免疫毒素的表達和純化方法

免疫毒素的表達和純化方法
【專利摘要】一種在巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中表達免疫毒素的方法，包括：a)在包含蛋白的酶消化產物和酵母提取物的生長培養基中培養可表達免疫毒素的巴斯德畢赤酵母；b)對巴斯德畢赤酵母進行甲醇誘導，其中甲醇誘導的溫度在約17.5℃以下。
【專利說明】免疫毒素的表達和純化方法
[0001] 本申請為分案申請，其原申請的申請日為2004年8月2日，申請號為 201110263529. 9,名稱為"免疫毒素的表達和純化方法"。
[0002] 本申請要求2003年8月1日提交的美國臨時申請60/491，923的權益。美國政府 對該申請擁有一定權利。
[0003] 發明背景

【技術領域】：
[0004] 本發明一般而言涉及蛋白表達和純化方法，更具體地說，涉及免疫毒素的表達和 純化方法。

【背景技術】：
[0005] 美國每年進行的器官移植手術約有24, 000例，主要包括腎臟移植（14, 000例）、 肝臟移植（5, 000例）、心臟移植（2, 200例），以及少量的胰、肺、心一肺和腸移植（2002年 0PTN/SRTR年度報告）。
[0006] 移植耐受仍然是患者和醫生難以企及的目標，他們期望成功地實現異源器官移植 而無需堅持使用無限期的、非特異性的免疫抑制劑，并免除其帶來的副作用。許多此類患者 使用環孢菌素（cyclosporin)、硫唑噪呤（azathioprine)和潑尼松（prednisone),以及多 種其他免疫抑制劑治療，以誘導或維持免疫抑制。在美國，維持免疫抑制療法的年均花費約 $11, 000 (Immunosuppressive Drugs Coverage Act, National Kidney Foundation,參見 http://www. kidney, org/general/pubpol/immufact. cfm)。雖然這些藥物可有效防止排斥 反應，但免疫抑制療法的副作用是相當大的。免疫抑制療法誘導免疫系統的非特異性無應 答。移植接受者易于感染，并有患惡性腫瘤的風險，如以移植后淋巴增生性障礙的形式。移 植免疫生物學的主要目標是開發對器官移植的特異性免疫耐受，而使患者從持續藥理免疫 抑制的副作用及其帶來的并發癥和費用中解脫出來。
[0007] 開發了二價抗T細胞免疫毒素，A-dmDT390-bisFV(G4S)，用于對移植、T細胞白血 病和自體免疫疾病進行耐受誘導。該免疫毒素由白喉毒素的前390個氨基酸殘基（DT390) 和來自抗CD3抗體UCHTl的兩個成串的抗原結合結構域（sFv)構成，后者負責將該免疫毒 素結合至T細胞受體復合物的CD3e Y亞基。抗CD3e抗體部分使得該免疫毒素能夠靶向 特定細胞，而白喉毒素部分可殺死靶細胞。該免疫毒素可用于使至少部分T細胞耗盡，以治 療或防止T細胞介導的免疫系統疾病或病癥。
[0008] 施用抗T細胞免疫毒素提供了一種實現特異性免疫耐受的方法。它可應用于接受 者體內具有穩定移植物功能的新器官移植物，也可用于已經存在的移植物。該免疫毒素可 提供高度特異性免疫抑制，在靈長類中實現移植耐受，而沒有非特異性免疫抑制藥物、抗淋 巴細胞血清或放射的副作用。將排斥應答抑制到不會減短移植接受者平均壽命的程度，是 本領域的一個目標。
[0009] 甲基營養酵母-巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris)已成功用于表達不同來源 的異源蛋白（Gellissen 2000)。作為真核生物，巴斯德畢赤酵母能夠進行多種翻譯后蛋白 修飾，如蛋白酶解加工、折疊、二硫鍵形成和糖基化作用。像其他酵母一樣，巴斯德畢赤酵母 具有勝過高等真核細胞如中國倉鼠卵巢（CHO)或桿狀病毒感染的昆蟲細胞表達系統的顯 著優點。它易于操控，生長速度快，所需培養基價格低廉。這大大減少了生產時間和費用， 特別在商業規模上更是如此。與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)不同，巴斯德畢赤 酵母并非強發酵酵母，可很容易地培養至> IOOg干細胞/升的極高細胞密度（Siegel et al.，1989)。再加上采用強AOXl啟動子驅使外源基因轉錄，使得巴斯德畢赤酵母成為高水 平異源基因表達的優選系統。AOXl啟動子在表達對表達宿主有害的外源蛋白時也具有優 勢，因為該啟動子在非甲醇生長條件下受到嚴格調控和高度抑制。可誘導的和嚴格調控的 AOXl啟動子使得巴斯德畢赤酵母菌株（沒有任何導致對DT有抗性的突變）可成功地以分 泌形式表達基于DT的免疫毒素（Woo et al.，2002)。然而，如果白喉毒素（DT)的催化區能 夠進入胞質溶膠，它對所有的真核細胞來說都是很強的毒素。巴斯德畢赤酵母對這些毒素 本性上是敏感的。
[0010] 現有技術教導了培養巴斯德畢赤酵母的方法。例如，巴斯德畢赤酵母可在發酵 罐中培養。一種巴斯德畢赤酵母的發酵方法包括使用甘油作為最初的碳源，隨后進行短 暫的碳饑餓，再使用甲醇作為碳源（Pichia pastoris Fermentation Using a BioFlo IlOBenchtop Fermentor, New Brunswick Scientific)。
[0011] Woo等記載，當在巴斯德畢赤酵母中表達二價抗人抗T細胞免疫毒素 A-dmDT390-bisFv(G4S)時，含1%酪蛋白氨基酸的pH7. 0的緩沖復合物培養基可提供搖瓶 培養的最高表達，加入1至3mM范圍的PMSF可提高表達水平。（25Protein Expression and Purification270-82 (2002))。
[0012] Sreekrishna記載，以搖瓶培養巴斯德畢赤酵母，當細胞通入大量空氣并在補 充有酵母提取物和胨的PH6.0的緩沖培養基中培養時，可使分泌水平提高（Chapter 16, Industrial Microorganisms:Basic and Applied Molecular Genetics (1993)) 〇 含酵 母氮堿基以及硫酸銨、生物素和甘油的生長培養基，使用磷酸鉀以及酵母提取物和胨調節 pH至6.0。誘導培養基含有甲醇代替甘油。
[0013] 與之相比，本發明提供了一種使用巴斯德畢赤酵母制備免疫毒素的改進的方法。 本發明所表達和純化的免疫毒素可用于誘導免疫耐受的方法中。很有必要提供一種提高免 疫毒素產量的表達和純化方法。本發明在下文中闡述了此問題以及其他一些問題。


【發明內容】

[0014] 本發明一方面涉及一種在巴斯德畢赤酵母毒素抗性EF-2突變株中表達免疫毒素 的方法，包括：a)在包含蛋白的酶消化產物和酵母提取物的生長培養基中培養巴斯德畢赤 酵母；b)對巴斯德畢赤酵母進行甲醇誘導，誘導過程中添加0. 5至0. 75ml/min (每10L初 始培養基）的限量甲醇，且甲醇誘導的溫度在約17. 5°C以下。
[0015] 本發明另一方面涉及一種在巴斯德畢赤酵母中表達免疫毒素的方法，包括：a)在 包含蛋白的酶消化產物和酵母提取物的生長培養基中培養巴斯德畢赤酵母；b)使用含甲 醇和甘油的添加物對巴斯德畢赤酵母進行甲醇誘導，其中巴斯德畢赤酵母與苯甲烷磺酰氟 (phenylmethanesulfonyl fluoride)和氨基酸源相接觸，且甲醇誘導的溫度在約17. 5°C以 下。
[0016] 本發明再一方面涉及一種純化非糖基化免疫毒素的方法，包括：a)將含有非糖基 化免疫毒素的溶液裝入疏水作用柱（hydrophobic interaction column)中；b)從疏水作 用柱中獲得含洗脫劑的第一非糖基化免疫毒素；c)將步驟（b)中獲得的含洗脫劑的非糖基 化免疫毒素裝入陰離子交換柱中；d)通過使用硼酸鈉溶液洗脫非糖基化免疫毒素，從陰離 子交換柱中獲得含洗脫劑的第二非糖基化免疫毒素；e)稀釋步驟（d)中獲得的含洗脫劑的 第二非糖基化免疫毒素，使其中的硼酸鈉濃度達到約50mM或更低；f)在陰離子交換柱上濃 縮在步驟（e)中獲得的含洗脫劑的稀釋的非糖基化免疫毒素；g)從陰離子交換柱獲得純化 的非糖基化免疫毒素。
[0017] 應該理解，上文的一般性敘述和下文的詳細敘述均只起示例和解釋作用，并不限 制由權利要求書限定的本發明范圍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 附圖顯示一個或多個本發明的實施方案，并與文字敘述一起解釋本發明的原理。
[0019] 圖I : (a)真核EF-2中白喉酰胺結構域的保守性以及DT抗性突變。（b)巴斯德畢 赤酵母EF-2中可導致Arg替換Gly 701的核苷酸序列突變。帶有下劃線的序列為由核苷 酸突變導致的限制酶Sac II位點。見SEQ ID NO: 1-10。
