非洲豬瘟病毒基因ii型毒株單克隆抗體及制備方法和應用的制作方法

非洲豬瘟病毒基因ii型毒株單克隆抗體及制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本申請公開了一種非洲豬瘟病毒基因II型毒株單克隆抗體及其制備方法和應用。本申請的制備方法，包括用純化p54免疫蛋白對小鼠免疫，取免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合制備雜交瘤細胞，用三種篩選抗原進行篩選，獲得可穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞，再通過體內或體外的方法制備單克隆抗體；三種篩選抗原包括，原核表達p54重組蛋白、真核表達p54重組蛋白和人工合成的Seq ID No.1所示多肽。本申請，用三種篩選抗原對雜交瘤細胞進行篩選，特別是人工合成特別針對基因II型毒株的多肽作為篩選抗原，使制備的單克隆抗體能夠保障基因II型毒株的檢測率，減小了漏檢概率，提高了檢疫工作質量和效率。
CCTCC No.C2014213
20141203
【專利說明】非洲豬瘟病毒基因 M型毒株單克隆抗體及制備方法和應 用

【技術領域】
[0001] 本申請涉及單克隆抗體領域，特別是涉及一種特別針對非洲豬瘟病毒基因 II型 毒株的單克隆抗體，以及該單克隆抗體的制備方法和應用。

【背景技術】
[0002] 非洲豬瘟（African Swine Fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV)引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸傳染性疾病，其臨床癥狀表現高熱、皮膚 充血、流產、水腫及臟器出血，致死率高達100%。但也有少數毒株感染家豬后，豬只出現亞 急性感染或者隱性帶毒。世界動物衛生組織〔OIE〕將其列為A類動物疫病，受到世界各國 的高度重視，我國尚未發生該病，我國已將此病規定為一類動物傳染病，并作為動物外來疫 病進行研宄（孫懷昌.中國預防獸醫學報，1999,21(21) :117-119)。
[0003] 近年來，非洲豬瘟已由非洲大陸橫跨到亞歐大陸的亞美尼亞、烏克蘭、俄羅斯，特 別是近年來高加索地區疫情嚴峻，對我國造成極大威脅。非洲豬瘟在西歐、南美洲和東歐的 發生已經證實，非洲豬瘟一旦傳入將給養豬業帶來毀滅性的打擊。我國已將非洲豬瘟列入 2011年國家動物疫病監測計劃，確定新疆、內蒙古、黑龍江、吉林、遼寧、西藏等為重點監測 省區（王宏燕，養豬，2011，4:81-82)。
[0004]目前尚無有效的疫苗，因此通過快速診斷非洲豬瘟抗體水平來判斷豬只的感染情 況，從而制定有效的控制和消滅措施，進而及時準確的診斷檢測和嚴格有效的封鎖撲殺等 措施是成功消滅非洲豬瘟的有效方法。非洲豬瘟抗體診斷方法包括瓊脂擴散試驗、ELISA、 免疫印跡、免疫熒光等。目前，我國診斷非洲豬瘟的檢測試劑主要依賴進口，擁有自主知識 產權的方法和試劑很少，加之周邊國家嚴峻的疫情形勢，我國迫切需要建立自己的檢測方 法和試劑。
[0005] 并且，現有的抗體診斷方法中，由于采用活病毒感染細胞來制備抗原導致在臨床 運用時檢測程序無法標準化操作，且因操作活毒風險大，因此不適合推廣運用。目前用于 檢測方法及試劑的開發多用基因工程方法表達抗原，主要集中在如p72、p54、p32、PP62、 A104R、B602L、K205R等基因的研宄，其中p72、p54等應用較廣。而單克隆抗體的制備也主要 集中在這些結構蛋白，由此建立的基于免疫學方法的商業試劑盒目前世界范圍內僅四家。 但是，由于非洲豬瘟病病毒毒株間地域差異大，使得現有的商業試劑盒在使用過程中，容易 出現由某些毒株引起的非洲豬瘟病的漏檢現象。
[0006] 非洲豬瘟病毒基因 II型毒株是目前俄羅斯境內流行的非洲豬瘟病毒，由于其地 緣關系，該毒株對我國具有重大威脅；而目前尚沒有特別針對該毒株的檢測試劑盒，現有的 商業試劑盒又存在漏檢的風險。因此，根據我國與俄羅斯的地緣關系，為能準確檢測到鄰國 俄羅斯境內非洲豬瘟病毒，亟需一種特別針對俄羅斯境內的非洲豬瘟病毒基因 II型毒株 的檢測試劑或方法。


【發明內容】

[0007] 本申請的目的是提供一種新的非洲豬瘟病毒基因 II型毒株的單克隆抗體，以及 該單克隆抗體的制備方法和應用。
