制性核酸內切酶SalⅠ(20單位)在400μl中緩沖液(上述)中使質粒于37℃消化3小時。在6%聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)上電泳分離產生的1035bp片段，通過電泳洗脫回收。
用限制性核酸內切酶EcoRⅤ和XhoⅠ(各25單位)在400μl中緩沖液(上述)中使表達載體pMG-1(10μg)于37℃消化3小時。然后，在30μl連接酶緩沖液(上述)中，用1單位T4-DNA連接酶使來自pUCRLf的1035bpBamHⅠ末端填平的/SalⅠ片段(400μg)連接至此載體(100ng)中，連接反應于4℃進行16小時。
用連接混合物轉化大腸桿菌MM294Cl+株。得到氨芐青霉素抗性集落之后，篩選含有正確定向的插入基因的克隆。鑒別到正確構建的質粒(pNSl81RLf△9)，將其轉化至大腸桿菌AR58株(CIts857)中，檢測孢子小體外周蛋白基因產物的表達，該產物缺乏最初18個N端氨基酸(CS1-18)、中心重復區和含有區域Ⅱ的鄰接區的9個N端氨基酸(CS248-296)(RLf△9)，并通過來自連接在pMG-1表達載體中的合成人工接頭的6個氨基酸(Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp)，與流感病毒非結構蛋白1的81個N端氨基酸即NS181相融合。NS181RLf△9具有如下順序NS181-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123-CS297-412使Asp(合成人工接頭的C端)與RLf△9(CS19-123-CS297-412)分開的脯氨酸是填平pCSP的BamHⅠ/FokⅠ片段的BamHⅠ位點時產生的偽跡。
使細胞在Luria-Bertani肉湯(LB)中于32℃培養至650nm處的吸光率(A650)為0.6，然后在42℃溫度誘導3小時，以啟動表達質粒中RL啟動子的轉錄，以及隨后的NS181CS蛋白衍生物轉譯。取1ml細胞的等分樣品，沉淀后再懸浮于溶胞緩沖液中(10mM Tris-HCl pH7.8，25% vol/vol甘油，2% 2-巰基乙醇，2% SDS，0.1%溴酚藍)，在105℃熱阻斷5分鐘。
通過SDS-PAGE(13%丙烯酰胺，30∶0.8丙烯酰胺∶二丙烯酰胺的比例)分離蛋白質。將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上，通過Western印跡分析檢測在大腸桿菌中產生的NS181RLF△9蛋白質，在分析中使用與CS蛋白的區域1反應的多克隆抗體(Dame等，Science 225∶593，1984)，以及與NS181蛋白反應的多克隆抗體。實驗還表明，大腸桿菌產生的NS181RLf△9蛋白與混合的5種單克隆抗體沒有反應活性，這些抗體針對惡性瘧原蟲CS蛋白的四肽重復區。
實例2 pNS181RLfAuth的構建用限制性核酸內切酶BamHⅠ和FokⅠ在中緩沖液中消化大腸桿菌表達載體pCSP(見上述)。通過電泳洗脫回收產生的DNA片段，它編碼含有區域Ⅰ的鄰接區，但沒有前面18個N端氨基酸。
用限制性核酸內切酶Tth111Ⅰ和SalⅠ在中緩沖液中消化第二等分試樣的pCSP。通過電泳洗脫回收產生的DNA片段，它編碼含有區域Ⅱ的鄰接區，但沒有前面9個N端氨基酸。
用限制性核酸內切酶BamHⅠ和SalⅠ在中緩沖液中消化大腸桿菌表達載體pUC18(見上述)。
為了恢復CS蛋白中心重復區C端側的區域Ⅱ的9個N端氨基酸(CS288-296)(它們是在用限制酶TthlllⅠ消化pCSP時丟失的)，制備一個含有FokⅠ和TthlllⅠ末端的合成的DNA片段，它具有如下順序AspProGlyAsnLysAsnAsnGLnGlyAsnGlyGlnFokI5′ATCCCGGGAATAAAAACAACCAAGGTAATGGACA3′3′GCCCTTATTTTTGTTGGTTCCATTACCTGTT5′Tth111I將BamHⅠ/FokⅠ片段、TthlllⅠ/SalⅠ片段和合成片段都連接至BamHⅠ/SalⅠ消化的pUC18中。