[0020] 圖2 :巴斯德畢赤酵母EF-2的5'端序列，顯示短內含子（SEQ ID NO: 11 ;mRNA)和 (SEQ ID N0:12;gDNA)。5'剪接位點、分支位點以及3'剪接位點使用下劃線標出。EF-2編 碼序列使用粗體標出。
[0021] 圖3 : (A) (B) (C) (D)巴斯德畢赤酵母EF-2 (SEQ ID NO: 13)的核苷酸序列和推得的 氨基酸序列。核苷酸序列從起始密碼子的開端處開始編號。蛋白序列中共有的GTP結合基 序為AHVDHGKST(SEQ ID勵:14)，據推測在體內被￡?-2激酶磷酸化的蘇氨酸殘基用圓圈標 出，在所有的延長因子中均保守的效應物結構域為DEQERGITIKSTA(SEQ ID N0:15)。白喉酰 胺結構域中22個高度保守的殘基使用方框標出。
[0022] 圖4 :使用已經體外突變的EF-2的3'序列進行定向突變。突變質粒 pBLURA-A 5' mutEF-2包括四個重要元件：P -內酰胺酶基因（Ampr)、尿啼陡選擇標記 (URA3)、3'A0X1轉錄終止序列（TT)和體外突變的FF-23'序列A5'mutEF-2。
[0023] 圖5 :對來自巴斯德畢赤酵母JC308菌株的所選Ura+克隆的PCR產物進行瓊脂糖 凝膠電泳。（a)使用引物1和M的PCR產物；(b)使用引物2和w的PCR產物；（c) Sca II 消化的使用引物2和3的PCR產物。
[0024] 圖6 :在突變型和野生型巴斯德畢赤酵母菌株中胞質溶膠表達的DT-A鏈的蛋白質 印跡分析。（a)泳道1?6為使用pPIC3-DtA轉化的6個獨立mutEF2JC307-8克隆的細胞 提取物，+C:純化的 A-dmDT390_bisFv。M:SeeBlue plus2 蛋白標記（Invitrogen)。（b)在 兩個獨立菌落mut-3和mut-5 (分別為mutEF2JC307-8 (3)和（5))，C3和C4培養物中，胞質 溶膠表達的DT-A鏈。蛋白樣本加于4?12% NuPAGE凝膠（Invitrogen)上。
[0025] 圖7 :細胞內表達DT-A對帶有突變型或野生型EF-2的巴斯德畢赤酵母菌株的存 活的影響。Mut-3 和 Mut 5 分別為 EF-2 突變體 mutEF2JC307-8-DtA(3)和（5)，Mut-3 在胞 質溶膠中表達DT A鏈，而mut-5并非如此。C3和C4是野生型EF-2菌株，在胞質溶膠中表 達（C4)或不表達DT A鏈。每一類的第一個柱表示甲醇誘導前的菌落形成單位。每一類的 第二個柱代表甲醇誘導后的菌落形成單位。
[0026] 圖 8 :質粒構建示意圖。（a)pBLARG-A-dmDT390-bisFv ; (b) pPGAPArg-A-dmDT390-bisFv ; (c)pPGAPHis-A-dmDT390-bisFv。
[0027] 圖9 :A-dmDT390-bisFV表達情況的蛋白質印跡分析。培養基（a)和細胞提取物 (b)樣本加于 4 ?12% NuPAGE 凝膠（Invitrogen)上。+c 泳道為純化的 A-dmDT390_bisFv。 泳道1?9是使用2拷貝A-dmDT390-bisFv基因轉化的mut EF2JC303中，所選的9個克隆 樣本。泳道10、11和12是單拷貝克隆樣本：泳道12為非突變型EF-2克隆JHW#2,泳道10 和11是兩個選出的mutEF2JC307-8(l)和mutEF2JC307-8(2)克隆，后者也稱為YYL#8-2。
[0028] 圖10:比較不同巴斯德畢赤酵母菌株的甲醇消耗速率。所有這些菌株均為 Mut+(甲醇利用增加），除了 pJHW#3為MutS(甲醇利用緩慢）。pJHW#2到5和EF-2突變體 YYL#8-2均表達二價免疫毒素A-dmDT390-bisFv。X-33為不表達A-dmDT390-bisFv的野生 型菌株，但使用表達載體轉化。
[0029] 圖11 :X_33和JW102之間，以及在指定溫度下對JW102添加不同營養物之間的甲 醇消耗速率曲線的比較。YE和casa分別代表添加酵母提取物和酪蛋白氨基酸。
[0030] 圖12 :降低發酵中的攪拌速度減少免疫毒素聚集體。在高攪拌速度下進行發酵導 致50%以上的分泌免疫毒素在上清液中以無活性的聚集體形式存在。另外，聚集體在誘導 時間內累積。然而，將攪拌速度從SOOrpm降低到400rpm減少了免疫毒素聚集體。免疫毒 素聚集體在誘導時間內水平保持不變。
[0031] 圖13 :在30°C、250rpm下，經20小時誘導之后，TWEEN 20?對純化免疫毒素聚集 的影響。使用純化免疫毒素，通過攪拌，TWEEN20?可防止聚集體的形成。通過在30°C、 250rpm下誘導20小時，大約50%的純化免疫毒素聚集。然而，通過攪拌，0. 01 %?0. 04% 的TWEEN 20?可顯著減少純化免疫毒素的聚集。
[0032] 圖14 :甲醇誘導的前44小時內濕細胞密度收獲量的變化。MeOH，只有甲醇并加入 酪蛋白氨基酸；M:G = 4:1，補充甲醇/甘油混合物并補充酪蛋白氨基酸；YE+MeOH，補充酵 母提取物以及只有甲醇；YE+4:1，補充酵母提取物并補充甲醇/甘油混合物。
[0033] 圖15 :根據誘導溫度不同，二價免疫毒素的表達水平及其最終純化產率。A :誘導 溫度不同表達水平的變化。B :從甲醇誘導22、44和67小時時所取的1升上清液中所獲最 終純化產率的變化。22小時、44小時和67小時代表甲醇誘導時間。C :誘導溫度不同甲醇 消耗量的變化。
[0034] 圖16 :優化的發酵批次的代表。在所示時間點取的樣本在4?20% SDS-tris-甘 氨酸凝膠上分級，并且該凝膠使用考馬斯藍染色。箭頭表示二價免疫毒素的位置。使用Mark 12 標記（Invitrogen) 〇
[0035] 圖17 :通過butyl 650M捕捉步驟獲得的蛋白的SDS-PAGE電泳分析。泳道1?4,樣 本流過組分#1?#4 ;泳道5,匯集的樣本流過組分；泳道6?8,洗滌組分#1?#3 ;泳道9， 匯集的洗漆組分；泳道1〇、11、17,上清液；泳道12, Mark 12蛋白標準樣本（Invitrogen); 泳道13?15,洗脫組分#1?#3 ;泳道16,匯集的洗脫組分。IT，免疫毒素。
[0036] 圖18 :通過Poros 50HQ硼酸鹽陰離子交換步驟獲得的蛋白的SDS-PAGE電泳分 析。泳道1，Mark 12蛋白標準樣本（Invitrogen);泳道2,從Butyl 650M HIC步驟獲得的 樣本；泳道3?7,樣本流過組分#1?#5 ;泳道8,使用25mM溶于緩沖液B的硼酸鹽洗脫的 組分#1 ;泳道9,使用50mM溶于緩沖液B的硼酸鹽洗脫的組分#2 ;泳道10,使用75mM溶于 緩沖液B的硼酸鹽洗脫的組分#3 ;泳道11，使用IOOmM溶于緩沖液B的硼酸鹽洗脫的組分 #4 ;泳道12,使用IM溶于緩沖液B的NaCl洗脫的組分#5 ;IT，免疫毒素。
[0037] 圖19 :純化免疫毒素的分析凝膠過濾和SDS-PAGE電泳分析。A :Superdex 200 10/300 GL凝膠過濾色譜圖。B :考馬斯染色的SDS-聚丙烯酰胺凝膠圖譜。
[0038] 圖 20 : (a) (b) (c)Ala-dmDT390-bisFv(UCHTl)的氨基酸序列（SEQ ID NO: 16)。
[0039] 圖21 :甲醇誘導過程中的細胞生長、甲醇消耗和免疫毒素分泌曲線比較。組A : X-33菌株和產生免疫毒素的毒素抗性EF-2突變體mutEF2JC307-8 (2)。這兩個菌株在甲醇 誘導過程中具有相似的甲醇消耗速率和濕細胞密度增長曲線。組A中所示數據來自X-33。 對于毒素抗性突變體，在甲醇誘導44h時，最大甲醇消耗速率和濕細胞密度增長分別為 2. 2ml/min和9. 17%。組B-F:菌株JW102。在所有組A-F中的恒定條件是在誘導之前的甘 油分批階段，并繼之以甘油補料分批階段。對于誘導，僅使用純甲醇（MeOH)或者使用4:1 甲醇：甘油（M/G)混合補料。誘導過程中持續注入溶于甲醇的IOmM的PMSF。當不添加酵 母提取物（YE)時則添加酪蛋白氨基酸。誘導條件：組A，添加M/G，不添加YE;組B，添加甲 醇，不添加YE ;組C，添加甲醇，添加YE ;組D，添加M/G，添加YE ;組E，添加M/G，不添加YE ; 組F，添加M/G，添加YE。誘導溫度，A-E為23?25°C，F為15°C (注意組F的右側軸與其 他組相比壓縮2倍）。甲醇消耗速率（ml/min)，虛線；濕細胞密度（％，w/v)，實線；分泌免 疫毒素水平（mg/L)，短劃線。因為在IOL生物反應器發酵中有大量的工作，所以重復組A-E 的結果是不切實際的。優化方法組F進行了 3次，點為平均值，當均值的標準差超過10%時 在圖中表示出來。濕細胞密度和分泌免疫毒素水平的準確數據點顯示為方塊和圓圈。因為 每分鐘測量一次甲醇消耗速率，所以省略了甲醇消耗速率的準確數據點。
