專利名稱：抗促卵泡激素單克隆抗體及其制備和使用的制作方法
技術領域：
本發明涉及單克隆抗體及其制備和使用方法。
促卵泡激素(FSH或follitropin)是由垂體分泌的一種糖蛋白激素。FSH及其它垂體糖蛋白激素(促黃體激素LH，促甲狀腺素TSH)均由α亞基和β亞基構成，這些激素的α亞基是相同的，而β亞基卻是不同的，它決定著各激素的特異性。
FSH與雄性動物和雌性動物的性功能有關，就雄性動物而言，FSH最重要的作用似乎是與精子成熟和營養有關，而對雌性動物來說，FSH起著促進卵發育和排卵的作用。在胚胎轉移過程中，外源性FSH可用于加速排卵，或增加排卵，以得到更高的生殖力。然而，治療動物的應答變化可能是主要問題，應答變化可能是因為批料變化和在FSH中存在污染物，尤其是有其它垂體糖蛋白激素、LH(促黃體激素)存在之故。
現有技術中，提取羊FSH(oFSH)已知的主要方法包括(ⅰ)利用乙醇和酸沉淀，由羔羊垂體腺制備oFSH粗提物(Sherwood，etal(1970)J.BiolChem.2452329-2336)，(ⅱ)硫酸銨沉淀(Reichcrt，L.E.inMethodsinEnzymologyVol.xxxvllFd.O′MalleyB.W.andHardmanJ.G.AcademicPressInc.N.Y.1975)。
按照該方法，通過分批加入冷乙醇或硫酸銨，沉淀出不需要的蛋白質。最后一次加入的乙醇或硫酸銨沉淀出活性組分及污染物。這些方法生產出含0.5-1.0iu/mg粗蛋白的FSH粗提物。
用垂體粗提物進一步提純的步驟包括凝膠過濾和離子交換層析(Sherwood，etal，1970，Sairam1979，Grinecti1974)，得到的純化產品的效能為每mg總蛋白含110至188單位FSH。
但是這些方法帶來大量花費，浪費時間而且從每個垂體腺中提取的產品量也很少，其結果難以大量滿足獸醫的使用，尤其是具有穩定效能的FSH。
因此，本發明的目的是克服或至少是減輕現有技術中諸多難點之一或幾個難點。
因此，本發明首先提供一種抗促卵泡激素(FSH)的單克隆抗體的制備方法，該方法包括提供能產生抗FSH抗體的B細胞和骨髓瘤細胞;
使B細胞與骨髓瘤細胞融合;
并繁殖生成的雜種瘤細胞。
根據本發明制備單克隆抗體的方法還包括采集所述雜種瘤細胞產生的抗體。
能產生抗FSH抗體的B細胞可選自試驗動物的脾細胞和淋巴細胞。該試驗動物可以是小鼠、大鼠等。該B細胞可從用FSH免疫的動物或從其致免疫的組織中獲得。BALB/C小鼠是最佳免疫動物。一次或多次免疫的動物可用作產生淋巴細胞或脾細胞的抗體源。最佳方法是用多次免疫的鼠的細胞用來制備融合細胞雜種。
骨髓瘤細胞可以是任何適宜的類型。現有技術中，眾所周知的從淋巴細胞瘤中形成的專門骨髓瘤細胞系，已用于產生雜種瘤的融合過程。
有幾個骨髓瘤細胞系可用來制備融合的細胞雜種，其中包括P3/x63-Ag8，NS-I型骨髓瘤細胞，例如P3/NSI/1-Ag4-1，Sp2/O-Ag14和S194/5XXO·BU·1。在本發明的實例中，NS-I型骨髓瘤細胞(取自BALB/C小鼠)是最佳細胞系。
為了產生抗體的脾細胞或淋巴結細胞和骨髓瘤細胞的雜種細胞，按照本發明的融合步驟包括將體細胞與骨髓瘤細胞混合，混合比例大約為20∶1至1∶1，以10∶1為最佳。在能促進細胞膜融合的一種或數種試劑存在下，進行融合。理想的是將同類動物用作融合過程中使用的體細胞和骨髓瘤細胞源。所用的促融合劑可包括仙臺(Sendai)病毒或聚乙二醇(PEG)。