用限制性核酸內切酶BamHⅠ在中緩沖液中消化產生的質粒pUCRLfAuth，填平末端后用限制性核酸內切酶SalⅠ消化。通過電泳洗脫回收產生的DNA片段，它編碼真正的孢子小體外周蛋白，但缺乏前面的18個N端氨基酸和中心重復區。
然后，使分離的BamHⅠ末端填平的/SalⅠ片段連接至編碼NSl81的大腸桿菌表達載體pMG-1(見上述)中，后者已預先用限制性核酸內切酶EcoRⅤ和XhoⅠ消化。產生的表達載體是pNSl81RLfAuth，它表達具有如下順序的蛋白Nsl81-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123-Gly-CS288-412使區域Ⅰ和含有區域Ⅱ的CS鄰接區(CS19-123和CS288-412)分開的甘氨酸是合成的FokⅠ/TthlllⅠ DNA人工接頭順序的偽跡。
NSl81RLfAuth的完整的核苷酸和氨基酸順序如下
實例3 pNSl81RLfAuth+(NANP)2的構建用限制性核酸內切酶SmaⅠ在中緩沖液(見上述并含有KCl)中使pNSl81RLfAuth(上述)于25℃消化3小時。
將具有如下順序AsnAlaAsnProAsnAlaAsnPro5′AACGCAAACCCAAATGCAAACCCC3′3′TTGCCTTTGGGTTTACGTTTGGGG5′的合成的DNA人工接頭連接至SamⅠ消化的pNSl81RlfAuth中。合成的DNA人工接頭編碼(NANP)(代表氨基酸的單字母符號，N＝天冬酰胺(Asn);A＝丙氨酸(Ala);P＝脯氨酸(Pro))，此四肽包括CS蛋白中具免疫優勢的重復區的所謂共感順序。用限制性核酸內切酶SmaⅠ消化pNSl81RLfAuth后，使得任意數目的由合成的DNA人工接頭編碼的重復四肽可連接至CS蛋白中原來由具免疫優勢的重復區所占據的區域。通過這種方式，可在載體中連接進更多的編碼四肽的DNA片段。產生的質粒稱為pNSl81RLfAuth+(NANP)2，它編碼具有如下順序的蛋白質Nsl81-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123-(NANP)2-Gly-CS288-412實例4 pNSl81(NANP)4RLfAuth的構建用限制性核酸內切酶BamHⅠ消化表達載體pUCRLfAuth(見上述)。
將編碼(NANP)4的合成的DNA片段連接至BamHⅠ消化的pUCRLf中。該合成的DNA片段具有如下順序
產生的質粒稱為pUC18(NANP)4RLfAuth。
用限制性核酸內切酶BamHⅠ消化表達載體pUC18(NANP)4RLfAuth，填平末端(Klenow片段)后用限制性核酸內切酶SalⅠ消化，通過電泳洗脫回收產生的DNA片段。
將BamHⅠ末端填平的/SalⅠ片段連接至編碼NSl81的表達載體pMG1(上述)中，該載體已預先用限制性核酸內切酶EcoRⅤ和XhoⅠ消化。產生的質粒稱為pNSl81(NANP)4RLfAuth，在它所編碼的蛋白質中，由合成的DNA片段編碼的重復四肽插在NSl81的氨基酸81(Met)和NcoⅠ/SacⅠ合成DNA人工接頭的N端Asp之間Nsl81-(NANP)4-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123-Gly-CS288-412實例5 pNSl81(NVDP)4RLfAuth的構建pNSl81(NVDP)4RLfAuth的構建與上述pNSl81(NANP)4RLfAuth的構建基本相同，只是編碼(NVDP)4(CS蛋白中心重復區的另一種四肽順序)的合成的DNA人工接頭具有如下順序