[0008] 為了實現上述目的，本申請采用了以下技術方案：
[0009] 本申請一方面公開了一種非洲豬瘟病毒基因 II型毒株單克隆抗體的制備方法， 包括采用純化的p54免疫蛋白對小鼠進行免疫，取免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合 制備雜交瘤細胞，然后采用三種篩選抗原對陽性雜交瘤細胞株進行篩選，獲得可穩定分泌 抗非洲豬瘟病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞，然后通過體內或體外的方法制備非洲豬瘟病毒 基因 II型毒株單克隆抗體；三種篩選抗原包括，原核表達P54重組蛋白、真核表達p54重組 蛋白，以及人工合成的SeqID No. 1所不序列的多狀；
[0010] Seq ID No. I :PVTGRPATNRPATNKPVTDNPVT。
[0011] 需要說明的是，本申請的關鍵在于采用三種篩選抗原對雜交瘤細胞株進行篩選， 其中Seq ID No. 1所示序列人工合成的多肽，是特別針對非洲豬瘟病毒基因 II型毒株而設 計的篩選抗原，因此，由其篩選出的雜交瘤細胞株所制備的單克隆抗體能夠保障基因 II型 毒株的檢出率；但是，由于不同毒株之間具有一定的共性，并且俄羅斯境內病毒毒株也是由 其它地區或國家傳入的，因此，本申請的單克隆抗體只是能夠保障所有俄羅斯境內病毒毒 株，即基因 II型毒株都能夠被檢出，避免漏檢，但不排除其它地域的其它部分毒株也可以 檢出。
[0012] 還需要說明的是，本申請的關鍵是采用三種篩選抗原對雜交瘤細胞株進行篩選， 尤其是創造性的設計了一條人工合成多肽，從而使得制備的單克隆抗體能夠特別有效的檢 測基因 II型毒株；至于P54免疫蛋白的制備和純化、原核表達P54重組蛋白的制備、真核表 達P54重組蛋白的制備、制備融合雜交瘤細胞的具體條件和步驟、雜交瘤細胞的免疫篩選 等都可以參考現有的常規方法進行，在此不累述。篩選獲得可穩定分泌抗非洲豬瘟病毒單 克隆抗體的雜交瘤細胞后，單克隆抗體的體內或體外的制備方法，也可以參考現有的常規 方法；例如，將雜交瘤細胞腹腔注射動物，如小鼠，采集腹水，分離純化單克隆抗體；或者， 通過體外培養該雜交瘤細胞收集分泌產生的單克隆抗體。
[0013] 經篩選獲得的可穩定分泌抗非洲豬瘟病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞，命名為雜交 瘤細胞株SZCIQASFV2,其微生物保藏號為：CCTCC No. C2014213 ;分類命名為：雜交瘤細胞 hybridoma cell ;保藏時間為：2014年12月3日；保藏單位是：中國典型培養物保藏中心； 保藏地址是：湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心。
[0014] 本申請中，p54免疫蛋白通過以下方式獲取，將pMD18-T-p54質粒中p54基因片段 轉入pET-52b(+)質粒，并在大腸桿菌DH5a中進行可溶性表達，然后提取純化表達蛋白，即 P54免疫蛋白。
[0015] 本申請中，原核表達p54重組蛋白為利用pET-52b(+)質粒在大腸桿菌中原核表達 后提取純化的P54重組蛋白；真核表達p54重組蛋白為利用pFastBac/NT-TOPO昆蟲表達系 統真核表達獲得的P54重組蛋白。
[0016] 本申請的另一面公開了一種非洲豬瘟病毒基因 II型毒株單克隆抗體，該單克隆 抗體由保藏號CCTCC No. C2014213的雜交瘤細胞株SZCIQASFV2分泌產生。
[0017] 需要說明的是，實際上，本申請的非洲豬瘟病毒基因 II型毒株單克隆抗體就是由 本申請的制備方法制備獲取的。
[0018] 本申請的再一面公開了本申請的單克隆抗體在制備非洲豬瘟病毒基因 II型毒株 檢測試劑或設備中的應用。
[0019] 本申請的再一面具體公開了一種含有本申請的單克隆抗體的非洲豬瘟病毒基因 II型毒株酶聯免疫檢測試劑盒。
[0020] 在以上研宄的基礎上，本申請還提供了一種分泌本申請的非洲豬瘟病毒基因 II 型毒株單克隆抗體的雜交瘤細胞，其保藏號為CCTCC No. C2014213。
