一種固化酶切制備Fab抗體的方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及免疫分析醫學領域，特別是涉及一種固化酶切制備Fab抗體的方法及其用途。本發明提供一種固化酶切制備Fab抗體的方法，包括如下步驟：1）固化酶的制備方法：在木瓜蛋白酶溶液中加入活化的微球，使木瓜蛋白酶與活化偶聯填料充分偶聯；2）固化酶酶切：取2H4抗體5mg，與5ml含100μl固定化木瓜蛋白酶的EDTA-Na2消化緩沖液混合、孵育，酶濃度為0.05mg/ml；3）酶切后Fab抗體分離純化即得Fab抗體。本發明建立的Fab抗體制備方法具有酶切速度快、分離簡單、固化酶可以反復使用，不需要昂貴的全自動化設備，試劑成本低廉等優勢，適合在國內普及推廣。
【專利說明】_種固化酶切制備Fab抗體的方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及免疫分析醫學領域，特別是涉及一種固化酶切制備Fab抗體的方法及 其用途。
【背景技術】
[0002] 單克隆抗體技術是1975年英國科學家Milstein和Kohler所發明，目前廣泛應用 于臨床治療及診斷領域，是免疫學領域的重大突破。鼠源性單克隆抗體經常需要切除其Fc 段以減少免疫治療過程中的人抗鼠反應（HAM)及臨床檢測時導致的假陽性干擾。木瓜蛋 白酶（papain)能水解IgG的部位是在鉸鏈區二硫鍵連接的2條重鏈的近N端，裂解后可得 到三個片段，2個相同片段稱為抗原結合片段（fragment antigen binding，Fab)及1個可 結晶片段（fragment crystallizable，Fe) 〇
[0003] 抗體經木瓜蛋白酶酶切后需要分離Fab片段及Fe片段，并除去加入的木瓜蛋白酶 才能使用。目前，常用的方法是通過Protein G/A除掉Fc段后采用凝膠過濾的方式通過分 子量大小進行分離，該方法比較費時，一次只能處理l_2ml樣本，不適于大規模制備。也有 報道通過Protein A和Protein G不同親和部位不同進行快速親和純化分離，但該方法并 不適用于不同抗體亞類的鼠單克隆抗體。
【發明內容】
[0004] 鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明通過將酶偶聯于活化的NHS-S印harose微 球，然后將其加入到抗體及酶切緩沖中微震蕩酶切，酶切結束后離心分離微球并proteinA/ G -步既可以分離酶切后的Fab抗體，以提供一種固化酶切制備Fab抗體的方法及其用途， 用于解決現有技術中的問題。
[0005] 為實現上述目的及其他相關目的，本發明第一方面提供一種固化酶切制備Fab抗 體的方法，包括如下步驟：
[0006] 1)固化酶的制備方法：在木瓜蛋白酶溶液中加入活化的微球，使木瓜蛋白酶與活 化偶聯填料充分偶聯；
[0007] 2)固化酶酶切：取2H4抗體5mg，與5ml含100 μ 1固定化木瓜蛋白酶的EDTA-Na2 消化緩沖液混合，于37°C下孵育2h，酶濃度為0. 05mg/ml ;
[0008] 3)酶切后Fab抗體分離純化即得Fab抗體。
[0009] 優選的，所述步驟1中，活化的微球具體為NHS-activated Sepharose 4Fast Flow 微球。
[0010] 優選的，所述步驟2酶切后，用TriS-HCl (I. 0m〇l/L，pH 8. 0)將抗體酶切產物pH 調節到7. 5?8. 0。
[0011] 優選的，所述步驟3中分離純化的具體條件包括如下步驟：
[0012] (1)用 Tris-HCl (I. 0mol/L，pH 8. 0)將抗體酶切產物 pH 調節到 7. 5 ?8. 0。
[0013] (2)將抗體酶切產物通過空白層析柱收集流出液，濾去固定化酶并將其回收。
[0014] (3)將流出液通過蛋白A柱，收集流出蛋白記為蛋白PI。
[0015] (4)使用PBS緩沖液充分平衡蛋白A柱后，用HCl-甘氨酸（0. lmol/L，Ph 2. 7)洗脫 柱子，收集洗脫蛋白記為蛋白P2,用Tris-HCl (I. Omol/L，pH 8. 0)將P2的pH調節到7. 5? 8. 0〇
[0016] (5)將所得蛋白透析于PBS中。
[0017] 本發明第二方面提供所述固化酶切制備Fab抗體的方法在Fab抗體制備領域的用 途。