所產生的質粒編碼具有如下順序的蛋白Nsl81-(NANP)4-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123-Gly-CS288-412實例6 從大腸桿菌中分離NSl81RLf△9在溫度敏感的λ溶素原(CIts857)中誘導NSl81RLf△9的合成之后，通過離心收集細菌細胞，產生的沉淀在-70℃溫度冷凍。用120ml溶胞緩沖液(pH8)稀釋大約12g濃縮的冷凍細胞以使其融解，該緩沖液含有50mM Tris，10mM EDTA，5%甘油和10mM DTT。在稀釋細胞中加入最終濃度為0.2mg/ml的溶菌酶(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)，使溶液在4℃攪拌30分鐘。用Branson聲波儀處理細胞，直到溶液外表顯現液化為止。加入最終濃度為0.1%(v/v)的10%脫氧膽酸溶液，用Sorvall RC 5B離心機(Dupont)使溶液在4℃以15，600XG離心30分鐘。
傾棄上清液，留下的含有蛋白的沉淀懸浮于100ml緩沖液(pH10)中，其中含有50mM甘氨酸，2mM EDTA和5%甘油。懸浮液如上述用聲波處理，加入最終濃度為1%(V/V)的Triton X-100(Sigma)。聲波處理后的溶液在4℃攪動30分鐘，然后如上述離心。
在含有蛋白的上清液中加入最終濃度為8M的脲，用50%的乙酸溶液將樣品液滴定至pH5.5。使樣品用25ml QAE Sepharose Fast Flow(Pharmacia)色譜柱層析，該柱已預先用含有20mM乙酸鈉，1% Triton X-100和8M脲的緩沖液(pH5.5)平衡，流速為300cm/小時。將未結合組分中的蛋白加到10ml SP Sepharose Fast Flow(Pharmacia)色譜柱中，該柱已預先用含有20mM乙酸鈉和8M脲的緩沖液(pH5.5)平衡，流速為120cm/小時。通過280nm處的光吸收率監測流出液。用含有100mM Tris和8M脲的緩沖液(pH8)從此柱中洗脫蛋白。
產物的SDS-PAGE顯示出一個表觀分子量為40，000kD的主帶，純度約為80%。純化過程產生12mg蛋白質，每毫克蛋白質中含有大約14單位內毒素。
實例7 從大腸桿菌中分離NSl81RLf△9在溫度敏感的λ溶素原中誘導NSl81RLf△9的合成之后，通過離心收集細菌細胞，產生的沉淀在-70℃溫度冷凍。用2200ml緩沖液(pH8.0)稀釋大約636g濃縮的冷凍細胞以使其融解，該緩沖液含有60mM Tris，12mM EDTA，6%甘油和12mM DTT。使融解細胞在6000-7000psi條件下兩次通過Manton Gaulin均化器。加入最終濃度為0.1%(v/v)的10%脫氧膽酸溶液，溶胞液在4℃攪動30分鐘，使其在Sorvall RC 5B離心機(Dupont)中以10，000XG在4℃離心60分鐘。
棄去沉淀，在含有蛋白的上清液中每毫升加入25μl1050或2100Biocryl小珠混合物(Supelco)。攪動溶液，并如上述離心。
棄去沉淀，在剩下的含有蛋白的上清液中加入固體硫酸銨，在5分鐘的期間內加至20%飽和度。
如上述使樣品攪動和離心。沉淀懸浮于400ml含有20mM乙酸鈉、1% Triton X-100和8M脲的緩沖液(pH5.5)中。使懸浮液離心，上清液在含有100mM Tris和8M脲的緩沖液(pH8.0)中透析。將滯留液調節至pH5.5，并在100ml SP Sepharose Fast Flow(Pharmacia)色譜柱中層析，該柱已預先用含有20mM乙酸鈉、1% Triton X-100和8M脲的緩沖液(pH5.5)平衡，流量為10ml/分。用平衡緩沖液洗滌柱子，然后用含有0.1MTris和8M脲的緩沖液(pH8)洗滌。柱子用500ml 0.0至0.5M氯化鈉溶液進行線性梯度洗脫，該梯度洗脫液配制于含有0.1M Tris和8M脲的緩沖液(pH8)中。
蛋白質在0.3M氯化鈉濃度處被洗脫。合并含有產物的組分，用YM10膜在Amicon攪動池中使其濃縮，用含有20mMTris的緩沖液(pH3.0)作為透析液，然后在磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中透析。