[0040] 圖22 :蛋白降解和免疫毒素生產。A :在補充甲醇和酵母提取物的培養物（圖21C) 中，甲醇誘導過程中免疫毒素水平的時程。免疫毒素條帶使用IT和箭頭標出。B :對等體 積的純化免疫毒素QSOyg/ml)與等體積的在甲醇誘導后所示時間收集的上清液，在培育 (28 °C，20h，250rpm搖動）后通過SDS-PAGE對殘留免疫毒素進行分析。等體積純化免疫毒 素和PBS緩沖液的混合物，或者來自Oh的上清液用作對照（CON)。10 ill制備的樣本加于 SDS-PAGE，并在非還原條件下在4?20% SDS-tri-甘氨酸凝膠上分級。凝膠使用考馬斯藍 染料染色。使用Mark 12標記（Invitrogen)作為蛋白標記。
[0041] 圖23 :溫度對生產免疫毒素的影響。在所不誘導時間點（44,50,67h)從不同誘導 溫度（15?23°C )批次中取得的樣本，在非還原條件下在4?20% SDS-tris-甘氨酸凝膠 上分級。對于所有批次，持續添加酵母提取物和甲醇-甘油補料。凝膠使用考馬斯藍染料 染色。IT-dp表示二價免疫毒素的降解產物。這些降解產物通過蛋白質印跡使用抗DT抗體 和抗（G 4S)3接頭抗體識別。抗（G4S)3接頭抗體可檢測二價免疫毒素和降解產物，因為免疫 毒素包含三個（G 4S)3接頭。箭頭指向與二價免疫毒素無關的條帶。IT表示免疫毒素。使 用Mark 12標記（Invitrogen)作為蛋白標記。
[0042] 圖24 :在15°C下的甲醇誘導過程中，對于存在和不存在PMSF的上清液中的蛋白酶 活性進行分析。上清液是在甲醇誘導〇、22、44和67h時，從持續添加酵母提取物和甲醇-甘 油補料處理的發酵批次中取得的。上清液與作為底物的無切口的CRM9 -起培育。培育后， 10 樣本在還原條件下在4?20% SDS-tris-甘氨酸凝膠上分級。染色和干燥后，通過 使用NIH成像軟件將凝膠數字化并分析無切口 CRM9的條帶密度。在甲醇誘導中補充PMSF， 實線；無PMSF，虛線。每個數據點為3個發酵批次的平均值，并帶有均值的標準差。

【具體實施方式】
[0043] 在公開和描述本發明的化合物、組合物、物品、裝置和/或方法之前，應該理解，除 非另有說明，并不限于特定的合成方法或特定的重組生物技術方法，除非另有說明，并不限 于特定試劑，因其毫無疑問地可有多種變化形式。還應理解，本文所用術語只是出于描述特 定實施方案的目的，而非意在限制。
[0044] 如在說明書和所附權利要求書中使用的，單數形式的"一"、"一種"和"該"包括復 數指代對象，除非上下文中另外明確指出。因此，例如，提及"一種藥物載體"包括兩種或更 多種這類載體的混合物等等。
[0045] 本文中范圍可以表示為從"大約"一個具體的數值，和/或至"大約"另一個具體 的數值。當表示為這種范圍時，另一個實施方案包括從前述的一個具體的數值和/或至前 述的另一個具體的數值。類似地，當通過在前面使用"大約"將數值表示為近似值時，應當 理解的是，該具體的數值構成另一個實施方案。應當進一步理解的是，每個范圍的端點在與 另一個端點相關和獨立于另一個端點時都是有意義的。還應當理解的是此處公開了許多數 值，且除了數值本身外每一個數值在此還以"大約"該具體數值公開。例如，如果公開了數 值"10"，那么也公開了 "大約10"。還應當理解的是，當公開了一個數值時，也公開了 "小于 或等于該數值"，"大于或等于該數值"以及數值間可能的范圍，如本領域技術人員所恰當理 解的。例如，如果公開了數值"10"，也公開了 "小于或等于10"以及"大于或等于10"。還 應理解，在整個本申請中，以多種不同格式提供數據，這些數據代表了端點和起點，以及這 些數據點任何組合的范圍。例如，如果公開了特定數據點"10"和特定數據點15,應該理解， 大于、大于或等于、小于、小于或等于、等于10和15,以及10和15之間的數值也認為已經公 開。
[0046] 在本說明書及其后的權利要求書中，將會提及許多被界定為具有如下含義的術 語：
[0047] "可選的"或"可選地"意即：隨后所描述的事件或情況可以發生或不發生，以及該 描述包括其中所述事件或情況發生的例子及其不發生的例子。
[0048] "接觸"是指將一種物質置于可與另一種物質發生物理關聯的條件下。
[0049] "非糖基化"是指沒有糖基化作用，或者使用本領域常規的測定糖基化的方法，檢 測不到糖基化作用。因此，非糖基化包括已使糖基化位點發生突變使得糖基化作用不發生， 在不發生糖基化作用的系統中表達，或者在野生狀態下不具有糖基化作用位點。
[0050] "裝入"柱中是指將樣本放在某位置，以使至少一部分樣本最終進入柱中由樹脂占 據的位置。
[0051] "酶消化"是指使用一種或多種不同的酶將蛋白或肽在肽鍵處水解。此類酶包括但 不限于胰島素、糜蛋白酶、胃蛋白酶、凝血酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草 桿菌蛋白酶或羧肽酶A。
[0052] "酵母提取物"是指通過對酵母細胞內的蛋白進行蛋白酶解而獲得的肽和氨基酸 的制備物。
[0053] "誘導"是指為給定的啟動子提供信號，促使給定基因的表達。
[0054] "添加"是指以一定速率提供新鮮培養基或營養物，以至少部分取代被消耗掉的培 養基或營養物。
[0055] "部分"是指可分為多個部分的分子或化合物的一個部分。在本發明中，部分可以 指免疫毒素的毒素部分或抗體部分。
[0056] 本發明中，術語"二價"是指單個組合物能夠與兩個配體相結合。例如， A-dmDT390-bisFv(G 4S)免疫毒素可結合兩個⑶3分子。還應理解，術語"兩價"在本領域中 具有相似的含義。在此，術語"二價"和"兩價"指相同的性質，可互換使用。
[0057] 本發明提供了一種在巴斯德畢赤酵母變體中表達和純化變體ADP核糖基化毒 素和毒素融合蛋白的系統。本發明方法具有遵循優質生產規范（Good Manufacturing Practices)的優點。
[0058] 正如廣泛使用的情況一樣，免疫毒素可選為融合蛋白。免疫毒素可包括白喉毒素 部分。應該理解且涵蓋于本文之中的是，本方法可使用其他ADP核糖基化免疫毒素。例如， 特別考慮的是免疫毒素包含綠膿桿菌外毒素A(Psuedomonas exotoxin A)部分的融合蛋 白。毒素部分可為截短型（truncated)部分和/或可包含相對于野生型毒素的變異。免疫 毒素可進一步包括CD3抗體部分或其他抗體部分。還應理解，免疫毒素可包括除CD3抗體以 外的靶向抗體部分。本領域技術人員可根據靶細胞，知道在免疫毒素中使用何種部分。例 如，CD22抗體可用于將免疫毒素融合蛋白引導至B細胞。
[0059] 本發明提供了一種在巴斯德畢赤酵母毒素抗性EF-2突變株中表達免疫毒素的方 法，包括：在包含蛋白的酶消化產物和酵母提取物的生長培養基中培養巴斯德畢赤酵母； 在約17. 5°C以下的溫度下進行甲醇誘導。
[0060] 本發明一方面提供了一種在巴斯德畢赤酵母毒素抗性EF-2突變株中表達免疫毒 素的方法，包括：在包含蛋白的酶消化產物和酵母提取物的生長培養基中培養巴斯德畢赤 酵母；對巴斯德畢赤酵母進行甲醇誘導，誘導過程中添加0. 5至0. 75ml/min (每IOL初始培 養基）的限量甲醇，且甲醇誘導的溫度在約17. 5°C以下。
[0061] 本發明另一方面提供了一種在巴斯德畢赤酵母中表達免疫毒素的方法，包括：在 包含蛋白（如大豆蛋白）的酶消化產物和酵母提取物的生長培養基中培養巴斯德畢赤酵 母；使用含甲醇和甘油的添加物（如甲醇和甘油的比例為約4:1)對巴斯德畢赤酵母進行甲 醇誘導，其中巴斯德畢赤酵母與苯甲烷磺酰氟和氨基酸源（如酵母提取物）相接觸，且甲醇 誘導的溫度在約17. 5°C以下。
[0062] 在該表達方法中，將巴斯德畢赤酵母與苯甲烷磺酰氟和氨基酸源接觸的操作包 括，將這些細胞與苯甲烷磺酰氟和氨基酸源接觸至少2小時，包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或 更多的小時數，或者介于其中的任何量。優選地，苯甲烷磺酰氟溶于4:1的甲醇甘油誘導添 加物中，濃度不超過10mM。
[0063] 甲醇誘導溫度優選在約17. 5°C以下，更優選約15°C。本方法實踐中適于發生甲醇 誘導的其他溫度包括 17. 0、16. 5、16. 0、15. 5、14. 5、14. 0、13. 5、13、12. 5、12°C或者介于其中 的任何量。
