一種非酶切的膠原肽段制備方法
【專利摘要】本發明描述了一種可用于膠原蛋白的非酶切肽段的制備方法。屬于生物【技術領域】。主要解決目前膠原蛋白酶法分解時對制品純度的干擾問題，克服傳統膠原肽段由于酶解造成對測試結果干擾或對生物材料制備純化的影響。
【專利說明】一種非酶切的膠原肽段制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種用于膠原蛋白的非酶切肽段的制備方法，制備的肽段可用于膠原分型、電泳和架橋分析，也可用于生物材料的制備。
【背景技術】
[0002]無論是在膠原蛋白一級結構分析中，還是在膠原類生物材料的制備中，由于反應定量性的限制或材料性質的特殊要求，常需要對膠原蛋白進行切斷處理，傳統方法一般是利用胰蛋白酶、胃蛋白酶等酶解切斷，但由于酶也是一種特殊的蛋白質，其作用完成后的殘留即成為制品中的雜質，對后期的分析和使用都會帶來干擾和純化的困難。本發明則利用CNBr與蛋白質中蛋氨酸殘基反應，生成含有甲基硫氰酸和帶有高絲氨酸內酯的肽段(位于C末端)，以及結合在蛋氨酸殘基C段的氨基酸殘基(成為新的N末端)形成的肽段。而副產物主要包括甲基硫氰酸、溴化氫和過量的CNBr，這些副產物極易揮發，通過簡單的凍干處理即可除去。這樣形成的肽段有利于后期分析測試和材料制備。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是提供一種膠原蛋白非酶切肽段的制備方法。其步驟如下:
[0004]1、取市售或自制膠原溶于I?50ml的50?80% (v/v)甲酸溶液中，通氮氣5?20min除氧；
[0005]2 JpACNBr固體10?80mg或濃度為90?99% (w/v) CNBr的甲酸溶液(所用甲酸濃度與上步驟一致)10?150ml，再次通氮氣I?5min ；
[0006]3、密封容器中攪拌反應2?40小時，控制反應溫度為4?35°C，反應后，加入2?15倍的去尚子水稀釋并凍干；
[0007]4、凍干樣品再加2?15倍的去離子水稀釋并凍干，可如此反復多次，直至過量反應物和副產物脫除干凈；
[0008]5、樣品分離:使用市售羧甲基纖維素或磷酸纖維素層析填料。起始緩沖液為0.01?0.05mol/L枸櫞酸鈉(PH2.0?4.5)緩沖液。洗脫緩沖液為0.10?0.33mol/L枸櫞酸鈉(PH2.0?4.5)緩沖液。柱清洗緩沖液為0.01?0.5mol/L NaOH緩沖液；
[0009]6、填柱溫度為35?50 °C，填柱緩沖液為柱清洗緩沖液，柱平衡用起始緩沖液進行，直至PH值達到2.0?4.5 ;
[0010]7、將冷凍干燥樣品10?10mg溶解于2?200ml起始緩沖液中，30?50°C條件下加熱處理8?20min后上柱，起始緩沖液與洗脫緩沖液梯度洗脫；
[0011]8、以226nm測定樣品吸光度，分別收集峰1、峰I1、峰III，凍干即為三個肽段。
【具體實施方式】
[0012]實施例一
[0013]取1mg市售或自制膠原溶于20ml的70% (v/v)甲酸溶液中，通氮氣1min除氧。加入CNBr固體40mg，再次通氮氣2min。密封容器中攪拌反應4小時，控制反應溫度為30°C，反應完成后，加入8倍的去離子水稀釋并凍干。凍干樣品再加5倍的去離子水稀釋并凍干，如此反復2次。使用市售羧甲基纖維素層析填料。起始緩沖液為0.02mol/L枸櫞酸鈉(PH3.6)緩沖液。洗脫緩沖液為0.18mol/L枸櫞酸鈉(PH3.6)緩沖液。柱清洗緩沖液為0.0lmol/L NaOH緩沖液。填柱溫度為45°C，填柱緩沖液為柱清洗緩沖液，柱平衡用起始緩沖液進行，直至PH值達到3.6。將冷凍干燥樣品1mg溶解于2ml起始緩沖液中，50°C條件下加熱處理1min后上柱，起始緩沖液與洗脫緩沖液梯度洗脫。以226nm測定樣品吸光度，分別收集峰1、峰I1、峰III，凍干即為三個肽段。