產物的SDS-PAGE分析揭示出一個表觀分子量為40，000kD的主帶和一系列次要組分。純化后產生25mg蛋白，每毫克蛋白中含有144單位內毒素。
實例8從大腸桿菌中分離R16CSP在大腸桿菌中表達的R16CSP是如下制備的將從pUC8克隆1中分離的XhoⅡ片段(上述)連接至預先用限制性核酸內切酶BamHⅠ消化的pCSP(上述)中。R16CSP在實例9中用作ELISA捕獲抗原，它是如下述純化。
在大腸桿菌中誘導R16CSP的合成之后，通過離心收集細菌細胞，產生的沉淀在-20℃溫度冷凍。大約373g濃縮的冷凍細胞在1.43升緩沖液(pH3.0)中融解，該緩沖液含有50mMTris，10mMEDTA，5%甘油和10mMDTT。加入最終濃度為0.1%(v/v)的10%脫氧膽酸(w/v)溶液，然后使細胞在7，000psi條件下兩次通過Manton-Gaulin均化器。在均化液中加入最終濃度為0.5%的10%聚吖丙啶(polyethyleneimine)(BRL)溶液，此溶液在0.5MTrispH8.0緩沖液(w/v)中。使溶液在4℃攪拌1小時，在SorvallRC2B離心機(Dupont)中在4℃以13000xG離心45分鐘。
棄去沉淀，在上清液中加入固體硫酸銨，在5分鐘內加至35%的飽和度。攪動溶液，并如上述離心。
沉淀懸浮在含有300ml20mMTris和10mMEDTA的緩沖液中(pH8.0)。加入含有300ml8M脲、2.7升10mM乙酸鈉和4M脲的溶液，將pH立即調至4.0。使樣品如上述離心。
將上清液加在50ml SP-Sepharose Fast Flow(Pharmacia)色譜柱中，該柱已用含有20mM乙酸鈉和4M脲的緩沖液(pH4.0)平衡。用含有20mM乙酸鈉的緩沖液(pH5.0)洗滌柱子，然后用250ml含有0.0-1.0M氯化鈉線性梯度濃度的洗滌緩沖液洗脫。在大約0.3M氯化鈉濃度處洗脫出產物。
50ml一份離子交換產物的試樣用10%三氟乙酸(TFA)(v/v)調至pH2.3，在用0.1%TFA平衡的C4反相柱(Vydac，1×25cm)上進行色譜層析。在45分鐘內流過在0.1%TFA中的0-60%乙腈(ACN)線性梯度濃度的溶液，在大約60%ACN濃度處洗脫出產物。通過加入25μl/ml1M碳酸氫銨來中和反相產物。
大約45ml反相產物在含有2M鹽酸胍的緩沖液(pH5.0)中透析，在YM30膜(Amicon)上濃縮至20ml。10ml試樣在2.5×50cm Superose 12(Pharmacia)色譜柱中層析，該柱用含有2.0M鹽酸胍的緩沖液(pH5.0)平衡。在表觀分子量358kD處洗脫的蛋白在含有20mM乙酸鈉的緩沖液(pH4.5)中透析。
Superose產物的考馬斯(Coomassie)染色的SDS-PAGE顯現出兩個主帶，表觀分子量為72kD和70kD。最終產物的氨基酸分析和N端順序在期望值的15%之內。
實例9 小鼠對NSl81RLf△9的抗體應答為了評價其免疫原性，將純化的NSl81KLf△9抗原接種至3個小鼠品種中，即C57BL/6(H-2b);BALB/C(H-2d);C3H/HEN(H-2k)。以前已經表明，只有H-2b單倍型小鼠針對惡性瘧原蟲孢子小體外周蛋白重復的抗原決定簇產生抗體。抗原與Freund氏佐劑一起注射，利用酶聯免疫吸附檢測(ELISA)法篩選免疫動物的血清樣品。對照動物用R32tet32免疫，這是一種含有CS蛋白重復四肽的抗原。3個品種的小鼠在用NSl81RLf△9接種后，都產生了與孢子小體外周蛋白的非重復(鄰接)區反應的抗體。免疫原性檢測的詳情和結果如下。
三個品種的小鼠各分為兩個組，每組有4至5只小鼠。第一組動物用NSl81RLf△9免疫，第二組用R32tet32免疫(J.Young等，Science 228∶958，1985)。R32tet32含有兩個XhoⅡ片段，每個片段編碼具有如下順序的肽〔(Asn-Ala-Asn-Pro)15(Asn-Val-Asp-Pro)〕2。tet32是一種32氨基酸的肽，它是由解讀框中的四環素抗性基因編碼的。
