抗麻疹與百白破四價卵黃抗體制劑的制備工藝的制作方法
【專利摘要】抗麻疹與百白破四價卵黃抗體制劑的制備工藝，包括如下步驟：免疫接種疫苗雞的選擇-免疫接種疫苗制備及劑量-免疫程序-卵黃分離方法與技巧-卵黃抗體水溶性組分液（WSF）制備-卵黃抗體分離提取-卵黃抗體提取物無菌處理-PEG溶液配制-透析袋處理。本發明從雞蛋中制備高純度和高效價的百白破的特異性卵黃抗體IgY,雞蛋作為正常的膳食成分其IgY是沒有毒副作用的，提純的IgY是現代理想的免疫增強劑和治療劑，制備方便，安全可靠，可用于人群麻疹與百白破的預防和治療，特別是兒童暴露下的緊急預防和治療。
【專利說明】抗麻疹與百白破四價卵黃抗體制劑的制備工藝
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫藥生物【技術領域】，特別是涉及一種抗麻疹與百白破四價卵黃抗體制劑的制備工藝。
【背景技術】
[0002]麻疹(measles)是由麻疹病毒引起一種嚴重危害兒童健康的急性呼吸道傳染病，傳染性極強，兒童是主要易感人群(尤多見于嬰兒)。麻疹病毒屬副粘病毒科，是麻疹的病原體，麻疹病毒主要通過噴嚏、咳嗽和說話等途徑由飛沫傳播。麻疹最常見并發癥為肺炎，是麻疹死亡主要原因，還有喉炎、腦炎、肝損害等，特別當兒童營養不良時，常常引起并發癥死亡，迄今為止麻疹仍是低齡兒童中疫苗可預防性傳染病導致死亡的首要原因之一。包括我國在內的世界衛生組織西太平洋區域每年大約有3萬名兒童死于麻疹。因此其危害在疫苗可預防疾病中仍占有重要地位。目前WHO已將麻疹定為繼天花、脊髓灰質炎之后的第三個將被消除或消滅的疾病。
[0003]百白破疫苗是百日咳、白喉、破傷風混合疫苗的簡稱，它是由百日咳疫苗、精制白喉和破傷風類毒素按適量比例配制而成，用于預防百日咳、白喉、破傷風三種疾病。百日咳(bronchocephalitis)是小兒常見的高傳染性急性呼吸道傳染病,感染對象多為5歲以下嬰幼兒，其致病菌是百日咳桿菌，主要通過空氣傳播，人類是百日咳桿菌的唯一宿主。其主要的臨床表現特征為陣發性痙攣性咳嗽，咳嗽末伴有特殊的吸氣吼聲，病程可達數周甚至3個月左右，故有百日咳之稱。據據報道，每年全球有200萬-4000萬例百日咳病例，且約35萬死亡病例，即使在一些免疫接種覆蓋率很高的發達國家，近年來百日咳發病率也呈明顯上升趨勢。白喉(diphtheritis)白喉是由白喉桿菌所引起的一種急性呼吸道疾病，由白喉棒狀桿菌產毒株感染引起，具有極強的傳染性，為乙類傳染病，多發生于秋冬或早春季節，15歲以下兒童發病率約占90%，其中I?5歲兒童發病率最高。其主要的臨床表現以發熱，氣憋，聲音撕啞，犬吠樣咳嗽，咽、扁桃體及其周圍組織出現白色偽膜為特征，嚴重者可并發心肌炎和神經麻痹，全身中毒癥狀明顯。自從實施白喉毒素的接種以來，白喉的發病率明顯下降，但大齡的患者構成比偏多，所以加強對大齡者的預防接種是防止白喉再次流行的重要手段。破傷風(lockjaw)是由梭狀芽胞桿菌感染引起的常和創傷相關的一種急性致命性疾病，典型癥狀是在肌緊張性收縮(肌強直、發硬)的基礎上，陣發性強烈痙攣，通常最先受影響的肌群是咀嚼肌，隨后順序為面部表情肌、頸、背、腹、四肢肌，最后為膈肌，破傷風桿菌及其毒素不能侵入正常的皮膚和黏膜，一切開放性損傷，均有可能發生破傷風，另外還可能發生于不潔條件下分娩的產婦和新生兒。新生兒破傷風由臍帶感染引起，病死率很高，雖然世界衛生組織積極推行了全球免疫計劃，據估計全世界每年仍有近百萬破傷風病例，數十萬新生兒死于破傷風。
