環形生長激素釋放因子(grf)類似物及其制備方法

專利名稱：環形生長激素釋放因子(grf)類似物及其制備方法
動物的生長是由一聯串生物調節分子調節的。下丘腦產生一種叫做生長激素釋放因子(GRF)的物質，該物質再作用于垂體，引起生長激素釋放。垂體是通過生長激素釋放抑制因子和胰島素生長因子(IGF)保持負反饋控制。已經發現，GRF極為活躍，能促進血液中生長激素以每毫升微克的水平釋放。在大多數領域中，GRF可用于治療目的，可取代生長激素的應用，如可用來治療由于異常生長激素的產生而引起的垂體性矮小癥和糖尿病，加速傷口愈合，治療燒傷或延緩衰老過程。
GRF的成功分離部分基于下述發現，即與肢端肥大癥有關的腺瘤異位產生大量的GRF。已經分離出三種形式的GRF，它們具有同源氨基酸順序，但長度不同(44.40.37個氨基酸)。
具有44個氨基酸的酰胺化型GRF被認為是母體分子。已生產了多種合成類似物。它們包括多肽或其具有各種氨基酸取代物的類似物。所述多肽具有與最初分離的一種GRF或有生物活性的一段片段相同的氨基酸順序。已專門設計了若干改變形式，以獲得其生物性能比母體分子生物性能更為優越的合成類似物。因此，希望設計出具有如下特點的類似物，即在效力、有效性和穩定性等方面均具有最高的生物活性。
至今為止，所有已知的GRF類似物均是線性構型的。一般而言，線性肽是具有撓性的分子，缺乏十分確定的構象。當線性肽中的每個氨基酸暴露在周圍環境下時，它對酶和化學降解的敏感度更大。
所謂環形肽(內酰胺)是這樣的一種肽，即其酸性氨基酸(如Asp或Glu)的側鏈羧基末端經過所產生的酰胺與堿性氨基酸(如Lys)的側鏈氨基末端連接。
環肽與其線性類似物相比，其生物性質通常可改變。環肽更具撓性，有十分確定的構形和內氨基酸殘基，從而與周圍環境隔離。這些不同之處反映在肽的生物性質中。由于環肽具密實結構，使其對化學和酶降解不太敏感，因此作用時間更長。被隔離的內氨基酸殘基引起組織分布的改變，從而提高了環肽的生物利用率。此外，環肽的十分確定的構象，使其對靶受體具有更好的專一性，由此減少了產生不良生物副作用的可能性。就線性肽而言，具有中央和外圍受體的特定線性肽一般具有交叉活性，而具有受體的特定肽對另一種肽同樣具有相當大的交叉活性。
本發明涉及具有上述特定氨基酸順序的GRF線性類似物和環形類似物，包括其藥物上可接受的鹽。
本發明還涉及一種促進受治療者生長激素釋放的方法，該方法包括將有效量的本發明化合物施用于受治療者。
本說明書中所采用的符號和術語的定義如下1.環形肽或內酰胺，指一種肽，由酸性氨基酸(如Asp或Glu)的側鏈羧基末端通過酰胺鍵(內酰胺)與堿性氨基酸(如Lys)的側鏈氨基末端連接。
2.812指肽鏈中的第八個氨基酸“A”與鏈中的第
十二個氨基酸“B”連接，產生環內酰胺結構。
3.GRF指人體生長激素釋放因子，具有氨基酸順序的多肽，其氨基酸順序為5Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-1015Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-2025Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-3035Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-40Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2
4.[Leu27]GRF指具有與GRF相應氨基酸順序的多肽，其中甲硫氨酸殘基在27位被亮氨酸殘基取代。這類GRF類似物一般由GRF前面括號中的取代氨基酸表示。
5.GRF(1-29)指具有完整的開始29個氨基酸順序的GRF肽片段。一般情況下，GRF后括號中的數字相當于具有原來GRF順序的氨基酸位置，表示片段的N末端和C末端。
6.脫NH2Tyr′指在位置1從酪氨酸殘基脫除的氨基末端NH2。
7.OcHex指環己基。
8.DIEA指二異丙基乙胺。
9.DTE指二硫乙烷。


圖1表示本發明化合物促進鼠垂體細胞中生長激素釋放的效果。將兩種垂體(“pit”)腺(1∶4稀釋)浸在過濾測定器的各濾片上;該測定器通常測試生物活性。采用下列專用縮寫“rGH”表示重組長生激素，“[A15環8-12]GRF(1-29)-NH2”表示環8，12[Asp8，Ala15]-GRF(1-29)-NH2;“環(8-12)[D-Ala 2 Ala 15]GRF(1-29)-NH2”表示環8，12[D-Ala2，Asp8，Ala15]-GRF(1-29)-NH2，“環(8-12)[脫NH2Tyr 1 D-A2 A15](1-29)-NH2”表示環8，12[脫NH2Tyr′，D-Ala2，Asp8，Ala15]-GRF(1-29)-NH2以及“環(8-12)[脫NH2Tyr 1A 15](1-29)-NH2”表示環8，12[脫NH2Tyr1，Asp8，Ala15]-GRF(1-29)-NH2。