[0021] 需要說明的是，本申請的分泌非洲豬瘟病毒基因 II型毒株單克隆抗體的雜交瘤 細胞，實際上，就是非洲豬瘟病毒基因 II型毒株單克隆抗體的制備方法中篩選獲得的可穩 定分泌抗非洲豬瘟病毒基因 II型毒株單克隆抗體的雜交瘤細胞。
[0022] 由于采用以上技術方案，本申請的有益效果在于：
[0023] 本申請的制備方法，采用三種篩選抗原對雜交瘤細胞進行篩選，特別是針對非洲 豬瘟病毒基因 II型毒株設計并人工合成了一條多肽作為篩選抗原，使得制備出的單克隆 抗體能夠保障基因 II型毒株的檢測，從而可以準確的檢測出鄰國俄羅斯境內非洲豬瘟病 毒，防止其傳入我國，提高了動物檢驗檢疫及防控的工作質量和效率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1 :是本申請實施例中重組表達質粒pET-52b(+)3C/LIC-p54的PCR鑒定結果；
[0025] 圖2 :是本申請實施例中pET-52b(+)3C/LIC-p54重組質粒在BL21(DE3)中的誘導 表達產物的SDS-PAGE分析結果；
[0026] 圖3 :是本申請實施例中pET-52b(+)3C/LIC-p54重組質粒在BL21(DE3)中的誘導 表達產物的純化及免疫印跡分析結果；
[0027] 圖4 :是本申請實施例中pFastBac_p54重組質粒和Bacmid_p54重組粘粒的PCR鑒 定結果；
[0028] 圖5 :是本申請實施例中pFastBac/NT-TOPO昆蟲表達系統真核表達p54重組蛋白 的Western-blot鑒定結果；
[0029] 圖6 :是本申請實施例中非洲豬瘟病毒p54蛋白序列的比對分析結果圖。

【具體實施方式】
[0030] 由于俄羅斯為我國鄰國，對流行其境內的非洲豬瘟病毒基因 II型毒株的檢驗檢 疫尤為重要；但是目前的檢測試劑盒并沒有特別針對基因 II型毒株而設計。為了保障基因 II型毒株的檢測質量；本申請旨在創制出一株單克隆抗體，該株單抗能特別針對非洲豬瘟 病毒基因 II型毒株發生結合，保障其檢測率；以便基于該單抗制備ELISA檢測試劑、膠體金 檢測試劑等免疫學試劑來檢測非洲豬瘟病毒基因 II型毒株，用于我國邊境地區豬只疫病 的檢測、監測工作，嚴防鄰國俄羅斯非洲豬瘟疫情傳入我國。
[0031] 基于以上需求和目的，本申請特別設計并人工合成了一條特別針對非洲豬瘟病毒 基因 II型毒株的多肽，即Seq ID No. 1所示序列的多肽，用于雜交瘤細胞篩選，同時，采用 原核表達P54重組蛋白和真核表達p54重組蛋白進行篩選，使得最終制備的單克隆抗體能 夠特別有效的對非洲豬瘟病毒基因 II型毒株進行檢測。其中，人工合成的作為篩選抗原的 多肽，經NCBI數據庫比對證實，其為基因 II型毒株所特有，理論上，可以特異性的保障基因 II型毒株的檢測，但如前面所說，由于毒株的同源性，不排除其他地域的其它部分毒株也可 以被檢出。
[0032] 在以上研宄的基礎上，本申請提供了非洲豬瘟病毒基因 II型毒株單克隆抗體，及 其應用。可以理解，本申請的單克隆抗體專門針對基因 II型毒株設計，對其具有良好的檢 測率，大大減小了漏檢的概率；因此，可以制備成試劑盒廣泛用于檢驗檢疫工作；該試劑盒 除了含有本申請的單克隆抗體以外，當然也含有其它酶聯免疫檢測的常規試劑，在此不累 述。
[0033] 下面通過具體實施例和附圖對本申請作進一步詳細說明。以下實施例僅對本申請 進行進一步說明，不應理解為對本申請的限制。
[0034] 實施例1免疫抗原的制備
[0035] 1.目的基因的擴增與純化
[0036] 設計一對引物，從克隆有非洲豬瘟病毒p54基因的pMD18-T-p54質粒中擴增靶標 基因；其中pMD18-T-p54質粒由深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心保存提 供，該質粒中含有如Seq ID No. 10所示序列的552bp的p54基因。該引物的上游引物為 Seq ID No. 2所不序列，下游引物為Seq ID No. 3所不序列。
[0037] Seq ID No. 2 :5, -CAGGGACCCGGTTATACTATTCTCATTGCTATCG-3'
[0038] Seq ID No. 3 :5, -GGCACCAGAGCGTTCAAGGAGTTTTCTAGGTC-3'
[0039] 在引物合成公司合成以上引物后，以pMD18-T-p54質粒為模板進行PCR擴增，反應 條件為 94°C lmin，58°C lmin，30cycles，72°C 5min。