[0064] 生長培養基是指所選有機體生長所需的任何物質。生長所需的物質包括但不限于 碳、氫、氧、氮、磷、硫、鉀、鎂、鈣、鈉、鐵、微量元素和有機生長因子。生長培養基中可包括多 種原料以提供所需物質。這些物質包括但不限于單糖，提取物如胨、大豆胨（soytone)、胰 胨（tryptone)、酵母提取物，二氧化碳，維生素，氨基酸，噪呤和啼陡。本發明方法的一個實 例利用了 DIFCO公司生產的大豆的酶消化產物的存在。本發明方法的另一個實例利用了 DIFCO公司生產的酵母提取物的存在。應該理解，可使用生產此類產品的任何廠商（如New England Biosciences)生產的酵母提取物和酶消化產物。
[0065] 在本方法的一個具體的非限制性實例中，生長培養基的組成為約4%甘油，約2% 酵母提取物，約2%大豆蛋白的酶消化產物，約1.34%含有硫酸銨不含氨基酸的酵母氮堿 基，以及約〇. 43% PTMl溶液。生長培養基可選進一步包括消泡劑。更具體地，消泡劑的濃 度為約0. 01 %或更高。例如，消泡劑濃度可為0. 07%，或者約0. 01 %至約0. 07 %之間的任 何量。消泡劑的最佳水平可選擇為：使液體一空氣界面之上的泡沫層減少至1/2英寸或更 薄所需的最小量。因此，生長培養基的組成可為約4%甘油，約2%酵母提取物，約2%大豆 蛋白的酶消化產物，約1. 34%含有硫酸銨不含氨基酸的酵母氮堿基，約0. 43% PTMl溶液， 以及約0.02 %消泡劑。
[0066] 應該理解，本領域技術人員知道可以改變生長培養基的組成以利于最佳生長。特 別考慮的變化是高于或低于生長培養基中組分百分比最多20%。因此本文公開了一種 生長培養基，其中該生長培養基的組成為約3. 2-4. 8%甘油，約1. 6-2. 4%酵母提取物，約 1. 6-2. 4%大豆蛋白的酶消化產物，約1. 07-1. 61 %含有硫酸銨不含氨基酸的酵母氮堿基， 以及約.34-. 52% PTMl溶液。例如，特別公開了一種培養基，其中該生長培養基的組成為約 3. 6%甘油，約2. 4%酵母提取物，約1.9%大豆蛋白的酶消化產物，約1.43%含有硫酸銨不 含氨基酸的酵母氮堿基，以及約〇. 43% PTMl溶液。
[0067] 在本發明的表達方法中，可選地，生長培養基中溶解氧濃度保持在40%或更高 (如45%、50%、55%、60%或65%)的數值。例如，在本發明中，甲醇誘導開始之前采用添 加甘油批料階段（glycerol-fed batch phase)以獲得高細胞密度。當溶解氧濃度上升到 40%以上時開始添加甘油批料階段。每當溶解氧上升至40%以上時即添加甘油，直至該水 平降至40%以下。停止添加甘油后溶解氧再次升高時，添加物換為甲醇。溶解氧（DO)水平 升高或達到尖峰說明已耗盡碳源。通常DO尖峰用于顯示生長所用的甘油已耗盡，說明應該 轉為甲醇誘導階段。
[0068] 另外，生長階段可選pH值為約3. 0-4. 0,甲醇誘導階段pH值為約6. 7-7. 4。例如， 生長階段PH值為3. 5,甲醇誘導階段pH值為7. 0。
[0069] 可增加甲醇誘導時間以提高產量。通常的誘導時間包括22h、44h、67h和163h。誘 導可長達12天（288h)。因此，特別考慮的甲醇誘導持續約22h至約12天（288h)。例如， 應該理解，甲醇誘導可持續163h。
[0070] 因而本發明的一個實施方案為一種在巴斯德畢赤酵母中表達免疫毒素的方法，包 括：a)在包含蛋白的酶消化產物和酵母提取物的生長培養基中培養巴斯德畢赤酵母；b) 對巴斯德畢赤酵母進行甲醇誘導，其中所述甲醇誘導包括添加0. 5-0. 75ml/min/10L初始 體積的限量甲醇，其中誘導進行的溫度在17. 5°C以下，補充消泡劑至0.07%，攪拌減慢至 400RPM，且其中誘導步驟進行約22至288h之間。
[0071] 更具體地，本發明的一個實施方案包括一種在巴斯德畢赤酵母中表達免疫毒素的 方法，包括：a)在生長培養基中培養可表達免疫毒素的巴斯德畢赤酵母，所述生長培養基 包括約4%甘油，約2%酵母提取物，約2%大豆蛋白的酶消化產物，約1. 34%含有硫酸銨不 含氨基酸的酵母氮堿基，以及約〇. 43% PTMl溶液，其中生長期間pH值約為3. 5,且生長培 養基中溶解氧濃度保持在40%或更高的數值；b)對巴斯德畢赤酵母進行甲醇誘導，其中所 述甲醇誘導包括添加0.5-0.75ml/min/10L初始體積的限量甲醇，其中誘導進行的溫度為 15°C，pH值約7. 0,補充消泡劑0. 02%，攪拌減慢至400RPM，且誘導階段約163h。
[0072] 已經開發了可選擇性殺傷人T細胞的二價抗T細胞免疫毒素 A-dmDT390-bisFv(G 4S)，用以治療T細胞白血病、自體免疫病和移植耐受誘導（美國專利 申請09/573, 797,通過引用納入本文）。二價抗T細胞免疫毒素A-dmDT390-bisFv (G4S)， 由白喉毒素（DT)的前390個氨基酸殘基（DT390)和來自抗CD3抗體UCHTl的兩個成串 的抗原結合結構域（sFv)構成。通過引入兩個突變已將DT390免疫毒素中的兩個N糖基 化位點除去（Liu et al.，2000)，導致生成分子量96.5kDa的非糖蛋白。免疫毒素還可 包括接頭分子，用以連接抗體部分與毒素部分。接頭（U可為Gly-Ser接頭。Gly-Ser 接頭可以是但不限于（Gly4Ser)n或（Gly3Ser)n。更具體地說，接頭可為（Gly4Ser)3 接頭（GGGGSGGGGSGGGGS) (SEQ ID NO: 17)，本文也稱為（G4S)，或者（Gly3Ser)4 接頭 (6665666566656665)(5￡〇10勵:18)，本文也稱為（635)。在一個優選的實施方案中，免疫 毒素包括 A-dmDT390-bisFv (G4S)。
[0073] 免疫毒素對6.0以下的pH水平敏感，這與低pH可誘導DT390部分的易位結構 域（translocation domain)的不可逆構象改變相一致。易位結構域介導DT390的A鏈以 質子依賴方式從內體或質膜到胞質溶膠的易位。催化型A鏈在胞質溶膠中通過延長因子 2 (EF-2)的ADP核糖基化負責蛋白合成抑制。這種蛋白合成抑制作用對許多真核細胞具有 毒性。由于陽離子交換色譜法和親和色譜法需用低PH緩沖液洗脫，所以免疫毒素的pH敏 感性限制了這兩種技術的使用。
[0074] 使用毒素抗性真核細胞可克服免疫毒素的毒性問題。然而，篩選和鑒定毒素抗性 真核細胞是一項煩瑣、費力、費時的工作。而且，在EF-2突變體CHO細胞表達系統中生產二 價免疫毒素被限制在5mg/L，無法通過選擇多基因插入提高其產量。由于這種限制，除三個 例外（12, 20, 25)，所有治療用途的重組免疫毒素的生產均限于使用大腸桿菌（E. coli)制 備，迫使包含體（6)變性再重新折疊。然而，來自大腸桿菌的二價免疫毒素的多結構域結構 的重新折疊不能有效完成，無法恢復其全部生物活性（25)。還有，二價免疫毒素的多結構域 結構妨礙大腸桿菌的高效生產。因此，現有生產系統的缺點驅使我們試圖開發有效的二價 免疫毒素的巴斯德畢赤酵母生產系統。
[0075] 對于二價抗T細胞免疫毒素A-dmDT390-bisFv來說，巴斯德畢赤酵母是良好的表 達系統，這是因為，與原核表達系統相比，它可提供最佳的蛋白折疊，而與哺乳動物細胞表 達相比（CH0細胞），它可提供更高的產量。抗體融合蛋白需要正確的二硫鍵，酵母的內質 網提供了與真核的抗體制造細胞相似的氧化環境。二價免疫毒素的多結構域結構需要真 核表達系統來正確地折疊這種復雜的蛋白。而免疫毒素一旦表達，多數真核生物對其蛋白 合成抑制作用敏感。然而，一種芽殖酵母--巴斯德畢赤酵母對DT具有一定程度的耐受性 (Neville et al.，1992 ;Woo et al.，2002)，在發酵罐培養中免疫毒素的產量可達40mg/L。 通過遺傳工程改造的巴斯德畢赤酵母（JW102,從pJHW#2重新命名（Woo et al.，2002))的 發酵，由分泌途徑制備免疫毒素。如實施例41所示，本方法在163h的誘導階段之后可提供 120mg/l的產量，純化后的產量為90. 8mg/L (見表6)。