因為融合方法在很低頻率(例如當脾用作體細胞源時，大約每2×105個脾細胞只得到1個雜種)下產生能活的雜種細胞，所以最好有一種能從未融合細胞中尤其是未融合的骨髓瘤細胞中選出融合的細胞雜種的方法。在其它產生融合的細胞雜種中，一種測定所需的能產生抗體的雜種瘤的方法也是必需的。
通常挑選融合細胞雜種的方法是在培養基中培育這些細胞，所用培養基只容許雜種瘤細胞生長，而不容許無限分裂下去的骨髓瘤細胞生長。用次黃嘌呤/氨基蝶呤/胸嘧啶(HAT)培養基來挑選融合細胞雜種，由于脾細胞的HPRT陽性基因型，則融合細胞雜種能在HAT培養基中幸存下來。在容許有遺傳能力的雜種細胞生長的培養基中，挑選有各種遺傳缺陷(如其它酶缺乏，藥物敏感性等)的骨髓瘤細胞也是有可能的。
在雜種瘤細胞系的無性繁殖和挑選時，應用高分辨的檢測方法有助于選擇具有所需特異性的單克隆抗體。
可用幾種標準分析法之任何一種，來檢測能產生抗體的雜種細胞，這些方法包括酶聯免疫測定法和放射免疫測定法。免疫組織法也可用于抗體測定和選擇，最佳測定法是應用放射性碘標記的oFSH的雙抗體放射免疫測定法，已經證明其它分析方法會導致假陽性結果。
一旦選擇了所需融合的細胞雜種，并無性繁殖成為產生抗體的細胞系，則每個細胞系可以兩種標準方法之任一種進行繁殖。雜種瘤的試樣可注入組織相容的動物體內，該動物能提供最初融合的體細胞和骨髓瘤細胞。注射后，動物生出瘤，該瘤分泌出由融合細胞雜種產生的特異單克隆抗體。該動物的體液，如血清或腹水可穿刺放液，以提供高濃度單克隆抗體。另外，每個細胞系可在實驗室培養皿中作體外繁殖。通過潷析、過濾或離心可獲得含有高濃度單一特異性單克隆抗體的培養基。
本發明的目的之二是提供一種能產生抗促卵泡激素的單克隆抗體的連續細胞系，其中包括由能產生抗促卵泡激素抗體的B細胞與骨髓瘤細胞融合而形的雜種瘤細胞。
最好通過NS-I骨髓瘤細胞與用促卵泡激素免疫的BALB/C小鼠體中得到的脾B細胞融合，形成雜種瘤細胞系，羊促卵泡激素(oFSH)制劑可用來使上述小鼠免疫。
用由羔羊或豬垂體腺提取的FSH與佐劑的混合物，使小鼠免疫。雜種瘤細胞系生長于營養溶液組織培養基中。當通過稀釋克隆反復地進行組織培養后分析純度時，該細胞系給出以100%頻率產生FSH特異克隆的抗體。
有意義的是雜種瘤細胞可稀釋克隆，以確保單細胞系的選擇。雜種瘤細胞至少可稀釋克隆4次，雜種瘤細胞系的具體實例是標記為BFR87-70和BFR87-124的細胞系，培養它們對抗羊FSH。
上述試樣保存于Bunge(Australia)Pty.Ltd.CellCollectionat89FlemingtonRoad，NorthMelbourne，Australia。本文所述的發明并不局限于列舉的雜種瘤細胞系范圍，由于這些實施例旨在說明本發明的一種目的，因此，產生功能上相當的單克隆抗體的任何等效細胞系均在本發明范圍內。下述雜種瘤細胞系試樣已保藏在歐洲動物的細胞培養物收藏中心(ECACC)。
培養物保藏號BFR87-70BFR87-124本發明目的之三是提供一種抗促卵泡激素的單克隆抗體，該單克隆抗體是由能產生抗FSH的單克隆抗體的連續細胞系產生的，其中包括能產生抗促卵泡激素抗體的B細胞與骨髓瘤細胞融合，形成雜種瘤。
可由如上所述的雜種瘤細胞系產生單克隆抗體。單克隆抗體的具體實例包括那些由雜種瘤細胞系標記為BFR87-70和BFR87-124形成的抗體，該細胞系的培養是為抗羊FSH。其樣品保藏在CellCollectionfacilityofBunge(Australia)Pty.Ltd.at89FlemingtonRoad，NorthMelbourne，Australia。