[0040] 反應結束后采用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳PCR擴增產物，并用膠回收試劑盒回收 純化目的DNA，即獲得靶標基因。
[0041] 2.重組質粒的構建
[0042] 在上述步驟獲得的靶標基因中加入T4DNA聚合酶，22 °C孵育30min，75 °C孵育 20min，加入 3C/LIC 載體，22°C孵育 5min，加入 EDTA 后 22°C孵育 5min，構建 pET-52b (+) 3C/ LIC-p54重組質粒。
[0043] 3.重組質粒的轉化與鑒定
[0044] 將上述步驟獲得的pET-52b (+) 3C/LIC-p54重組質粒轉入大腸桿菌DH5 α，并接種 于含100mg/L氨芐青霉素的LB營養瓊脂上，37°C培養12h，挑取單個菌落于含50mg/L氨芐 青霉素的LB液體培養基中37°C培養12h后，提取質粒，進行PCR鑒定和測序，檢測靶標基因 的完整性。
[0045] 其中PCR鑒定分別采用了兩對引物進行，第一對即擴增靶標基因的Seq ID No. 2 和Seq ID No. 3所示引物對，第二對引物為pET_52b(+)3C/LIC質粒自帶的T7引物對。PCR鑒 定的凝膠電泳結果如圖1所示，圖中，M泳道為DNAmarker，1泳道為第一對引物PCR擴增的 電泳結果，2泳道為第二對引物PCR擴增的電泳結果；可見，本例的pET-52b (+) 3C/LIC-p54 重組質粒構建成功，含有約462bp的靶標基因，與理論預期相符。測序結果顯示重組質粒中 含有462bp的p54基因，其序列與Seq ID No. 10所示序列相符，進一步驗證了本例構建的 pET-52b (+) 3C/LIC-p54重組質粒含有我們所需要的p54基因。
[0046] 需要說明的是，p54基因的前端包含兩個啟動子，而本例原核表達時只克隆了其中 一個啟動子，即P54基因的前端90bp大小的信號肽核苷酸序列未有進行克隆，所以第一對 即擴增靶標基因的Seq ID No. 2和Seq ID No. 3所示引物對擴增產物大小為462bp，該基因 同樣包含了 P54蛋白的全部基因序列，只是未包含前端90bp的信號肽核苷酸序列；對本例 來說，不影響p54蛋白的原核表達。
[0047] 4.重組質粒在BL21(DE3)中的誘導表達
[0048] 制備BL21(DE3)細菌感受態細胞，將重組質粒pET-52b(+)3C/LIC-p54轉化入 BL21 (DE3)細胞后，在含100mg/L氨芐青霉素的LB平板上培養，挑取單個菌落，接種于2mL 含100mg/L氨芐青霉素的LB培養液中，37°C，200r/min恒溫搖床振蕩培養至0D600值為0. 6 左右。加入終濃度為2mM的IPTG，培養2h后收取菌液。將培養液在4°C離心15min，去上 清，收集菌體。用PBS重懸沉淀，4°C IOOOOg離心15min，去上清。用破菌緩沖液重懸菌體， 冰上超聲破碎，4°C離心15min，收集上清。用變性不連續的SDS-PAGE對表達產物進行考馬 斯亮藍染色，觀察結果。
[0049] 結果如圖2所示，圖中，M泳道為蛋白分子質量標準；1-5泳道分別為0. 5mM，ImM， 2mM，4mM，8mM IPTG誘導pET-52b (+) 3C/LIC-p54兩小時后細菌裂解上清的分析結果；6泳 道為未加 IPTG誘導pET-52b (+) 3C/LIC-p54兩小時后細菌裂解上清的分析結果；7泳道為 ImMIPTG誘導BL21 (DE3)兩小時后細菌裂解上清的分析結果；8-12泳道分別為ImM IPTG 誘導pET-52b (+) 3C/LIC-p541h，2h，3h，4h，5h后細菌裂解上清的分析結果；13泳道為未加 IPTG誘導pET-52b (+) 3C/LIC-p54兩小時后細菌裂解上清的分析結果；14泳道為ImMIPTG 誘導BL21 (DE3)兩小時后細菌裂解上清。結果顯示，本例構建的pET-52b(+)3C/LIC-p54重 組質粒能夠穩定的表達所需的P54重組蛋白。
[0050] 5.表達產物的鑒定