[0076] 在經過基因優化，減少DNA序列中的AT含量之后，在生物反應器內經過24 - 44小時的誘導，受AOXl啟動子控制的分泌表達水平可達25 - 30mg/L。巴斯德畢赤酵母 對在胞質溶膠中表達的白喉毒素A鏈的毒性作用敏感，該鏈使延長因子2 (EF-2) ADP核糖 基化導致蛋白合成停止。通過分泌途徑表達的A-dmDT390-bisFv的毒性可通過誘導后甲 醇消耗水平的不斷降低來說明。給細胞提供甘油和甲醇的混合添加物。在胞質溶膠中表 達DT的催化結構域（A鏈）對巴斯德畢赤酵母來說是致命的。當使用甲醇誘導帶有構建 體A-dmDT390-bisFv(UCHTl)的細胞以表達免疫毒素時，24小時后近50%被殺死（Woo et al.，2002)。與之相比，當在具有DT抗性突變的CHO細胞中表達相同的免疫毒素時，沒有觀 察到毒性作用（Liu, et al.，2000 !Thompson, et al.，2001)。在真核細胞的胞質溶膠中，DT 的催化結構域催化延長因子2(EF-2)的ADP核糖基化，導致蛋白合成抑制和細胞死亡（by protein starvation and or apoptosis, Van Ness et al.，1980 ;Houchins, 2000) 〇 真核 EF-2對這些毒素所致的ADP核糖基化的敏感性在于該蛋白的結構。EF-2是約850個氨基酸 的單條多肽鏈，由兩個結構域組成。N末端G結構域負責結合和水解可促進翻譯的GTP，C末 端R(或白喉酰胺）結構域被認為與核糖體相互作用（Kohno et al.，1986;Perentesis et al.，1992)。白喉酰胺結構域（圖la)在22殘基的區域中包括一個在所有真核生物EF-2中 高度保守的組氨酸殘基。該保守性組氨酸經過特別的翻譯后修飾變為衍生物白喉酰胺，白 喉酰胺為DT所致ADP核糖基化時的獨特靶標（Van Ness et al.，1880)。在釀酒酵母中，可 使該保守性組氨酸發生突變并使用某些其他2個氨基酸替換，可產生對ADP核糖基化具有 抗性的功能性 EF-2(Phan et al.，1993;Kimata and Kohnol994)。然而，其 EF-2 在白喉酰 胺位置發生突變的細胞比表達野生型EF-2的細胞生長緩慢。在CHO細胞中，位于白喉酰胺 C末端一側第3位置的另一個高度保守的甘氨酸若被精氨酸單一替換，也可阻止白喉酰胺 的形成（Kohno&Uchida, 1987 ;Foley et al.，1992)，生成不可 ADP 核糖基化的 EF-2。該突 變對釀酒酵母EF-2具有相同的效果（Kimata et al.，1993)。與白喉酰胺的突變相比，EF-2 中Gly到Arg的突變不會影響CHO和釀酒酵母的細胞生長（Foley et al.，1992 ;Kimata and Kohno 1994 ；Kimata et al. , 1993)〇
[0077] 為了確定可否通過使巴斯德畢赤酵母對毒素不敏感來實現進一步提高 A-dmDT390-bisFv的表達水平，使巴斯德畢赤酵母的EF-2基因產生突變，701位的Gly變 為Arg，該突變在其他生物體內已經顯示可阻止EF-2的ADP核糖基化。EF-2誘變需要克 隆該基因，將帶有選擇標記URA3的體外突變序列引入基因組中，以及對突變的克隆進行 PCR鑒定。巴斯德畢赤酵母的整個EF-2基因已被克隆和測序。巴斯德畢赤酵母EF-2的編 碼序列為2526個核苷酸，編碼842個氨基酸。巴斯德畢赤酵母EF-2與釀酒酵母和裂變酵 母（S. pombe)的EF-2長度相同，并分別與兩者在氨基酸序列上具有88 %和78%的相同性 (identity)。與這兩種酵母相比，巴斯德畢赤酵母只有一個含較短內含子的EF-2基因拷 貝。在弄清EF-2的完整序列之前，曾使用各種方法使巴斯德畢赤酵母發生突變，以獲得DT 抗性株。由于缺少有效的篩選方法，所有這些努力都以失敗而告終。基于獲得的EF-2序 列，構建了靶向巴斯德畢赤酵母EF-2基因的pBLURA- A 5 'mutEF-2，通過同源重組在該基因 中引入Gly 701到Arg的突變。該構建體包括EF-2的3'端1028個核苷酸和營養缺陷標 記URA3,其中EF-2已經體外誘變含有上述的氨基酸替換。還開發了 PCR檢測方法，以便在 尿嘧啶篩選之后快速準確地分辨突變克隆。使用構建體pBLURA- A 5' mutEF-2進行的定向 克隆手段使得在巴斯德畢赤酵母EF-2基因的突變體中，約40%的尿嘧啶陽性克隆被發現 含有引入的突變。使用不同的營養缺陷標記培育EF-2突變體，（特別是mutEF2JC308 (ade 1 arg4his4)，mutEF2JC303 (arg4his4)和 mutEF2JC307 (his4))，證實了 EF-2 中 Gly701 至 Arg 的突變使之對胞質溶膠中表達的DT A鏈產生抗性。
[0078] 當EF-2突變體在AOXl啟動子的調控之下用于表達A-dmDT390-bisFv時，與未 突變的表達株JW102相比，在搖瓶中制備該蛋白時并未顯示出優勢。然而，若在JW102 的最適條件下進行大規模發酵培養，突變株YYL#8-2[MUT2JC307-8(2)]的產量在96小 時內持續提高，達到高于未突變JW102株1. 46倍的水平。至于細胞生長和甲醇消耗 速度，表達A-dmDT390-bisFv的突變株和不表達的野生株是相等的。因此，似乎表達 A-dmDT390-bisFv對突變株沒有毒性。EF-2突變體允許在組成型GAP啟動子（P mp)的調控 下表達A-dmDT390-bisFv。在搖瓶培養中，由控表達A-dmDT390-bisFv的產量比由 P mxi調控表達要高出約30%。若采用發酵培養，由Pmp調控表達的產量可更為顯著地提高， 這是由于發酵可使細胞生長至極高的密度。
[0079] 在巴斯德畢赤酵母表達系統中，使用簡單的合成培養基（defined medium)已成功 表達和/或分泌了多種異源蛋白，如疫苗用肉毒菌神經毒素片段（Potter et al.，2000)、 乙型肝炎病毒表面抗原（Hardy et al.，2000)、明膠（Werten et al.，1999)、膠原 (Nokelainen et al.，2001)和胰島素（Wang et al.，2001)。胞質溶膠中表達DT的催化結 構域導致蛋白合成抑制，使合成培養基中所有細胞死亡，但在天然培養基中不會如此（Liu et al.，2003)。該發現表明，天然培養基在減弱由EF-2的ADP核糖基化導致的蛋白合成抑 制方面起著重要作用。使用搖瓶培養時，在合成培養基中觀察到極少量二價免疫毒素生成， 但在天然培養基中沒有。已經開發了基于合成培養基的巴斯德畢赤酵母發酵方法，用以表 達異源蛋白，但使用天然培養基以分泌形式表達二價免疫毒素會提高產量。
[0080] 在當前利用巴斯德畢赤酵母大規模制備二價免疫毒素過程中，將誘導溫度降至 15°C會顯著提高生物活性免疫毒素的分泌量，因而可補償巴斯德畢赤酵母分泌能力的限 制。另外，使用含酵母提取物的天然培養基明顯減弱了免疫毒素對巴斯德畢赤酵母宿主的 毒性作用，進一步提高了免疫毒素的分泌量。
[0081] 通過按如下方式優化巴斯德畢赤酵母的發酵條件，生物反應器培養時的二價免疫 毒素表達水平可比搖瓶培養提高4倍：（1)使用基于大豆蛋白胨（Soytone Peptone)和酵母 提取物的天然培養基，（2)甲醇誘導過程中，使用甲醇/甘油混合添加物（4:1)補充能源， (3)誘導過程中繼續添加PMSF和酵母提取物，（4)甲醇誘導過程中將溫度降至15°C。甲醇 誘導過程中降低溫度可導致分泌量相比23°C時提高2倍。
[0082] 如上所述，生產二價免疫毒素的主要問題是在甲醇誘導階段甲醇利用量減少。甲 醇利用量減少是由限速酶醇氧化酶（AOXl)的活性降低所致。這相對于從分泌區泄漏或者 從輕度酸性分泌區通過質子依賴的易位，而到達胞質溶膠區的二價免疫毒素所導致的蛋白 合成抑制來說，還是次要的（Arata et al.，2002)。在EF-2基因中具有毒素抗性突變的巴 斯德畢赤酵母菌株中，甲醇利用量不受產生免疫毒素的影響（Liu et al.，2003)，這一事實 說明在菌株JW102中，毒素誘導的ADP核糖基化是AOXl活性降低的原因。然而，AOXl水平 是由合成和降解兩方面的平衡來控制的，降解機制可因毒素介導的ADP核糖基化而加強。 出于未知原因，酵母提取物可提高甲醇利用量，但對野生型水平不起作用。另外，低甲醇利 用量會負面影響巴斯德畢赤酵母細胞的生長。這在本方法中，通過在甲醇誘導過程中加入 另一種碳源--甘油，以及持續添加酵母提取物來解決。這兩項措施將甲醇利用量提高到 非表達菌株的80%。