[0018] 本發明的內容包括：1)固化酶的制備方法；2)固化酶酶切抗體使用的緩沖體系； 3)固化酶酶切抗體的方法；以及4)酶切后Fab抗體的分離。進一步，根據本發明制備固 化酶的方法及其應用包括以下步驟：1)配置酶溶液并將其偶聯于活化的NHS-sepharose微 球；2)配置酶切緩沖液并加入抗體及微球；3)將酶切混合物置于37°C震蕩酶切30-60分 鐘；以及4)proteinA/G分離酶切后的Fab抗體。
[0019] 本發明建立的Fab抗體制備方法具有酶切速度快、分離簡單、固化酶可以反復使 用，不需要昂貴的全自動化設備，試劑成本低廉等優勢，適合在國內普及推廣。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020] 圖1顯示為本發明固定化法抗體酶切結果圖。
[0021] 圖2顯示為本發明固定化木瓜蛋白酶偶聯電泳結果。
[0022] 圖3顯示為本發明抗原免疫親和柱偶聯電泳結果。
[0023] 圖4顯示為間接ELISA法檢測Fc段。
[0024] 圖5顯示為間接ELISA法檢測Fab片段免疫活性。
【具體實施方式】
[0025] 以下通過特定的具體實例說明本發明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書 所揭露的內容輕易地了解本發明的其他優點與功效。本發明還可以通過另外不同的具體實 施方式加以實施或應用，本說明書中的各項細節也可以基于不同觀點與應用，在沒有背離 本發明的精神下進行各種修飾或改變。
[0026] 在進一步描述本發明【具體實施方式】之前，應理解，本發明的保護范圍不局限于下 述特定的具體實施方案；還應當理解，本發明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體 實施方案，而不是為了限制本發明的保護范圍；在本發明說明書和權利要求書中，除非文中 另外明確指出，單數形式"一個"、"一"和"這個"包括復數形式。
[0027] 當實施例給出數值范圍時，應理解，除非本發明另有說明，每個數值范圍的兩個端 點以及兩個端點之間任何一個數值均可選用。除非另外定義，本發明中使用的所有技術和 科學術語與本【技術領域】技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、 材料外，根據本【技術領域】的技術人員對現有技術的掌握及本發明的記載，還可以使用與本 發明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現有技術的任何方法、設備和材料來實 現本發明。
[0028] 除非另外說明，本發明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術 領域常規的分子生物學、生物化學、染色質結構和分析、分析化學、細胞培養、重組DNA技 術及相關領域的常規技術。這些技術在現有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook 等 MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001;Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates ；the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego ；ffolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION， Third edition， Academic Press， San Diego,1998 ;METHODS IN ENZYMOLOGY， Vol. 304,Chromatin(P. M. Wassarman and A. P. ffolffe,eds.) ,Academic Press，San Diego， 1999;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol. 119, Chromatin Protocols(P.B. Becker， ed. )Humana Press，Totowa，1999 等。
[0029] 本發明的實施例中所使用的實驗材料如下：