本發明目的之四是提供一種純化促卵泡激素(FSH)的方法，該方法包括提供一個不純的FSH源和與一種基質結合的抗FSH的單克隆抗體;以及將不純的FSH通過單克隆抗體基質，以俘獲FSH。
該提純方法還包括將單克隆抗體基質俘獲的FSH洗脫下來。
與基質結合的單克隆抗體可用上述的任一種單克隆抗體。
由于現有技術中公知方法均昂貴而耗時，并且產品純度低，因此能純化促卵泡激素的簡易方法具有重要意義。純化的FSH也具有重要意義，因為它在體內能提供更完善的生物學反應。例如，帶有LH的污染物降低了所給的FSH的作用。就人用藥物而言，高純度的FSH是極需要的。
通過單克隆抗體的親合色譜，純化FSH的技術得以發展從而提供了一種方法，該方法有可能提供大批量高純度的FSH。
高純度的FSH比現有不純的FSH產品具有某些獨特的優點。比較起來，現有商品FSH的每批號間差異很大，在體內應答的質量很差。用本文所述從不純的FSH批料中提純FSH，即使存在批間差別也是微乎其微的，并且在體內提供了更完善的應答。用各種試驗均能證明這種完善的應答。
本發明目的之五是提供一種純化的促卵泡激素(FSH)，最佳的純FSH是純羊FSH。
所用的基質可以是任何適宜類型，以色譜凝膠為最佳，可采用親合色譜凝膠。從Bio-Rad實驗室獲得的市售商標為AFFIGEL10的凝膠是最適宜的。AFFIPREP10中15(從Bio-rad實驗室獲得)也較適宜。
將不純的FSH通過單克隆抗體基質的步驟可以在任何適宜容器中進行，小規模純化時可用親合柱，而大規模純化應采用大容器或大桶。該大容器或大桶通過旋轉、振蕩或攪拌以確保不純的FSH和單克隆抗體基質之間充分接觸。最適宜容器是旋轉瓶。
可用任何適宜的洗脫液，從單克隆抗體基質上洗脫俘獲的FSH。可用有機酸溶液，也可用各種pH緩沖液，用檸檬酸鹽/檸檬酸緩沖液可除去柱中未結合的物質。
用PH約6.75至2.0的0.1M檸檬酸鹽/檸檬酸溶液分階洗脫是適宜的。
應用下述新技術可改進FSH的體內應答(ⅰ)高純度FSH，和(ⅱ)FSH的單克隆抗體。
本發明的目的之六是提供一種誘發雌性動物動情和/或增強其生殖力的方法，該方法包括給動物施加有效量的純化促卵泡激素。由此誘導動物進入動情期和排卵。
本文在說明書和權利要求中所用術語“動物”包括家畜動物，如綿羊、山羊、牛和豬等，也包括人在內的其它動物。
對綿羊和山羊可施以約2至10iu的羊促卵泡激素，對牛可施以約2至20iu促卵泡激素。
本發明目的之七是提供一種增加雌性動物在動情周期內的排卵數(排卵加速)的方法。該方法包括對動物施以有效量純促卵泡激素。排卵的數目至少可增加至最少時約5個，最佳時為15-20個。
對綿羊和山羊可施以約4至20iu促卵泡激素。
對牛可施以約4至20iu促卵泡激素。
業已公開促卵泡激素的單克隆抗體可阻滯和/或增強動物促卵泡激素的生物活性。
當FSH用于下述目的時，使用單克隆抗體控制體內FSH的生物活性是有利的。所述目的為(ⅰ)加速排卵;
(ⅱ)提高生殖力;以及(ⅲ)控制動情周期。
因此，上述的方法還包括在給予動物FSH的同時或之后，再施以約0.25-3.0mg由雜種瘤細胞系生成的抗FSH的純單克隆抗體。
可利用上述加速排卵的特點，給予低劑量FSH以增強生殖力，即動情期的雙生和多生。通過這些單克隆抗體與低劑量FSH合用，能較好地控制各特殊情況下的雙生。由于雙生是較容易的，而且更易重復，故不希望有的三生和多生的次數可減少。
本發明目的之八是提供一種通過增加排卵使雌性動物雙生的方法，該方法包括對動物施以有效量純化的促卵泡激素。
待試驗動物最好是綿羊、山羊或奶牛，施用的促卵泡激素的量約為2至20iu。