[0014]實施例二
[0015]取1mg市售或自制膠原溶于50ml的50% (v/v)甲酸溶液中，通氮氣15min除氧。加入CNBr固體70mg，再次通氮氣5min。密封容器中攪拌反應8小時，控制反應溫度為10°C，反應完成后，加入10倍的去離子水稀釋并凍干。凍干樣品再加8倍的去離子水稀釋并凍干，如此反復2次。使用市售磷酸纖維素層析填料。起始緩沖液為0.05mol/L枸櫞酸鈉(PH2.2)緩沖液。洗脫緩沖液為0.23mol/L枸櫞酸鈉(PH2.2)緩沖液。柱清洗緩沖液為0.lmol/L NaOH緩沖液。填柱溫度為35°C，填柱緩沖液為柱清洗緩沖液，柱平衡用起始緩沖液進行，直至PH值達到2.2。將冷凍干燥樣品1mg溶解于5ml起始緩沖液中，35°C條件下加熱處理Smin后上柱，起始緩沖液與洗脫緩沖液梯度洗脫。以226nm測定樣品吸光度，分別收集峰1、峰I1、峰III，凍干即為三個肽段。
[0016]實施例三
[0017]取10mg市售或自制膠原溶于50ml的80% (v/v)甲酸溶液中，通氮氣20min除氧。加入濃度98% CNBr甲酸溶液90ml，再次通氮氣3min。密封容器中攪拌反應18小時，控制反應溫度為4°C，反應完成后，加入9倍的去離子水稀釋并凍干。凍干樣品再加2倍的去離子水稀釋并凍干，如此反復I次。使用市售磷酸纖維素層析填料。起始緩沖液為0.0lmol/L枸櫞酸鈉(PH4.5)緩沖液。洗脫緩沖液為0.17mol/L枸櫞酸鈉(PH4.5)緩沖液。柱清洗緩沖液為0.3mol/L NaOH緩沖液。填柱溫度為50°C，填柱緩沖液為柱清洗緩沖液，柱平衡用起始緩沖液進行，直至PH值達到4.5。將冷凍干燥樣品10mg溶解于10ml起始緩沖液中，40°C條件下加熱處理15min后上柱，起始緩沖液與洗脫緩沖液梯度洗脫。以226nm測定樣品吸光度，分別收集峰1、峰I1、峰III，凍干即為三個肽段。
【權利要求】
1.一種用于膠原蛋白的非酶切肽段的制備方法，制備的肽段可用于膠原分型、電泳和架橋分析，也可用于生物材料的制備，其特征在于制備過程包括下列各步驟: (1)取市售或自制膠原溶于1?501111的50?80% 0/^)甲酸溶液中，通氮氣5?.20111111 除氧； (2)加入⑶此固體10?80呢或濃度為90?99%(界八)⑶此的甲酸溶液(所用甲酸濃度與上步驟一致)，再次通氮氣1?5111111 ； (3)密封容器中攪拌反應2?40小時，控制反應溫度為4?35。X:，反應完成后，加入.2?15倍的去離子水稀釋并凍干； (4)凍干樣品再加2?15倍的去離子水稀釋并凍干，可如此反復多次，直至過量反應物和副產物脫除干凈；(5)樣品分離:使用市售羧甲基纖維素或磷酸纖維素層析填料，起始緩沖液為0.01?.0.05001/1枸櫞酸鈉陳0?4.5)緩沖液，洗脫緩沖液為0.10?0.33001/1枸櫞酸鈉陳0?4.5)緩沖液，柱清洗緩沖液為0.01?0.5^01/1關!I緩沖液； (6)填柱溫度為35?501:，填柱緩沖液為柱清洗緩沖液，柱平衡用起始緩沖液進行，直至值達到2.0?4.5 ； (7)將冷凍干燥樣品10?100呢溶解于2?20001起始緩沖液中，30?501:條件下加熱處理8?20111111后上柱，起始緩沖液與洗脫緩沖液梯度洗脫； (8)以226=111測定吸光度，分別收集峰1、峰I1、峰III，凍干即為三個肽段。
【文檔編號】C07K1/02GK104478988SQ201410662382
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月5日 優先權日:2014年11月5日
【發明者】謝磊, 畢宏偉 申請人:天津市賽寧生物工程技術有限公司