根據實例6純化NSl81RLf△9，施用前使其與完全的Freund氏佐劑混合。每只小鼠(6-8星期齡)用50μg抗原皮下免疫，以200μl的劑量施用于右后角。對小鼠進行兩次免疫，第一次用在完全的Freund氏佐劑中含有50μg抗原的單一的200μl劑量。加強注射在4星期后進行，注射方法與第一次注射基本相同，只是使抗原乳化于不完全的Freund氏佐劑中。
第二次免疫7天之后使動物放血。合并一個組內所有動物的血液，在4℃溫度凝結過夜，離心分離血清，然后貯存于-70℃。利用ELISA測定合并的血清，看是否存在針對R32tet32、NSl81RLf△9或R16CSP產生的抗體。(R16CSP如上述制備和純化。)“夾層”ELISA作為捕獲抗原摻入有R32tet32、R16CSP和NSl81RLf△9，它們吸附在微量滴定板的小穴壁上。
通過在小穴中加入50μl含有0.75μg捕獲抗原和0.2μg煮沸過的酪蛋白的PBS溶液，使捕獲抗原吸附在微量滴定板的小穴壁上。此溶液如下制備將8μl(3.76μg)捕獲抗原加在2，5ml的溶液中，此溶液含有4μl 0.5%煮沸過的酪蛋白溶液(見下述)對5ml Dulbecco氏磷酸鹽緩沖液(PBS)(一種含水溶液，包括0.8% NaCl;0.217% Na2HPO4·7H2O;0.02% KH2PO4和0.02% KCl，pH7.4)。
在室溫保溫過夜后，吸出小穴內容物，平板上剩余的活性結合位點用煮沸的0.5%酪蛋白溶液阻斷(5g/升酪蛋白(J.T.BakerChemicalCo.);0.1g/升Thimersol(SigmaChemicalCo.);0.02g/升苯酚紅(SigmaChemicalCo.);900mlPBSpH7.4;100ml0.1NNaOH)，此溶液是與1%Tween20(SigmaChemicalCo.)的混合液(99∶1)。
小鼠血清樣品在含有0.025%Tween20的0.5%煮沸的酪蛋白溶液中稀釋為1∶100;1∶1000;1∶10，000;1∶100，000和1∶1，000，000。然后將受試血清加至穴中，保溫2小時后，除去血清，用含有0.05%Tween20的PBS溶液將小穴洗滌兩次。在小穴中加入與過氧化物酶結合的抗小鼠IgGAb，用與血清相同的稀釋液稀釋為1∶2000。保溫1小時后，吸出小穴內容物，用含有0.05%Tween20的PBS溶液洗滌3次，加入純凈的過氧化物酶底物溶液(Kirkegaard&Perry，根據廠家說明書制備)。過氧化物酶與底物的反應導致形成深綠色產物，色澤強度與血清樣品中的抗體量成正比。15分鐘后，用ELISA平板讀數儀在405至414nm處讀取結果，以光密度(O.D.)單位記錄。
結果示于圖1(a)和1(b)(在C3H/HEN中的抗體應答);圖2(a)和2(b)(在C57BL/6中的抗體應答);圖3(a)和3(b)(在BALB/C中的抗體應答)。
用NSl81RLf△9抗原對所有3個品種的小鼠C3H/HEN(H-2k)、BALB/C(H-2d)、C3H/HEN(H-2b)進行接種，導致形成與孢子小體外周蛋白非重復區強烈反應的抗體。對NSl81RLf△9捕獲抗原的反應活性比對R16CSP的活性稍強。(R16CSP捕獲抗原只檢測出針對CS蛋白非重復區的抗體，而NSl81RLf△9捕獲抗原能夠檢測抗NSl81和抗RLf△9抗體二者)。正如所期望的那樣，C3H/HEN小鼠不產生對于R32tet32的抗體應答，而C57B1/6小鼠卻產生。雖然BALB/C小鼠對R32tet32的抗體應答比C57BL/6的抗體應答弱得多(差別為1個對數值)，但此應答卻是在期望之外的，而且與文獻中關于這種單倍型小鼠對于(NANP)40的陰性應答的報道相反(Del Giudice等，J.Immunol.137∶2952，1986報道，在14個攜帶有9個不同的H-2單倍型的小鼠品種中(其中包括BALB/C(H-2d))，用沒有載體蛋白的(NANP)40免疫后，只有H-2b小鼠產生了針對(NANP)40的抗體應答。H-2d小鼠(BALB/C)根本沒有應答。但用(NANP)40與作為載體蛋白的鑰孔