增加排卵使之雙生的更好方法還包括施以促卵泡激素的同時或之后，對動物施以約0.50至1.0mg由雜種瘤細胞系生成的抗促卵泡激素的純單克隆抗體。
本發明中誘發動情和/或提高生殖力的方法還包括在施以約FSH的同時或之后，對需處理動物再施以有效量的由雜種瘤細胞系生成的抗促卵泡激素單克隆抗體。
該單克隆抗體可以是上述任何一種抗體，并可以任何適宜的有效量施用，對綿羊和山羊可施以約0.25至1.0mg，牛可施以約1.0至3.0mg，豬可施以約0.2至0.5mg。
就加速排卵的方法而言，對綿羊和山羊可施以約0.5至2.0mg單克隆抗體，牛可施以約0.5至3.0mg。
當施以FSH單克隆抗體以控制體內的FSH時，最好精確估計所需劑量。
適宜的抗體劑量取決于下述幾個變量(ⅰ)所選擇的單克隆抗體;
(ⅱ)FSH劑量;
(ⅲ)FSH注入后抗體注入的時間;
(ⅳ)所用動物種類;
(ⅴ)動物的大小;以及(ⅵ)動物預處理的次數。
對于母羊和奶牛，使用單克隆抗體控制體內FSH無論是為了加速排卵以增強生殖力即雙生，還是為了誘發動情，上述這些方法也同樣適用于山羊、人、狗、貓、豬和其它哺乳動物。
所需抗體的有效劑量隨所用的抗體、動物的種類、FSH的治療劑量和注射FSH后施藥的時間而變化。例如，就最佳狀態而言，將約15至20iuFSH注入母羊，我們發現，根據上述的變量，可用約0.05至0.50mg抗體。該單克隆抗體可以與FSH同時給藥，或在FSH之后給藥。
在施以FSH的同時或在其之后施以單克隆抗體可改變FSH的生物活性，這種改變可降低或增強FSH的活性，FSH生物活性的增強和降低都可歸入同一生物活度。用“FSH-抗體”復合物可使FSH的效力強加5-10倍是可能的。
FSH和單克隆抗體分先后給藥和同時一起或分別給藥可形成抗體-FSH復合物，增強FSH的活性，導致更大的生物活性。
同樣，形成的抗體-FSH復合物不同可有效地降低FSH或已復合的FSH的生物活性，活性降低的原因是復合物的形成使FSH的生物活性消失。
本發明目的之九是提供一種測定動物促卵泡激素(FSH)的方法。該測定方法可用免疫熒光法、放射免疫法、酶聯免疫法或凝集法。就IgM免疫球蛋白類單克隆抗體而言，采用凝集測定法為最佳。血凝集測定法是最佳的。
就最佳狀態而言，以血凝集延緩測定法為佳。
試驗樣可以是任一種適宜的樣品，可采用血清、血漿、唾液或尿，或它們的提取物為樣品。
顯然可用目視法鑒定FSH的存在，FSH主要存在于血清中，結合在單克隆抗體的有效鍵合位置上。當加入被哺乳動物紅細胞包復的FSH時，沒抗體與此抗源有效地結合，結果導致抑制凝集作用。未凝集細胞在容器底部滑動，形成細胞黑點。
容器可以是任一種適宜容器，可用微滴定板或微滴定盤或試管。以圓底形微滴定板或盤為佳。可采用單克隆抗體作為溶液，可用磷酸鹽緩沖液。
本發明目的之十是提供一種能改變哺乳動物FSH生物活性的獸用或藥用組合物，其中包括以單位劑形供給的有效量單克隆抗體，該單克隆抗體選自以上所述的抗體或其混合物。
該獸用或藥用組合物還包括獸藥可接受的或藥物可接受的稀釋載體或其賦形劑。可以溶液的形式提供單克隆抗體，可用緩沖磷酸鹽緩沖液。
現以下述實施例更充分說明本發明，然而應理解，這僅僅為了說明而不應視作對以上所述的發明內容的限制。
實施例FSH單克隆抗體的制備對BALB/C小鼠腹膜內注入5mgoFSH或pFSH的純制劑(50iu/mg，根據Reichert(1957年)法沉淀的硫酸銨，接著經幾次離子交換層析步驟，用1∶1的完全弗羅因德氏佐劑(FCA)乳化的50μlPBS。這種免疫步驟一周內重復4次。在最終注射后一周，通過放射免疫法(RIA)測定小鼠血清中的FSH的反應性和特異性，血清取自小鼠尾巴。在融合前4天，通過尾靜脈注射100μg相同純度的oFSH或pFSH(50iu/mg)(溶于0.1mlPBS中)，以提高具有最高血清滴定度的小鼠的免疫力。
