具有ace抑制活性的米糠蛋白肽的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種具有ACE抑制活性的米糠蛋白肽的制備方法，該方法以米糠為原料，首先提取米糠蛋白，然后采用酶解法制備米糠蛋白水解物，再采用超濾法、葡聚糖凝膠Sephadex G-15、RP-HPLC法對米糠ACE抑制肽進行分離純化。本發明有效利用了現有豐富且廉價的米糠資源，加工制備出了具有高ACE抑制活性的米糠蛋白肽。本發明將米糠ACE抑制肽的降壓功能得到最大化利用，一方面增加了米糠的附加值，創造出好的經濟效益和市場價值；另一方面，有效緩解高血壓的發病率、控制高發病率，保衛人類免受高血壓的危害，具有良好的應用價值和社會效益，同時也為研究米糠蛋白ACE抑制肽結構和降血壓機理提供了一定的理論基礎和實驗依據。
【專利說明】具有ACE抑制活性的米糠蛋白肽的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于食品【技術領域】，涉及一種具有ACE抑制活性的米糠蛋白肽的制備方 法。
【背景技術】
[0002] 稻谷是我國第一大糧食品種，年總產量1. 8?2. 0億噸左右，占全國糧食總產量的 42%、世界稻谷總產量35%左右。米糠是稻谷的副產品之一，目前我國擁有量在1000萬噸 左右，是一種量大面廣的可再生資源。然而我國對于米糠的深度開發利用及相應理論研宄 尚處于低水平階段，大部分作為畜禽飼料被浪費了，僅有10%?15%用來榨油或提取植酸 鈣、肌醇、谷維素等較高價值的再生產品。
[0003] 米糠是一種具有很大開發潛力的食品、化工和藥物原料，據估計米糠經綜合利用 后其經濟效益可提高10倍以上。聯合國工業發展組織（UNIDD)把米糠稱為一種未能充分利 用的寶貴資源，我國也將米糠綜合利用作為"九五"、"十五"期間糧食深加工研宄和開發的 重點。米糠重量雖只占稻米重量的6%?8%，但卻含有90%以上人體必需元素，其主要成 分為14%?24%油脂、12%?18%蛋白質、33%?53%無氮浸出物、8%?12%灰分、7%? 14%水分；除此之外，米糠還含有抗癌及其他促進人體健康的功能型物質，如膳食纖維、維 生素、礦物質、谷維素、植酸、蛋白酶抑制劑等；同時還可以從廉價的米糠資源中獲得高價值 的營養物質或生物活性物質，如蛋白質、蛋白活性肽、生育酚、二十八碳烷醇、角鯊烯、神經 酰胺等，對人體健康和現代文明病的預防及治療具有重要作用。
[0004] 近年來隨著科學研宄的不斷深入，生物活性肽由于具有品種多、應用范圍廣、無毒 副作用、吸收快、效率高和被吸收的氨基酸組成平衡等優點，正廣泛應用于食品、醫藥和飼 料等行業。經研宄表明，活性肽都以非活性狀態存在于蛋白質長鏈中，當采用適當的水解方 法得到這些低肽時，其活性就會釋放出來。生物活性肽的功能特性及生理活性與其分子量 大小及氨基酸鏈長短、組成結構密切相關。與游離氨基酸相比，寡肽轉運系統速度更快，并 且具有耗能低、不易飽和的特點。許多活性肽具有原蛋白質或其組成氨基酸所沒有的功能， 它們與機體的各種功能調節、疾病的發生以及免疫、內分泌、衰老、代謝等有著非常緊密的 聯系，在生命活動中起著顯著作用，可廣泛用作藥物、疫苗和食品營養制劑等。如今已證實 了，米糠蛋白肽更易于被人體吸收利用，同時兼具低過敏性、溶解性好等特點。并且米糠蛋 白肽在抗氧化、降血壓血脂、血管緊張素轉換酶抑制活性、阿片樣拮抗活性、免疫調節等生 物功能活性方面都已有相關報道，是一種非常有實用前途的功能活性肽。其中米糠蛋白血 管緊張素轉換酶抑制肽越來越受到研宄者的重視，它通過抑制血管緊張素轉換酶（ACE)活 性，從而起到緩解血壓升高的作用，其生物保健功能及藥用功能不可小視。