[0051] 將上述步驟培養的菌液，在4°C離心15min，去上清，收集菌體。用PBS重懸沉淀， 4°C IOOOOg離心15min，去上清。用破菌緩沖液重懸菌體，冰上超聲破碎，4°C離心15min，收 集上清。采用非洲豬瘟標準陽性血清對表達產物進行免疫印跡分析，以檢測目的蛋白的抗 原性。免疫印跡分析結果如圖3所示，圖中，M為蛋白質分子質量標準，1為樣品洗液，2為 目的蛋白純化樣品，3為樣品裂解液，4為目的蛋白免疫印跡分析；結果顯示，本例獲取的重 組蛋白確實為P54重組蛋白。
[0052] 6.表達產物的純化
[0053] 采用Ni柱親和層析方法純化冰上超聲破碎的上清液，純化產物即本例所需要的 免疫抗原，即P54免疫蛋白；經檢測本例制備的p54免疫蛋白具有Seq ID No. 11所示序列。
[0054] 實施例2篩選抗原的制備
[0055] 本例采用了三種篩選抗原對雜交瘤細胞進行篩選，一是實施例1中作為免疫抗原 的原核表達P54重組蛋白，將經過鎳柱純化后的p54免疫蛋白作為篩選抗原；二是利用人工 合成的方法合成的Seq ID No. 1所示多肽；三是利用pFastBac/NT-TOPO昆蟲表達系統真核 表達P54重組蛋白，將感染重組桿狀病毒細胞超聲破碎上清作為篩選抗原。
[0056] 其中人工合成的Seq ID No. 1所示多肽是本例在比對了目前已經公開的所有非洲 豬瘟病毒的P54蛋白序列的基礎上提出的，為所有基因 II型毒株共有的多肽序列，因此，其 作為篩選抗原獲得的單克隆抗體，理論上可以保障非洲豬瘟病毒基因 II型毒株的檢測，避 免漏檢，對比結果如圖6所示。需要說明的是，本例制備的單克隆抗體，其目的是保障基因 II型毒株的檢測，其它毒株是否可以檢測出，并不在本例的關注范圍內。
[0057] 抗原的具體制備如下：
[0058] Seq ID No. I ：PVTGRPATNRPATNKPVTDNPVT
[0059] 1.引物的合成
[0060] 根據pFastBac/NT-TOPO昆蟲表達系統合成3組引物，第一組為p54基因擴增引 物對，上游引物NT-T0P0-ASFV54F為Seq ID No. 4所示序列，下游引物NT-T0P0-ASFV54R 為Seq ID No. 5所示序列；第二組為對pFastBac/NT-T0P0-p54重組質粒進行PCR鑒定 的引物對，其上游引物Polyhedrin forward primer為Seq ID No. 6所示序列，下游引物 SV40polyAreverse primer為Seq ID No. 7所不序列；第三組為對Bacmid_p54重組粘粒進 行PCR鑒定的引物對，其上游引物pUC/M13Forward為Seq ID No. 8所示序列，下游引物pUC/ M13 Reverse 為 Seq ID No. 9 所不序列。
[0061] Seq ID No. 4 :5' -ATGGATTCTGAATTTTTTCAACC-3'
[0062] Seq ID No. 5 :5' -TTACAAGGAGTTTTCTAGGTCT-3'
[0063] Seq ID No. 6 :5' -AAATGATAAC CATCT CGC-3'
[0064] Seq ID No. 7 :5, -GGTAT GGCTGATTAT GATC-3'
[0065] Seq ID No. 8 :5' -CCCAG TCACGACGTT GTAAAACG-3'
[0066] Seq ID No. 9 :5, -AGCGGATAAC AATTT CACAC AGG-3'
[0067] 2. pFastBac_p54重組轉座載體的構建
[0068] 以與實施例1相同的pMD18T-p54重組質粒作為PCR模板，用第一組引物，即p54 基因擴增引物對p54基因進行擴增，用PureLink HiPure Mini Plasmid Purification Kit 回收PCR產物，即獲得靶標基因。取4 μ L靶標基因與1 μ L pFastBac/NT-T0P0載體進行連 接，然后轉化DH5a感受態細胞。
[0069] 挑取陽性克隆細菌，采用上述兩組引物進行PCR鑒定：一是采用擴增目標基因的 引物對NT-T0P0-ASFV54F和NT-T0P0-ASFV54R進行PCR，即第一組引物。二是采用引物對 NT-T0P0-ASFV54F和 SV40 polyA reverse primer。結果顯不，第一組引物擴增得到約 552bp 的片段，與預期的552bp的p54基因相符；第二組引物擴增得到片段大小約為758bp，說明 目的基因已經連接到了載體適合位置，且連接方向正確，獲得pFastBac-p54重組質粒。PCR 擴增的部分凝膠電泳結果如圖4的A圖所示，其中，M為DNA Marker、泳道1和2均是第二 組引物擴增產物的電泳結果，1為陰性菌落質粒擴增產物、2為陽性菌落質粒擴增產物。