本發明包括下式所示的環肽及其藥物上可接受的鹽R1-R2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-A-Ser-Tyr-Arg-B-Val-Leu-R3-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-R4-R5-R6-x
式中R1＝Tyr，脫NH2-Tyr，Ac-Tyr，His，N-甲基-L-TyrR2＝Ala，D-Ala，N-甲基-D-AlaR3＝Gly，Ala，Leu，Val，Ile，Nle，NVal，β-Ala，α-AibR4＝Met，Leu，Nle，IleR5＝Ser，AsnR6＝氨基酸順序，選自Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu或其片段，其中從羧基末端開始片段減少1-15個氨基酸X＝OH、NH2、N(R7)(R8)，其中R7和R8＝H或低級烷基A＝Asp，Glu，α-氨基庚二酸，α-氨基己二酸B＝Lys，Orn，二氨基丙酸、二氨基丁酸其中A的側鏈羧基末端通過酰胺鍵同B的側鏈氨基末端連接。
較理想的是，式Ⅰ肽中的R1＝Tyr、脫NH2Tyr、N-甲基-L-Tyr;R2＝Ala、D-Ala;R3＝Ala;X＝NH2。
更為理想的是，上述式Ⅰ肽中的A＝Asp;B＝Lys(并且Asp的側鏈羧基末端通過酰胺鍵與Lys的側鏈氨基末端共價連接);R4＝Met;R5＝Ser;R6＝Arg。
尤其理想的是，肽中的R1＝Tyr，R2＝Ala，R3＝Ala，其結構式為Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2.
同樣特別理想的肽是其中R2＝D-Ala的肽，其結構式為Tyr-D-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2.
同樣理想的肽是式Ⅰ中R1＝脫NH2Tyr的肽。
特別理想的是其中R2＝Ala的一類肽，其結構式如下脫NH2-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2.
同樣特別理想的肽是其中R2＝D-Ala的一類肽，其結構式如下脫NH2-Tyr-D-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2.
本發明還包括上面特別提到的環肽的線性類似物。
可采用適宜的方法，如采用全部固相合成法、部分固相合成法、片段縮合或經典溶液合成等方法來合成肽。重組DNA技術也可用于僅含天然氨基酸殘基的類似物。較為可取的是，按照Merrifield在J.Am.Chem.Soc.85，2149(1963)中所述固相肽合成法，制備本發明的肽。在氨基酸α-氨基末端被保護的情況下，進行合成。同樣，用適宜的基團對帶有不穩定側鏈的三官能氨基酸進行保護，可防止肽集合過程中在不穩定側鏈發生化學反應。有選擇地脫除α-氨基保護基，以便隨后在氨基末端進行偶聯反應。脫除α-氨基保護基所用的反應條件不會導致側鏈保護基脫去保護。
α-氨基保護基是分步合成肽的技術中公知的一類基團，包括酰基型保護基(如甲酰基、三氟乙酰基、乙酰基)，芳族尿烷型保護基(如芐氧基羰基(Cbz)和取代的芐氧羰基)、脂族尿烷型保護基(如叔丁氧基羰基(Boc)、異丙氧基羰基、環己氧基羰基)和烷基型保護基(如芐基、三苯基甲基)。優選的保護基是Boc。Tyr側鏈保護基包括四氫吡喃基、叔丁基、三苯甲基、芐基、Cbz、4-Br-Cbz和2，6-二氯芐基。Tyr的優選側鏈保護基是2，6-二氯芐基。Asp側鏈保護基包括芐基、2，6-二氯芐基、甲基、乙基和環己基。Asp的優選側鏈保護基是環己基。Thr和Ser的側鏈保護基包括乙酰基、苯甲酰基、三苯甲基、四氫吡喃基、芐基、2，6-二氯芐基和Cbz。Thr和Ser的優選保護基是芐基。Arg側鏈保護基包括硝基、甲苯磺酰基(Tos)、Cbz、金剛烷氧基羰基或Boc。Arg的優選保護基是Tos。可用Cbz、2-Cl-Cbz、Tos或Boc對Lys側鏈氨基進行保護。2-Cl-Cbz是Lys的優選保護基。側鏈保護基的選擇基于以下因素，即在偶聯過程中側鏈保護基保持完整，并且在脫去氨基末端保護基時或在偶聯反應條件下不會分裂。在不改變所述肽的反應條件下，于最終肽的合成結束后，所述側鏈保護基必須是可脫除的。