已接觸抗原的小鼠斷頭致死，在無菌操作下摘除脾臟，放在10mlGKN(1升二次蒸餾水中含0.8gNaCl，0.4gKCl，1.42g NaHPO4，2H1O，2.0gD葡萄糖和0.01g酚紅)中，用針挑開該脾組織取得脾細胞。通過離心收集細胞。離心收集(200g5分鐘，室溫)生長于組織培養基〔Dulbecco′s氏改良的Fagles培養基、DME和0.2%(重量/體積)碳酸氫鈉〕中的NS-I骨髓瘤細胞(2×107)P3/NSI/1-Ag4-1，并且重懸浮于10mlGIN溶液中。
在室溫下，于50ml離心管(Falcon)中混合脾細胞和NS-I骨髓瘤細胞，并于70g離心5分鐘，倒掉上清液，留下細胞，慢慢地輕拍該管子，使這些細胞重懸浮于極少量剩余的上清液中形成漿液，然后將1.5ml50%的聚乙二醇無菌液于37℃在緩慢攪拌下加入該漿液中，90秒鐘加完。該聚乙二醇(PEG，Art，9727聚乙二醇4000，Merck)無菌液是在密封容器中用1.0ml二次蒸餾水壓熱滅菌處理1.0gPEG而制得。再混合30秒鐘后，在2分鐘內于37℃謹慎地加入GKN，接著在3分鐘內再加入8ml。最后沿離心管壁緩慢加入30mlGKN。
該細胞懸浮液在室溫下立即以70g離心3分鐘，倒掉上清液在重懸浮于100mlHAT選擇性培養基(每l培養基含13.6mg次黃嘌呤、0.19mg氨基蝶呤和3.87mg胸腺嘧啶的組織培養基)之前，緩慢地輕拍該管，使形成細胞漿液。然后，將細胞懸浮液試樣(0.5ml)加到8個一組的24＃平底Linbro板(Flow實驗室)的每個＃中，每個＃含有1.5mlHAT選擇培養基(含1.5×106鼠胸腺細胞)，在融合前一天制備胸腺細胞，并在濕潤的5%CO2的環境中，于37℃下培養過夜。
在融合后13天，用RIA和組織免疫法測定上清液。在96＃平底Linbro板中，選擇的細胞用HAT選擇培養基的胸腺細胞稀釋克隆。
放射免疫測定法通常將ELISA(酶連接免疫吸附劑測定)系統作為檢測雜交瘤細胞上清液中單克隆抗體的方法。然而，在這類系統中，抗原產生于固相，即，粘附于塑性的ELISA板，由此許多科學家發表了不可靠的結果(Miller，K.F.，Goldsby，R.A，andBolt，D.J.J.Endocr.(1987)，115283-288)。為測試抗體(這種抗體要求供液相應用使用，即對抗體進行親合性的色譜并將其注入動物，作為對FSH活性的抑制劑)，研究開發了一種液相測定技術，下面對此進行描述。
一開始用雙抗體RIA測定分泌羊FSH抗體的雜種瘤細胞。用碘精(Pierce，United States of America)放射碘化oFSH的純制劑(75iu/mg，取自NIH Bethesda，United States of America)。在這一方法中，在玻璃管壁涂有1.2mg碘精情況下，將5ugoFSH與0.5mg125I(Amersham IMS 30)和50μl 0.1M磷酸鹽緩沖液(PH7.4)一起培養，在室溫下培養10分鐘后，用10ml G-25色譜柱從游離125I中分離出碘化的oFSH(125I-oFSH)。