[0070] 3.重組粘粒Bacmid_p54構建
[0071] 將10 μ L重組質粒pFastBac_p54轉化E. coli DH IOBac感受態細胞。轉化完后 往EP管中加入900 μ L LB培養液，37°C搖床225rpm培養4h。以室溫，LB培養液按1 :10、 I :100和I :1000三種濃度稀釋菌液，分別涂布在含有50 μ g/mL卡那霉素（以下簡稱K+)、 7 μ g/mL慶大霉素（以下簡稱G+)、10 μ g/mL四環素（以下簡稱Tet+)、100 μ g/mL的X-Gal 和40 μ g/mL的IPTG的LB篩選平板上，37°C倒置培養48h。挑取至少10個白斑，接種到上 述組成的篩選平板上，劃線分單菌落，37°C倒置培養過夜，確認是否仍為白斑。最終確定為 白斑的菌落重新接種到20mL的LB培養液中，培養液含有K+、G+和Tet+，37°C搖床225rpm 培養過夜。同時將Bacmid-CAT和Bacmid-HTA做同樣的操作，分別設為陽性和陰性對照。 取出1份菌液，采用大質粒提取試劑盒PureLink HiPure Plasmid DNA Miniprep Kit提 取Bacmid，其余菌液4°C保存。用兩組引物進行PCR鑒定：一是采用第一組引物，即擴增目 標基因的引物對NT-T0P0-ASFV54F和NT-T0P0-ASFV54R進行PCR ;二是采用第三組引物， 即引物對PUC/M13 Forward和pUC/M13 Reverse進行PCR。PCR擴增產物的部分凝膠電泳 圖如圖4的B圖所示，其中M為DNA Marker、3為第一組引物即引物對NT-T0P0-ASFV54F 和NT-T0P0-ASFV54R的擴增產物、4為第三組引物即引物對pUC/M13 Forward和pUC/M13 Reverse的擴增產物、5為陰性對照。結果顯示，第一組引物擴增得到約552bp的片段，與 預期的552bp的p54基因相符；第三組引物擴增得到大小約為2988bp的片段，說明p54基 因已經連接到了桿狀病毒載體上。鑒定完成后將4°C保存的余下菌液制備成甘油菌并凍存 在-80。。。
[0072] 4.重組桿狀病毒AcNPV_p54的獲得
[0073] 按 Cellfectin? II Reagent 轉染試劑盒操作說明，將 Bacmid_p54， Bacmid-CAT，Bacmid-HTA脂質化。脂質化后轉染Sf9昆蟲細胞，同時把沒有轉染Bacmid DNA 的正常Sf9昆蟲細胞設為空白對照。把細胞置28°C恒溫培養箱培養大約72h，期間注意觀 察細胞病變情況。大約36小時后細胞出現病變，72小時左右80%細胞出現病變，收集細胞 培養上清，其中含有重組桿狀病毒。上清再感染正常細胞，觀察細胞病變情況，72小時左右 80%細胞出現病變，收集上清和細胞。將感染重組桿狀病毒的細胞超聲破碎，提取上清作為 篩選抗原。
[0074] 對篩選抗原進行Western-blot鑒定，結果圖圖5所示，圖中，M為蛋白質marker、 1為正常sf9細胞蛋白、2為p54重組蛋白；結果顯示，上清液中含有預期的真核表達p54重 組蛋白
[0075] 實施例3單克隆抗體的制備
[0076] 1.動物免疫
[0077] 將實施例1中制備的純化p54免疫蛋白與等量的弗氏完全佐劑混合并乳化，皮下 注射7周齡BALB/c雌鼠，每只0. 2 μ g。14d后用等量弗氏不完全佐劑與p54蛋白混合并乳 化，皮下多點注射。21d后用等量弗氏不完全佐劑與p54蛋白混合并乳化，皮下多點注射。 在計劃和SP2/0細胞融合前3d進行不加任何佐劑的加強免疫注射。
[0078] 2.陽性雜交瘤細胞株的建立
[0079] 取效價高的免疫小鼠，將其脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按10 : 1比例混合，常規 PEG融合法制備雜交瘤細胞。采用實施例2中制備的篩選抗原進行間接ELISA方法檢測每 孔雜交瘤細胞培養上清，并設大腸桿菌、Sf9細胞蛋白作為篩選抗原的陰性對照。