[0083] 為了進一步補償由表達的免疫毒素所致的巴斯德畢赤酵母蛋白合成抑制，采 用使甲醇代謝限速酶-醇氧化酶I (AOXl)具有最大活性的發酵條件（Veenhuis et al.，1983)。既然免疫毒素基因和AOXl基因處于同一強啟動子的調控之下，免疫毒素應該 被高水平表達。然而，先前曾觀察到，在異源蛋白的分泌中，各種蛋白似乎分別具有最佳分 泌水平。在哺乳動物、昆蟲和酵母細胞中，分泌型異源蛋白的超過最佳水平的表達（過表 達）可導致分泌型蛋白產量減少（Bannister and Wittrup, 2000 ;Liebman et al.，1999; Liu et al.，2003 ;Pendse et al.，1992)。為了確定二價免疫毒素在巴斯德畢赤酵母中是 否過表達，在甲醇誘導過程中降低誘導溫度。由于在低溫下包括蛋白合成在內的大部分細 胞活性均降低，所以降低誘導溫度應該降低二價免疫毒素的合成速率。對所導致的任何分 泌變化均作出判斷。在較低的誘導溫度下，二價免疫毒素的表達水平提高，在17. 5°C時達到 最大值，生物活性的免疫毒素的分泌在15°C時達到最大值,盡管存在甲醇消耗率在15°C時 下降至23°C時的75%這一事實。因為在誘導過程中持續添加PMSF和酵母提取物可有效抑 制上清液中的蛋白酶活性，所以似乎不能用較低誘導溫度下蛋白酶活性降低來解釋15°C下 二價免疫毒素的分泌水平增加了近2倍。前述的巴斯德畢赤酵母分泌二價免疫毒素的限制 可能實際上反映了在23°C時過表達，在15°C時表達減少，從而實現分泌區內輸入和輸出的 較好平衡。
[0084] 簡單地說，使用巴斯德畢赤酵母（JW102)，在發酵罐中以甲醇作為碳源，在AOXl啟 動子的調控下以分泌途徑制備免疫毒素。高效制備免疫毒素主要有兩大障礙，免疫毒素對 巴斯德畢赤酵母的毒性和巴斯德畢赤酵母分泌免疫毒素的能力限制。對巴斯德畢赤酵母的 毒性導致在合成培養基中進行甲醇誘導的過程中，出現甲醇消耗代謝率下降、細胞生長速 率減緩以及產量極低等。這些問題通過以下手段克服：（1)使用基于大豆蛋白的酶消化產 物（如大豆蛋白胨）和酵母提取物的天然培養基，（2)在甲醇誘導過程中使用甲醇/甘油 混合添加物（4:1)補充能源，（3)甲醇誘導過程中持續添加PMSF和酵母提取物。將誘導溫 度降至15°C，與誘導溫度23°C時的分泌相比，分泌的免疫毒素產量提高幾乎2倍，達40mg/ L (誘導67小時），盡管此時甲醇消耗量下降。另外，使用本方法，以無生物活性的寡聚體形 式存在的免疫毒素部分減少。
[0085] 本發明還提供了一種純化非糖基化免疫毒素的方法，包括：a)將含有非糖基化免 疫毒素的溶液裝入疏水作用柱中；b)從疏水作用柱中獲得含洗脫劑的第一非糖基化免疫 毒素；c)將步驟（b)中獲得的含洗脫劑的非糖基化免疫毒素裝入陰離子交換柱中；d)通過 使用硼酸鈉溶液洗脫非糖基化免疫毒素，從陰離子交換柱中獲得含洗脫劑的第二非糖基化 免疫毒素；e)稀釋步驟（d)中獲得的含洗脫劑的第二非糖基化免疫毒素，使其中的硼酸鈉 濃度達到約50mM或更低；f)在陰離子交換柱上濃縮在步驟（e)中獲得的含洗脫劑的稀釋 的非糖基化免疫毒素；g)從陰離子交換柱獲得純化的非糖基化免疫毒素。可選地，本方法 進一步包括在使用硼酸鈉溶液洗脫之前，先使用約25mM硼酸鈉溶液洗滌陰離子交換柱。被 純化的非糖基化免疫毒素優選通過本文教導的方法表達。
[0086] 純化方法的步驟（d)中，硼酸鈉溶液濃度在約25mM至約200mM之間，優選在約 75mM至約IOOmM之間。例如，步驟（e)中硼酸鈉濃度為約20mM。
[0087] 從巴斯德畢赤酵母上清液中大規模純化二價抗T細胞免疫毒素 A-dmDT390-bisFv(G4S)時所遇到的主要問題，是存在具有相似電荷、大小和疏水特性的宿 主糖蛋白。這個問題通過采用硼酸鹽陰離子色譜來解決。硼酸鹽陰離子對碳水化合物具有 親和性，可使這些結構帶有負電荷。硼酸鈉濃度在50至IOOmM之間時，非糖基化免疫毒素不 與Poros 50HQ陰離子交換樹脂結合，但是糖蛋白，包括與免疫毒素相關的聚集體卻可以結 合。通過利用硼酸鈉存在時的免疫毒素的這種特性，開發了 3步純化過程=(I)Butyl 650M 疏水作用色譜，（2)硼酸鹽存在下的Poros 50HQ陰離子交換色譜，（3) Q陰離子交換色譜。該 方法具有以下幾個優點：（1)相對簡單，無滲析或滲濾步驟；（2)重復性好；（3)最終產率超 過50%;(4)最終純度超過98%。以前，硼酸樹脂一直用于從蛋白質中分離糖蛋白。然而， 將硼酸鹽陰離子與常規陰離子交換樹脂結合可實現從糖蛋白中分離免疫毒素，沒有必要根 據優質生產規范準則評估非標準樹脂。因此，將硼酸鹽陰離子交換色譜用于從巴斯德畢赤 酵母糖蛋白中分離免疫毒素。
[0088] 免疫毒素只有單體形式具有功能活性。然而，從發酵過程中收獲的上清液包含免 疫毒素的單體、二聚體和更高的寡聚體形式，以及巴斯德畢赤酵母蛋白。在這些巴斯德畢赤 酵母蛋白之中，一種約45kDa的糖蛋白以二聚體形式（?90kDa)存在。二聚體和更高的寡 聚體形式的免疫毒素可相對容易地使用常規疏水作用色譜和陰離子交換色譜分離。然而， 分離純單體免疫毒素非常困難，因為45kDa的糖蛋白與單體免疫毒素的大小、疏水性和等 電點非常相似。
[0089] 以前，一直使用固定的苯硼酸樹脂從蛋白質中分離糖蛋白（Myohanen et al.，1981 ;Bouritis et al.，1981 ;Williams et al.，1981 ;Zanette et al.，2003)。根據 pH值、糖的存在與否、糖的類型、糖的濃度和緩沖液類型，這些固定樹脂可結合并選擇性阻 礙糖蛋白。將免疫毒素與45kDa的糖蛋白分離時使用硼酸鹽陰離子交換色譜，而不使用固 定苯硼酸親和色譜，因為苯硼酸樹脂的分離能力太差。硼酸鹽與具有鄰近順式羥基的糖殘 基形成復合物（Boeseken, 1949)，并且這些復合物可逆（Weigel, 1963)。硼酸鹽與糖蛋白上 的碳水化合物形成可逆復合物，導致糖蛋白的負電荷增加。該性質使得非糖蛋白和糖蛋白 的分離可以在陰離子交換色譜上進行（Nomoto et al.，1982 ;Nomoto and Inoue, 1983)。
[0090] 在分離免疫毒素與糖蛋白的過程中，硼酸鹽陰離子交換色譜和苯硼酸親和色譜具 有不同的結合特性。在苯硼酸親和色譜中，糖蛋白以及免疫毒素在低離子強度條件下結合， 它們可使用0 - IOOmM硼酸鈉梯度或0 - 50mM山梨糖醇梯度共洗脫，說明免疫毒素通過另 一種機制與至少一種結合的糖蛋白發生物理相互作用，或者與苯硼酸柱發生相互作用。純 化的二價免疫毒素也可與苯硼酸柱結合，這一事實說明結合通過另一種機制進行。
[0091] 在以前的使用搖瓶培養的純化方法中，采用包括DEAE陰離子交換色譜和蛋白L親 和色譜的2步操作過程來純化免疫毒素（Woo et al.，2002)。然而，在巴斯德畢赤酵母的 高密度發酵罐培養上清液中，含有嚴重影響陰離子交換樹脂能力的物質。另外，蛋白L親和 步驟需要超大型柱，費用較高，且沒有優質生產規范（GMP)認證。因而，需要開發其他方法。 利用Butyl 650M的疏水作用色譜可順利進行捕捉步驟，但同樣，濃縮的巴斯德畢赤酵母糖 蛋白與免疫毒素具有相似的電荷、大小和疏水性。刀豆素A(concanavalin A)親和樹脂有 望可除去糖蛋白，但具有潛在毒性的刀豆素A從樹脂上流下，造成對最終產品的不可接受 的污染。
[0092] 陰離子交換柱可以是但不限于陰離子丙烯酸、陰離子瓊脂糖、陰離子纖維素、陰離 子葡聚糖或陰離子聚苯乙烯。陰離子交換柱優選Poros HQ 50和Q陰離子交換柱。在本發 明中，通過使用Poros 50HQ硼酸鹽交換色譜，可實現免疫毒素單體形式的基本純化，盡管 洗脫部分的免疫毒素被稀釋。因此，隨后通過Q陰離子交換色譜進行濃縮步驟。
[0093] 疏水作用柱可以是但不限于Phenyl- SEPHAROSE? CL-4B, Octyl Agarose,Phenyl-Sepharose 6Fast Flow, Phenyl-Agarose, Phenyl-Sepharose 6Fast Flow,Octyl-Sepharose 4Fast Flow, Butyl Sepharose? 4Fast Flow, Octyl Agarose, Ph enyl-Agarose, Hydrophobic chromatography media-monoamino MAA-8, Hexyl-Agarose, D odecyl-Agarose, Hexyl-Agarose, 4-Phenylbutylamine-Agarose,Ethyl-Agarose,Matrix ,Butyl-Agarose, Propyl Agarose, Affinity chromatography media AAF-8, Octyl Agaro se,Butyl-Agarose, Decyl-Agarosej Phenyl-Agarose, Methyl Matrix:Ceramic HyperD F Hydrogel Composite, Octyl Agarose, Trityl-Agarosej Q Sepharose, Ether 650,Phenyl 650, Butyl 650或Hexyl 650。疏水作用柱優選Butyl650M疏水作用柱。