[0005] 生物活性肽具有品種多、應用范圍廣、無毒副作用、吸收快、效率高和被吸收的 氨基酸組成平衡等優點，目前正廣泛應用于食品、醫藥等行業。ACE抑制肽是對現代常見 病-高血壓具有良好生理調節功效的一類生物活性肽。與化學合成ACE抑制劑或藥物相比， 從天然食源性物質中獲取的ACE抑制劑雖見效相對較慢，但更易被人體吸收利用，同時調 節血壓時效更長、相對溫和持久，尤為關鍵的是對人體腎臟、肝臟等器官無毒副作用。盡管 如此，我國目前對于ACE抑制肽等降壓肽的研宄尚屬于起步階段，且大多集中在大豆肽和 玉米肽等的研宄[21]，僅有極少量報道米糠蛋白降壓肽；并且對于分離純化ACE抑制肽并無 系統的方法，一級結構鑒定、分析其與ACE抑制活性的關系等相關研宄也尚處于空白狀態； 僅僅處于實驗室基礎研宄階段，并沒有擴展工業化生產。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種具有ACE抑制活性的米糠蛋白肽的制備方法，該方法有 效利用了現有豐富且廉價的米糠資源，加工制備出了具有高ACE抑制活性的米糠蛋白肽。
[0007] 本發明的目的是通過以下技術方案實現的：
[0008] -、以米糖為原料，米用喊法提取米糖蛋白；
[0009] 二、向米糠蛋白中加入蒸餾水，控制底物濃度為1. 0?6. Omg/mL，充分攪拌溶解 后，調節pH值為7. 5?10。再添加一定比例的蛋白酶后放于恒溫水浴中，使其發生酶解反 應，控制酶添加量為500?5000u/g，酶解溫度為30?55°C，水解時間為0. 5?10h ;反應 結束后，迅速升溫至94?96°C保持10?15min，對蛋白酶進行充分的滅活處理；離心分離 酶解液，即得米糠蛋白水解液；
[0010] 三、采用超濾法初級分離米糠蛋白水解液，控制超濾操作溫度為20?25°C，超濾 操作壓力在〇? 1?〇? 4MPa范圍內，截留分子量< 6KDa。
[0011] 四、采用葡聚糖凝膠Sephadex G-15純化步驟三獲得的米糠ACE抑制肽；
[0012] 五、采用RP-HPLC法分離純化步驟四獲得的米糠ACE抑制肽，得到純化的米糠ACE 抑制肽。
[0013] 本發明有效利用了現有豐富且廉價的米糠資源，加工制備出了具有高ACE抑制活 性的米糠蛋白肽，探索出一種實用、高效的分離純化米糠ACE抑制肽的連續色譜，并測定其 氨基酸組成及氨基酸序列，得到其一級結構，進而將純化后的米糠ACE抑制肽添加到原料 中，加工制得有降血壓功效的功能性保健食品、藥品等。本發明將米糠ACE抑制肽的降壓功 能得到最大化利用，一方面增加了米糠的附加值，創造出好的經濟效益和市場價值；另一方 面，有效緩解高血壓的發病率、控制高發病率，保衛人類免受高血壓的危害，具有良好的應 用價值和社會效益，同時也為研宄米糠蛋白ACE抑制肽結構和降血壓機理提供了一定的理 論基礎和實驗依據。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014] 圖1為米糠ACE抑制肽的制備、分離純化及結構表征、其他相關性質研宄的實驗技 術流程圖；
[0015] 圖2為酶解法制備米糠ACE抑制肽實驗流程圖；
[0016] 圖3為超濾法初步分離米糠蛋白肽的實驗裝置流程圖；
[0017] 圖4為測定蛋白酶活力的酪氨酸標準曲線；
[0018] 圖5為經各蛋白酶酶解后米糠蛋白水解物的NSI、DH及ACE抑制活性；
[0019] 圖6為底物濃度對制備具有ACE抑制活性的水解物的影響；
[0020] 圖7為酶添加量對制備ACE抑制肽的影響；
[0021] 圖8為pH對制備ACE抑制肽的影響；
[0022] 圖9為酶解溫度對制備ACE抑制肽的影響；
[0023] 圖10為底物濃度與酶添加量對ACE抑制率影響的響應面；
[0024] 圖11為底物濃度與酶添加量對ACE抑制率影響的等高線；
[0025] 圖12為底物濃度與pH對ACE抑制率影響的響應面；
[0026] 圖13為底物濃度與pH對ACE抑制率影響的等高線；
[0027] 圖14為底物濃度與酶解溫度對ACE抑制率影響的響應面；
[0028] 圖15為底物濃度與酶解溫度對ACE抑制率影響的等高線；
[0029] 圖16為酶添加量與pH對ACE抑制率影響的響應面；
[0030] 圖17為酶添加量與pH對ACE抑制率影響的等高線；
[0031] 圖18為酶添加量與酶解溫度對ACE抑制率影響的響應面；
[0032] 圖19為酶添加量與酶解溫度對ACE抑制率影響的等高線；
[0033] 圖20為pH與酶解溫度對ACE抑制率影響的響應面；
[0034] 圖21為pH與酶解溫度對ACE抑制率影響的等高線；