通常使α-氨基已保護的(側鏈保護)氨基酸與適宜的固體載體連接，從待合成的肽的羧基末端進行固相合成。當氨基酸與氯甲基化或羥甲基樹脂連接時，形成酯鍵，并且所得的靶肽在C-端帶有游離羧基。另外，采用二苯甲基胺或對甲基二苯甲基胺樹脂。在此情況下，形成酰胺鍵，所得的靶肽在C-端帶有羧酰胺基。這些樹脂是市售的，其制備方法如Stewart等人在“固相肽合成”(2ndEdition，PierceChemicalCo.，Rockford，IL.1984)中所述。
C-末端氨基酸(在側鏈用Tos保護，在α-氨基功能團用Boc保護)為Arg時，采用包括二環己基碳化二亞胺(DCC)，N，N′-二異丙基碳化二亞胺或羰基二咪唑在內的各種激活劑，可將所述氨基酸與二苯甲基胺樹脂連接。與樹脂載體連接后，利萌宜幔═FA)或HCl，在二噁烷中，于0℃至25℃，脫除α-氨基保護基。引入甲硫氨酸(Met)后，將二甲硫加到TFA中，以抑制可能產生的S-烷基化。脫去α-氨基保護基后，按所要求的規程，將余下的已保護氨基酸分步連接，以獲得所需的肽順序。可用于該偶聯反應的各種激活劑包括DCC、N，N-二異丙基碳化二亞胺、(苯并三唑-1-基-氧)[三(二甲基氨基)]六氟磷酸鏻(BOP)和DCC-羥基苯并三唑(HOBt)。過量(＞2.5當量)地使用各保護氨基酸，通常在二甲基甲酰胺(DMF)、CH2Cl2或它們的混合物中進行偶聯反應。根據Kaiser等人在Anal.Biochem.，34，595(1970)中所述，通過水合茚三酮反應，監測偶聯反應每一步完成的程度。若偶聯反應不完全，則重復進行偶聯反應。可采用Vega 250一類的合成儀，應用生物系統合成儀或其他市售設備，自動進行偶聯反應。表1給出本發明的肽合成中一個典型的合成循環步驟。
表1 一個典型的合成循環步驟a步驟試劑時間1 1%DMS/CH2Cl21x1min2 50%TFA/CH2Cl2+1%DMS(v/v) 1x1min3 1%DMS/CH2Cl21x1min4 50%TFA/CH2Cl2+1%DMS(v/v) 1x20min5 CH2Cl23x1minb6 10%DIEA/CH2Cl21x5min7 CH2Cl22x1min8重復步驟6，79MeOH2x1min10 CH2Cl23x1min11a 2.5 eq.Boc-AA-COOH/CH2Cl25minCb 2.5 eq.DCC/CH2Cl260minc 1.5% DIEA/CH2Cl215min12重復步驟10，1113 CH2Cl22x1min14MeOH1x1min15 CH2Cl21x1minb
a測得洗滌及偶聯反應用溶劑的體積達15-20ml/g樹脂b開氏(Kaiser)水合茚三酮試驗c Boc-Arg(Tos)-OH用的DMF/CH2Cl2將所要合成的肽全部集合后，在0℃下，使肽-樹脂先后同TFA/二硫乙烷和諸如液態HF試劑反應1-2小時，用液態HF將肽從樹脂上切下，除去所有的側鏈保護基。
在固態載體上進行側鏈至側鏈的環化需要采用正交保護法。通過這種方法，可以有選擇地將酸性氨基酸(如Asp)的側鏈官能團同堿性氨基酸(如Lys)的側鏈官能團分開。為此，Asp側鏈可采用9-芴甲基OFm保護基，Lys側鏈可采用9-芴甲氧基羰基(Fmoc)保護基。在這些情況下，于含哌啶的DMF中，可選擇性地除去Boc保護的肽-樹脂側鏈保護基(OFm和Fmoc)。應用各種活化劑，包括DCC、DCC/HOBt或BOP，可在固體載體上實現環化。HF反應在上述經過環化的肽-樹脂上進行。
可采用肽化學中眾所周知的方法，將本發明的多肽純化。可采用高壓液相色譜(HPLC)法，提純本發明的多肽，然而，還可利用其他公知的色譜法，如凝膠滲透法，離子交換法和分配色譜法或逆流分配法進行純化。
本發明還包括如下方法，即將有效量的式Ⅰ肽施用于受治療者，以促進其體內生長激素的釋放。
本發明的多肽具有生長激素釋放的活性。本發明的藥物組合物包括分散在藥物上或獸用藥物上可接受的液態或固態載體中的長度約為29至44個氨基酸的類似物或這些類似物的任何無毒性的鹽。上述藥物組合物可用于人體或獸類治療或診斷藥物。例如，它們可用來治療與生長有關的一類疾病，如由于產生異常的生長激素而引起的垂體性侏儒癥和糖尿病。此外，它們可用來促進生長或提高飼養動物的進食率，以增加鮮肉，奶和蛋的產量。