[0080] 取同時滿足實施例2中的三種篩選抗原間接ELISA結果強陽性的孔，采用有限稀 釋法進行亞克隆，連續5次的雜交瘤細胞稀釋和連續5次的單克隆抗體測試，并且最后3次 抗體測試，全部陽性率孔穴達100 %，得到穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
[0081] 3.單克隆抗體的制備
[0082] 取10周齡BALB/c雌鼠，腹腔注射液體石蠟，每只0. 5mL，l周后向腹腔注射 5父106個陽性雜交瘤細胞。7-10(1后小鼠腹部明顯脹大，收集腹水并以200017^11離心 5min，上清液即為含抗非洲豬瘟p54蛋白單克隆抗體的腹水，即本例的非洲豬瘟病毒基因 II型毒株單克隆抗體，一 80°C保存備用。
[0083] 4.單克隆抗體亞類的鑒定
[0084] 將用Sigma公司的單抗亞類鑒定試劑盒內的試劑恢復至室溫，在裝有試紙卡的小 試管中先加入500 μ L緩沖液，再加500 μ L收集的小鼠腹水，輕輕晃動小試管使試紙卡充分 浸沒。再加入ImL抗小鼠抗體膠體金結合物，保持試紙卡有字的一面始終浸在液體中，于室 溫下輕輕晃動小試管，直到出現小點。經鑒定，該株雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體為IgGl 亞類，與預期相符。
[0085] 5.單克隆抗體特異性鑒定
[0086] 分別米用豬瘟病毒、豬藍耳病病毒、口蹄疫病毒、豬流感病毒、豬偽狂犬病病毒的 全病毒蛋白包被ELISA板，作為檢測抗原，采用本例制備的非洲豬瘟病毒基因 II型毒株單 克隆抗體作為被檢抗體，經間接ELISA方法檢測，結果顯示本例制備的非洲豬瘟病毒基因 II型毒株單克隆抗體與上述常見豬病病原均無交叉反應，具有良好的特異性。
[0087] 實施例4單克隆抗體的應用
[0088] 采用實施例3所獲得的單克隆抗體建立競爭ELISA方法，用于檢測非洲豬瘟病毒 不同地區來源毒株感染的豬只陽性血清。具體實驗如下：
[0089] 1.包被抗原的制備
[0090] 采用實施例1制備的純化抗原，測定蛋白濃度，用于包被ELISA板。
[0091] 2.單克隆抗體的制備
[0092] 采用上述制備的單克隆抗體，并標記上辣根過氧化物酶（HRP)，一 80°C保存備用。
[0093] 3.競爭ELISA操作程序
[0094] 包被：將6中所制備的P54抗原用包被液稀釋至2. 5 μ g/mL，分別加入到96孔酶 標板中，每孔l〇〇yL，置4°C冰箱過夜，或37°C作用lh。
[0095] 洗板：取出酶標板棄去液體，每孔加洗液200 μ L，洗板，共三次。最后一次倒置拍 干。
[0096] 封閉：每孔加封閉液100 μ L，37°C反應lh。反應完成后洗板。
[0097] 加樣：樣品和弱陽性對照、陽性對照、陰性對照用稀釋液作1 :5稀釋，混勻，分別加 入ELISA反應板，每孔50 μ L ;37°C反應lh。反應完成后洗板。
[0098] 加酶標單抗：將酶標單抗稀釋成工作濃度，混勻。每孔加50 μ L，震蕩混勻。37°C 作用30min。作用完成后洗板。
[0099] 加底物液：每孔加100 μ L底物液，37°C作用lOmin。
[0100] 終止反應：取出反應板，每孔快速加入50 μ L終止液，在30min內測其OD值。
[0101] 測吸光值：用酶標儀在450nm波長下，測定其吸光值。
[0102] 4.競爭ELISA方法結果判定閾值確定
[0103] 為確定競爭ELISA試驗方法判定陰陽性結果的臨界值，本實驗采用20份陰性血清 作為被檢血清，按上述競爭ELISA試驗程序進行試驗，然后測定每份血清的OD值。按照下 列公式計算該20份血清的阻斷率，即PI值：
[0104] PI (% ) = (1-樣品血清平均OD值/陰性血清對照平均OD值）xlOO%
[0105] 計算20份血清的平均PI值以及其標準差S ;按平均PI值加上3倍標準差S的值 作為陽性結果判定臨界值；按平均PI值加上2倍標準差S的值作為陰性結果判定臨界值； 位于兩者間則判定為可疑樣品。
[0106] 5.競爭ELISA方法應用于檢測田間樣本
[0107] 取來源于包括俄羅斯等不同國家的20份陽性血清樣品，其中包括5份俄羅斯境內 的基因 II型毒株感染豬只的陽性血清樣品，按上述操作規程及判定標準檢測。
[0108] 6 結果