[0035] 圖22為酶解時間對制備ACE抑制肽的影響；
[0036] 圖23為超濾分離純化得到的三個組分的IC5Q值；
[0037] 圖24為米糠ACE抑制肽的分離純化與結構表征分析實驗流程；
[0038] 圖25為洗脫液為0. 01M HC1時對Sephadex G-15柱層析分離純化米糠ACE抑制 肽的影響；
[0039] 圖26為洗脫液為1. 0M HAc時對S印hadex G-15柱層析分離純化米糠ACE抑制肽 的影響；
[0040] 圖27為洗脫液為0. 1M乙酸銨時對S印hadex G-15柱層析分離純化米糠ACE抑制 肽的影響；
[0041] 圖28為洗脫液為0. 2M pH = 4. 0, HAc-NaAc緩沖液時對S印hadex G-15柱層析 分離純化米糠ACE抑制肽的影響；
[0042] 圖29為徑高比為16mm : 250mm時對S印hadex G-15柱層析分離純化米糠ACE抑 制肽的影響；
[0043] 圖30為徑高比為16mm : 300mm時對Sephadex G-15柱層析分離純化米糠ACE抑 制肽的影響；
[0044] 圖31為徑高比對為16mm : 350mm時Sephadex G-15柱層析分離純化米糠ACE抑 制肽的影響；
[0045] 圖32為洗脫流速為0. 2mL/min時對S印hadex G-15柱層析分離純化米糠ACE抑 制肽的影響；
[0046] 圖33為洗脫流速為0. 8mL/min時對S印hadex G-15柱層析分離純化米糠ACE抑 制肽的影響；
[0047] 圖34為洗脫流速為0. 5mL/min時對S印hadex G-15柱層析分離純化米糠ACE抑 制肽的影響；
[0048] 圖35為經S印hadex G-15分離純化得到的5個組分的IC5Q值；
[0049] 圖36為組分E的制備型RP-HPLC分離圖譜；
[0050] 圖37為制備型RP-HPLC分離純化組分E得到11個組分的IC5(I值；
[0051] 圖38為組分E-9的RP-HPLC分析圖譜；
[0052] 圖39為米糠ACE抑制肽E-9的氨基酸圖譜；
[0053] 圖40為肽鏈骨架斷裂及其碎片命名；
[0054] 圖41為米糠ACE抑制肽E-9的一級質譜圖；
[0055] 圖42為米糠ACE抑制肽E-9的氨基酸碎片二級質譜圖；
[0056] 圖43為米糠ACE抑制肽與目前市場上常見的降壓藥物進行了抑制ACE活性的比 較實驗流程；
[0057] 圖44為模擬體內消化對ACE抑制肽IC5(l的影響；
[0058] 圖45為經ACE處理后對ACE抑制肽活性的影響；
[0059] 圖46為溫度對ACE抑制肽活性的影響；
[0060] 圖47為pH對ACE抑制肽活性的影響。
【具體實施方式】
[0061] 下面結合附圖對本發明的技術方案作進一步的說明，但并不局限于此，凡是對本 發明技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，均應涵蓋 在本發明的保護范圍中。
[0062] 本發明提供了一種具有ACE抑制活性的米糠蛋白肽的制備方法，包括以下內容：
[0063] (1)制備具有ACE抑制活性的米糖蛋白狀：
[0064] 以米糠為原料，首先提取米糠蛋白，然后以ACE抑制率為主要的考察指標，用篩選 出來的最優蛋白酶酶解米糖蛋白，制備具有ACE抑制活性的米糖蛋白水解物。
[0065] (2)分離純化米糠ACE抑制肽及其結構的表征：
[0066] ①超濾法分離米糠蛋白活性肽；
[0067] ②葡聚糖凝膠SephadexG-15分離純化步驟①獲得的米糠蛋白肽；
[0068] ③RP-HPLC法分離純化步驟②獲得的米糠ACE抑制肽；
[0069] ④氨基酸自動檢測儀法檢測步驟③獲得的米糠蛋白ACE抑制肽的氨基酸組成；
[0070] ⑤質譜測定米糠ACE抑制肽分子量，分析一級結構。
[0071](3)米糠ACE抑制肽的模擬體內消化試驗及其耐熱性、耐酸堿性、耐ACE性等穩定 性研宄，并在體外與常見的化學合成類降壓藥物比較抑制ACE活性的效果。
[0072] 關于米糠ACE抑制肽的制備、分離純化及結構表征、其他相關性質研宄的實驗技 術流程如圖1所示。
[0073] 1、酶解法制備米糠ACE抑制肽研宄