[0094] 這里的硼酸鹽陰離子交換色譜可用于純化巴斯德畢赤酵母表達的其他蛋白。巴斯 德畢赤酵母正越來越多地用作治療用重組蛋白的表達系統（Cereghino et al.，2002)。由 于巴斯德畢赤酵母和人類的糖基化作用模式具有顯著差異，許多這些重組蛋白已經去掉了 其糖基化作用位點。然后這些重組蛋白可使用硼酸鹽陰離子交換色譜來純化。
[0095] 可考慮使用任何緩沖液、流速和柱大小，只要與裝在柱上的免疫毒素相比，其可以 成功影響免疫毒素的洗脫，使之處于更加純凈的狀態。
[0096] 本發明中使用的免疫毒素包括與抗體部分（靶向部分）相連的突變型毒素部分 (如DT毒素）。可使用的毒素包括但不限于白喉毒素、蓖麻毒素、假單胞菌外毒素。抗體部 分優選單鏈（sc)可變區。
[0097] 除非另有說明，本發明實施時將采用分子生物學、微生物學、重組DNA、蛋 白質化學和免疫學領域內的常規技術。這些技術在參考文獻中給出詳細解釋，包括 Sambrook，et al.，MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL第二版（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989) ;DNA CLONING,第 I 和 II 卷，D. N Glover 編著 (IRL Press, 1985) !OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS, M.J. Gait 編著（IRL Press, 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION, B. D. Hames 和 S. J. Higgins 編著（IRL Press,1984); TRANSCRIPTION AND TRANSLATION, B.D. Hames 和 S.J. Higgins 編著，（IRL Press, 1984); ANIMAL CELL CULTURE, R. I. Freshney 編著（IRL Press, 1986) ;IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES，K.Mosbach(IRL Press，1986) ;B.Perbal，A PRACTICAL ⑶IDE TO MOLECULAR CLONING, Wiley(1984);系列 METHODS IN ENZYM0L0GY，Academic Press,Inc. ;GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS, J.H. Miller 和 M.P. Calos 編著（Cold Spring Harbor Laboratory,1987) !METHODS IN ENZYM0L0GY，第 154 和 155 卷，分 別由 Wu 和 Grossman 編著，以及 Wu 編著，（Academic Press, 1987)，IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY, R. J. Mayer 和 J. H. Walker 編著（Academic Press London, Harcourt Brace U.S.，1987)，PROTEIN PURIFICATION:PRINCIPLES AND PRACTICE,第 2 版（Springer-Verlag，N.Y. (1987)，和 HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY,第 I-IV卷，D.M. Weir et al.，（Blackwell Scientific Publications, 1986); Kitts et al. , Biotechniques 14:810-817 (1993) ；Munemitsu et al.，Mol. and Cell. Biol.10:5977-5982(1990)。
[0098] 本發明利用了編碼含白喉毒素的融合蛋白的核酸，其中該核酸可由酵母細胞表 達。可由酵母表達的核酸包括修飾的天然白喉編碼序列。為了促進本發明的核酸由酵母細 胞的表達，對富含A和T核苷酸的核酸區進行修飾，以使其編碼的免疫毒素融合蛋白可由酵 母表達。例如，這種修飾使之可由巴斯德畢赤酵母表達。這種修飾設計為可抑制聚腺苷酸 化信號和/或減少RNA轉錄的提前終止。更具體地說，對天然白喉編碼序列的一個或多個 富含AT區進行修飾，減少AT含量。富含AT區包括AT含量至少60%的至少150個連續核 苷酸的區域，或者AT含量至少65%的至少90個連續核苷酸的區域，富含AT區的AT含量優 選降至55 %或更低。富含AT區還包括AT含量至少63 %的至少150個連續核苷酸的區域， 或者AT含量至少68%的至少90個連續核苷酸的區域，富含AT區的AT含量降至55 %或更 低。優選將天然白喉編碼序列進一步修飾以編碼C末端截短的白喉毒素。而且，優選將天 然白喉編碼序列進一步修飾，以在天然白喉毒素氨基末端甘氨酸殘基之前編碼一個或多個 氨基酸。而且，優選將天然白喉編碼序列進一步修飾，以編碼a-交配因子信號肽或其一部 分。
[0099] 本發明的免疫毒素可在多種生物體內表達和純化。這些生物體包括酵母如巴斯 德畢赤酵母或釀酒酵母，細菌如大腸桿菌，哺乳動物細胞如中國倉鼠卵巢細胞或桿狀病毒 感染的昆蟲細胞。使用酵母表達系統（包括，例如釀酒酵母和巴斯德畢赤酵母）有以下幾 個優點。首先，有證據表明，由酵母分泌系統產生的蛋白顯示正確的二硫配對（disulfide pairing)。其次，使用酵母表達系統，可進行高效的大規模生產。釀酒酵母前-原-a交 配因子前導區可用于指導酵母的蛋白分泌（Brake，et al. (82))。前-原-a交配因子的 前導區包括信號肽和原-片段，其中原-片段又包括由KEX2基因編碼的酵母蛋白酶的識 別序列：該酶在Lys-Arg二肽切割信號序列的羧基一側將前體蛋白切除。核酸編碼序列與 前-原_a交配因子前導區發生框內（in-frame)融合。該構建體可放置于強轉錄啟動子的 調控之下，如醇脫氫酶I啟動子、醇氧化酶I啟動子、糖分解啟動子（glycolytic promoter) 或者半乳糖利用途徑啟動子。核酸編碼序列隨后是翻譯終止密碼子，再后是轉錄終止信號。 或者，核酸編碼序列可與另一條蛋白編碼序列（如Sj26或P -半乳糖苷酶）融合，以有利 于融合蛋白通過親和色譜法純化。可在用于酵母表達的構建體內插入蛋白酶切割位點，以 便將該融合蛋白的各部分分開。
[0100] 當白喉毒素A鏈在胞質溶膠區合成而沒有分泌信號時，該毒素對酵母是有毒性的 (Parentesis et al.，1988)。該毒素催化活性對EF-2具有特異性，發生于第699位的獨特 的翻譯后組氨酸殘基，該殘基在所有真核生物EF-2的保守性氨基酸序列中均有發現。酵母 EF-2中的第701位甘氨酸變為精氨酸殘基，可導致對DT產生抗性。
[0101] 在另一個純化方法中，（Ala) dmDT390-bisFv (UCHTl)在畢赤酵母（Pichia)培養基 中生產，產量在5mg/ml水平，不論是否存在突變型EF-2基因。在以下兩方面之間存在極緊 耦合：一方面是a _交配因子信號序列的存在，另一方面是（Ala)dmDT390-bisFv(UCHTl)區 室化，進入分泌途徑而遠離胞質溶膠區中的EF-2毒素底物，因為胞質溶膠中的一個毒素分 子在24小時內就可以使99%的EF-2失活。利用a-交配因子信號序列在畢赤酵母中生產 (Ala) dmDT390-bisFv (UCHTl)，而非使畢赤酵母產生毒素抗性的突變，已經提供了成功的結 果。另外，酵母產生的毒素（蓖麻毒素A鏈）和信號序列Kar2的結合可導致生產細胞的死亡 (Simpson et al.，1999(80))。在畢赤酵母中的免疫毒素融合蛋白的基因劑量較高的情況 下，mEF-2有可能對生產具有益處。對生產免疫毒素融合蛋白來說，酵母相對于哺乳動物細 胞的另一個優勢為，未經任何處理的酵母即對存在于外部培養基中的水平高達3. 3X KT6M 的白喉毒素具有極高的抗性。顯然，酵母莢膜阻止了毒素被逆行運輸回胞質溶膠區，而在哺 乳動物細胞和酵母原生質球中會發生此類現象（Chen et al.，1985)。