將雜種瘤細胞上清液(100μl)加到裝有含每分鐘計數(CPm)125I-oFSH為約100，000的100μl0.1%BSA/PBS的聚苯乙烯試管(3DT管，Johns)中，在室溫下培養2小時后，加入100μl第二種沉淀抗體，該第二抗體是從免子體內得到的抗鼠抗體(RAM，affinity Purified Silenus Laboratories)，共軛于Spharose 4B(CnBr-Sepharose 4B，Pharmacia)旋轉振蕩后試管在室溫放置1小時，加入1ml冷(4℃)磷酸鹽緩沖液，在4℃下，這些管子立即以3，000rpm離心15分鐘，抽出上清液中結合125I-oFSH的非抗體，用γ分光光度計計算含oFSH的125I-oFSH單克隆抗體的沉淀。
免疫組織法從本地屠場收集新鮮組織(垂體腺)，置于Bouins溶液中固定2小時，然后置于甲醛液中過夜。修整該組織后，置于4℃的無水乙醇中，每小時換一次乙醇，換四次;然后在室溫下置于二甲苯中，換四次二甲苯;最后置于56℃液化的石蠟中，通過上述步驟，組織被包埋于石蠟中，然后讓其在4℃固化過夜。
用超蕩切片刀(Leitz)將石蠟包埋的組織切成6μm厚的組織薄片，并將其浮于取自1%凝膠(重量/體積)溫水浴的載物玻璃片上，然后將載物玻璃片在37℃保溫過夜，使組織切片粘牢。在使用前，把該切片放在下述每種溶液中分別保溫5分鐘再水合，所述溶液為二甲苯、無水酒精、淡無水酒精、70%酒精和流動水。
把雜種瘤細胞的凈上清液直接置于載物玻璃板上的組織切片上，在室溫下，將載物玻璃片置于潮濕盒子里保溫2-3小時。在用PBS輕度漂清后，用共軛于馬小蘿卜過氧化物酶(RAM-HRP，Dakopatt，Denmar)的免抗小鼠IgG覆蓋，該IgG是用含2%正常綿羊血清的PBS稀釋(1∶75)。然后，再保溫1小時，沖洗后，將載物玻璃片浸入基質液中，該基質液是將0.14g3，3′-二氨基芐基咪四氯化物溶于250ml0.01M檸檬酸緩沖液(PH5)和250μl30%過氧化氫中制得。在10分鐘后，停止該反應，用蒸餾水沖洗該載物玻璃片。
用哈里斯蘇木精和碳酸鋰復染色，然后分別用70%酒精、無水酒精、新蒸餾的無水酒精、二甲苯和新蒸餾二甲苯沖洗1分鐘，以固定染色。如果用本文獻介紹的典型方法染色垂體細胞細胞質，對FSH抗體來說可認為上清液是陽性的。
結果在對oFSH免疫的小鼠脾細胞上進行的細胞融合生產出兩種能產生oFSH抗體的雜種瘤細胞(結果見表1)。
表1RIA組織法BFR87-7030%+BFR87-12424%+a，總的125I-oFSH的最大結合;
b，+表示垂體細胞細胞質的染色。
將FSH的單克隆抗體通過親合色譜可改進FSH制劑的生物活性。當FSH與單克隆抗體偶合時，也能提高注入的FSH效力。
通過親合色譜層析，從粗提物中提取的具有生物活性的純FSH
能證實抗體的特異性，也可精確測定FSH的生物特性。
取每種單克隆抗體約200mg(取自細胞培養基或腹水)進行純化，并與凝膠Affigel 10偶合(16mg/ml)。為了建立最佳偶合和洗脫條件使用少量(200μl)凝膠制備親合凝膠柱。通過在200μl不同PH值的緩沖液中保溫10μl凝膠研究了這些最佳條件。在室溫下1個小時后，這些試管經離心，抽出未結合的125I-oFSH，然后用γ分光光度計測定含125I-oFSH的凝膠。
BFR87-70的最佳結合緩沖液結合計數結合率%0.1乙醇胺-HClpH11.02，6102PBS磷酸鹽pH7.468，920470.1M檸檬酸鹽/檸檬酸pH7.064，490440.1M檸檬酸鹽/檸檬酸pH6.058，710400.1M檸檬酸鹽/檸檬酸pH5.554，240370.1M檸檬酸鹽/檸檬酸pH5.053，270360.1M檸檬酸鹽/檸檬酸pH4.538，460260.1M檸檬酸鹽/檸檬酸pH4.019.550130.1M檸檬酸鹽/檸檬酸pH3.53，8202.60.1M檸檬酸鹽/檸檬酸pH3.03，4902.4為獲得最佳洗脫條件，在一系列試管中加入10μl凝膠和用PBS稀釋的125I-OFSH，然后保溫，結合有125I-oFSH的那些試管，加入不同PH值的緩沖液繼續保溫，接著離心和計數。