[0030] 實驗所使用的BNP鼠單克隆抗體2H4(亞類為IgGl)及所對應的BNP重組蛋白均 由第三軍醫大學臨床生化教研室提供，血清標本收集于附屬醫院檢驗科。
[0031] 蛋白 A/L Sepharose Fast Flow 及 NHS-activated Sepharose 4Fast Flow 活化 偶聯填料購自Amersham公司。
[0032] 生物素化試劑及HRP標記的親和素購自Pierrce公司；HRP標記的山羊抗小鼠購 自北京中杉金橋生物技術有限公司；小牛血清為四季青公司產品；半胱氨酸、木瓜蛋白酶、 BSA購自北京鼎國生物技術有限公司；其他試劑均為分析純，實驗用水為去離子雙蒸水。
[0033] ELISA 板，購自 Jet Biofit 公司。
[0034] 本發明的實施例中所使用的儀器如表1所示：
[0035] 表 1
[0036] 微量震蕩器 江蘇海門麒麟醫用儀器廠，MH- I 磁力攪拌器 紹興市衛星醫療設備公司，ML-902 酶聯免疫檢測儀 美國Bio-Rad, 550 康樂電熱恒溫水浴箱 上海醫療器械七廠 漢瞻牌生化培養箱 重慶漢瞻儀器廠，PSH70 琪特牌穩壓穩流電泳儀 上海琪特分析儀器廠，DYY-8 電子天平 上海精天電子儀器有限公司，JA2003A 實驗室純水系統 英國ELGA,UHQ-PS-MK3 定時恒溫磁力攪拌器 紹興衛星醫療設備廠，ML-902 臺式低溫高速離心機 長沙湘儀離心機有限公司，TGL-16 AKTA prime Iif「I純化儀 瑞典 Amersham Bioscicnccs 凝膠圖像分析系統 上海小源科技有限公司，SX-300 酶聯洗板機 美國Bio-Rad 微孔板震蕩器 江蘇海門，QB9002 CO2培養箱 美國SHEL L/B 板式化學發光檢測儀 威高生物
[0037] 本發明的實施例中所使用的試劑如表1所示：
[0038] 表 2
[0039] 尿素 北京鼎國 BSA蛋白 北京鼎國 Marker invitrogcn KCl 重慶北碚化學試劑廠 K2HPO4 天津市大茂化學試劑廠 NaCl 成都科龍化工試劑廠 Na2HPO4 國營重慶市無機化學試劑廠 NaOAc 重慶市化學試劑廠 NaOH 天津市大茂化學試劑廠 N,N-二甲基甲酰胺 天津市光復精細化工研究所 SDS Afl·： R&R Bio, Co; Ltd, Tris Solarbio HRP-羊抗鼠 IgG 北京中衫公司 TMB 美國sigma公司
[0040] 預染SDS-PAGE低分子量標準蛋白質 北京天根 無水乙醇 重慶川東化工集團有限公司化學試劑廠 無水乙酸 上海申博化工有限公司
[0041] 消化緩沖液i (2X):含0· 02mol/L EDTA (非鈉鹽）和0· 02mol/L半胱氨酸的PBS， 新鮮配制，冰置〈10小時使用。
[0042] 消化緩沖液 2(2X):含 0. 02mol/L EDTA-NajPO. 02mol/L 半胱氨酸的 PBS，新鮮配 制，冰置〈10小時使用。
[0043] 親和柱平衡液：I X PBS緩沖液（過濾）
[0044] PBS 緩沖液：137mmol/L NaCl，2. 7mmol/L KCl，lOmmol/L Na2HPO4, 2mmol/L KH2PO4 以HCl調節至pH 7· 4,高壓備用。
[0045] 15 % 的 SDS-PAGE 凝膠電泳：
[0046] A 液：1. 5mol/L Tris-HCl 緩沖液（Tris 18. 15g，溶于適量水，用 HCl 調 pH 8. 8,定 容至 10OmT, ;8ml。
[0047] B液：30%丙烯酰胺，0.8% N，N-亞甲基雙甲叉丙烯酰胺；4ml。
[0048] C 液：1 % SDS (十二烷基磺酸鈉）；I. 6ml。
[0049] D液：10%四甲基乙二胺；10 μ 1。
[0050] E液：10%過硫酸銨（APS)，臨用前配制；100 μ 1。
[0051] F 液：0· 5mol/L Tris-HCl 緩沖液（Tris 6. 05g 加水溶解，用 HCl 調 pH 6. 8,定容 至 10OmT, ；2. 25ml〇
[0052] ddH20 :2. 28ml。
[0053] 電極緩沖液：Tris 3g，甘氨酸14. 4g，SDS lg，以水溶解，用HCl調pH 8. 3,定容至 1L。樣品緩沖液：Tris 0. 303g，溴酚藍2mg，SDS 0. 8g，量取HCl 0. 189mL，甘油4mL，加水稀 釋至10mL，此溶液用于非還原SDS-PAGE，如用于還原SDS-PAGE，則再加 β -巰基乙醇2mL。