本發明多肽的適宜施用劑量根據具體受治療者而定，更具體地說，取決于其生長激素的缺乏程度和治療的病情程度。根據與正常生長有關的已知的生長激素和本發明多肽的生長激素釋放活性的循環水平，專業人員能夠確定合適的劑量。具體地說，以受治療者的體重計，可采用0.04μg/kg/天至20.0μg/kg/天的劑量，來促進生長激素的釋放。用于促進牲畜生長活性的劑量顯著高于用于治療人體生長激素缺乏癥(如垂體性侏儒癥)的劑量(以受治療者的每公斤體重計)。牲畜一般以0.4μg/kg/天至100μg/kg/天的劑量經皮下施用，便可促進垂體生長激素的釋放。
本發明還提供了一種治療以生長激素缺乏為特征以及與生長有關的一類疾病的方法。該方法包括施用有效量的本發明的類似物，促進生長激素產生，達到正常生長的水平。
生長激素的正常水平存在個體差異，就具體個人而言，生長激素循環水平在一天內變化也很大。據報道，成人生長激素的正常血清水平約在0～10毫微克/毫升內變化，兒童生長激素的正常血清水平大約在0～20毫微克/毫升內變化。
為利用上述類似物有效地治療由垂體機能不良引起的侏儒癥，在正常生長時期進行治療。女性治療期一般不要距始經期太晚。因此，根據個人的具體情況，女患者的治療應在約12至16歲時進行。男性在青春期過后的較長一段時間里，仍有可能促進生長。因此，男患者的有效治療期可延至18至19歲，在某些情況下，可延至25歲。
本發明還提供了一種加快動物生長速度的方法。即施用有效量的類似物，促進生長激素以高于正常生長的水平釋放。
可以以人體或獸用的藥物組合物的形式施用本發明的多肽。所述的藥物組合物可通過常規制劑技術制備。可采用適于口服、靜脈內、皮下、肌內、腹膜內、鼻內或經皮用藥的組合物形式。藥用的適宜劑型中含大約0.01至0.5mg的本發明化合物，可將其凍干并與無菌水或生理鹽水再組合。應將該組合物維持在約pH5.0以下，以保持類似物的穩定性。還可將取自受治療者的血清白蛋白(例如人的血清白蛋白和奶牛牛血清白蛋白等)與其他公知的佐藥一起使用。
結合以下僅用于說明的實施例，描述本發明。
實施例1環8，12[Asp8，Ala15]-GRF(1-29)-NH2的合成Boc-Arg(Tos)-二苯甲基胺-樹脂的制備各用900mlCH2Cl2、MeOH、CH2Cl2、含25%Et3N的CH2Cl2(3倍)、CH2Cl2、MeOH和CH2Cl2洗滌二苯甲基胺-樹脂(60g，0.7meq/g，42meq)。加入含BOC-Arg(Tos)-OH(35.95g，84mmol，2eq)的DMF(80ml)-CH2Cl2(600ml)，將該混合物搖振5分鐘，加入DCC(17.3g，84mmol，2eq)，反應24小時。用DMF、CH2Cl2、MeOH和CH2Cl2對所得到的Boc-Arg(Tos)-BHA-樹脂進行洗滌。對等分液的氨基酸進行分析，結果表明;取代程度為0.38mmol/g。于25℃，用300ml 50%的Ac2O吡啶將樹脂乙酰化2小時，用CH2Cl2、MeOH、CH2Cl2洗滌，真空干燥，得到70g Boc-Arg(Tos)-BHA-樹脂(取代程度0.6meq/g)。-GRF(1-29)-二苯甲基胺-樹脂的制備按表1給出的步驟，將Boc-Arg(Tos)-BHA-樹脂(70g，0.6meq/g，42meq)脫去保護，并中和。三功能團氨基的保護如下Boc-Arg(Tos)、Boc-Asp(OcHex)、Boc-Glu-(OBzl)、Boc-Lys(2Cl-Z)、Boc-Ser(Bzl)、Boc-Thr(Bzl)、Boc-Tyr-(2，6-Cl2Bzl)、Boc-Asp8(OFm)和Boc-Lys12(Fmoc)。所述步驟的例外情況是Boc-Gln-OH(24位和16位)的偶聯以及緊接Gln(23位和15位)后的偶聯，其中于DMF中采用3當量對稱酐(雙聯)。在需要進行第三偶聯的特殊例子中，采用各為2.5當量的Boc-氨基酸、1-羧基苯并三唑和DCC，在DMF(120ml)中預活化，制備HOBt酯，然后過濾(脫除二環己基脲)，用甲苯稀釋至1.2l。偶聯反應進行了2小時后，加入1.5%二異丙基乙胺，再反應15分鐘。
除去一部分中間體[Ala15]-GRF(13-29)-BHA-樹脂(1.88g，0.714mmol)，如上所述，繼續分步進行固相合成。導入Lys12(Fmoc)后，用0.6%DIEA/CH2Cl2代替步驟6。通過用1-羥基苯并三唑(6.6當量)和DCC(6當量)預活化，用Boc-Asn-OH(6當量)接肽。