[0109] 6. 1競爭ELISA方法臨界值及判定標準的確定
[0110] 本實驗采用20份本地陰性血清作為被檢血清，該20份血清經西班牙INGENASA公 司的非洲豬瘟抗體ELISA檢測試劑盒檢測為陰性血清，按上述優化好的競爭ELISA方法試 驗程序進行試驗，然后測定每份血清的OD值。計算20份血清的平均PI值以及其標準差S。 按平均PI值加上3倍標準差S的值作為陽性結果判定臨界值；按平均PI值加上2倍標準 差S的值作為陰性結果判定臨界值；位于兩者間則判定為可疑樣品，具體結果如表1所示。
[0111] 表1臨界值計算結果
[0112]

【權利要求】
1. 一種非洲豬瘟病毒基因 II型毒株單克隆抗體的制備方法，其特征在于：包括采用純 化的p54免疫蛋白對小鼠進行免疫，取免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合制備雜交瘤 細胞，然后采用三種篩選抗原對陽性雜交瘤細胞株進行篩選，獲得可穩定分泌抗非洲豬瘟 病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞，然后通過體內或體外的方法制備非洲豬瘟病毒基因 II型 毒株單克隆抗體；所述三種篩選抗原包括，原核表達P54重組蛋白、真核表達p54重組蛋白， 以及人工合成的Seq ID No. 1所示序列的多肽； Seq ID No. 1 :PVTGRPATNRPATNKPVTDNPVT。
2. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述p54免疫蛋白通過以下方式獲 取，將pMD18-T-p54質粒中p54基因片段轉入pET-52b(+)質粒，并在大腸桿菌DH5a中進 行可溶性表達，然后提取純化表達蛋白，即P54免疫蛋白。
3. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述原核表達p54重組蛋白為利用 pET-52b(+)質粒在大腸桿菌中原核表達后提取純化的p54重組蛋白；所述真核表達p54重 組蛋白為利用pFastBac/NT-TOPO昆蟲表達系統真核表達獲得的p54重組蛋白。
4. 一種非洲豬瘟病毒基因 II型毒株單克隆抗體，其特征在于：所述單克隆抗體由保藏 號CCTCC No. C2014213的雜交瘤細胞株SZCIQASFV2分泌產生。
5. 根據權利要求4所述的單克隆抗體，其特征在于：所述單克隆抗體由權利要求1-3 任一項所述的方法制備。
6. 根據權利要求4或5所述的單克隆抗體在制備非洲豬瘟病毒基因 II型毒株檢測試 劑或設備中的應用。
7. -種非洲豬瘟病毒基因 II型毒株酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中 含有權利要求4或5所述的單克隆抗體。
8. -種分泌非洲豬瘟病毒基因 II型毒株單克隆抗體的雜交瘤細胞，其保藏號為CCTCC No.C2014213。
9. 根據權利要求8所述的雜交瘤細胞的制備方法，包括采用純化的p54免疫蛋白對小 鼠進行免疫，取免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合制備雜交瘤細胞，然后采用三種篩 選抗原對陽性雜交瘤細胞株進行篩選，對三種篩選抗原均為強陽性的樣品進行有限稀釋法 細胞亞克隆，連續若干次的雜交瘤細胞稀釋和連續若干次的單克隆抗體測試，并且最后三 次抗體測試全部陽性率孔穴達100%的雜交瘤細胞，即獲得可穩定分泌抗非洲豬瘟病毒基 因 II型毒株單克隆抗體的雜交瘤細胞； 所述三種篩選抗原包括，原核表達P54重組蛋白、真核表達p54重組蛋白，以及人工合 成的Seq ID No. 1所示序列的多肽； Seq ID No. 1 :PVTGRPATNRPATNKPVTDNPVT。
【文檔編號】C07K16/08GK104497136SQ201410736095
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月5日 優先權日:2014年12月5日
【發明者】曹琛福, 花群義, 呂建強, 張彩虹, 劉建利, 宗卉, 唐金明, 楊俊興, 阮周曦, 陶虹 申請人:深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心