[0054] 考馬斯亮藍染液：考馬斯亮藍R25tlIg,加入甲醛200mL，冰醋酸50mL，水250mL混勻。 考馬斯亮藍脫色液：甲醇400mL，冰醋酸100mL，與水500mL混勻。
[0055] ELISA包被液：I. 59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3, 0· 2g NaN3加去離子水溶解后，NaOH 調 節pH至9. 6,定容至1L，常溫保存。
[0056] ELISA 洗滌液：8. Og NaCl，0· 2g KCl，0· 2g KH2PO4, 2. 9g Na2HPO4 · 12Η20,0· 5mL Tween-20加去離子水溶解后，調節pH至9. 4,定容至1L，常溫保存。
[0057] 樣品稀釋液：8. Og NaCl，0· 2g KCl，0· 2g KH2PO4, 2. 9g Na2HPO4 .UH2OJweer^Olml 加去離子水溶解后，調節pH至9. 4,定容至1L，常溫保存。
[0058] ELISA封閉液：5ml BSA，95ml樣品稀釋液，現用現配。
[0059] ELISA 終止液：2mol/L H2SO4
[0060] 偶聯稀釋液：0· IM NaHC03,0. 5M NaCl，pH 8. 3
[0061] 親和柱洗脫液：0. IM甘氨酸-鹽酸PH 2. 3
[0062] 實施例1固定化木瓜蛋白酶酶切：
[0063] 1.配制不同濃度木瓜蛋白酶溶液：
[0064] 準確稱取0· 0050g木瓜蛋白酶，溶于0· 5ml PBS緩沖液，配成10mg/ml木瓜蛋白酶 溶液。用緩沖液稀釋，配成〇. lmg/ml，0. 05mg/ml，0. 025mg/ml木瓜蛋白酶溶液。
[0065] 2.反應體系建立：
[0066] 向木瓜蛋白酶溶液中加入足量的NHS-activated Sepharose 4Fast Flow，震蕩， 使木瓜蛋白酶與活化偶聯填料充分偶聯，制備固定化木瓜蛋白酶。SDS-PAGE檢測偶聯效果。 固定化酶切反應體系如表1所示：
[0067] 表 1
[0068]
【權利要求】
1. 一種固化酶切制備Fab抗體的方法，包括如下步驟： 1) 固化酶的制備方法：在木瓜蛋白酶溶液中加入活化的微球，使木瓜蛋白酶與活化偶 聯填料充分偶聯； 2) 固化酶酶切：取2H4抗體5mg，與5ml含100 y 1固定化木瓜蛋白酶的EDTA-NaJ^t 緩沖液混合、孵育，酶濃度為0. 05mg/ml ; 3) 酶切后Fab抗體分離純化即得Fab抗體。
2. 如權利要求1所述的一種固化酶切制備Fab抗體的方法，其特征在于，所述步驟1 中，活化的微球具體為NHS-activated Sepharose 4Fast Flow微球。
3. 如權利要求1所述的一種固化酶切制備Fab抗體的方法，其特征在于，所述步驟2酶 切后，用Tris-HCl (1. Omol/L，pH 8. 0)將抗體酶切產物pH調節到7. 5?8. 0。
4. 如權利要求1所述的一種固化酶切制備Fab抗體的方法，其特征在于，所述步驟2 中，具體的孵育條件為：于37°C下孵育2h。
5. 如權利要求1所述的一種固化酶切制備Fab抗體的方法，其特征在于，所述步驟3中 分離純化的具體條件包括如下步驟： (1) 用Tris-HCl (1. Omol/L，pH 8. 0)將抗體酶切產物pH調節到7. 5?8. 0。 (2) 將抗體酶切產物通過空白層析柱收集流出液，濾去固定化酶并將其回收。 (3) 將流出液通過蛋白A柱，收集流出蛋白記為蛋白P1。 (4) 使用PBS緩沖液充分平衡蛋白A柱后，用HC1-甘氨酸（0. lmol/L，Ph 2. 7)洗脫柱 子，收集洗脫蛋白記為蛋白P2,用TriS-HCl(1.0m〇l/L，pH 8.0)將P2的pH調節到7. 5? 8. 0〇 (5) 將所得蛋白透析于PBS中。
6. 如權利要求1-4任一權利要求所述的固化酶切制備Fab抗體的方法在Fab抗體制備 領域的用途。
【文檔編號】C07K1/34GK104498576SQ201410736395
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月5日 優先權日:2014年12月5日
【發明者】吉權 申請人:重慶乾德生物技術有限公司