環8，12[Asp8，Ala15]-GRF(1-29)-NH2的制備在Boc-[Asp8(OFm)，Lys12(Fmoc)，Ala15]-GRF(1-29)-BHA-樹脂(2.72g，0.714mmol)結合后，用20%哌啶/DMF將樹脂脫去保護20分鐘，得到Boc-[Asp8，Ala15]-GRF(1-29)-BHA-樹脂。在含Et3N(157μl，1.12mmol，2.8eq)的DMF(40ml)中，與BOP試劑(443mg，1.0mmol，2.5eq)反應4小時，從而將一部分樹脂(1.40g，0.40mmol)環化。洗滌后，再環化兩次，時間分別為11小時和3小時(Kaiser水合茚三酮陰性試驗);并對該肽-樹脂進行洗滌、干燥，于0℃，用含DTE(1ml/g樹脂)的HF(約20ml)將肽鏈從樹脂上切下來，時間為2小時。將HF蒸發后，用EtOAc洗滌，以TFA(6×5ml)萃取，蒸發，用醚研制。
環8，12[Asp8，Ala15]-GRF(1-29)-NH2的純化和鑒定將粗制產物(708mg)懸浮于20mlH2O(0.025%TFA)中，攪拌，離心，過濾，利用Synchropak RP-P柱(20×50cm)進行提純[洗脫條件洗脫液(A)H2O(0.025%TFA)-(B) ACN(0.025%TFA);線性梯度20～45%(B)，120分鐘;流速4ml/分]。每隔1分鐘收集餾分。將餾分82-89匯集起來，凍干，得到84mg半純產物。從餾分90-93得到副產物(33mg)。利用Nucleosil C18柱(1.0×50cm;5μ)將半純物(84mg)再提純[洗脫條件洗脫液(A)H2O(0.1%TFA)-(B)ACN(0.1%TFA);線性梯度20-40%(B)，120分鐘;流速3ml/分]。每隔1分鐘收集餾分。將餾分120-121匯集起來，凍干，得到均勻產物(9mg)，由餾份122-138得到42mg產物，其純度高于97%。
hplc分析表明，該產物是均勻的。氨基酸分析(6MHCl，110°，24小時)Asp，2.72;Thr，0.96;Ser，2.98;Glu，2.14;Ala，4.00;Val，0.96;Met，0.97;Ile，1.89;Leu，4.28;Tyr，2.01;Phe，0.98;Lys，2.06;Arg，3.04，實施例2環8，12[脫NH2Tyr1，D-Ala2，Asp8，Ala15]-GRF(1-29)-NH2的合成除去一部分中間體[Ala15]-GRF(13-29)-BHA-樹脂(5.1g，1.63mmol)，按表1的步驟，繼續進行分步固相合成。加入Lys12(Fmoc)后，用0.6%DIEA/CH2Cl2代替步驟6。繼續進行合成，得到6.4g Boc-[Asp8(OFm)，Lys12(Fmoc)，Ala15]-GRF(3-29)-BHA-樹脂。將1.0g(0.255mmol)所得樹脂與Boc-D-Ala-OH進行一個循環的固相合成，得到Boc-[D-Ala2，Asp8(OFm)，Lys12(Fmoc)，Ala15]-GRF(2-29)-BHA-樹脂。將0.5所得樹脂與脫NH2Tyr-OH進行最后一個循環的固相合成，得到[脫NH2Tyr1，D-Ala2，Asp8(OFm)，Lys12(Fmoc)，Ala15]-GRF(1-29)-BHA-樹脂;用20%哌啶/DMF使所得樹脂脫去保護20分鐘。在含DIEA(0.3ml，2.2mmol)的DMF(20ml)中，用BOP試劑(170mg，0.384mmol，3eq)環化2小時。用新鮮的BOP試劑重復進行環化(Kaiser水合茚三酮陰性試驗)，(如上所述)，將肽洗滌，干燥，于0℃下，用HF(～10ml)，將肽從樹脂上切下來，時間為2小時。蒸發HF，隨后用EtOAc洗滌，用TFA萃取，蒸發，用醚研制，得到229mg粗制品。如上所述，用制備性hplc法對環8，12[Asp8，Ala15]-GRF(1-29)-NH2進行純化。
實施例3環8，12[脫NH2Tyr1，Asp8，Ala15]-GRF(1-29)-NH2的合成將1.0g(0.255mmol)部分的Boc-[Asp8(OFm)，Lys12(Fmoc)，Ala15]-GRF(3-29)-BHA-樹脂先后與Boc-L-Ala-OH和脫NH2Tyr-OH進行兩輪循環的固相合成，得到[脫NH2Tyr1，Asp8(OFm)，Lys12(Fmoc)，Ala15]-GRF(1-29)-BHA-樹脂;用20%哌啶/DMF使所得樹脂脫去保護20分鐘，在含DIEA(0.3ml，2.2mmol)的DMF(20ml)中，用BOP試劑(170mg，0.384mmol，3eq)環化2小時。用新鮮的BOP試劑重復進行環化，Kaiser水合茚三酮陰性試驗)，并對肽進行洗滌，干燥，于0℃下用HF(～10ml)將肽從樹脂上切下，所用時間為2小時。蒸發HF，隨后用EtOAc洗滌，以TFA萃取，蒸發，用醚研制，得到450mg粗制產物。如前所述，經制備性hplc法，將環8，12[Asp8，Ala15]-GRF(1-29)-NH2純化。