血藍蛋白結合后免疫BALB/C小鼠卻的確能產生抗(NANP)40的抗體。
實例10孢子小體侵染的抑制(ISI)在此研究中，測定用NSl81RLf△9免疫的家免血清抑制惡性瘧原蟲孢子小體侵入肝細胞的性能，孢子小體發育和成熟為紅細胞外階段的位點。
用NSl81RLf△9免疫3個小鼠品種，BALB/C、C57BL/6、A/J，在完全的Freund氏佐劑或氫氧化鋁中施用，結果產生針對CS蛋白非重復區的高滴度抗體。然而，根據Hollingdale，M.R.等人，J.Immunol.132(7)∶909(1984)所描述的孢子小體侵染的抑制檢測法檢測時，這些小鼠的血清都不能阻抑孢子小體侵入培養的人類肝癌細胞(HepG2-A16)。
與此相反，用100μg NSl81RLf△9免疫新西蘭白家兔后，即在第0、3和7星期在完全的Freund氏佐劑中施用，能誘導出針對CS蛋白非重復區的高滴度抗體(盡管低于在小鼠中測到的值)。然而，根據Hollingdale的ISI檢測法測定時，證實用NSl81RLf△9免疫的家兔血清能顯著抑制孢子小體對肝癌細胞的侵入(在一個動物中為98%，平均抑制為大約60%)。
來自用NSl81RLf△9免疫的家兔的血清，顯著抑制惡性瘧原蟲氯奎抗性株(7G8株)和惡性瘧原蟲氯奎敏感株(BF54株)的孢子小體侵入肝癌細胞。ISI測定的結果表明，惡性瘧原蟲7G8株的孢子小體侵入肝癌的抑制率(平均為85%)高于NF54菌株的抑制率(平均為60%)。
正常的人類肝細胞代替人類肝癌細胞進行ISI研究時發現，用NSl81RLf△9免疫的家兔血清抑制惡性瘧原蟲NF54株孢子小體浸入肝細胞(一只家兔的血清抑制89%，平均抑制率為大約45%)。
這些研究提示，孢子小體的存在將中和在NSl81RLf△9抗原上的抗原決定簇。
權利要求
1.一種多肽，它包括一個或多個來自瘧原蟲(Plsamodium)表面蛋白第一鄰接區的免疫原決定簇，一個或多個來自第二鄰接區的免疫原決定簇，以及包括(但比其總數要少)或不包括來自二者之間的重復區的重復的免疫原決定簇。
2.按權利要求1的多肽，它包括瘧原蟲表面蛋白的第一和第二鄰接區之間的重復區中的至少一個重復的免疫原決定簇。
3.按權利要求1的多肽，它包括第一鄰接區和第二鄰接區的基本上所有免疫原決定簇。
4.按權利要求1的多肽，其中的瘧原蟲表面蛋白的免疫原決定簇選自惡性瘧原蟲(P.falciparum)、間日瘧原蟲(P.vivax)、瘧疾瘧原蟲(P.malarial)或卵形瘧原蟲(P.ovale)中任一種的表面蛋白。
5.按權利要求3的多肽，它進一步包括瘧原蟲表面蛋白第一和第二鄰接區之間的重復區中的至少一個免疫原決定簇。
6.按權利要求1-5中任一項的多肽，它與一種載體蛋白相融合。
7.按權利要求1-6中任一項的多肽，其中的表面蛋白是孢子小體外周蛋白。
8.按權利要求6的多肽，其中的載體蛋白包括流感病毒非結構蛋白1的81個N端氨基酸。
9.按權利要求3的多肽，其中的第一鄰接區包括的氨基酸順序相應于惡性瘧原蟲CS蛋白的氨基酸19(Leu)至123(Pro)，第二鄰接區包括的氨基酸順序相應于惡性瘧原蟲CS蛋白的氨基酸297(Gly)至412(Asn)。
10.按權利要求1的多肽，其中的第一鄰接區包括的氨基酸順序相應于惡性瘧原蟲CS蛋白的氨基酸19(Leu)至123(Pro)，第二鄰接區包括的氨基酸順序相應于惡性瘧原蟲CS蛋白氨基酸288(Asn)至412(Asn)。
11.按權利要求9或10的多肽，它進一步包括具有式-(Asn-X-Y-Pro)n-的免疫原決定簇，其中X是Ala或Val，Y是Asn或Asp，n是一個整數，當免疫原決定簇位于鄰接區之間時n小于41，當免疫原決定簇位于鄰接區之前時n小于100。