BFR87-70的最佳洗脫緩沖液結合計數洗脫率%0.1乙醇胺pH11.08，27091PBSpH7.490，78000.1M磷酸鹽pH7.086，56060.1M檸檬酸鹽/檸檬酸pH6.085，18080.1M檸檬酸鹽/檸檬酸pH5.580，12080.1M檸檬酸鹽/檸檬酸pH5.077，010210.1M檸檬酸鹽/檸檬酸pH4.535，800460.1M檸檬酸鹽/檸檬酸pH4.027，380670.1M檸檬酸鹽/檸檬酸pH3.512，160870.1M檸檬酸鹽/檸檬酸pH3.09，16091＊對照組的第一次保溫用PBS最佳結合是用PBS作為結合緩沖液，而將125I-oFSH從凝膠基質上最完全洗脫下來是用0.1M檸檬酸鹽/檸檬酸(PH3.0)緩沖液，由于FSH在PH3時不易受損害，故最好用PH3而不用PH11.0的緩沖液洗脫，詳見
圖1。
用2ml柱做試驗表明該方法是適宜的(表2)。
表2親合柱(2ml)加入125I-oFSH 3，047，800洗滌計數840，000(28%)鍵合計數2，200，000(72%)用PH3.0檸檬酸鹽/檸檬酸洗脫計數2，116，550鍵合計數的96%
可用柱或分批法進行大規模試驗。可采用Steelman和Pohley所介紹的FSH的hCG增強測定法(Endocrinology，53604-616，1953)，或利用Maughium-Rogister等的豬試驗受體測定法(Eur.J.Biochen.86121-131，1978)測試親和純化的FSH的生物活性。
這種經過純化制得的FSH，可保證其以精確的劑量給出。原始制劑中存在的原料變化及產生的問題可得到緩解。
這些羊和豬FSH的抗體可用于促進FSH活性的研究方法是將生物FSH和其抗體偶合，并將該復合體注入試驗對象體內。這種處理可顯著降低FSH的劑量率，由于純化FSH的成本較高，因此也可降低對FSH進行處理的費用。
最后，應該意識到，可作出各種其它的改進和/或變換，而不脫離這里所述的本發明的精神。
權利要求
1.一種抗促卵泡激素(FSH)的單克隆抗體的制備方法，該方法包括提供一種能產生抗FSH抗體的B細胞和一種骨髓瘤細胞；使B細胞與骨髓瘤細胞融合；并繁殖融合生成的雜種瘤細胞；以及采集所述雜種瘤細胞產生的抗體。
2.根據權利要求1的方法，其中能產生抗體的B細胞可從用羊促卵泡激素(oFSH)免疫的動物或從其致免疫的組織中獲得;以及骨髓瘤細胞系是一種NS-I型骨髓瘤細胞系。
3.根據權利要求2的方法，其中融合步驟包括在選自仙臺(Sendai)病毒和聚乙二醇的促融合劑存在下，將體細胞與骨髓瘤細胞混合。
4.根據權利要求3的方法，其中雜種瘤細胞繁殖步驟包括利用放射免疫測定法和免疫組織法測定產生抗體的雜種瘤細胞;接著將選擇融合的細胞雜種無性繁殖成為產生抗體的細胞系;以及每個細胞系在體內或體外繁殖。
5.產生抗促卵泡激素的單克隆抗體的連續細胞系包括由能產生抗促卵泡激素抗體的B細胞與骨髓瘤細胞融合而形成的雜種瘤細胞。
6.通過NS-I骨髓瘤細胞與用羊促卵泡激素免疫的BALA/C小鼠體中得到的B細胞融合，形成根據權利要求5所述的連續細胞系。
7.連續細胞系選自上述的BFR87-70和BFR87-124。