實施例4環8，12[D-Ala2，Asp8，Ala15]-GRF(1-29)-NH2的合成將0.5g取自例2的Boc-[D-Ala2，Asp8(OFm)，Lys12(Fmoc)，Ala15]-GRF(2-29)-BHA-樹脂與Boc-Tyr[2，6-Cl2Bzl]-OH進行最終輪循環的固相合成，得到Boc-[D-Ala2，Asp8(OFm)，Lys12(Fmoc)，Ala15]-GRF(1-29)-BHA-樹脂。用20%哌啶/DMF使所得樹脂脫去保護20分鐘，并用BOP試劑(170mg，0.384mmol，3eq)在含DIEA(0.3ml，2.2mmol)的DMF(20ml中環化2小時。(如上所述)用新鮮BOP試劑重復進行環化(開氏水合茚三酮陰性試驗)，并對肽進行洗滌，干燥，于0℃下，歷時2小時，用HF(～10ml)將肽鏈從樹脂上切下來。蒸發HF，繼之以EtOAc洗滌，用TFA萃取，蒸發，用醚研制，得到198mg粗制產物。如上所述，經制備性hplc法，對環8，12[Asp8，Ala15]-GRF(1-29)-NH2進行純化。
實施例5環8，12[N-甲基-Tyr1，D-Ala2，Asp8，
Ala15]-GRF(1-29)-NH2的合成將0.5gBoc-[D-Ala2，Asp8(OFm)，Lys12(Fmoc)，Ala15]-GRF(2-29)BHA-樹脂(取自上例)與Boc-N-甲基-L-Tyr-(2，6-Cl2Bzl)-OH進行最終輪循環的固相合成，得到Boc-[N-甲基-L-Tyr′(2，6-Cl Bzl)，D-Ala2，Asp8(OFm)，Lys12(Fmoc)，Ala15]-GRF(1-29)-BHA-樹脂。用20%哌啶/DMF使所得樹脂去保護20分鐘，并用BOP試劑(170mg，0.384mmol，3eq)在含DIEA(0.103ml，0.765mmol，6eq)的DMF(5ml)中環化2小時。采用新鮮BOP試劑再進行兩次環化(水合茚三酮陰性試驗)，并對肽進行洗滌，干燥，于0℃下用HF(～10ml)將肽從樹脂上切下來(如上所述)，時間為2小時。蒸發HF，繼之以EtOAc洗滌，用TFA萃取，蒸發，用醚研制，得到219mg粗制產物。如上所述，經用hplc法，對環8，12[Asp8，Ala15]-GRF(1-29 NH2進行純化。
雖然結合優選實施例描述了本發明，但這并不意味著要將本發明的范圍限制于所述特定形式，相反，意在復蓋權利要求所定義的本發明的精神和范圍內可能包含的變換、改進和等同物。
權利要求
1.一種制備下式所示的肽及其藥物上可接受的鹽的方法R1-R2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-
-Val-Leu-R3-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-R4-R5-R6-X式中R1=Tyr，脫NH2-Tyr，Ac-Tyr，His，N-甲基-L-TyrR2=Ala，D-Ala，N-甲基-D-AlaR3=GlY，Ala，Leu，Val，Ile，Nle，NVal，β-Ala，α-AibR4=Met，Leu，Nle，IleR5=Ser，AsnR6=氨基酸順序，選自Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu或其片段，其中片段從羧基末端開始減少1至15個氨基酸。X=OH、NH2、N(R7)(R8)，其中R7和R8=H或低級烷基A=Asp，Glu，α-氨基庚二酸，α-氨基己二酸B=Lys，Orn，二氨基丙酸，二氨基丁酸A的側鏈羧基末端通過酰胺鍵與B的側鏈氨基末端連結，該方法的特征在于采用固相肽合成法，將與樹脂連結的、側鏈已適當保護的具有相應氨基酸順序的多肽同液體HF反應，需要時將這樣的肽轉化成藥物上可接受的鹽。
2.按權利要求1的方法，其中R1＝Tyr、脫NH2-Tyr、N-甲基-L-Tyr，R2＝Ala、D-Ala，R3＝Ala，X＝NH2。
3.按權利要求2的方法，其中A＝Asp，B＝Lys(并且Asp的側鏈羧基末端經酰胺鍵與Lys的側鏈氨基末端共價結合)，R4＝Met，R5＝Ser，R6＝Arg。
4.按權利要求3的方法，其中R1＝Tyr。
5.按權利要求4的方法，其中R2＝Ala，所述化合物的結構式如下Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2.