[0004]IgY及理化性質:禽類的免疫系統包括細胞免疫和體液免疫系統，分別受胸腺和法氏囊的控制。當機體受到外來抗原刺激后，法氏囊內的B細胞分化成為漿細胞，分泌特異性抗體進入血液循環，當血液流經卵巢時，特異性抗體(主要是IgG)在卵細胞中逐漸蓄積，形成卵黃抗體(yolk antibody, IgY), IgY的理化性質與哺乳動物的IgG相似。正常雞IgY的分子量約為180KDa，由兩條輕鏈(2L)和兩條重鏈(2H)組成，分子量分別為60_70KDa和22-30KDa。其等電點約為5.2。 IgY與一般哺乳動物IgG相比，具有較強的耐熱、耐酸、抗離子強度和一定的抗酶降解能力。在低于75°C條件下，IgY具有良好的熱穩定性。IgY制劑在4°C貯存5年或在室溫貯存6個月其活性仍無明顯變化或下降，65°C時可保持24h以上，70°C時加熱90min后其活性才明顯下降，60°C,30min條件下巴氏消毒不影響IgY，高于80°C，大部分IgY失去活性。IgY對胃蛋白酶有較高的抵抗力，但對胰蛋白酶十分敏感。將胃蛋白酶和IgY在PH2.0溫育Ih后，幾乎所有活性喪失，但在pH4.0時Ih后可保持91%的活性，甚至溫育1h后仍有63%活性。IgY分別與胰蛋白酶和胰凝乳酶溫育8h，活性分別保持 39% 和 41%。
[0005]IgY的作用機理:特定病原菌的IgY能直接黏附于病原菌的細胞壁上，改變病原細胞的完整性，直接抑制病原菌的生長；IgY可黏附于細菌的菌毛上，使之不能黏附于腸道黏膜上皮細胞；一部分IgY在腸道消化酶作用下，降解為可結合片段，這些片段含有抗體的可變小肽(Fab)部分，這些小肽很容易被腸道吸收，進入血液后能與特定的病原菌黏附因子結合，使病原菌不能黏附易感細胞而失去致病性，而IgY的穩定區(Fe部分)留在腸內。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于提供一種抗麻疹與百白破四價卵黃抗體制劑的制備工藝，用于人群麻疹和百白破的預防和治療，特別是兒童暴露下的緊急預防和治療。
[0007]抗麻疹與百白破四價卵黃抗體制劑的制備工藝，包括如下步驟:
O免疫接種疫苗雞的選擇:選擇健康狀態良好，17-18周齡粵禽雞；
2)免疫接種疫苗制備及劑量:麻疹疫苗與百白破疫苗1:1比例混合，每只雞免疫接種人用麻疹疫苗每次量為0.75ml ；
3)免疫程序:免疫途徑為皮下注射，免疫次數為4次，免疫時間為第I次與第2次間隔為3天，第3次與第4次間隔為7天，免疫注射技巧為3點注射；
4)卵黃分離方法與技巧:用75%酒精浸泡雞蛋5-10分鐘，取出雞蛋用清水沖洗，干凈紗布將蛋殼擦干，用剪刀打開蛋殼一個小孔，讓蛋清緩慢流出，順流盡蛋清，打開蛋殼，小心將整個蛋黃移至滅菌濾紙上，來回流動，除盡蛋清，取蛋黃加入量杯，記錄卵黃量；
5)卵黃抗體水溶性組分液(WSF)制備:按卵黃量的8倍加入滅菌的雙蒸水，用0.1M HCl調卵黃稀釋液PH為5.0-5.1，放置在4°C環境下攪拌8小時取出，在4°C環境下將卵黃稀釋液放入離心機中以10000-12000轉/分鐘，離心15分鐘，收取得卵黃抗體水溶性組分液上清液；