[0074] 以ACE抑制率為主要的考察指標，采用米糠蛋白為原料，比較四種不同蛋白酶對 其酶解的影響效果，篩選出制備具有ACE抑制活性的米糠蛋白肽的最佳制備酶，并利用 Box-Behnken響應曲面分析方法對酶解法制備米糠ACE抑制肽反應進行了優化試驗。然后 采用中空纖維超濾膜對米糠蛋白水解物進行了初級分離純化，為后續實驗進一步分離純化 ACE抑制肽奠定研宄基礎。
[0075] 實驗流程見圖2。
[0076] 1. 1米糠蛋白水解物的制備
[0077] 1. 1. 1制備脫脂米糠
[0078] 向實驗米糠中按1 : 10 (V : V)比例加入正己烷，在室溫條件下，充分攪拌30min， 3000r/min離心lOmin，離心沉淀在室溫下晾干后，再次粉碎即得實驗用脫脂米糠，冷藏于 4°C冰箱，備用。
[0079] 1. 1. 2堿法制備米糠蛋白
[0080] 脫脂米糠一加水混合（1:10以：￥))-恥011調節？11值至9.45，堿溶一恒溫 水浴加熱（50°C、3h，每lOmin調節pH保持在9. 45)-離心（3500r/min，15min)，取上清液 -HCL調pH至4. 1?4. 5,蛋白酸沉一離心（3000r/min，lOmin)-水洗沉淀三次一收集沉 淀，冷凍干燥一米糠蛋白，于-12°C冰箱保存備用。
[0081]
【權利要求】
1. 一種具有ace抑制活性的米糠蛋白肽的制備方法，其特征在于所述方法步驟如下： 一、 以米糠為原料，采用堿法提取米糠蛋白： 二、 向米糠蛋白中加入蒸餾水，控制底物濃度為1. 0?6. Omg/mL，充分攪拌溶解后，調 節pH值為7. 5?10 ;再添加一定比例的蛋白酶后放于恒溫水浴中，使其發生酶解反應，控 制酶添加量為500?5000u/g，酶解溫度為30?55°C，水解時間為0. 5?10h ;反應結束后， 迅速升溫至94?96°C保持10?15min，對蛋白酶進行充分的滅活處理；離心分離酶解液， 即得米糠蛋白水解液； 三、 采用超濾法初級分離米糠蛋白水解液； 四、 采用葡聚糖凝膠Sephadex G-15純化步驟三獲得的米糠 ACE抑制肽； 五、 采用RP-HPLC法分離純化步驟四獲得的米糠 ACE抑制肽，得到純化的米糠 ACE抑制 肽。
2. 根據權利要求1所述的具有ACE抑制活性的米糠蛋白肽的制備方法，其特征在于所 述蛋白酶為堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶或復合風味蛋白酶。
3. 根據權利要求1所述的具有ACE抑制活性的米糠蛋白肽的制備方法，其特征在于所 述蛋白酶為喊性蛋白酶。
4. 根據權利要求1或3所述的具有ACE抑制活性的米糠蛋白肽的制備方法，其特征在 于所述最佳酶解條件：底物濃度3. 9mg/mL、酶添加量3006u/g、pH = 9. 1、酶解溫度40°C、酶 解4h。
5. 根據權利要求1所述的具有ACE抑制活性的米糠蛋白肽的制備方法，其特征在于所 述超濾操作溫度為20?25°C，超濾操作壓力在0. 1?0. 4MPa范圍內，截留分子量< 6KDa。
6. 根據權利要求1所述的具有ACE抑制活性的米糠蛋白肽的制備方法，其特征在于所 述S印hadex G-15純化米糠 ACE抑制肽的最佳洗脫參數：上樣量3. OmL ;洗脫液0. 01M HC1 ; 徑高比16mm:300mm ;洗脫流速0? 5mL/min ;檢測波長280nm。
7. 根據權利要求1所述的具有ACE抑制活性的米糠蛋白肽的制備方法，其特征在 于所述純化的米糠 ACE抑制肽是由蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸組成的三肽物質，分子量為 345. 238Da，其氨基酸序列為 Ile-Thr-Leu 或 Leu-Thr_Ile〇
【文檔編號】C07K1/16GK104450839SQ201410616924
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月5日 優先權日:2014年11月5日
【發明者】劉穎, 竇博鑫, 付薇, 隋艷曉, 王宇新 申請人:哈爾濱商業大學