8.由產生抗促卵泡激素單克隆抗體的連續細胞系產生的抗促卵泡激素單克隆抗體包括能產生抗促卵泡激素抗體的B細胞與骨髓瘤細胞融合形成的雜種瘤細胞。
9.由選自上述的BFR87-70和BFR87-124連續細胞系產生的單克隆抗體。
10.一種純化促卵泡激素(FSH)的方法，該方法包括提供一個不純的FSH源和與一種基質結合的抗FSH的單克隆抗體;將不純的FSH通過單克隆抗體基質，以俘獲FSH，以及將俘獲的FSH從單克隆抗體基質洗脫下來。
11.根據權利要求10的方法，其中促卵泡激素是一種羊促卵泡激素(oFSH);與基質結合的單克隆抗體選自上述的BFR87-70和BFR87-124。
12.根據權利要求11的方法，其中所述基質是色譜凝膠，所述洗脫步驟包括用0.1M檸檬酸鹽/檸檬酸溶液分階洗脫。
13.用權利要求10的方法制備純促卵泡激素。
14.一種誘發雌性動物動情和/或增強其生殖力的方法，該方法包括給動物施以權利要求13所述的有效量的純化促卵泡激素。
15.根據權利要求14的方法，其中處理動物是綿羊或山羊，純FSH的給藥量約2至10iu。
16.根據權利要求15的方法，還包括在給予動物FSH的同時或之后，再施以約0.25-1.0mg由雜種瘤細胞系生成的抗FSH的單克隆抗體。
17.根據權利要求14的方法，其中處理動物是奶牛，施用的FSH的量約為2至20iu。
18.根據權利要求17的方法，還包括施以FSH的同時或之后，對動物施以約1.0至3.0mg由雜種瘤細胞系生成的抗FSH的純單克隆抗體。
19.一種在雌性動物一個動情期內顯著增加產卵數的方法，該方法包括給動物施以根據權利要求13所述的有效量純FSH。
20.根據權利要求19的方法，其中處理動物是綿羊或山羊，施用的FSH的量約為4至20iu。
21.根據權利要求20的方法，還包括施以FSH的同時或之后，對動物施以約0.5至2.0mg由雜種瘤細胞系生成的抗FSH的純單克隆抗體。
22.根據權利要求19的方法，其中所述動物是奶牛，施用的FSH的量為4至20iu。
23.根據權利要求22的方法，還包括施以FSH的同時或之后，對動物以由雜種瘤細胞系生成的抗FSH的純單克隆抗體。
24.一種增加排卵使雌性動物雙生的方法，該方法包括對動物施以根據權利要求13所述的有效量純FSH。
25.根據權利要求24的方法，其中所述動物是綿羊、山羊或奶牛，施用的FSH的量約為2至20iu。
26.根據權利要求24的方法，還包括施以FSH的同時或之后，對動物施以由雜種瘤細胞系生成的抗FSH的純單克隆。
27.一種獸用或藥用組合物，其中包括由雜種瘤細胞系生產的抗促卵泡激素(FSH)的有效量單克隆抗體;以及一種獸藥或藥物可接受的稀釋賦形劑或其載體。
28.根據權利要求27所述的藥用或獸用組合物，其中還包括根據權利要求13所述的有效量純FSH。
29.根據權利要求28的獸用或藥用組合物，其中所述純促卵泡激素是一種純羊促卵泡激素。
30.根據權利要求29的獸用或藥用組合物，其中所述組合物是一種緩沖鹽水溶液。
全文摘要
本發明涉及單克隆抗體及其制備方法和使用方法。制備方法包括提供一種能產生抗FSH的B細胞和一種骨髓瘤細胞，將它們融合并繁殖，產生雜種瘤細胞，采集雜種瘤細胞產生的抗體。使用方法包括將制備的單克隆抗體用于純化FSH，并將制得的純FSH單獨和將其與單克隆抗體合用于哺育動物，以誘發雌性動物動情和(或)增強其生殖能力。
文檔編號C07K16/00GK1035128SQ8910023
公開日1989年8月30日 申請日期1989年1月12日 優先權日1988年1月12日
發明者羅德尼·約翰·菲德斯 申請人:邦奇(澳大利亞)有限公司