6)卵黃抗體分離提取方法:將卵黃抗體水溶性組分液上清液加入8%PEG6000100ml,攪拌30分鐘，然后在4°C環境下放入離心機中以10000-12000轉/分鐘，離心15分鐘，收集沉淀，去上清液，沉淀裝入透析袋透析；
7)卵黃抗體提取物無菌處理:將直徑0.22Mffl過濾膜裝入濾器，高壓蒸汽滅菌后抗體提取物過濾，即為無菌抗體，將卵黃抗體置_20°C保存備用，保存期2年；
8)PEG 溶液配制:用 PBS (0.01mol/L PH7.4)配制；
9)透析袋處理:將透析袋放入300ml透析處理液(2%NaHC03、lmmol/LEDTA, PH 8.0)中煮沸10分鐘后，以蒸餾水徹底漂洗后再用300ml (PH 8.0)lmmol/LEDTA液中煮沸10分鐘，最后用滅菌的雙蒸水里外徹底沖洗。
[0008]所述步驟3)免疫注射技巧3點注射為，胸部一點，兩翼下各一點。
[0009]所述步驟4)打開蛋殼一個小孔后，從小孔內注入少量無菌NS洗凈蛋清。
[0010]采用上述技術方案的有益效果是:
本發明從雞蛋中制備高純度和高效價的百白破的特異性卵黃抗體IgY，雞蛋作為正常的膳食成分其IgY是沒有毒副作用的，提純的IgY是現代理想的免疫增強劑和治療劑，制備方便，安全可靠，可用于人群麻疹與百白破的預防和治療，特別是兒童暴露下的緊急預防和治療。
【具體實施方式】
[0011]一、免疫家禽:
1)免疫原制備:免疫原為人用麻疹與百白破疫苗，將麻疹與百白破疫苗無菌條件下
I:1比例進行混合；
2)免疫家禽:選擇17-18周齡粵禽雞四只，將免疫原注射到粵禽雞體內，每只免疫原注射量0.75ml，免疫途徑為皮下注射，免疫次數為4次，免疫時間為第I次與第2次間隔為3天，第3次與第4次間隔為7天，免疫注射技巧為3點注射；加強免疫時免疫劑量與方法與首次免疫相同；
3)收集雞蛋:免疫結束后收集雞蛋，收集從最后一次免疫算起每日雞蛋，將雞蛋編號并做好記錄，并于4°C冰箱保存備用，(收集粵禽雞未免疫前雞蛋為陰性對照)。
[0012]二、提取卵黃抗體:
1)將收集的雞蛋用75%酒精浸泡5-10分鐘；
2)將雞蛋取出，用清水沖洗，干凈紗布將蛋殼擦干；
3)將雞蛋蛋殼用剪刀打開一個小孔，讓蛋清緩慢流出，直至流盡蛋清，并從小孔內注入少量無菌NS將殘余蛋清洗凈；
4)把只剩蛋黃的蛋殼用小鑷子輕輕打開，小心將整個卵黃移至滅菌濾紙上，來回流動，除盡蛋清；
5)把卵黃加入無菌量杯，記錄卵黃量(大約8-10g)，然后加入8倍滅菌的雙蒸水與量杯中制成卵黃稀釋液；
6)用0.1M HCl小心調節卵黃稀釋液的PH值，使其PH為5.0-5.1，然后將其置4°C冰箱攪拌8小時；
7)攪拌結束后，從冰箱取出卵黃稀釋液，在4°C環境下將卵黃稀釋液放入高速低溫離心機中以10000-12000轉/分鐘，離心15分鐘，收取得卵黃抗體水溶性組分液上清液(WSF);
8)于水溶性組分液上清液(WSF)中加入PBS(0.01mol/L PH7.4)配制8%PEG6000100ml (20g卵黃時)，將其同一方向攪拌30分鐘,在4°C的環境下置于高速低溫離心機以10000-12000轉/分鐘，離心，收集沉淀，除去上清液；