[0102] 本發明可利用包含編碼免疫毒素融合蛋白的核酸的細胞。該細胞可為原核細胞， 包括，例如細菌細胞。更具體地說，細菌細胞可為大腸桿菌細胞。或者，該細胞可為真核細 胞，包括，例如中國倉鼠卵巢（CHO)細胞（包括，例如，如Moehring和Moehring所選擇的 DT抗性CHO-KlRE 1.22c細胞系）、骨髓瘤細胞、畢赤酵母細胞或昆蟲細胞。可將免疫毒素 融合蛋白編碼序列引入中國倉鼠卵巢（CHO)細胞系，例如通過氨甲喋呤抗性編碼載體，或 者使用適當的選擇標記引入其他細胞系。可通過DNA印跡分析來確定轉化細胞中是否存在 載體DNA。可通過RNA印跡分析來確定是否有相應于插入編碼序列的RNA產生。已經開發 了許多其他適合的宿主細胞系，包括骨髓瘤細胞系、成纖維細胞系，以及多種腫瘤細胞系如 黑色素瘤細胞系。這些細胞的表達載體可包括表達控制序列，如復制起點、啟動子、增強子， 以及必需的信息處理位點，如核糖體結合位點、RNA剪接位點、聚腺苷酸化位點和轉錄終止 子序列。表達控制序列優選來自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒等的啟動 子。含有所研究的核酸片段的載體可通過公知的方法轉入宿主細胞中，且這些方法可根據 細胞宿主類型而變化。例如，氯化鈣轉化通常用于原核細胞，而磷酸鈣、DEAE葡聚糖或脂質 體（Iipofectin)介導的轉染或者電穿孔可用于其他細胞宿主。
[0103] 用于本發明的核酸可與一個或多個可指導和調控插入核酸的轉錄的功能元件有 效連接，并且該核酸可被表達。例如，核酸可與細菌或噬菌體啟動子有效連接，用于指導核 酸的體外轉錄。
[0104] 提供了巴斯德畢赤酵母的突變株。該突變株包括在至少一個編碼延長因子2 (EF2) 的基因中發生突變。該突變包括在修飾的組氨酸殘基白喉酰胺的羧基一側的兩個殘基位置 發生Gly到Arg的替換。籍此，可使該突變株產生對于白喉毒素ADP核糖基化毒性作用的 抗性。
[0105] 提供了一種表達白喉毒素蛋白部分的方法。本發明的此方法包括，在可使細胞中 蛋白編碼核酸表達的條件下，使用包括毒素蛋白編碼核酸的載體轉染本發明的突變巴斯德 畢赤酵母細胞。所述條件為用于巴斯德畢赤酵母細胞的條件，且可根據該特定系統優化。
[0106] 抗體部分優選經由抗⑶3途徑或其他T細胞表位途徑。免疫毒素可為單價，但目 前來講優選二價抗體部分，因為已經發現二價抗體可增強細胞殺傷能力約15倍。可考慮將 任何數量的化學耦合或重組DNA方法用于生成本發明的免疫毒素。因此，提到融合毒素或 耦合毒素，未必是限制性的。免疫毒素可為重組法制備的融合蛋白。可在重組產生的二價 抗體（靶向部分）和重組產生的突變型毒素部分的特殊位點，通過化學硫醚鍵連接制備免 疫毒素。免疫毒素的祀向部分可包括人U CH2、ii CH3和ii CH4區，以及來自鼠Ig抗體的VL 和VH區。這些區可來自抗體UCHT1，以使該抗體部分為scUCHTl，它是具有人ii CH2、ii CH3 和UCH4區和如圖所示的小鼠可變區的單鏈CD3抗體。可考慮多種DT突變型毒素部分，包 括例如DT390和DT389,帶有多個突變或者以野生型毒素部分的形式。
[0107] 毒素部分保留其毒性功能，以及全部膜易位至胞質溶膠的功能。位于該蛋白的受 體結合區域的結合功能的喪失，可通過減少與非靶細胞的結合來實現減小全身毒性。因此， 該免疫毒素可安全施用。通常由毒素結合功能提供的尋路（routing)功能由靶向抗體抗 CD3來提供。重要的尋路途徑有（1)定位于有被小窩進行胞吞作用，（2)從溶酶體尋路中逃 逸，（3)返回質膜。
[0108] 任何以此方式尋路的抗體均可與毒素部分一起發揮作用，而不論該抗體所針對的 表位，只要毒素沿該途徑可實現足夠的蛋白酶解加工。足夠的加工可通過細胞殺傷水平來 確定。
[0109] 作為核內體酸化的結果，受體構型受特定受體的誘導而變化，可導致抗體與 其受體的脫離，這時抗體進入溶酶體途徑。這可以通過以下方式避免或控制在最小水 平：將抗體導向質膜附近的相同受體上的外功能區表位（Ruud, et al. (1989) Scand. J. Immunol. 29:299 ；Herz et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:21355) 〇
[0110] 突變型DT毒素部分可為具有和沒有點突變或置換的截短型突變體，如DT390、 DT389或DT383,或其他的截短型突變體，以及具有點突變的全長毒素，如DTMl或CRM9 (在 潰瘍棒狀桿菌（C. ulcerans)中克隆），與DTMl和DT483的scUCHTl融合蛋白，DT390和 DT389,并且已經在大腸桿菌中克隆和表達。抗體部分可為具有本文所詳細敘述的尋路和其 他特性的scUCHTl或其他抗CD3或抗T細胞抗體。因此，用于本發明方法的免疫毒素的一 個實例包括融合蛋白免疫毒素UCHTl (或其片段）-DT390。
[0111] 有一條糖基化作用的共有序列（NXS/T(SEQ ID NO: 19))，可將其去除或插入以控 制糖基化作用。糖基化作用存在于所有真核生物中，如巴斯德畢赤酵母。
[0112] 有多種免疫毒素的變體。蛋白變體和衍生物為本領域技術人員所公知，可包括氨 基酸序列修飾。例如，氨基酸序列修飾通常可歸入三類中的一類或多類：置換、插入或缺失 變體。插入包括氨基和/或羧基末端融合，以及在序列內部插入單個或多個氨基酸殘基。 插入通常為比氨基或羧基末端融合小的插入，例如大約一至四個殘基。具免疫原性的融合 蛋白衍生物，例如實施例中所述的，是通過體外交聯或者使用編碼該融合蛋白的DNA轉化 的重組細胞培養，以使足夠大的可產生免疫原性的多肽與靶序列融合來制備。缺失的特征 是一個或多個氨基酸殘基從蛋白序列中去除。通常在蛋白分子內的任何位點，不超過大約 從2至6個殘基缺失。這些變體一般通過將編碼該蛋白的DNA中的核苷酸進行定點誘變制 備，由此產生編碼該變體的DNA，然后在重組細胞培養中表達。在具有已知序列的DNA中的 預定點造成置換突變的技術已為公知，例如M13引物誘變和PCR誘變。氨基酸置換通常為 單個殘基，但可以同時在多個不同位置發生；插入通常為大約1至10個氨基酸殘基；缺失 的范圍為大約1至30個殘基。缺失或插入優選在相鄰的一對中發生，即2殘基缺失或2殘 基插入。置換、缺失、插入或其任意形式的結合可一起實現最終的構建體。突變不可將序列 置于讀框之外，優選不產生可導致二級mRNA結構的互補區。置換變體是去掉至少一個殘基 并在該位置插入另一個殘基形成的變體。該置換一般按照下表進行，被稱為保守性置換。
[0113] 氨基酸縮寫
[0114]

【權利要求】
1. 一種純化非糖基化免疫毒素的方法，包括： a) 將含有所述非糖基化免疫毒素的溶液加入疏水作用柱中； b) 從所述疏水作用柱中獲得含洗脫劑的第一非糖基化免疫毒素； c) 將步驟（b)中獲得的所述含洗脫劑的非糖基化免疫毒素加于陰離子交換柱上； d) 通過使用硼酸鈉溶液洗脫所述非糖基化免疫毒素，從所述陰離子交換柱中獲得含洗 脫劑的第二非糖基化免疫毒素； e) 將步驟（d)中獲得的所述含洗脫劑的第二非糖基化免疫毒素中的硼酸鈉濃度稀釋 至約50mM或更低； f) 在陰離子交換柱上濃縮在步驟（e)中獲得的所述稀釋的含洗脫劑的非糖基化免疫 毒素； g) 從陰離子交換柱獲得純化的非糖基化免疫毒素。
2. 根據權利要求1的方法，其中所述非糖基化免疫毒素是在酵母中表達。
3. 根據權利要求2的方法，其中所述酵母為巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris)。
4. 根據權利要求1的方法，其中所述免疫毒素為融合蛋白。
5. 根據權利要求1的方法，其中所述免疫毒素包括白喉毒素部分。
6. 根據權利要求5的方法，其中所述白喉毒素部分為截短型。
7. 根據權利要求6的方法，其中所述免疫毒素進一步包括CD3抗體部分。
8. 根據權利要求7的方法，其中所述非糖基化免疫毒素包括A-dmDT390-bisFv (G4S)。
9. 根據權利要求1的方法，進一步包括在使用所述硼酸鈉溶液進行洗脫之前，使用約 25mM的硼酸鈉溶液洗滌所述陰離子交換柱。
10. 根據權利要求1的方法，其中步驟（d)中的所述硼酸鈉溶液的濃度在約50mM至約 200mM之間。
11. 根據權利要求10的方法，其中步驟（d)中的所述硼酸鈉溶液的濃度在約75mM至約 100mM之間。
12. 根據權利要求1的方法，其中步驟（e)中的硼酸鈉的濃度為約20mM。
【文檔編號】C07K16/28GK104356241SQ201410643698
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2004年8月2日 優先權日:2003年8月1日
【發明者】D·M·內維爾, J-H·禹, Y-Y·劉 申請人:美國政府（由衛生和人類服務部、國立衛生研究院的部長所代表）