6.按權利要求4的方法，其中R2＝D-Ala，所述化合物的結構式如下Tyr-D-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2.
7.按權利要求3的方法，其中R1＝脫NH2-Tyr。
8.按權利要求7的方法，其中R2＝Ala，所述化合物的結構式如下脫NH2-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2.
9.按權利要求7的方法，其中R2＝D-Ala，所述化合物的結構式如下-脫NH2-Tyr-D-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2.
10.按權利要求3的方法，其中R1＝N-甲基-L-Tyr。
11.按權利要求10的方法，其中R2＝Ala，所述化合物的結構式如下N-甲基-L-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2
12.按權利要求10的方法，其中R2＝D-Ala，所述化合物的結構式如下N-甲基-L-Tyr-D-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2.
13.一種制備下式所示的肽及其藥物上可接受的鹽的方法，R1-R2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-A-Ser-Tyr-Arg-B-Val-Leu-R3-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-R4-R5-R6-X式中R1＝Tyr，脫 NH2·Tyr，Ac-Tyr，His，N-甲基-L-TyrR2＝Ala，D-Ala，N-甲基＝D-AlaR3＝Gly，Ala，Leu，Val，Ile，Nle，NVal，β-Ala，α-AibR4＝Met，Leu，Nle，IleR5＝Ser，AsnR6＝氨基酸順序，選自Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu或其片段，其中該片段從羧基末端開始減少1至15個氨基酸X＝OH、NH2、N(R7)(R8)，其中R7和R8＝H或低級烷基A＝Asp、Glu、α-氨基庚二酸、α-氨基己二酸B＝Lys、Orn、二氨基丙酸、二氨基丁酸該方法的特征在于采用固相肽合成法，將與相樹脂連結的、側鏈已適當保護的具有相應氨基酸順序的多肽同液體HF反應，需要時將這樣的肽轉化成藥物上可接受的鹽。
14.按權利要求13的方法，其中R1＝Tyr，R2＝Ala，A＝Asp，B＝Lys，R3＝Ala，R4＝Met，R5＝Ser，R6＝Arg，X＝NH2，所述肽的結構式為Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2
15.按權利要求13的方法，其中R1＝Tyr，R2＝D-Ala，A＝Asp，B＝Lys，R3＝Ala，R4＝Met，R5＝Ser，R6＝Arg，X＝NH2，所述化合物的結構式為Tyr-D-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2.
16.按權利要求13的方法，其中R1＝脫NH2Tyr，R2＝Ala，A＝Asp，B＝Lys，R3＝Ala，R4＝Met，R5＝Ser，R6＝Arg，X＝NH2，所述化合物的結構式為脫NH2-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2.
17.按權利要求13的方法，其中R1＝脫NH2Tyr，R2＝D-Ala，A＝Asp，B＝Lys，R3＝Ala，R4＝Met，R5＝Ser，R6＝Arg，X＝NH2，所述化合物的結構式為脫NH2-Tyr-D-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2.
18.按權利要求13的方法，其中R1＝N-甲基-L-Tyr，R2＝Ala，A＝Asp，B＝Lys，R3＝Ala，R4＝Met，R5＝Ser，R6＝Arg，X＝NH2，所述化合物的結構式為N-甲基-L-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2.
19.按權利要求13的方法，其中R1＝N-甲基-L-Tyr，R2＝D-Ala，A＝Asp，B＝Lys，R3＝Ala，R4＝Met，R5＝Ser，R6＝Arg，X＝NH2，所述化合物的結構式為N-甲基-L-Tyr-D-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2.