12.按權利要求1的多肽，它具有如下的結構式NSl1-18-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123-CS297-412
13.按權利要求1的多肽，它具有如下的結構式NSl1-18-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123-Gly-CS288-412
14.按權利要求1的多肽，它具有如下的結構式NSl1-18-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123(Asn-X-Y-Pro)n-Gly-Cs288-412其中X是Ala或Val，Y是Asn或Asp，n是大于或等于1但小于41的整數。
15.按權利要求1的多肽，它具有如下的結構式NSl81-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123-(Asn-Val-Asp-Pro)n-Gly-Cs288-412其中n是大于或等于1但小于41的整數。
16.按權利要求15的多肽，其中n＝2。
17.按權利要求1的多肽，它具有如下的結構式NSl81-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123-(Asn-Val-Asp-Pro)n-Gly-Cs288-412其中n是大于或等于1但小于41的整數。
18.按權利要求1的多肽，它具有如下的結構式NSl1-81-(Asn-X-Y-Pro)n-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123-Gly-CS288-412其中n是大于或等于1但小于100的整數。
19.按權利要求1的多肽，它具有如下的結構式NSl1-81-(Asn-Ala-Asn-Pro)n-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123-Gly-CS288-412其中n是大于或等于1但小于100的整數。
20.按權利要求19的多肽，其中n＝4。
21.按權利要求1的多肽，它具有如下的結構式NSl1-81-(Asn-Val-Asn-Pro)n-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19-123-Gly-CS288-412其中n是大于或等于1但小于100的整數。
22.按權利要求21的多肽，其中n＝4。
23.一種編碼權利要求1的多肽的表達載體。
24.按權利要求23的載體，它是一種大腸桿菌的表達載體。
25.大腸桿菌表達載體pMG-1。
26.大腸桿菌表達載體pNSl81RLf△9。
27.大腸桿菌表達載體pNSl81RLfAuth。
28.大腸桿菌表達載體NSl81RLfAuth+(NANP)n，其中n是大于或等于1的整數。
29.大腸桿菌載體pNSl81(NANP)nRLfAuth，其中n是大于或等于1的整數。
30.大腸桿菌表達載體pNSl81(NVDP)nRLfAuth，其中n是大于或等于1的整數。
31.一種保護人類預防瘧原蟲孢子小體感染的疫苗，包括免疫具預防量的權利要求1的多肽。
32.一種治療人類以預防瘧原蟲孢子小體感染的方法，包括共同施用有效量的權利要求1的多肽和一種疫苗劑，從而誘導針對瘧原蟲孢子小體的抗體應答。
全文摘要
一種含有免疫多肽的瘧疾疫苗，該多肽包括一個或多個來自瘧原蟲表面蛋白中心重復區的第一鄰接區的免疫原決定簇，一個或多個來自重復區的第二鄰接區的免疫原決定簇，以及包括(但比基總數要少)或不包括來自中心重復區的重復的免疫原決定簇。
文檔編號C07K19/00GK1046937SQ9010262
公開日1990年11月14日 申請日期1990年5月2日 優先權日1989年5月3日
發明者米歇爾·斯圖爾特·格羅斯, 詹姆斯·弗朗西斯·楊格 申請人:史密絲克萊恩比徹姆公司