9)將透析袋于300ml透析處理液(2%NaHC03、lmmol/LEDTA, PH 8.0)中煮沸10分鐘后，將透析袋以蒸餾水徹底漂洗后，再在300ml (PH 8.0) lmmol/LEDTA液中煮沸10分鐘，再以滅菌水里外徹底沖洗； 10)將收集的沉淀裝入透析袋，透析24h后，0.22ΜΠ1膜過濾，然后于_20°C保存；
11)IgY 含量測定(mg/ml) = (OD280 — OD403 X0.3) X0.62 ；
12)IgY效價測定雙向瓊脂擴散試驗效價3 1:16，ELISA試驗3 1:8000。
[0013]本發明制劑具有特異性預防麻疹和百白破的功能，增強非特異性免疫功能。該制劑無過敏反應，服用安全，簡便，采用口服給藥途徑，不受條件限制，不影響該制劑的生物學活性，是一種高效安全的制劑。
【權利要求】
1.抗麻疹與百白破四價卵黃抗體制劑的制備工藝，其特征在于:該工藝包括如下步驟: 1)免疫接種疫苗雞的選擇:選擇健康狀態良好，17-18周齡粵禽雞； 2)免疫接種疫苗制備及劑量:麻疹疫苗與百白破疫苗1:1比例混合，每只雞免疫接種人用麻疹疫苗每次量為0.75ml ； 3)免疫程序:免疫途徑為皮下注射，免疫次數為4次，免疫時間為第I次與第2次間隔為3天，第3次與第4次間隔為7天，免疫注射技巧為3點注射； 4)卵黃分離方法與技巧:用75%酒精浸泡雞蛋5-10分鐘，取出雞蛋用清水沖洗，干凈紗布將蛋殼擦干，用剪刀打開蛋殼一個小孔，讓蛋清緩慢流出，順流盡蛋清，打開蛋殼，小心將整個蛋黃移至滅菌濾紙上，來回流動，除盡蛋清，取蛋黃加入量杯，記錄卵黃量； 5)卵黃抗體水溶性組分液(WSF)制備:按卵黃量的8倍加入滅菌的雙蒸水，用0.1M HCl調卵黃稀釋液PH為5.0-5.1，放置在4°C環境下攪拌8小時取出，在4°C環境下將卵黃稀釋液放入離心機中以10000-12000轉/分鐘，離心15分鐘，收取得卵黃抗體水溶性組分液上清液； 6)卵黃抗體分離提取方法:將卵黃抗體水溶性組分液上清液加入8%PEG6000100ml,攪拌30分鐘，然后在4°C環境下放入離心機中以10000-12000轉/分鐘，離心15分鐘，收集沉淀，去上清液，沉淀裝入透析袋透析； 7)卵黃抗體提取物無菌處理:將直徑0.22Mffl過濾膜裝入濾器，高壓蒸汽滅菌后抗體提取物過濾，即為無菌抗體，將卵黃抗體置_20°C保存備用，保存期2年； 8)PEG 溶液配制:用 PBS (0.01mol/L PH7.4)配制； 9)透析袋處理:將透析袋放入300ml透析處理液(2%NaHC03、lmmol/LEDTA, PH 8.0)中煮沸10分鐘后，以蒸餾水徹底漂洗后再用300ml (PH 8.0)lmmol/LEDTA液中煮沸10分鐘，最后用滅菌的雙蒸水里外徹底沖洗。
2.如權利要求1所述的抗麻疹與百白破四價卵黃抗體制劑的制備工藝，其特征在于:所述步驟3)免疫注射技巧3點注射為，胸部一點，兩翼下各一點。
3.如權利要求1所述的抗麻疹與百白破四價卵黃抗體制劑的制備工藝，其特征在于:所述步驟4)打開蛋殼一個小孔后，從小孔內注入少量無菌NS洗凈蛋清。
【文檔編號】C07K16/06GK104341499SQ201410618386
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年11月6日 優先權日:2014年11月6日
【發明者】孫萬邦, 郭錦錦, 唐艷麗, 王少慧 申請人:遵義醫學院