20.一種制備藥物組合物的方法，該方法包括將權利要求1至19之任一項的化合物或一種或多種其他治療用活性物質同治療用的惰性載體物質混合，將該混合物制成蓋侖劑型。
21.一種藥物組合物，含有權利要求1至19之任一項的化合物和治療用的載體物質。
22.一種用于治療人和動物生長激素缺乏癥的藥物組合物，所述藥物組合物含有權利要求1至19之任一項的化合物和治療用的惰性載體物質。
23.將權利要求1至19之任一項的化合物用于制備作為治療用活性物質的藥物組合物。
24.將權利要求1至19之任一項的化合物用于制備治療以人體生長激素缺乏癥為特征的生長疾病的藥物組合物。
25.將權利要求1至19之任一項的化合物用于治療動物，以促進其生長。
26.下式所示的環肽及其藥物上可接受的鹽，R1-R2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-A-Ser-Tyr-Arg-B-Val-Leu-R3-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-R4-R5-R6-x式中R1＝Tyr、脫NH2-Tyr、Ac-Tyr、His、N-甲基-L-TyrR2＝Ala、D-Ala、N-甲基-D-AlaR3＝Gly、Ala、Leu、Val、Ile、Nle、NVal、β-Ala、α-AibR4＝Met、Leu、Nle、IleR5＝Ser、AsnR6＝氨基酸順序，選自Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu或其片段，其中片段從羧基末端開始減少1至15個氨基酸X＝OH、NH2、N(R7)(R8)，其中R7和R8＝H或低級烷基A＝Asp、Glu、α-氨基庚二酸、α-氨基己二酸B＝Lys、Orn、二氨基丙酸、二氨基丁酸A的側鏈羧基末端經酰胺鍵與B的側鏈氨基末端連結所述環肽及其藥物上可接受的鹽可按下述方法制備，該方法的特征在于采用固相肽合成法，將與樹脂連結的側鏈已適當保護的具有相應氨基酸順序的多肽與液體HF反應，需要時將這樣的肽轉化成藥物上可接受的鹽。
27.下式所示的線性肽及其藥物上可接受的鹽，R1-R2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-A-Ser-Tyr-Arg-B-Val-Leu-R3-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-R4-R5-R6-X式中R1＝Tyr，脫NH2-Tyr，Ac-Tyr，His，N-甲基，-L-TyrR2＝Ala，D-Ala，N-甲基-D-AlaR3＝Gly，Ala，Leu，Val，Ile，Nle，NVal，β-Ala，α-AibR4＝Met，Leu，Nle，IleR5＝Ser，AsnR6＝氨基酸順序，選自Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu或其片段，其中片段從羧基末端開始減少1至15個氨基酸X＝OH、NH2、N(R7)(R8)，其中R7和R8＝H或低級烷基A＝Asp、Glu、α-氨基庚二酸、α-氨基己二酸B＝Lys、Orn、二氨基丙酸、二氨基丁酸所述線性肽及其藥物上可接受的鹽可按下述方法制備，該方法的特征在于采用固相肽合成法，將與樹脂連結的、側鏈已適當保護的具有相應氨基酸順序的多肽與液體HF反應，需要時將這樣的肽轉化成藥物上可接受的鹽。
28.按前文所述的發明內容。
29.與樹脂連接的側鏈已適當保護的多肽，其結構式為R1-R2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-A-Ser-Tyr-Arg-B-Val-Leu-R3-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-R4-R5-R6-x式中R1＝Tyr，脫 NH2-Tyr，Ac-Tyr，His，N-甲基-L-TyrR2＝Ala，D-Ala，N-甲基-D-AlaR3＝Gly，Ala，Leu，Val，Ile，Nle，NVal，β-Ala，α-AibR4＝Met，Leu，Nle，IleR5＝Ser，AsnR6＝氨基酸順序，選自Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu或其片段，其中片段從羧基末端開始減少1至15個氨基酸X＝OH、NH2、N(R7)(R8)，其中R7和R8＝H或低級烷基A＝Asp、Glu、α-氨基庚二酸、α-氨基己二酸B＝Lys、Orn、二氨基丙酸、二氨基丁酸A的側鏈羧基末端通過酰胺鍵同B的側鏈氨基末端連結。
30.與樹脂連接的側鏈已適當保護的多肽，其結構式為R1-R2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-A-Ser-Tyr-Arg-B-Val-Leu-R3-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-R4-R5-R6-x式中R1＝Tyr、脫NH2-Tyr、Ac-Tyr、His、N-甲基-L-TyrR2＝Ala、D-Ala、N-甲基-D-AlaR3＝Gly、Ala、Lue、Val、Ile、Nle、NVal、β-Ala、α-AibR4＝Met、Leu、Nle、IleR5＝Ser、AsnR6＝氨基酸順序，選自Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu或其片段，其中片段從羧基┒絲技跎 至15個氨基酸X＝OH、NH2、N(R7)(R8)，其中R7和R8＝H或低級烷基A＝Asp、Glu、α-氨基庚二酸、α-氨基己二酸B＝Lys、Orn、二氨基丙酸、二氨基丁酸。A的側連羧基末端通過酰胺鍵同B的側鏈氨基末端連結。
全文摘要
本發明公開了有關線性和環形生長激素釋放因子類以物，以及將有效量的本發明的化合物施用于患者，刺激其生長激素釋放的方法。
文檔編號C07K14/575GK1032014SQ88106810
公開日1989年3月29日 申請日期1988年9月17日 優先權日1987年9月18日
發明者阿瑟·馬丁·費利克斯, 埃德加·菲利普·海馬 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司